全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４４(３): ２７６￣２８６(２０１４)
收稿日期: ２０１３￣０８￣０９ꎻ 修回日期: ２０１４￣０１￣１５
基金项目: 国家自然科学基金(３１０７１６６０)ꎻ９７３ 项目(２０１０ＣＢ１２６２０３ꎬ２０１２ＣＢ７２２５０４)ꎻ国际科技合作项目 (２０１２ＤＦＡ３０９００)
通讯作者: 孙丽英ꎬ博士ꎬ副研究员ꎬ主要从事植物病毒学研究ꎻ Ｔｅｌ: ０５７１￣８６４１９０２１ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｓｕｎｌｙ＿ｄｅ＠１２６.ｃｏｍ
陈剑平ꎬ博士ꎬ研究员ꎬ主要从事植物保护研究ꎻＴｅｌ: ０５７１￣８６４０４００３ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｊｐｃｈｅｎ２００１＠１２６.ｃｏｍ
第一作者: 沈江锋ꎬ男ꎬ浙江嵊州人ꎬ在读硕士研究生ꎬ主要研究方向为植物病理学ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｓｈｅｎｊｆ.０２３＠１６３.ｃｏｍꎮ
水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹叶枯病毒侵染下
水稻 ｑＲＴ￣ＰＣＲ内参基因的筛选
沈江锋１ꎬ２ꎬ 李俊敏２ꎬ 孙丽英２∗ꎬ 陈剑平２∗
( １浙江师范大学化学与生命科学学院ꎬ金华 ３２１００４ꎻ ２浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所ꎬ杭州 ３１００２１)
摘要:病毒侵染通常会干扰寄主细胞的生理代谢过程ꎬ分析病毒侵染后寄主基因的表达差异ꎬ将为病毒与寄主之间的互作
研究提供重要的分子基础ꎮ 实时荧光定量 ＰＣＲ(ｑＲＴ￣ＰＣＲ)是目前基因表达分析中应用最广泛的方法之一ꎬ选择合适的内
参基因对实验进行校正和标准化至关重要ꎮ 但是ꎬ一些常用作内参的看家基因会受到病毒侵染的影响ꎮ 本研究中ꎬ以感染
水稻黑条矮缩病毒(Ｒｉｃｅ ｂｌａｃｋ￣ｓｔｒｅａｋｅｄ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓꎬＲＢＳＤＶ)和水稻条纹叶枯病毒(Ｒｉｃｅ ｓｔｒｉｐｅ ｖｉｒｕｓꎬＲＳＶ)的水稻总 ＲＮＡ为
材料ꎬ利用 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 技术和 ３ 个统计学软件探讨了 １０ 个常用内参基因在病毒侵染下的稳定性ꎮ 结果显示ꎬ感染 ＲＢＳＤＶ
和 ＲＳＶ水稻中表达最稳定的都是 ＵＢＣ和 β￣ＴＵＢꎮ 因此ꎬ可选用 ＵＢＣ和 β￣ＴＵＢ组合作为分析 ＲＢＳＤＶ和 ＲＳＶ侵染过程的水
稻内参基因ꎮ
关键词:水稻ꎻＲＢＳＤＶꎻＲＳＶꎻｑＲＴ￣ＰＣＲꎻ内参基因
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｒｉｃｅ
ｐｌａｎｔｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｒｉｃｅ ｂｌａｃｋ￣ｓｔｒｅａｋｅｄ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ ｏｒ Ｒｉｃｅ ｓｔｒｉｐｅ ｖｉｒｕｓ 　 ＳＨＥＮ Ｊｉａｎｇ￣
ｆｅｎｇ１ꎬ２ꎬ ＬＩ Ｊｕｎ￣ｍｉｎ２ꎬ ＳＵＮ Ｌｉ￣ｙｉｎｇ２ꎬ ＣＨＥＮ Ｊｉａｎ￣ｐｉｎｇ２ 　 ( １Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｎｏｒｍａｌ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｊｉｎｈｕａ ３２１００４ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｈａｎｇ￣
ｚｈｏｕ ３１００２１ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｄｉｓｒｕｐｔｓ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｏｓｔ. Ａｔ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｌｅｖｅｌꎬ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ａ ｇｌｏｂａｌ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｈｏｓｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓꎬ ｉｎ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒꎬ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ
ｈｏｓｔ ｇｅｎｅｓ ｔｈａｔ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ ｄｅｆｅｎｓｅ ａｇａｉｎｓｔ ｐａｔｈｏｇｅｎ ａｔｔａｃｋｓ. Ｔｈｕｓꎬ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｔｈｅ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ
ｏｆ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｕｐｏｎ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｍａｙ ｐｒｏｖｉｄｅ ｄｅｔａｉｌｅｄ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ
ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｈｏｓｔ. Ｔｈｅ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ (ｑＲＴ￣ＰＣＲ) ｈａｓ ｂｅｅｎ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ
ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ. Ｆｏｒ ｔｈｅ ａｃｃｕｒａｃｙ ｏｆ ｑＲＴ￣ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓꎬ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ａｐｐｒｏｐｒｉ￣
ａｔｅ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｅｎｅｓ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ. Ｈｏｗｅｖｅｒꎬ ｓｏｍｅｔｉｍｅｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｔｈａｔ ａｒｅ ｃｏｍ￣
ｍｏｎｌｙ ｕｓｅｄ ａｓ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｉｓ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ. Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙꎬ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｒｉｃｅ ｂｌａｃｋ￣ｓｔｒｅａｋｅｄ
ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ (ＲＢＳＤＶ) ｏｒ Ｒｉｃｅ ｓｔｒｉｐｅ ｖｉｒｕｓ (ＲＳＶ) ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ １０ ｒｉｃｅ (Ｏｒｙｚａ
ｓａｔｉｖａ) ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ １８Ｓꎬ ２５Ｓꎬ ＡＣＴꎬ β￣ＴＵＢꎬ ｅＥＦ￣１αꎬ ｅＩＦ￣４ａꎬ ＧＡＰＤＨꎬ ＵＢＣꎬ ＵＢＱ￣５ ａｎｄ
ＵＢＱ￣１０ ｗｅｒｅ ａｓｓｅｓｓｅｄ ｂｙ ｑＲＴ￣ＰＣＲ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｆｕｒｔｈｅｒ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｔｈｒｅｅ ｃｏｍｍｏｎｌｙ ｕｓｅｄ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ: ｇｅＮｏｒｍꎬ
ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ ａｎｄ ＢｅｓｔＫｅｅｐｅｒ. Ｔｈｅ ｑＲＴ￣ＰＣＲ ｒｅｓｕｌｔｓꎬ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｒｅｅ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ａｎａｌｙｓｅｓꎬ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｈａｌｆ
ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｉｃｅ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ＲＢＳＤＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｈｉｌｅ ｍｏｓｔ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ
ｗｅｒｅ ｓｔａｂｌｅ ｉｎ ＲＳＶ￣ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓ. Ａｍｏｎｇ ｔｈｏｓｅ ｇｅｎｅｓꎬ ＵＢＣ ａｎｄ β￣ＴＵＢ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ
　
　 ３期 沈江锋ꎬ等:水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹叶枯病毒侵染下水稻 ｑＲＴ￣ＰＣＲ内参基因的筛选
ｍｏｓｔ ｕｎａｌｔｅｒｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｌｅｖｅｌｓ ｂｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＲＢＳＤＶ ａｎｄ ＲＳＶ. Ｔａｋｅｎ ｔｏｇｅｔｈｅｒꎬ ｏｕｒ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ
ＲＢＳＤＶ ａｎｄ ＲＳＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｙ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｔｈａｔ ｗｅｒｅ
ｃｏｍｍｏｎｌｙ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ ｑＲＴ￣ＰＣＲ. Ｔｈｕｓꎬ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｉｓ
ｃｒｕｃｉａｌ ｆｏｒ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｔｈｅ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｒｉｃｅꎻ ＲＢＳＤＶꎻ ＲＳＶꎻ ｑＲＴ￣ＲＣＲꎻ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅ
中图分类号: Ｓ４３２.４４　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０３￣０２７６￣１１
　 　 病毒侵染是影响植物生长发育的重要生物胁
迫因素ꎬ很多寄主因子参与了病毒侵染、复制以及
病症的表达ꎮ 分析病毒对相关寄主基因表达的调
控是研究病毒与寄主互作ꎬ解析病毒致病机理和寄
主抗病机制的重要基础ꎮ 实时荧光定量 ＰＣＲ( ｒｅａｌ￣
ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲꎬｑＲＴ￣ＰＣＲ)是目
前检测生物样品中基因表达差异最灵敏、便捷的方
法之一[１]ꎮ 在利用 ｑＲＴ￣ＰＣＲ进行基因表达的研究
中ꎬ为测定目的基因的表达水平ꎬ需要使用合适的
内参基因对实验样品进行校正和标准化ꎬ以降低转
录效率、ｃＤＮＡ浓度差异对实验的影响ꎮ 目前大多
数内参基因选择的是寄主的看家基因(ｈｏｕｓｅｋｅｅｐ￣
ｉｎｇ ｇｅｎｅ)ꎬ该类基因编码的蛋白质是维持细胞结
构和基本代谢所必需ꎬ并且在生物体的各类细胞及
发育阶段中的表达基本保持一致ꎬ常用的有 １８Ｓ核
糖体 ＲＮＡ基因ꎬ２５Ｓ 核糖体 ＲＮＡ 基因ꎬ甘油醛￣３￣
磷酸脱氢酶基因ꎬ肌动蛋白基因ꎬ微管蛋白基因
等[２]ꎮ 近年来的研究发现ꎬ在一些生物和非生物
因素胁迫下ꎬ某些管家基因的表达水平会发生变
化ꎬ如植物病毒在侵染寄主时会影响寄主细胞的进
程ꎬ而这些进程中大多有管家基因编码的因子参
与[３]ꎬ如肌动蛋白(β￣ａｃｔｉｎ)是细胞骨架微丝的主
要成分ꎬ在体内的表达稳定性高ꎬ常常被人们作为
内参基因ꎬ但是研究发现ꎬ在细胞的生长、分化、化
学物质的刺激和病变状态下ꎬβ￣ａｃｔｉｎ 基因的表达
会发生改变[４ꎬ ５]ꎬ并不适合作为通用的内参基因ꎮ
因此ꎬ在特定的条件下ꎬ筛选出稳定表达的内参基
因ꎬ不仅能确保 ｑＲＴ￣ＰＣＲ结果的可靠性ꎬ更能保证
后续实验的顺利进行ꎮ
　 　 近年来ꎬ气候条件、生态环境失衡等因素造成
水稻病毒病害的发生呈明显的上升趋势ꎮ 水稻黑
条矮缩病和水稻条纹病是水稻中的两个主要病害ꎬ
分别由水稻黑条矮缩病毒 ( Ｒｉｃｅ ｂｌａｃｋ ｓｔｒｅａｋｅｄ
ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓꎬＲＢＳＤＶ)和水稻条纹病毒(Ｒｉｃｅ ｓｔｒｉｐｅ
ｖｉｒｕｓꎬＲＳＶ)引起ꎬ在我国至少 ２０个省、市发生或流
行[６]ꎬ严重威胁我国的粮食生产安全ꎮ ＲＢＳＤＶ 和
ＲＳＶ 均由灰飞虱(Ｌａｏｄｅｌｐｈｇａｘ ｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓ)为主要
介体进行持久性的传播ꎬ其中 ＲＢＳＤＶ 是呼肠孤病
毒科斐济病毒属(Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ Ｆｉｊｉｖｉｒｕｓ)的成员ꎬ属
双链 ＲＮＡ病毒ꎬ其病害症状为植株浓绿矮缩ꎬ叶
片僵直ꎬ不抽穗或穗小发育不全ꎬ在水稻茎秆上延
着维管束方向有蜡白色的瘤状突起生成[７]ꎻＲＳＶ
是纤细病毒属(Ｔｅｎｕｉｖｉｒｕｓ)的单链 ＲＮＡ 病毒ꎬ受
ＲＳＶ 侵染的水稻在苗期发病ꎬ叶基出现褪绿黄白
斑ꎬ后扩展成与叶脉平行的黄绿相间条纹ꎬ分蘖数
减少ꎬ病株往往提早枯死[８]ꎮ 虽然这两个病毒于
２０世纪 ６０、７０ 年代就已被发现和鉴定ꎬ但是对于
它们的致病机理的研究仍然进展缓慢[９ꎬ １０]ꎮ 随着
分子生物学研究技术的发展ꎬ病毒与寄主之间的相
互作用、病毒侵染对寄主基因表达调控日益成为
ＲＢＳＤＶ和 ＲＳＶ 病理研究的热点ꎬｑＲＴ￣ＰＣＲ 技术
正广泛用于相关基因表达调控的研究ꎬ因此筛选出
病毒胁迫下稳定表达的内参基因ꎬ对寄主基因的差
异表达分析起着关键的作用ꎮ 为进一步研究寄主
对 ＲＢＳＤＶ 和 ＲＳＶ 侵染的分子反应ꎬ我们结合 ３
个常用的统计学软件 ｇｅＮｏｒｍꎬ ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ 和
ＢｅｓｔＫｅｅｐｅｒ[１１ꎬ １２]对 １０个常用的内参基因进行了病
毒胁迫下基因表达的稳定性评估ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 材料
　 　 水稻材料为日本晴ꎬ在浙江省农科院试验田
(浙江杭州)种植ꎮ 采集 ４０ ~ ５０ 日龄ꎬ具有明显黑
条矮缩病和条纹叶枯病症状的水稻苗ꎬ以 Ｗｅｓｔｅｒｎ￣
ｂｌｏｔ 方法检测确认带毒后供试ꎬ同期健康水稻苗作
对照ꎮ
１.２　 候选内参基因及引物设计
　 　 根据前人已经发表的常用内参基因ꎬ筛选出
１０个候选的内参基因(表１) [１３~１５] ꎬ分别为１８Ｓ、
７７２
　
植物病理学报 ４４卷
Ｔａｂｌｅ １　 Ｌｉｓｔ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒｓ
Ｇｅｎｅ ｓｙｍｂｏｌ Ｇｅｎｅ ｎａｍｅ ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ. Ｐｒｉｍｅｒ (５′￣３′)
１８Ｓ １８Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ＡＦ０６９２１８.１
Ｆ: ＣＴＡＣＧＴＣＣＣＴＧＣＣＣＴＴＴＧＴＡＣＡ
Ｒ: ＡＣＡＣＴＴＣＡＣＣＧＧＡＣＣＡＴＴＣＡＡ
２５Ｓ ２５Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ Ｍ１１５８５.１
