全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４５(１): ６７￣７２(２０１５)
收稿日期: ２０１３￣１０￣３０ꎻ 修回日期: ２０１４￣０９￣２８
基金项目: “十二五”农村领域国家科技计划课题(２０１３ＢＡＤ２０Ｂ０４)ꎻ科技部科技攻关项目(２０１１ＢＡＤ３５Ｂ０２￣０１)ꎻ 科技部科技支撑项目
(２０１１ＢＡＤ１６Ｂ１１)
通讯作者: 邹德堂ꎬ教授ꎬ主要从事水稻遗传育种研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ: ｚｏｕｄｔ＠１６３.ｃｏｍ
第一作者: 任月坤ꎬ女ꎬ山东阳谷人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从水稻遗传育种研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｒｅｎｙｕｅｋｕｎ１９８８＠１２６.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１５.０１.００９
东农 ４１５稻瘟病抗性遗传分析及基因定位
任月坤ꎬ 邹德堂∗ꎬ 赵宏伟ꎬ 王敬国ꎬ 刘化龙ꎬ 孙 健ꎬ 郭丽颖
(东北农业大学农学院水稻研究所ꎬ哈尔滨 １５００３０)
摘要:粳稻品种东农 ４１５自育成以来一直以其早熟、抗病、高产特性而著称ꎬ在黑龙江省稻瘟病高发区种植 ２０ 多年均表现
高抗稻瘟病ꎮ 本研究利用 １５８个采集于黑龙江省不同稻区的稻瘟病菌株对东农 ４１５进行接种鉴定ꎬ结果表明东农 ４１５对黑
龙江省稻瘟病菌株有很强的抗性ꎬ抗谱高达 ８９.２％ꎮ 以东农 ４１５与丽江新团黑谷(ＬＴＨ)杂交衍生的 Ｆ１和 Ｆ２群体为遗传分
析试验材料ꎬ通过接种鉴定ꎬ发现东农 ４１５对稻瘟病菌株 Ｆ￣１０￣１１的抗性由一个显性基因控制ꎮ 进一步采用分子标记结合
隐性群体分离分析法ꎬ以对菌株 Ｆ￣１０￣１１极端感病的 ９９个 Ｆ２单株为作图群体ꎬ将东农 ４１５的抗病基因定位在第 ２ 染色体ꎬ
距离基因两侧标记 ＲＭ５３００和 ＲＭ２１３的遗传距离分别为 ７.６和 ３.０ ｃＭꎬ暂命名为 Ｐｉ￣ｄｎ( ｔ)ꎮ 将 Ｐｉ￣ｄｎ( ｔ)位点映射到水稻
参考基因组图谱上ꎬ在抗病位点基因组区段内发现 ３ 个编码基因 Ｏｓ０２ｇ５６０１０、Ｏｓ０２ｇ５５５４０ 和 Ｏｓ０２ｇ５６４００ 具有抗病基因结
构域ꎬ可作为 Ｐｉ￣ｄｎ( ｔ)的候选基因ꎮ
关键词:水稻ꎻ 稻瘟病ꎻ 抗病基因ꎻ 基因定位
Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｄｏｎｇｎｏｎｇ４１５
ＲＥＮ Ｙｕｅ￣ｋｕｎꎬ ＺＯＵ Ｄｅ￣ｔａｎｇꎬ ＺＨＡＯ Ｈｏｎｇ￣ｗｅｉꎬ ＷＡＮＧ Ｊｉｎｇ￣ｇｕｏꎬ ＬＩＵ Ｈｕａ￣ｌｏｎｇꎬ ＳＵＮ Ｊｉａｎꎬ ＧＵＯ Ｌｉ￣ｙｉｎｇ
(Ｒｉｃｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅꎬ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅꎬ Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｈａｒｂｉｎ １５００３０ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｄｏｎｇｎｏｎｇ４１５ ｉｓ ｗｅｌｌ ｋｎｏｗｎ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｍａｔｕｒｉｔｙꎬ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄ ｓｉｎｃｅ ｂｒｅｅｄｉｎｇꎬ
ａｎｄ ｈａｓ ａ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｂｌａｓｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｆｔｅｒ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ２０ ｙｅａｒｓ ｉｎ ｈｉｇｈ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｒｅａ ｏｆ ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ ｉｎ
Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ ｐｒｏｖｉｎｃｅ. Ｔｈｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｏｎｇｎｏｎｇ４１５ ｆｏｒ ｉｔｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｇａｉｎｓｔ １５８ ｂｌａｓｔ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ
ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒｉｃｅ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ｃｕｌｔｉｖａｒ ｃａｎ ｒｅｓｉｓｔ ８９.２％ ｏｆ ａｌｌ
ｔｅｓｔｅｄ ｉｓｏｌａｔｅｓꎬ ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ Ｄｏｎｇｎｏｎｇ４１５ ｈａｓ ａ ｂｒｏａｄ￣ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｂｌａｓｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ. Ｆ￣１０￣１１ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｔｅｓｔ
ｉｓｏｌａｔｅꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｄｏｎｇｎｏｎｇ４１５ ｂｙ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｎｇ Ｆ１ａｎｄ Ｆ２ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｃｒｏｓｓ ｏｆ
Ｄｏｎｇｎｏｎｇ４１５×ＬＴＨꎬ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ Ｄｏｎｇｎｏｎｇ４１５ ｔｏ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅ ｗａｓ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｂｙ ａ ｓｉｎｇｌｅ
ｄｏｍｉｎａｎｔ ｇｅｎｅ. Ｗｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ａ ｍａｐｐｉｎｇ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ ９９ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ Ｆ２ ｐｌａｎｔｓ ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅ Ｆ￣１０￣１１.
Ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｄｏｎｇｎｏｎｇ４１５ꎬ ｔｅｍｐｏｒａｒｉｌｙ ｎａｍｅｄ ａｓ Ｐｉ￣ｄｎ ( ｔ)ꎬ ｗａｓ ｍａｐｐｅｄ ａｔ ａ ｒｅｇｉｏｎ ｂｅｗｅｅｎ
ＲＭ２１３ ａｎｄ ＲＭ５３００ ｗｉｔｈ ３.０ ａｎｄ ７.６ ｃＭ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｔａｎｃｅｓ ｉｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ２ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ
ＢＳＡ￣ＲＣＡ ｓｔｒａｔｅｇｙ. Ｐｉ￣ｄｎ( ｔ) ｌｏｃｉ ｗｅｒｅ ｍａｐｐｅｄ ｉｎ ｒｉｃｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｏｍｅꎬ ａｎｄ ｔｈｒｅｅ ｃｏｄｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ
ｄｏｍａｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｏｓ０２ｇ５６０１０ꎬ Ｏｓ０２ｇ５５５４０ ａｎｄ Ｏｓ０２ｇ５６４００ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ
ｓｅｇｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｌｏｃｉ. Ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｇｅｎｅｓ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ａｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ Ｐｉ￣ｄｎ( ｔ) .
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｒｉｃｅ (Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ.)ꎻ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅꎻ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅꎻ ｇｅｎｅ ｍａｐｐｉｎｇ
中图分类号: Ｓ４３２.４４　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１５)０１￣００６７￣０６
　
植物病理学报 ４５卷
　 　 稻瘟病是由稻瘟病菌(Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅꎬ无
性态:Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ)引发的一种水稻病害ꎬ是
水稻生产中危害最为严重的病害之一ꎬ且具有突发
性强、易于流行的特点ꎮ 稻瘟病在全世界各水稻生
产区均有发生ꎬ其中以亚洲和非洲等主要稻区发病