Ｆ: ＡＡＧＧＣＣＧＡＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＧＧＴ
Ｒ: ＣＧＴＣＣＣＴＴＡＧＧＡＴＣＧＧＣＴＴＡＣ
ＡＣＴ Ａｃｔｉｎ ＡＢ０４７３１３.１
Ｆ: ＣＡＧＣＣＡＣＡＣＴＧＴＣＣＣＣＡＴＣＴＡ
Ｒ: ＡＧＣＡＡＧＧＴＣＧＡＧＡＣＧＡＡＧＧＡ
β￣ＴＵＢ β￣ｔｕｂｕｌｉｎ Ｄ３０７１６.１
Ｆ: ＧＣＴＧＡＣＣＡＣＡＣＣＴＡＧＣＴＴＴＧＧ
Ｒ: ＡＧＧＧＡＡＣＣＴＴＡＧＧＣＡＧＣＡＴＧＴ
ｅＥＦ￣１α
Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ
ｆａｃｔｏｒ １￣ａｌｐｈａ
ＧＱ８４８０７３.１
Ｆ: ＴＴＣＡＣＴＣＴＴＧＧＴＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＴ
Ｒ: ＣＴＴＣＣＴＴＣＡＣＧＡＴＴＴＣＡＴＣＧＴＡＡ
ｅＩＦ￣４ａ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４ａ ＡＢ０４６４１４.１
Ｆ: ＴＴＧＴＧＣＴＧＧＡＴＧＡＡＧＣＴＧＡＴＧ
Ｒ: ＧＧＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＡＴＣＡＴＡＧＡ
ＧＡＰＤＨ
Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ￣３￣
ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ
ＧＱ８４８０４９.１
Ｆ: ＡＧＣＣＡＧＣＡＴＣＣＴＡＴＧＡＴＣＡＧＡＴＴ
Ｒ: ＧＴＡＡＣＣＣＡＧＡＡＴＡＣＣＣＴＴＧＡＧＴＴＴ
ＵＢＣ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ￣ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ Ｅ２ ＡＫ０５９６９４
Ｆ: ＣＣＧＴＴＴＧＴＡＧＡＧＣＣＡＴＡＡＴＴＧＣＡ
Ｒ: ＡＧＧＴＴＧＣＣＴＧＡＧＴＣＡＣＡＧＴＴＡＡＧＴＧ
ＵＢＱ￣５ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ５ ＡＫ０６１９８８.１
Ｆ: ＡＣＣＡＣＴＴＣＧＡＣＣＧＣＣＡＣＴＡＣＴ
Ｒ: ＡＣＧＣＣＴＡＡＧＣＣＴＧＣＴＧＧＴＴ
ＵＢＱ￣１０ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ １０ ＡＫ１０１５４７
Ｆ: ＴＧＧＴＣＡＧＴＡＡＴＣＡＧＣＣＡＧＴＴＴＧＧ
Ｒ: ＧＣＡＣＣＡＣＡＡＡＴＡＣＴＴＧＡＣＧＡＡＣＡＧ
　
２５Ｓ、ＡＣＴ、 β￣ＴＵＢ、 ｅＥＦ￣１α、 ｅＩＦ￣４ａ、ＧＡＰＤＨ、ＵＢＣ、
ＵＢＱ￣５和 ＵＢＱ￣１０ꎬ设计的引物由上海铂尚生物技
术有限公司合成ꎮ
１.３　 总 ＲＮＡ的提取与检测
　 　 选取感染 ＲＢＳＤＶ、ＲＳＶ 及健康水稻各 ６ 株ꎬ
分别选取病叶ꎬ混合后定量为 ２ ｇꎬ参照 ＴＲＩｚｏｌ
( Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)提取 ＲＮＡ 的方法提取总 ＲＮＡ[１６]ꎬ重
复以上实验ꎬ将获得的总 ＲＮＡ 混合均匀ꎬ经 １.２％
琼脂糖凝胶电泳检测总 ＲＮＡ 的完整性ꎬ超微量紫
外分光光度计(Ｔｈｅｒｍｏ)检测 ＲＮＡ 的浓度、纯度ꎬ
置于￣８０℃冰箱保存ꎮ
１.４　 ｃＤＮＡ合成与 ＰＣＲ反应条件优化
　 　 参照 ＦａｓｔＱｕａｎｔ ＲＴ Ｋｉｔ(ＴＩＡＮＧＥＮ)试剂盒说
明书ꎬ对总 ＲＮＡ进行去 ＤＮＡ 处理后ꎬ用特异性反
向引物合成 ｃＤＮＡ第一链ꎬ４２℃孵育 １５ ｍｉｎꎬ９５℃
孵育 ３ ｍｉｎ后置于冰上ꎬ得到的 ｃＤＮＡ ４℃保存ꎬ用
于后续实验ꎮ 以合成的 ｃＤＮＡ 为模板ꎬ加入特异
性引物进行 ＰＣＲ反应ꎮ 扩增产物用 １ ％琼脂糖凝
胶电泳检测ꎬ优化反应条件ꎮ
１.５　 ｑＲＴ￣ＰＣＲ分析
　 　 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 反应在 ＣＦＸ９６ＴＭ Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ
(Ｂｉｏ￣Ｒａｄ)仪器中进行ꎮ 反应体系包括 ｉＴａｑ ＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ(Ｂｉｏ￣Ｒａｄ)５ μＬꎬ上下游引物各 ０.５
μＬ(５ ｍＭ)ꎬｃＤＮＡ ２ μＬ(约 ２０ ｎｇ)ꎬ用 ＭＱ 水补
足 １０ μＬꎮ 反应程序为:９４℃预变性 ３ ｍｉｎꎻ９４℃变
性 ２０ ｓꎬ６０℃退火 ２０ ｓꎬ７２℃延伸 １５ ｓꎬ３９ 个循环ꎻ
６５℃ ~ ９５℃生成熔解曲线ꎮ ｑＲＴ￣ＰＣＲ 生成的数据
由 Ｂｉｏ￣Ｒａｄ ＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒ 软件读取并导出ꎬ用于后
续实验分析ꎮ
１.６　 基因扩增效率及稳定性分析
　 　 实时荧光定量 ＰＣＲ 仪获得的荧光值通过
Ｅｘｃｅｌ表格形式输入到 ＬｉｎＲｅｇ ＰＣＲ 软件( ｈｔｔｐ: / /
８７２
　
　 ３期 沈江锋ꎬ等:水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹叶枯病毒侵染下水稻 ｑＲＴ￣ＰＣＲ内参基因的筛选
ＬｉｎＲｅｇＰＣＲ.ｎｌ / )进行分析ꎬ计算 ＰＣＲ 扩增效率和
相关系数(Ｒ２ )ꎮ 根据 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 仪读取的 Ｃｔ 值
( ｃｙｃｌｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ)ꎬ用 ｇｅＮｏｒｍ、 Ｂｅｓｔｋｅｅｐｅｒ、 Ｎｏｒｍ￣
ｆｉｎｄｅｒ软件对各个候选基因在水稻感病样品中的
表达稳定性进行统计学分析ꎬ从而筛选出合适的内
参基因ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 总 ＲＮＡ质量检测
　 　 琼脂糖凝胶电泳显示ꎬ各 ＲＮＡ 样品的 ２８Ｓ
ｒＲＮＡ和 １８Ｓ ｒＲＮＡ 条带清晰ꎬ且 ２８Ｓ ｒＲＮＡ 条带
宽度和亮度大于 １８Ｓ ｒＲＮＡꎬ无明显降解现象(图
１Ａ)ꎮ 根据紫外分光光度计检测结果ꎬ各样品
Ａ２６０ / Ａ２８０比值均在 ２.０ 左右ꎬ总 ＲＮＡ 提取的完
整性较好、纯度高ꎬ可以满足后续实验要求ꎮ
２.２　 ＰＣＲ反应条件的优化
　 　 以各 ＲＮＡ转录成的 ｃＤＮＡ 第一链为模板ꎬ通
过普通 ＰＣＲ 反应选择合适的反应条件ꎮ 优化后
ＰＣＲ 产物经琼脂糖凝胶电泳检测ꎬ各内参基因
ＰＣＲ片段大小跟预期一致且条带单一(图 １Ｂ)ꎬ说
明各内参基因引物均能特异扩增相应的片段ꎬ适合
进一步 ｑＲＴ￣ＰＣＲ分析ꎮ
２.３　 ｑＲＴ￣ＰＣＲ分析
　 　 根据 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 仪显示ꎬ１０ 个候选内参基因的
熔解曲线呈单峰状态(图 ２)ꎬ说明引物特异性好ꎮ
从 ＰＣＲ 仪中导出的荧光值数据输入到 ＬｉｎＲｅｇ
ＰＣＲ软件进行分析ꎬ计算单个 ＰＣＲ 反应的扩增效
率(ＥＲ)和线性相关系数 Ｒ２值ꎮ ＥＲ的默认初始值
为 ２ꎬＰＣＲ反应的扩增效率越接近 ２ꎬＲ２越接近 １ꎬ
说明扩增效率越好[１７]ꎮ 结果显示(表 ２)ꎬ各内参
基因的 Ｒ２≥０.９９９ꎬＰＣＲ 扩增效率接近 ２.０ꎬ符合
ｑＲＴ￣ＰＣＲ对扩增效率的要求ꎮ
２.４　 内参基因的表达稳定性分析
　 　 为进一步分析这些内参基因在不同水稻样品
中表达的稳定性ꎬ我们采用了 ３个常用的统计分析
软件 ｇｅＮｏｒｍꎬＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ 和 ＢｅｓｔＫｅｅｐｅｒ 分别进行
稳定性分析ꎮ
２.４.１　 ｇｅＮｏｒｍ 分析　 ｇｅＮｏｒｍ 软件是目前人们在
筛选内参基因中使用最广泛的的软件之一ꎬ通过评
定多个内参基因的稳定性(Ｍ值)及合适的内参基
Ｆｉｇ. １　 Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
Ａ: Ｔｏｔａｌ ＲＮＡｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｖｉｒｕｓ ｆｒｅｅ(ＶＦ)ꎬ ＲＳＶ￣ｏｒ ＲＢＳＤＶ￣ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓꎻ
Ｂ: ＲＴ￣ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｒｏｍ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ.
９７２
　
植物病理学报 ４４卷
Ｆｉｇ. ２　 Ｍｅｌｔ ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ １０ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｍｅａｎ Ｃｔ ｖａｌｕｅｓ ａｎｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ
Ｇｅｎｅ
ｓｙｍｂｏｌ
ＶＦａ ＲＳＶｂ ＲＢＳＤＶｃ
Ｍｅａｎ(Ｃｔ) ｄ ＳＤ(±Ｃｔ) ｅ Ｍｅａｎ(Ｃｔ) ｄ ＳＤ(±Ｃｔ) ｅ Ｍｅａｎ(Ｃｔ) ｄ ＳＤ(±Ｃｔ) ｅ
ＰＣＲ
ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ
Ｒ２
１８Ｓ ５.２７ ０.０９７ ５.７４ ０.０７２ ５.８１ ０.０８５ １.５１ ０.９９９
２５Ｓ ６.９４ ０.０５３ ６.８２ ０.１２７ ７.０９ ０.０６５ １.６０ ０.９９９
ＡＣＴ ２３.１５ ０.００６ ２４.１１ ０.０８７ ２０.８７ ０.０６６ １.９６ ０.９９９
β￣ＴＵＢ ２５.３３ ０.０８８ ２５.２５ ０.０５０ ２５.１７ ０.０６２ ２.００ ０.９９９
ｅＥＦ￣１α ２０.９８ ０.２９６ ２０.７２ ０.０８２ １７.７０ ０.０４６ ２.０１ ０.９９９
ｅＩＦ￣４ａ ２２.０５ ０.０９６ ２２.６５ ０.１００ １９.７０ ０.０８５ １.９９ １.０００
ＧＡＰＤＨ ２０.１１ ０.１２９ ２１.１３ ０.０７３ １９.３３ ０.０６６ ２.０３ ０.９９９
ＵＢＣ ２２.５３ ０.４３３ ２２.５５ ０.１０６ ２２.４３ ０.０７０ １.９５ ０.９９９
ＵＢＱ￣５ ２３.２１ ０.０６４ ２２.７１ ０.１４２ ２０.８５ ０.３１８ ２.０１ ０.９９９
ＵＢＱ￣１０ １８.６４ ０.００６ １９.８５ ０.０２８ １８.９７ ０.０８８ １.９８ ０.９９９
ａ:Ｖｉｒｕｓ ｆｒｅｅ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓꎻ ｂ: ＲＳＶ￣ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓꎻ ｃ: ＲＢＳＤＶ￣ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓꎻ ｄ: Ａｒｉｔｈｍｅｔｉｃ ｍｅａｎ ｏｆ Ｃｔ ｖａｌｕｅꎻ ｅ: Ｓｔａｎ￣
ｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｔ ｖａｌｕｅ.
因配对数(Ｖｎ / ｎ＋１)ꎬ给 ｑＲＴ￣ＰＣＲ反应提供内参基
因选择上的参考ꎮ 该软件基于标准差以 Ｍ值作为
评价参数ꎬＭ值默认为 ０.５ꎬ若某个内参基因的 Ｍ
值小于 ０.５ꎬ可以考虑将其作为内参基因ꎮ 从定量
ＰＣＲ仪获得各内参基因的 Ｃｔ 值ꎬ经 ２( ￣ΔＣｔ )换算后
输入到 ｇｅＮｏｒｍ 软件进行分析ꎮ 软件分析结果显
示ꎬ１０个候选内参基因在感 ＲＢＳＤＶ水稻样品中的
表达稳定性为 ＵＢＣ ＝ β￣ＴＵＢ>２５Ｓ>ＵＢＱ￣１０>１８Ｓ>
ＧＡＰＤＨ>ＡＣＴ>ｅＩＦ￣４ａ>ＵＢＱ￣５>ｅＥＦ￣１α(图 ３Ａ)ꎬ其
中 ＵＢＣ和 β￣ＴＵＢ 的 Ｍ 值为 ０.００５ꎬ表达最稳定ꎻ
２５ＳꎬＵＢＱ￣１０ꎬ１８ＳꎬＧＡＰＤＨ 的 Ｍ 值都小于 ０.５ꎬ也
可以作为内参基因的选择对象ꎮ 在感 ＲＳＶ的水稻
样品中ꎬ１０个候选内参基因的表达稳定性为 ＵＢＣ
＝２５Ｓ>β￣ＴＵＢ>ｅＥＦ￣１α>ＵＢＱ￣５>１８Ｓ>ｅＩＦ￣４ａ>ＡＣＴ>
ＧＡＰＤＨ>ＵＢＱ￣１０(图 ３Ｂ)ꎮ 除 ＵＢＱ￣Ｖ１０ 外ꎬ其余
基因的 Ｍ 值都小于 ０. ５ꎬ都适合作为内参基因ꎮ
Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅ等[１８]取 Ｍ<０.７ 作为取舍标准ꎬ根据
此标准ꎬ这 １０ 个候选基因都适合作为内参基因ꎮ
其中 ＵＢＣ和 ２５Ｓ的 Ｍ 值为 ０.０１３ꎬβ￣ＴＵＢ 的 Ｍ 值
为 ０.０２９ꎬ在 ＲＳＶ侵染后的水稻中表达更稳定ꎮ
０８２
　
　 ３期 沈江锋ꎬ等:水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹叶枯病毒侵染下水稻 ｑＲＴ￣ＰＣＲ内参基因的筛选
Ｆｉｇ. ３　 Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ａｓｓｅｓｓｅｄ ｂｙ ｇｅＮｏｒｍ ａｎａｌｙｓｉｓ
Ａ: Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ＲＢＳＤＶ￣ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓꎻ
Ｂ: Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ＲＳＶ￣ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓꎻ
Ｃ: Ｔｈｅ ｐａｉｒｗｉｓｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｗｏ ｖｉｒｕｓ￣ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓ.