较为严重[１]ꎮ 在中国ꎬ南北稻区每年都有稻瘟病
的发生ꎬ一般粳稻重于籼稻[２]ꎮ 黑龙江省作为我
国重要的粳稻商品粮生产基地ꎬ水稻种植面积约占
东北地区总面积的五分之三[３]ꎮ 然而ꎬ由于近年
来水稻品种的单一化种植以及追求高产ꎬ盲目增加
氮肥施用量ꎬ黑龙江省每年都有不同程度的稻瘟病
发生ꎬ严重影响了水稻的产量和品质[４]ꎮ 据不完
全统计ꎬ黑龙江省从 １９４９－２００９ 年间稻瘟病发生
较重的年份有 １１ 次ꎬ累计损失稻谷达 １２９. ２ 万
ｔ[５]ꎮ 其中ꎬ２００５ 年全省稻瘟病发病面积为 ６.６７×
１０５ ｈｍ２ꎬ重发病县(市、区)有 １５ 个ꎬ中等发病县
(市、区)有 １０ 个[６]ꎻ２００６ 年稻瘟病发病面积高达
７.３×１０５ ｈｍ２ꎬ损失程度为历年所罕见[７]ꎮ 综上所
述ꎬ稻瘟病已经成为限制黑龙江省水稻稳产、高产
的关键因素之一ꎮ 因此ꎬ如何控制及预防稻瘟病的
发生是黑龙江水稻生产的当务之急ꎮ
　 　 实践证明ꎬ选育和种植抗病品种是防治稻瘟病
最经济、有效的措施ꎮ 但由于稻瘟病菌生理小种复
杂多变ꎬ导致抗病品种在推广种植几年后抗性就容
易丧失[８]ꎮ 因此ꎬ发掘和鉴定新的稻瘟病抗性基
因对防治水稻稻瘟病具有十分重要的意义ꎮ 水稻
品种东农 ４１５是由东农 ３２０ 与城建 ６ 号杂交选育
而来的黑龙江省粳稻地方品种ꎮ 自 １９８９年育成以
来ꎬ一直保持着很强的稻瘟病抗性ꎮ 在没有药剂防
治的情况下ꎬ在稻瘟病高发区种植仍然表现高抗稻
瘟病[９]ꎬ是黑龙江省公认的高抗稻瘟病水稻品种ꎮ
Ｋｏｎｇ[１０]研究表明ꎬ东农 ４１５ 对黑龙江省优势最强
的 ＺＥ菌群 ＺＥ１小种呈 Ｒ 型反应ꎬ同时对 ＺＡ、ＺＤ
菌群 ＺＡ１、ＺＤ１小种也为 Ｒ型反应ꎮ Ｌｉ等[９]等研究
表明ꎬ东农 ４１５ 至少含有三对显性抗稻瘟病基因ꎬ
且基因间存在互作ꎮ 由此可见ꎬ东农 ４１５是一个优
异的粳稻稻瘟病抗源ꎬ深入研究其抗稻瘟病基因的
遗传组成ꎬ从中定位和克隆抗性基因ꎬ对揭示东农
４１５的广谱持久抗性机理具有重要意义ꎮ
　 　 本研究通过接种 ４ 个日本稻瘟病鉴别菌株和
１个新分离的黑龙江省强致病性代表菌株ꎬ对东农
４１５的稻瘟病抗性进行遗传分析和基因定位ꎬ以期
探明东农 ４１５稻瘟病高度抗性的遗传基础ꎬ挖掘新
的抗病基因ꎮ 为在生产和育种上更好地应用东农
４１５奠定基础ꎬ也为黑龙江省抗稻瘟病种质资源的
发掘及抗性基因的科学利用提供依据ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 试验材料
　 　 ２０１１年夏季用抗病亲本东农 ４１５ 和感病亲本
丽江新团黑谷(ＬＴＨ)配制杂交组合ꎬ收获 Ｆ１种子ꎬ
同年冬季在海南南繁加代ꎬ收获 Ｆ２种子ꎮ ２０１２年在
东北农业大学香坊试验站种植亲本、Ｆ１和 Ｆ２群体ꎬ用
于东农 ４１５稻瘟病抗性的遗传和基因定位研究ꎮ
　 　 供试菌株为 ２０１１年秋从黑龙江省各水稻主产
区采集的稻瘟病穗颈瘟标样ꎬ经分离得到稻瘟病单
孢菌株 １５８ 株ꎬ菌种采集地及采集品种见表 １ꎮ ４
个致病性稳定、产孢性能好的日本稻瘟病鉴别菌系
稻 ７２、研 ５３￣３３、研 ５４￣２０、研 ５４￣０４由黑龙江省农科
院水稻研究所宋成艳副研究员惠赠ꎬ用于东农 ４１５
抗性遗传分析ꎮ
１.２　 播种育苗与田间种植
　 　 将东农 ４１５、ＬＴＨ、Ｆ１及 Ｆ２代水稻种子浸种催
芽后播种于规格为 ５８ｃｍ×３３ｃｍ×６ｃｍ 的塑料育苗
盘中ꎬ用于东农 ４１５ 的抗谱测定和抗性遗传分析ꎮ
床土按照肥料配比施足底肥并进行酸化处理ꎬ分行
单粒播种ꎬ每盘播种 １０ 行ꎬＦ２代材料 ６ 行(１５ 粒 /
行)ꎬ亲本播种在首尾两行作为抗感对照ꎮ 出苗后
每隔 ４~５ ｄ喷施一次叶面肥ꎬ促使秧苗生长ꎮ
　 　 用于基因定位的 Ｆ２代种子经浸种催芽后播于
水稻育苗棚内ꎬ待秧苗生长至四叶一心时ꎬ移栽到
稻田ꎬ行长 ３ ｍꎬ行距 ３０ ｃｍꎬ穴距 １０ ｃｍꎮ 多肥多
水ꎬ其他种植管理同常规栽培ꎮ
１.３　 接种与发病调查
　 　 (１)苗期喷雾接种
　 　 稻苗生长到 ３~４叶期时转移到自制的接种箱
内进行隔离喷雾接种ꎬ接种前浇足水ꎬ在配制好的
孢子悬浮液中加入少量 ０.０２％体积的吐温 ２０ꎬ以
便孢子悬浮液能良好地附着到水稻叶片上ꎮ 用小
型喷雾器进行喷雾接种ꎬ使雾滴均匀分布在叶片表
面及茎杆上ꎬ每个秧盘接种 ４０~５０ ｍＬ的孢子悬浮
液ꎮ 接种后在温度 ２６℃、湿度大于 ９５％的条件下
８６
　
　 １期 任月坤ꎬ等:东农 ４１５稻瘟病抗性遗传分析及基因定位
黑暗处理 ２４ ｈꎮ 然后在接种箱上面悬挂遮阳网ꎬ并
定时喷水保湿ꎮ
　 　 (２)注射接种
　 　 在水稻分蘖盛期ꎬ每株选取 ３ 个分蘖对 Ｆ２群
体挂牌ꎮ 在距离稻茎顶端 １０~ １５ ｃｍ处ꎬ将注射器
针尖刺入稻茎中央注入孢子悬浮液ꎬ直到未展开的
心叶里冒出多余的孢子悬浮液ꎬ停止注射ꎮ
　 　 接种后 ７~１０ｄꎬ按国际水稻所公布的评价标准
调查病级[１１]ꎮ ０级:无任何病斑ꎻ１ 级:仅有针尖大
小的褐点ꎻ２ 级:较大褐点ꎻ３ 级:直径 １ ~ ３ ｍｍ 的
椭圆形病斑ꎻ４ 级:病斑梭形或椭圆型ꎬ直径大于
３ｍｍꎬ病斑面积不足叶面积的 ２％ꎻ５ 级:梭形病斑ꎬ
病斑面积小于叶面积 １０％ꎻ６级:梭形病斑ꎬ病斑面
积比例 １０％ ~ ２５％ꎻ７ 级:梭形病斑ꎬ病斑面积比例
２６％~５０％ꎻ７ 级:梭形病斑ꎬ病斑面积比例 ２６％ ~
５０％ꎻ８ 级:梭形病斑ꎬ病斑面积比例 ５１％ ~ ７５％ꎻ９
级:梭形病斑ꎬ病斑面积为大于 ７５％ꎬ甚至全部叶
片死ꎮ 统计分析时ꎬ将 ０ ~ ４ 级记为抗病(Ｒ)ꎬ将 ５
~９级记为感病(Ｓ)ꎮ
１.４　 基因组ＤＮＡ提取ꎬＳＳＲ分析及抗、感基因池构建
　 　 采用 ＣＴＡＢ法[１２]提取新鲜水稻叶片的 ＤＮＡꎮ
选取均匀分布于水稻 １２条染色体上的 ６００ 对 ＳＳＲ
引物进行亲本间多态性检测ꎬ引物序列来源于
ｗｗｗ.ｇｒａｍｅｎｅ.ｏｒｇꎬ由上海生工合成ꎮ ＰＣＲ 扩增采
用 １０ μＬ的反应体系ꎬ包括 １.５ μＬ 模板 ＤＮＡ(５０
ｎｇ / μｌ)ꎬ１.５ μＬ 引物(０.４ μｍｏｌ / Ｌ)ꎬ０.７５ μＬ Ｍｇ２＋
(２５ ｍｍｏｌ / Ｌ)ꎬ１ μＬ １０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒꎬ０.１５ μＬ ｄＮＴＰ
(１０ ｍｍｏｌ / Ｌ)ꎬ ０. １ μＬ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶ꎬ ５ μＬ
ｄｄＨ２Ｏꎮ 扩增程序为:９４℃预变性 ５ ｍｉｎꎻ９４℃变性
３０ ｓꎻ５５℃退火 ３０ ｓꎻ７２℃延伸 ３０ ｓꎬ３５ 个循环ꎻ７２℃
延伸 ６ ｍｉｎꎻ４℃保存ꎮ 用 ６％变性聚丙烯酰胺凝胶电