１８２
　
植物病理学报 ４４卷
　 　 ｇｅＮｏｒｍ软件通过分析多个内参基因的组合差
异值 Ｖｎ / ｎ＋１ꎬ能够确定某特定条件下 ｑＲＴ￣ＰＣＲ所
需内参基因的最优数目ꎬＶｎ / ｎ＋１ 默认值为 ０.１５ꎮ
由图 ３Ｃ 可知ꎬＶ２ / ３ＲＢＳＤＶ ＝ ０.０７７<０.１５ꎬＶ２ / ３ＲＳＶ ＝
０.０１２<０.１５ꎬ说明 ＲＢＳＤＶ和 ＲＳＶ侵染的水稻样品
都没有必要引入第 ３ 个内参基因来消除差异ꎮ 因
此ꎬ在对 ＲＢＳＤＶ 和 ＲＳＶ 侵染样品的 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 分
析中ꎬ根据 Ｍ值以及最适合的基因配对数ꎬ最佳的
组合分别为为 β￣ＴＵＢ / ＵＢＣ和 ２５Ｓ / ＵＢＣꎮ
２.４. ２ 　 Ｎｏｒｍｆｉｎｄｅｒ 分析 　 跟 ｇＮｏｒｍ 软件一样ꎬ
ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ也通过 Ｍ值的大小对候选的内参基因
进行筛选ꎬＭ值越小ꎬ基因表达越稳定ꎻＭ 值越大ꎬ
越不稳定ꎮ 由图 ４Ａ 可见ꎬ感染 ＲＢＳＤＶ 样品的 Ｍ
值由大到小的排列为 ｅＥＦ￣１α>１８Ｓ>ＵＢＱ￣５>ｅＩＦ￣４ａ
>２５Ｓ>ＡＣＴ>ＵＢＱ￣１０>β￣ＴＵＢ>ＵＢＣ>ＧＡＰＤＨꎬ其中
ＧＡＰＤＨ的Ｍ值最小ꎬ为表达最稳定的基因ꎬ其次为
ＵＢＣ和 β￣ＴＵＢꎮ 在感染 ＲＳＶ的样品中(图 ４Ｂ)ꎬＭ
值由大到小的排列为 ＵＢＱ￣１０ >ｅＥＦ￣１α >ＵＢＱ￣５>
ＧＡＰＤＨ>ＡＣＴ>ＵＢＣ>２５Ｓ>１８Ｓ>β￣ＴＵＢ>ｅＩＦ￣４ａꎬ其中
表达最稳定的是 ｅＩＦ￣４ａꎬ其次为 β￣ＴＵＢꎮ
２.４.３　 Ｂｓｅｔｋｅｅｐｅｒ 分析　 Ｂｓｅｔｋｅｅｐｅｒ 软件是通过比
较标准差(ＳＤ)、变异系数(ＣＶ)来分析各候选基因
的稳定性的ꎬＳＤ 值越小ꎬＣＶ 值越小ꎬ基因的稳定
性越好ꎮ 当候选内参基因的 ＳＤ 值大于默认值 １
时ꎬ说明稳定性不好ꎮ 如表 ３ꎬＲＢＳＤＶ 样品中ꎬ
ＡＣＴ、ｅＩＦ￣４ａ、ＵＢＱ￣５和 ｅＥＦ￣１α 的 ＳＤ值都大于 １ꎬ
Ｆｉｇ. ４　 Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ａｓｓｅｓｓｅｄ ｂｙ ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ
Ａ: Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ＲＢＳＤＶ￣ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓꎻ
Ｂ: Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ＲＳＶ￣ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓ.
２８２
　
　 ３期 沈江锋ꎬ等:水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹叶枯病毒侵染下水稻 ｑＲＴ￣ＰＣＲ内参基因的筛选
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ １０ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｂｙ ＢｅｓｔＫｅｅｐｅｒ
Ｇｅｎｅ
Ｓｙｍｂｏｌ
ＲＢＳＤＶ ＲＳＶ
ｎａ ＳＤ [± Ｃｔ] ＣＶ [％ Ｃｔ] ｂ ｎａ ＳＤ [± Ｃｔ] ＣＶ [％ Ｃｔ] ｂ
１８Ｓ １２ ０.３０６ ５.３５２ １２ ０.３１３ ５.４７４
２５Ｓ １２ ０.１０７ １.５１５ １２ ０.１１８ １.６９１
ＡＣＴ １２ １.１００ ４.９７３ １２ ０.５０１ ２.１１１
β￣ＴＵＢ １２ ０.０９６ ０.３７９ １２ ０.１２６ ０.４９５
ｅＩＦ￣４ａ １２ １.２０６ ５.７６６ １２ ０.３０５ １.３５８
ＧＡＰＤＨ １２ ０.３２ １.６１０ １２ ０.５３５ ２.５８５
ＵＢＱ￣５ １２ １.２２８ ５.５３９ １２ ０.２４４ １.０５２
ＵＢＱ￣１０ １２ ０.１３１ ０.６９３ １２ ０.６７３ ３.４５９
ｅＥＦ￣１α １２ １.５９２ ８.１６４ １２ ０.２３８ １.１４３
ＵＢＣ １２ ０.１９８ ０.８７７ １２ ０.１９３ ０.８５１
　 ａ: Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｓａｍｐｌｅｓꎻ　 ｂ: Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｔ ｖａｌｕｅ.
Ｔａｂｌｅ ４　 Ｒａｎｋｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅｉｒ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｖａｌｕｅ
ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ｇｅＮｏｒｍꎬ ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ ａｎｄ ＢｅｓｔＫｅｅｐｅｒ ａｎａｌｙｓｅｓ ｉｎ ＲＢＳＤＶ￣ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓ
Ｇｅｎｅ Ｓｙｍｂｏｌ
ｇｅＮｏｒｍ ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ ＢｅｓｔＫｅｅｐｅｒ
Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｖａｌｕｅ Ｒａｎｋｉｎｇ ｏｒｄｅｒ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｖａｌｕｅ Ｒａｎｋｉｎｇ ｏｒｄｅｒ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｖａｌｕｅ Ｒａｎｋｉｎｇ ｏｒｄｅｒ
β￣ＴＵＢ ０.００５ １ ０.４０５ ３ ０.０９６ １
ＵＢＣ ０.００５ １ ０.３５７ ２ ０.１９８ ４
２５Ｓ ０.１５６ ３ ０.６１１ ６ ０.１０７ ２
ＵＢＱ￣１０ ０.１７０ ４ ０.５５６ ４ ０.１３１ ３
１８Ｓ ０.２７０ ５ ０.８９１ ９ ０.３０６ ５
ＧＡＰＤＨ ０.３５２ ６ ０.２２１ １ ０.３２０ ６
ＡＣＴ ０.６９９ ７ ０.５６３ ５ １.１００ ７
ｅＩＦ￣４ａ ０.８９８ ８ ０.７６８ ７ １.２０６ ８
ＵＢＱ￣５ ０.９９６ ９ ０.８１６ ８ １.２２８ ９
ｅＥＦ￣１α １.１３７ １０ １.１２０ １０ １.５９２ １０
在筛选过程中应当舍去ꎬ剩下的基因根据 ＳＤ 和
ＣＶ的比较ꎬ稳定性排序为 β￣ＴＵＢ>２５Ｓ>ＵＢＣ>１８Ｓ
>ＵＢＱ￣１０>ＧＡＰＤＨꎻ在 ＲＳＶ 样品中ꎬＳＤ 值都小于
１ꎬ稳定性排序为 ２５Ｓ>β￣ＴＵＢ>ＵＢＣ>ｅＥＦ￣１α>ＵＢＱ￣
５>ｅＩＦ￣４ａ>１８Ｓ>ＡＣＴ>ＧＡＰＤＨ>ＵＢＱ￣１０ꎮ