泳检测 ＰＣＲ产物ꎬ银染显色ꎬ记录 ＤＮＡ带型ꎮ
　 　 在 Ｆ２代分离群体中选取 １５ 个抗病植株的
ＤＮＡ等量混合ꎬ构建抗病池(Ｒ 池)ꎻ选取 １５ 个感
病植株的 ＤＮＡ等量混合ꎬ构建感病池(Ｓ 池)ꎮ 用
筛选出的多态性标记对抗、感病池 ＤＮＡ 进行扩
增ꎬ在抗、感病池间依然有多态性ꎬ则标记很可能与
抗病基因连锁ꎮ
１.５　 数据分析
　 　 抗性频率(％)＝ (表现 Ｒ 反应的菌株数 /总菌
株数)×１００ꎮ
　 　 利用 Ｍａｐｍａｋｅｒ / ｅｘｐ ３.０ 软件[１３]对 Ｆ２分离群
体进行遗传连锁分析ꎮ 统计分析时ꎬ将与抗性亲本
东农 ４１５ 相同的带型赋值为“Ａ”ꎬ与 ＬＴＨ 相同的
带型赋值为 “Ｂ”ꎬ杂合带型赋值为 “Ｈ”ꎮ 默认
ＬＯＤ值 ３.０ꎬ最大遗传图距 ３０ ｃＭꎮ 用 Ｋｏｓａｍｂｉ 函
数将 重 组 率 转 换 成 遗 传 距 离 ( ｃｅｎｔｉｍｏｒｇａｎꎬ
ｃＭ) [１４]ꎮ 统计结果利用 ＭａｐＣｈａｒｔ 软件绘制遗传
连锁图ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 东农 ４１５对黑龙江省稻瘟病菌株的抗谱分析
　 　 ２０１１年秋在黑龙江省多个县市的水稻主产区
主栽品种上采集稻瘟病标样ꎬ共分离获得 １５８ 个单
孢菌株ꎮ 经全国统一的 ７个鉴别寄主共鉴定出 ６群
１９个生理小种ꎬＺＣ群为优势种群(数据未发表)ꎮ
　 　 利用以上 １５８ 个稻瘟病单孢菌株对东农 ４１５
进行接种鉴定(表 １)ꎮ 结果表明ꎬ东农 ４１５ 对来源
于黑龙江省 １０个不同稻区的稻瘟病菌株均具有较
高的抗性ꎬ对牡丹江市牡丹江农场采集的菌株抗性
频率最低ꎬ为 ８４.６％ꎻ对尚志市河东乡采集的菌株
抗性频率最高ꎬ为 ９５.０％ꎮ 对 １４１ 个菌株的平均抗
性频率达 ８９.２％ꎬ表明东农 ４１５对黑龙江省稻瘟病
菌株具有广谱抗性ꎮ
２.２　 东农 ４１５的抗性遗传分析
　 　 利用 ４个稻瘟病鉴别菌系研 ５４￣０４、研 ５４￣２０、
稻 ７２、研 ５３￣３３ 和在 ＺＣ 群中挑选的一个致病力
强、产孢性能好的菌株 Ｆ￣１０￣１１ 对东农 ４１５ 和 ＬＴＨ
杂交衍生的 Ｆ１和 Ｆ２群体接种ꎬ进行抗稻瘟病遗传
分析ꎮ ５ 个菌株对东农 ４１５ 均表现抗病反应ꎬ对
ＬＴＨ均表现感病反应ꎬ对 Ｆ１均表现抗病反应ꎬ表明
东农 ４１５ 对这 ５ 个菌株的抗性均是由显性基因控
制的ꎮ Ｆ２群体对研 ５４￣０４、研 ５４￣２０ 和稻 ７２ 的抗感
分离比例为 １５:１(表 ２)ꎬ表明东农 ４１５ 对菌系研
５４￣０４、研 ５４￣２０和稻 ７２ 的抗性是由两对显性基因
控制的ꎻ对研 ５３￣３３的抗感分离比为 ９:７ꎬ表明东农
４１５对菌系研 ５３￣３３的抗性是由两对互补的显性基
因控制ꎻ对 Ｆ￣１０￣１１的抗感分离比例为 ３ ∶ １ꎬ表明
东农 ４１５对 Ｆ￣１０￣１１ 的抗性是由一对显性基因控
制的ꎮ 用于构建抗病池的 １５ 株单株对菌株 Ｆ￣１０￣
１１均表现高抗(０~１级)ꎬ用于构建感病池的 １５ 株
单株对菌株 Ｆ￣１０￣１１均表现高感(８~９级)ꎮ
９６
　
植物病理学报 ４５卷
Ｔａｂｌｅ １　 Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ Ｄｏｎｇｎｏｎｇ ４１５ ｔｏ １５８ ｂｌａｓｔ ｉｓｏｌａｔｅｓ
ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ １０ ｒｉｃｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ ｐｒｏｖｉｎｃｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅｓ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ ｂｌａｓｔ ｉｓｏｌａｔｅ Ｎｏ. ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅ
Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ
/ ％
Ｔｉｅｌｉ Ｆａｒｍꎬ Ｔｉｅｌｉ ｃｉｔｙ Ｌｏｎｇｊｉｎｇ２７ １０ ９０.０
Ｑｉｘｉｎｇ Ｆａｒｍꎬ Ｆｕｊｉｎ ｃｉｔｙ
Ｋｏｎｇｙｕ１３１ １２ ９１.７
Ｌｏｎｇｊｉｎｇ ２５ １１ ９０.９
Ｌｏｎｇｊｉｎｇ ２６ １０ ９０.０
Ｐｕｙａｎｇ Ｆａｒｍꎬ Ｓｕｉｂｉｎ ｃｏｕｎｔｙ Ｋｏｎｇｙｕ１３１ １６ ８７.５
Ｍｕｄａｎｊｉａｎｇ Ｆａｒｍꎬ Ｍｕｄａｎｊｉａｎｇ ｃｉｔｙ Ｋｏｎｇｙｕ１３１ １３ ８４.６
Ｅｒｄａｏｈｅ Ｆａｒｍꎬ Ｆｕｙｕａｎ ｃｏｕｎｔｙ Ｋｏｎｇｙｕ１３１ ７ ８５.７
Ｗｕｔｏｎｇｈｅ Ｆａｒｍꎬ Ｌｕｏｂｅｉ ｃｏｕｎｔｙ Ｋｏｎｇｙｕ１３１ １３ ９２.３
Ｈａｎｃｏｎｇｇｏｕ ｓｅｅｄ ｆａｒｍꎬ Ｆｕｙｕａｎ ｃｏｕｎｔｙ Ｋｏｎｇｙｕ１３１ １８ ８８.９
Ｆａｎｇｚｈｅｎｇ ｃｏｕｎｔｙ Ｄｏｎｇｎｏｎｇ４２８ １３ ９２.３
Ｈｅｄｏｎｇ ｃｏｕｎｔｒｙꎬ Ｓｈａｎｇｚｈｉ ｃｉｔｙ Ｋｏｎｇｙｕ１３１ ２０ ９５.０
Ｑｉａｎｓｈａｏ Ｆａｒｍꎬ Ｙａｏｈｅ ｃｏｕｎｔｙ Ｋｏｎｇｙｕ１３１ １５ ９３.３
　
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ４１５ ｆｏｒ ｂｌａｓｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ
Ｉｓｏｌａｔｅ
Ｓｉｚｅ ｏｆ Ｆ１
ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ
Ｓｉｚｅ ｏｆ Ｆ２
ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ
Ｎｏ. ｏｆ ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ
Ｒ　 　 　 　 　 　 Ｓ
Ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｒａｔｉｏ χ２ Ｐ ｖａｌｕｅ
Ｙａｎ ５３￣３３ Ｒ １９０ １１２ ７８ ９:７ ０.５６１７ ０.２５￣０.５０
Ｄａｏ ７２ Ｒ １６８ １５８ １０ １５:１ ０.０２５４ ０.７５￣０.９０
Ｙａｎ ５４￣２０ Ｒ １５６ １５０ ６ １５:１ １.５３８５ ０.２５￣０.１０
Ｙａｎ ５４￣０４ Ｒ １８２ １６６ １６ １５:１ ２.００５９ ０.２５￣０.１０