　 　 ｇｅＮｏｒｍ、ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ 和 ＢｅｓｔＫｅｅｐｅｒ 这 ３ 个主
流的测评软件对 １０个候选的内参基因进行稳定性
评价结果显示(表 ４ꎬ表 ５)ꎬｇｅＮｏｒｍ 和 ＢｅｓｔＫｅｅｐｅｒ
的评价结果比较一致ꎬＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ 的结果跟其它
两个软件的结果有部分差别ꎮ 在 ＲＢＳＤＶ 侵染下
(表 ４)ꎬｇｅＮｏｒｍ和 ＢｅｓｔＫｅｅｐｅｒ的评价结果中ꎬ稳定
性排前四的 ４个内参都是 β￣ＴＵＢꎬＵＢＣꎬ２５ＳꎬＵＢＱ￣
１０ꎬ而在 ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ 的结果中ꎬ２５Ｓ 稳定性排在第
６ꎬ排第 １ 的是 ＧＡＰＤＨꎮ 同样地ꎬ在 ＲＳＶ 侵染下
(表 ５)ꎬＮｏｒｍＦｉｄｅｒ 的评价结果跟另外两个结果不
太一致ꎮ 在 ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ 中稳定性最高的 ｅＩＦ￣４ａꎬ
在 ｇｅＮｏｒｍ 和 ＢｅｓｔＫｅｅｐｅｒ 中分别排在第 ７ 和第 ６
位ꎬ而 ｇｅＮｏｒｍ和 ＢｅｓｔＫｅｅｐｅｒ中排名第 ４的 ｅＥＦ￣１α
３８２
　
植物病理学报 ４４卷
Ｔａｂｌｅ ５　 Ｒａｎｋｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅｉｒ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｖａｌｕｅ
ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ｇｅＮｏｒｍꎬ ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ ａｎｄ ＢｅｓｔＫｅｅｐｅｒ ａｎａｌｙｓｅｓ ｉｎ ＲＳＶ￣ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓ
Ｇｅｎｅ ｓｙｍｂｏｌ
ｇｅＮｏｒｍ ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ ＢｅｓｔＫｅｅｐｅｒ
Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｖａｌｕｅ Ｒａｎｋｉｎｇ ｏｒｄｅｒ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｖａｌｕｅ Ｒａｎｋｉｎｇ ｏｒｄｅｒ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｖａｌｕｅ Ｒａｎｋｉｎｇ ｏｒｄｅｒ
２５Ｓ ０.０１３ １ ０.２４６ ５ ０.１１８ １
ＵＢＣ ０.０１３ １ ０.１３５ ４ ０.１９３ ３
β￣ＴＵＢ ０.０２９ ３ ０.０９５ ２ ０.１２６ ２
ｅＥＦ￣１α ０.１６５ ４ ０.５４８ ９ ０.２３８ ４
ＵＢＱ￣５ ０.１９５ ５ ０.４３４ ８ ０.２４４ ５
１８Ｓ ０.３１７ ６ ０.１３３ ３ ０.３１３ ７
ｅＩＦ￣４ａ ０.３６１ ７ ０.０３０ １ ０.３０５ ６
ＡＣＴ ０.４４１ ８ ０.３２６ ６ ０.５０１ ８
ＧＡＰＤＨ ０.４８６ ９ ０.３６９ ７ ０.５３５ ９
ＵＢＱ￣１０ ０.５４２ １０ ０.５７９ １０ ０.６７３ １０
在 ＮｏｒｍＦｉｄｅｒ中排在了第 ９ 位ꎮ 虽然 ３ 个软件的
评价结果有差异ꎬ但是在舍去变化较大的数值后ꎬ
大部分候选内参基因的稳定性较一致ꎮ ｇｅＮｏｒｍ软
件对内参基因的配对数分析结果表明ꎬＲＢＳＤＶ 和
ＲＳＶ 侵染条件下ꎬ都只需两个内参基因就能很好
的满足实验条件的校正ꎮ 因此ꎬ在 ＲＢＳＤＶ 侵染的
水稻样品中ꎬＵＢＣ 和 β￣ＴＵＢ 这两个基因的稳定性
较高ꎬ适合作为内参基因ꎻ在 ＲＳＶ侵染条件下ꎬ２５Ｓ
和 ＵＢＣ这两个基因的稳定性也很高ꎬ然而 ２５Ｓ 和
１８Ｓ的 Ｃｔ值过小ꎬ两基因的表达丰度远高于其他
基因ꎬ导致 ＰＣＲ反应中背景过高ꎬ不适合作为内参
基因ꎮ 因此ꎬ在 ＲＳＶ 侵染条件下ꎬＵＢＣ 和 β￣ＴＵＢ
是最适合的内参基因组合ꎮ
３　 讨论
　 　 在水稻研究领域ꎬ关于筛选稳定的内参基因的
研究已经有了大量的报道ꎬ一些传统的看家基因如
１８Ｓ ｒＲＮＡꎬ２５Ｓ ｒＲＮＡꎬＡＣＴꎬＧＡＰＤＨ等ꎬ在各阶段各
组织的表达水平稳定可靠ꎬ成为了内参基因的首
选[１９]ꎮ 随着研究材料和研究手段的多样化ꎬ这些
看似稳定的内参基因在一些特殊条件(如病原物
的入侵)下ꎬ表达水平发生了改变ꎮ Ｊｅｓｓｉｃａ 等[２０]在
研究植物病原细菌 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ.
ｔｏｍａｔｏ ＤＣ３０００对拟南芥细胞骨架的影响中发现ꎬ
受 ＤＣ３０００病原菌的侵染ꎬ拟南芥幼苗细胞内的肌
动蛋白丝( ａｃｔｉｎ ｆｉｌａｍｅｎｔ)的密度增大ꎬ导致 ａｃｔｉｎ
的积累水平升高ꎮ Ｔｉｌｓｎｅｒ 等[２１]的研究显示ꎬ马铃
薯病毒(Ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ ＸꎬＰＶＸ)的 ＴＧＢ１ 基因能够利
用寄主细胞的 ａｃｔｉｎ、内质网 ( ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕ￣
ｌｕｍ) 和高尔基体 ( ｇｏｌｇｉ )ꎬ 病毒包涵体结构
“Ｘ￣ｂｏｄｙ”ꎬ从而影响寄主细胞的 ＡＣＴ表达ꎮ 因此ꎬ
我们不能随意选择这些看家基因作为内参ꎮ 然而ꎬ
在水稻研究中ꎬ病毒胁迫下的内参基因筛选工作鲜
有报道ꎮ ２０１１ 年ꎬＭａｒｏｎｉｃｈｅ 等[１２]对 ＲＢＳＤＶ 和
ＲＳＶ的传播介体灰飞虱的内参基因选择进行了报
道ꎬ选择材料为感染了里奥夸尔托病毒(Ｍａｌ ｄｅ
Ｒｉｏ Ｃｕａｒｔｏ ｖｉｒｕｓꎬＭＲＣＶ)的灰飞虱ꎬ而非感 ＲＢＳ￣
ＤＶ和 ＲＳＶ的植株ꎮ ２０１３ 年ꎬ中国农业大学的研
究人员[２２]选择了多种受病毒侵染的单子叶植物为
材料ꎬ对各条件下的内参基因的稳定性进行了评
价ꎬ同样地ꎬ他们选择的受 ＲＢＳＤＶ 侵染的材料为
玉米ꎬ而非水稻ꎮ 因此ꎬ本研究以 ＲＢＳＤＶ 和 ＲＳＶ
侵染的水稻为材料ꎬ选择水稻研究中常用的看家基
因作为候选的内参基因ꎬ既是对前人研究工作内容
的一个延伸ꎬ也填补了 ＲＢＳＤＶ 和 ＲＳＶ 与水稻互
作研究中内参基因筛选的空白ꎮ
　 　 标准曲线法是人们根据 Ｂｕｓｔｉｎ[２３]提出的 ｑＲＴ￣
ＰＣＲ最低标准指南(ＭＩＱＥ指南)计算 ｑＲＴ￣ＰＣＲ扩
增效率最常用的方法之一ꎬ需要对每个基因的模板
进行至少 ５个浓度梯度的稀释ꎮ 在该计算方法中ꎬ
人为假定了 ＰＣＲ 反应在指数扩增期相等ꎬ却忽略
了模板制备过程中盐、酚、氯仿等有毒物质对酶活
４８２
　
　 ３期 沈江锋ꎬ等:水稻黑条矮缩病毒和水稻条纹叶枯病毒侵染下水稻 ｑＲＴ￣ＰＣＲ内参基因的筛选
性的影响ꎬ随着模板稀释倍数增大ꎬ有毒物质也被
相应的稀释ꎬ这就造成了梯度稀释的样品本身的扩
增效率不一致ꎬ使得标准曲线法获得的结果跟真实
值存在差异[１７]ꎮ 因此ꎬ国外的一些学者只是把标
准曲线作为确定模板的起始浓度的一个工具ꎬ更多
的是选择一些计算机软件来获得扩增效率[２４]ꎮ 本
研究中选择了常用的 ＬｉｎＲｅｇＰＣＲ 软件来计算
ｑＲＴ￣ＰＣＲ的扩增效率ꎬ该软件是利用每个 ＰＣＲ 反
应获得的真实扩增曲线来获得我们需要的荧光值ꎬ
再经过软件分析计算即可获得每个基因的扩增效
率和 Ｒ２ꎬ不仅省时省力ꎬ而且获得的结果可信度更
高ꎮ
　 　 １８Ｓ ｒＲＮＡ 和 ２５Ｓ ｒＲＮＡ 是水稻中使用最多的
两个内参基因ꎬ根据 ｑＰＣＲ获得的 Ｃｔ 值显示ꎬ这两
个基因在水稻中的表达丰度远远高于其他基因的
ｍＲＮＡ水平ꎬ在 ｑＰＣＲ 数据分析时很难去除基准
线ꎬ从而导致扩增效率计算值过低ꎮ 因此ꎬ根据文
中 ３个软件的评价中ꎬ虽然 ２５Ｓ ｒＲＮＡ 的稳定性较
好ꎬ但是不适合作为感 ＲＢＳＤＶ 和 ＲＳＶ 水稻的内
参基因ꎮ 此外ꎬ根据 ３个软件对候选内参基因的评
价结果ꎬ相同的水稻品种在不同的病毒侵染条件
下ꎬ１０个候选内参基因也显示出不同的稳定性ꎮ
在感 ＲＢＳＤＶ的水稻中ꎬ评价稳定性的 Ｍ 值和 ＳＤ
值大于默认值的基因有一半以上ꎻ而在 ＲＳＶ 的材
料中ꎬ这些内参基因的稳定性基本在默认值以下ꎮ
由此表明ꎬ在 ＲＢＳＤＶ 侵染下ꎬ这些看家基因在水
稻中更容易受到病毒的影响ꎬ必须要对这些看家基
因进行稳定性分析ꎬ以选择合适的内参基因ꎻ而
ＲＳＶ 对这些看家基因的稳定性表达影响不是很
大ꎬ大多可以作为 ｑＰＣＲ中的内参基因ꎮ 结合各软
件的评价结果ꎬ在 ＲＢＳＤＶ 条件下ꎬＵＢＣ 和 β￣ＴＵＢ
适合作为内参基因ꎻ在 ＲＳＶ条件下ꎬ各候选的内参
基因基本适合作为内参基因ꎬ但是 ＵＢＣ 和 β￣ＴＵＢ
表达稳定性更好ꎬ更适合作为内参基因ꎮ 因此ꎬ
ＵＢＣ和 β￣ＴＵＢ适合作为 ＲＢＳＤＶ和 ＲＳＶ侵染下水
稻的通用内参基因ꎮ
参考文献
[１] 　 Ｂｕｓｔｉｎ Ｓ Ａ. Ａｂｓｏｌｕｔｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡ ｕｓｉｎｇ ｒｅ￣
ａｌ￣ｔｉｍｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ
ａｓｓａｙｓ [ Ｊ ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙꎬ
２０００ꎬ ２５(２): １６９￣１９３.
[２] 　 Ｒａｄｏｎｉｃ Ａꎬ Ｔｈｕｌｋｅ Ｓꎬ Ｍａｃｋａｙ Ｉ Ｍꎬ ｅｔ ａｌ. Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ
ｔｏ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ
ＰＣＲ [Ｊ] . Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍ￣
ｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓꎬ ２００４ꎬ ３１３(４): ８５６￣８６２.
[３] 　 Ｎｉｃｏｔ Ｎꎬ Ｈａｕｓｍａｎ Ｊꎬ Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｌꎬ ｅｔ ａｌ. Ｈｏｕｓｅｋｅｅｐ￣
ｉｎｇ ｇｅｎｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＲＴ￣ＰＣＲ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ
ｉｎ ｐｏｔａｔｏ ｄｕｒｉｎｇ ｂｉｏｔｉｃ ａｎｄ ａｂｉｏｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓ [ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙꎬ ２００５ꎬ ５６(４２１): ２９０７￣２９１４.
[４] 　 Ｓｅｌｖｅｙ Ｓꎬ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｅ Ｗꎬ Ｍａｔｔｈａｅｉ Ｋꎬ ｅｔ ａｌ. β￣Ａｃ￣
ｔｉｎ￣ａｎ ｕｎｓｕｉｔａｂｌｅ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｆｏｒ ＲＴ￣ＰＣＲ [Ｊ] . Ｍｏ￣
ｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓꎬ ２００１ꎬ １５(５): ３０７￣３１１.
[５] 　 Ｒｕａｎ Ｗꎬ Ｌａｉ Ｍ. Ａｃｔｉｎꎬ ａ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｉｎｔｅｒｎａｌ
ｃｏｎｔｒｏｌ? [ Ｊ] . Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａꎬ ２００７ꎬ ３８５(１):
１￣５.
[６] 　 Ｓｕｎ Ｘ Ｔꎬ Ｃｕｉ Ｒ Ｑꎬ Ｈｅ Ｈ Ｈꎬ ｅｔ ａｌ. Ｑｕｉｃｋ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
ＳＲＢＳＤＶ ａｎｄ ＲＢＳＤＶ ｂｙ ｄｕｐｌｅｘ ＲＴ￣ＰＣＲ [ Ｊ] . Ａｃｔａ
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓ Ｊｉａｎｇｘｉｅｎｓｉｓ(江西农业大学
学报)ꎬ ２０１２(０５): ９１４￣９１７.
[７] 　 Ｃｈｅｎ Ｓ ＹꎬＨｏｎｇ ＪꎬＬＵ Ｙ Ｐꎬｅｔ ａｌ. Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎ
ｂｅｔｗｅｅｎ ＲＢＳＤＶ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｓｔａｇｅｓ ｉｎ ｍａｉｚｅ ｖｅｉｎ ｃｅｌｌ ａｎｄ
ａｃｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｌａｏｄｅｌｐｈａｘ ｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓ ｆａｌｌｅｎ
[ Ｊ] . Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ(中国病毒学)ꎬ ２００４(０２): ５８￣
６２.
[８] 　 Ｚｈｕ Ｙ Ｆꎬ Ｈａｙａｋａｗａ Ｔꎬ Ｔｏｒｉｙａｍａ Ｓ. Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏ￣
ｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＲＮＡ ４ ｏｆ Ｒｉｃｅ ｓｔｒｉｐｅ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅ Ｔꎬ
ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ａｎｏｔｈｅｒ ｉｓｏｌａｔｅ ａｎｄ ｗｉｔｈ Ｍａｉｚｅ
ｓｔｒｉｐｅ ｖｉｒｕｓ [ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙꎬ １９９２ꎬ
７３(５): １３０９￣１３１２.