Ｆ￣１０￣１１ Ｒ ２８４ ２０６ ７８ ３:１ ０.９０００ ０.２５￣０.５０
　
２.３　 东农 ４１５抗稻瘟病基因的定位
　 　 选取均匀分布在水稻 １２条染色体上的 ６００ 对
ＳＳＲ标记ꎬ对东农 ４１５和 ＬＴＨ 进行亲本间的 ＤＮＡ
多态性分析ꎬ检测到 １３０ 对标记呈现明显的多
态性ꎬ亲本多态性检出频率 ２１.７％ꎮ 在接种调查完
毕后的 Ｆ２代分离群体中ꎬ选取对菌株 Ｆ￣１０￣１１ 典型
抗病和典型感病的各 １５ 个单株的 ＤＮＡ 等量混
合ꎬ建立抗病池(Ｒ)和感病池(Ｓ)ꎮ 利用筛选出的
１３０对亲本间呈多态性的标记对抗、感池 ＤＮＡ 进
行扩增和检测ꎬ结果位于第 ２ 染色体上的 ＲＭ２１３
在亲本间和抗、感池间表现出一致的多态性ꎮ 进一
步以 ＲＭ２１３ 检测了抗病池和感病池各单株的
ＤＮＡ 多态性ꎬ结果与抗感池的多态性表现一致ꎮ
因此ꎬ确定 ＲＭ２１３ 是与抗病基因紧密连锁的分子
标记ꎮ
　 　 在初步确定东农 ４１５ 的抗稻瘟病基因所在染
色体后ꎬ根据 ｗｗｗ.ｇｒａｍｅｎｅ.ｏｒｇ网站公布的第 ２ 染
色体 ＳＳＲ 标记信息ꎬ在 ＲＭ２１３ 附近新合成了 ５０
个 ＳＳＲ标记ꎮ 选用双亲及 Ｆ２抗感池中的分离个体
进行验证ꎬ结果又筛选出两个多态性标记 ＲＭ５３００
和 ＲＭ６０３０ꎮ 利用 ＲＭ２１３、 ＲＭ５３００ 和 ＲＭ６０３０
３个标记对菌株 Ｆ￣１０￣１１ 高度感病的 ９９ 个 Ｆ２单株
进行基因型分析ꎬ结果将东农 ４１５稻瘟病抗性基因
定位在水稻第 ２ 染色体上的标记 ＲＭ５３００ 和
ＲＭ２１３之间ꎬ距离分别为 ３. ０ ｃＭ 和 ７. ６ ｃＭ(图
１)ꎬ命名为 Ｐｉ￣ｄｎ( ｔ)ꎮ
０７
　
　 １期 任月坤ꎬ等:东农 ４１５稻瘟病抗性遗传分析及基因定位
２.４　 抗病位点 Ｐｉ￣ｄｎ( ｔ)与水稻物理图谱的整合
及抗病候选基因预测
　 　 将 Ｐｉ￣ｄｎ( ｔ)的连锁分子标记映射到日本晴参
考基因组物理图谱上ꎬ发现在 ＲＭ５３００ ~ ＲＭ２１３ 区
间包含 １６２ 个编码序列ꎬ这些基因中ꎬ大多数基因
为未知功能的预测蛋白ꎮ 根据 ｗｗｗ.ｇｒａｍｅｎｅ. ｏｒｇ
上的基因功能注释和抗病基因结构域预测ꎬ推断可
能参与抗病过程的基因有 ３ 个ꎬ其中 Ｏｓ０２ｇ５６０１０
和 Ｏｓ０２ｇ５５５４０是两个相邻基因且包含 ＬＲＲ 抗病
结构域ꎻＯｓ０２ｇ５６４００编码受体类蛋白激酶(ＯｓＷＡＫ
ｒｅｃｅｐｔｏｒ￣ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ)ꎬ拟南芥 ＷＡＫ 基因在
细胞增殖和抗真菌病害方面具有重要的生物学功
能[１５]ꎮ 因此ꎬ这 ３ 个基因可作为 Ｐｉ￣ｄｎ( ｔ)的候选
基因(图 ２)ꎮ
３　 讨论
　 　 Ｋｏｎｇ[１０]研究表明ꎬ东农 ４１５ 对黑龙江省优势
最强的 ＺＥ 菌群 ＺＥ１小种呈 Ｒ 型反应ꎬ对 ＺＡ、ＺＤ
菌群 ＺＡ１、ＺＤ１小种也为 Ｒ 型反应ꎮ 同时ꎬ用 ７ 个
日本鉴别菌株对东农 ４１５进行接种鉴定ꎬ表现全抗
反应ꎮ 本研究用于东农 ４１５ 抗谱分析的稻瘟病菌
株采自黑龙江省几个水稻主产区ꎬ菌株采集遵循了
多地点原则ꎬ稻瘟病菌株分离自各稻区的主栽品种
上ꎬ如空育 １３１、龙粳 ２５、龙粳 ２６ꎬ其中空育 １３１ 种
植面积占黑龙江省水稻种植面积的 ５０％以上[１６]ꎮ
因此ꎬ本研究分离的稻瘟病菌株具有很强的代表