[９] 　 Ｋａｋｕｔａｎｉ Ｔꎬ Ｈａｙａｎｏ Ｙꎬ Ｈａｙａｓｈｉ Ｔꎬ ｅｔ ａｌ. Ａｍｂｉｓｅｎｓｅ
ｓｅｇｍｅｎｔ ４ ｏｆ Ｒｉｃｅ ｓｔｒｉｐｅ ｖｉｒｕｓ: ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ
ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｗｉｔｈ ｐｈｌｅｂｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｕｕｋｕｖｉｒｕｓｅｓ (Ｂｕｎ￣
ｙａｖｉｒｉｄａｅ) [ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙꎬ １９９０ꎬ
７１(７): １４２７￣１４３２.
[１０] Ｚｈａｎｇ Ｈꎬ Ｃｈｅｎ Ｊꎬ Ｌｅｉ Ｊꎬ ｅｔ ａｌ. Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ
ｓｈｏｗｓ ｔｈａｔ ａ ｄｗａｒｆｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｎ ｒｉｃｅꎬ ｗｈｅａｔ ａｎｄ ｍａｉｚｅ
ｉｎ Ｃｈｉｎａ ｉｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｒｉｃｅ ｂｌａｃｋ￣ｓｔｒｅａｋｅｄ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ
[Ｊ] . Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ２００１ꎬ １０７
(５): ５６３￣５６７.
[１１] Ｌｉｕ Ｄꎬ Ｓｈｉ Ｌꎬ Ｈａｎ Ｃꎬ ｅｔ ａｌ. Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｖｉｒｕｓ￣ｉｎｆｅｃｔｅｄ
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ ｕｓｉｎｇ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ
ＰＣＲ [Ｊ] . ＰｌｏＳ Ｏｎｅꎬ ２０１２ꎬ ７(９): ｅ４６４５１.
５８２
　
植物病理学报 ４４卷
[１２] Ｍａｒｏｎｉｃｈｅ Ｇ Ａꎬ Ｓａｇａｄíｎ Ｍꎬ Ｍｏｎｇｅｌｌｉ Ｖ Ｃꎬ ｅｔ ａｌ.
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ
ｕｓｉｎｇ ＲＴ￣ｑＰＣＲ ｉｎ ｖｉｒｕｓ￣ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒｓ [ Ｊ ] .
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌꎬ ２０１１ꎬ ８(１): ３０８.
[１３] Ｊａｉｎ Ｍꎬ Ｎｉｊｈａｗａｎ Ａꎬ Ｔｙａｇｉ Ａ Ｋꎬ ｅｔ ａｌ. Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ
ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ａｓ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ
ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｒｉｃｅ ｂｙ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ
[Ｊ] . Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉ￣
ｃａｔｉｏｎｓꎬ ２００６ꎬ ３４５(２): ６４６￣６５１.
[１４] Ｋｉｍ Ｂꎬ Ｎａｍ Ｈꎬ Ｋｉｍ Ｓꎬ ｅｔ ａｌ. Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ￣ＰＣＲ ｗｉｔｈ ｈｏｕｓｅｋｅｅｐ￣
ｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｒｉｃｅ [Ｊ] . Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓꎬ ２００３ꎬ ２５
(２１): １８６９￣１８７２.
[１５] Ｌｉ Ｑꎬ Ｓｕｎ Ｓ Ｓꎬ Ｙｕａｎ Ｄꎬ ｅｔ ａｌ. Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｄｉｄａｔｅ
ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｃｃｕｒａｔｅ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅａｌ￣
ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ￣ＰＣＲ ｄａｔａ ｉｎ ｒｉｃｅ ｄｕｒｉｎｇ ｓｅｅｄ ｄｅ￣
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ [ Ｊ ] . Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｅｒꎬ
２０１０ꎬ ２８(１): ４９￣５７.
[１６] Ｓｉｎｇｈ Ｇꎬ Ｋｕｍａｒ Ｓꎬ Ｓｉｎｇｈ Ｐ. Ａ ｑｕｉｃｋ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｉｓｏ￣
ｌａｔｅ ＲＮＡ ｆｒｏｍ ｗｈｅａｔ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ￣ｒｉｃｈ ｓｅｅｄｓ
[ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｅｒꎬ ２００３ꎬ ２１(１):
９３.
[１７] Ｒａｍａｋｅｒｓ Ｃꎬ Ｒｕｉｊｔｅｒ Ｊ Ｍꎬ Ｄｅｐｒｅｚ Ｒ Ｈꎬ ｅｔ ａｌ.
Ａｓｓｕｍｐｔｉｏｎ￣ｆｒｅｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｐｏｌｙ￣
ｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ (ＰＣＲ) ｄａｔａ [ Ｊ] . Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ
Ｌｅｔｔｅｒｓꎬ ２００３ꎬ ３３９(１): ６２￣６６.
[１８] Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅ Ｊꎬ Ｄｅ Ｐｒｅｔｅｒ Ｋꎬ Ｐａｔｔｙｎ Ｆꎬ ｅｔ ａｌ. Ａｃｃｕ￣
ｒａｔｅ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ￣ＰＣＲ ｄａ￣
ｔａ ｂｙ ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ａｖｅｒａｇｉｎｇ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ
ｇｅｎｅｓ [Ｊ] . Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００２ꎬ ３(７): Ｈ３４.
[１９] Ｂｒｕｎｎｅｒ Ａꎬ Ｙａｋｏｖｌｅｖ Ｉꎬ Ｓｔｒａｕｓｓ Ｓ. Ｖａｌｉｄａｔｉｎｇ ｉｎｔｅｒｎａｌ
ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ
[Ｊ] . ＢＭＣ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００４ꎬ ４(１): １４.
[２０] Ｊｅｓｓｉｃａ Ｌꎬ Ｓｈｉｍｏｎｏ Ｍꎬ Ｌｉ Ｊꎬ ｅｔ ａｌ. Ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ａｃｔｉｎ
ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ ｒｅｓｐｏｎｄｓ ｔｏ ｓｉｇｎａｌｓ ｆｒｏｍ ｍｉｃｒｏｂｅ￣ａｓｓｏｃｉａ￣
ｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｔｅｒｎｓ [ Ｊ] . ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓꎬ ２０１３ꎬ ９
(４): ｅ１００３２９０.
[２１] Ｔｉｌｓｎｅｒ Ｊꎬ Ｌｉｎｎｉｋ Ｏꎬ Ｗｒｉｇｈｔ Ｋ Ｍꎬ ｅｔ ａｌ. Ｔｈｅ ＴＧＢ１
ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｘ ｒｅｏｒｇａｎｉｚｅｓ ａｃｔｉｎ
ａｎｄ ｅｎｄｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｘ￣ｂｏｄｙꎬ ａ ｖｉｒａｌ ｒｅｐｌｉｃａ￣
ｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｙ [ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ ２０１２ꎬ １５８ ( ３):
１３５９￣１３７０.
[２２] Ｚｈａｎｇ Ｋꎬ Ｎｉｕ Ｓꎬ Ｄｉ Ｄꎬ ｅｔ ａｌ. Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｖｉｒｕｓ￣ｉｎｆｅｃｔｅｄ
ｍｏｎｏｃｏｔｓ ｕｓｉｎｇ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ [ Ｊ ] .
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ ２０１３ꎬ １６８(１): ７￣１４.
[２３] Ｂｕｓｔｉｎ Ｓ Ａꎬ Ｂｅｎｅｓ Ｖꎬ Ｇａｒｓｏｎ Ｊ Ａꎬ ｅｔ ａｌ. Ｔｈｅ ＭＩＱＥ
ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ: ｍｉｎｉｍｕｍ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ [ Ｊ] . Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ ２００９ꎬ ５５(４): ６１１￣６２２.
[２４] Ｋａｒｌｅｎ Ｙꎬ Ｍｃｎａｉｒ Ａꎬ Ｐｅｒｓｅｇｕｅｒｓ Ｓꎬ ｅｔ ａｌ. Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ [ Ｊ] . ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒ￣
ｍａｔｉｃｓꎬ ２００７ꎬ ８: １３１.
责任编辑:李晖
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