性ꎬ能够反映出黑龙江省田间稻瘟病的群体结构及
分布特点ꎮ 东农 ４１５ 对测试菌株的抗菌频率达到
了 ８９.２％ꎬ表明东农 ４１５对黑龙江省稻瘟病菌株具
有广谱抗性ꎬ是良好的稻瘟病粳稻抗源ꎬ对黑龙江
省抗稻瘟病育种意义重大ꎮ
　 　 经前人研究ꎬ已经有 ７个抗稻瘟病基因被定位
在水稻第 ２ 染色体上[１７]ꎬ分别是 Ｐｉｄ１、Ｐｉ１４、Ｐｉ１６、
Ｐｉｇ、Ｐｉｔｑ５、 Ｐｉｂ 和 Ｐｉ２５ꎮ Ｐｉｄ１ 与标记 ＲＭ２６２ 连
锁[１７]ꎬＰｉ１４ 和 Ｐｉ１６ 与同工酶标记 Ａｍｐ￣１ 连
锁[１８ꎬ１９]ꎬ Ｐｉｇ 被定位在标记 ＲＭ１６６￣ＲＭ２０８ 之
间[２０]ꎬＰｉ２５ 在 ＲＦＬＰ 标记 ＲＧ５２０ 附近[２１]ꎮ Ｐｉｔｑ５
源于水稻品种特青ꎬ由于特青含有 Ｐｉｂꎬ与标记
ＲＭ２０８紧密连锁[２２]ꎬ并且鉴定 Ｐｉｂ 所用的菌株与
鉴定 Ｐｉｔｑ５所用的菌株相同ꎬ因此 Ｐｉｔｑ５和 Ｐｉｂ很可
能是同一个基因[１７]ꎮ 分析 Ｐｉ￣ｄｎ( ｔ)与已定位在第
２染色体上的 ７ 个抗病基因的关系ꎬＰｉ１４ 和 Ｐｉ１６
与标记 ＲＭ５３００ 的遗传距离较远ꎬ因此排除了
Ｐｉ￣ｄｎ( ｔ)与 Ｐｉ１４ 和 Ｐｉ１６ 为同一基因的可能ꎮ
Ｐｉｄ１、Ｐｉｇ 和 Ｐｉ２５ 尚未开发出功能性标记ꎬ所以无
法判断 Ｐｉ￣ｄｎ( ｔ)与 Ｐｉｄ１、Ｐｉｇ和 Ｐｉ２５的异同ꎮ 利用
Ｆｉｇ. １　 Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｐ ｏｆ ｂｌａｓｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ
Ｐｉ￣ｄｎ( ｔ) ｉｎ Ｄｏｎｇｎｏｎｇ４１５
Ｆｉｇ. ２ 　 Ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ
ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｐ ｏｆ Ｐｉ￣ｄｎ ( ｔ) ａｎｄ ｒｅｆｅ￣
ｒｅｎｃｅ ｇｅｎｏｍｅ
１７
　
植物病理学报 ４５卷
Ｐｉｂ的功能性标记对亲本进行基因检测ꎬＰＣＲ 扩增
呈阳性ꎬ说明东农 ４１５含有抗性基因 Ｐｉｂꎬ同时利用
与 Ｐｉｂ 紧密连锁的标记 ＲＭ２０８ 对 ９９ 个极端感病
的 Ｆ２单株进行 ＤＮＡ 扩增与检测ꎬ结果 ９９ 个极端
感病群体中有 １６ 个重组体ꎬ与 Ｐｉ￣ｄｎ( ｔ)的遗传距
离为 ２０ ｃＭ(图 １)ꎬ表明 Ｐｉ￣ｄｎ( ｔ)与 Ｐｉ￣ｂ 和 Ｐｉｔｑ５
不是同一个基因ꎮ 因此ꎬＰｉ￣ｄｎ( ｔ)可能是一个新的
抗稻瘟病基因ꎮ
　 　 本研究利用在黑龙江省致病力较强的稻瘟病
菌株 Ｆ￣１０￣１１对东农 ４１５和 ＬＴＨ 杂交衍生的 Ｆ２群
体接种ꎬ将抗稻瘟病基因 Ｐｉ￣ｄｎ( ｔ)定位在 ＲＭ５３００
和 ＲＭ２１３之间 １０.６ ｃＭ 的范围内ꎬ并预测 ３ 个基
因可作为 Ｐｉ￣ｄｎ( ｔ)的候选基因ꎮ 但 Ｐｉ￣ｄｎ( ｔ)距两
侧的分子标记还有一定距离ꎬ其更加精确的位置还
有待于进一步的精细定位来确定ꎮ
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责任编辑:曾晓葳
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