全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 43(2): 201-204(2013)
收稿日期: 2012-06-26; 修回日期: 2012-11-30
基金项目: 国家自然科学基金(31071651); 现代农业产业技术体系建设专项(nycytx-03); 高等学校学科创新引智计划(B07049)
通讯作者: 康振生,主要从事小麦与条锈菌互做研究; Tel: 029-87080061, E-mail: kangzs@nwsuaf. edu. cn。
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■研究简报
MircoRNA156 家族在小麦非生物胁迫中的表达分析
王 冰, 宋 娜, 孙燕飞, 冯 浩, 王晓杰, 康振生∗
(西北农林科技大学植物保护学院 旱区作物逆境生物学国家重点实验室, 杨凌 712100)
Expression analysis of wheat mircoRNA156 family in response to abiotic stress
WANG Bing, SONG Na, SUN Yan-fei, FENG Hao, WANG Xiao-jie, KANG Zhen-sheng　 (College of Plant
Protection; State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Area , Northwest A&F University, Yangling 712100, China)
Abstract: The objective of this study was to identify the roles of miR156 family in different abiotic surround-
ings in wheat ( Triticum aestivum L), reveal the cross-talk of members of miR156 family in abiotic regulatory
networks and better understand the mechanisms responsible for abiotic stress tolerance. Five members of
miR156 family were found in wheat through Solexa high-throughput sequencing. The Northern blot results
showed that the expressions of miR156a and miR156d∗ were up-regulated in UV-B stress, but the expression
pattern of miR156c∗ and miR156b∗ were significantly down-induced after 24 hours with cold and UV-B treat-
ment. Furthermore, the qRT-PCR analyses showed the expressions of miR156 family were different after trea-
ted by every abiotic stress. These results indicated that some members of miR156 family may play different
roles in response to abiotic stress.
Key words: wheat; abiotic; miR156 family; Northern blot; qRT-PCR
文章编号: 0412-0914(2013)02-0201-04
　 　 MircoRNA(miRNA)作为一类 20 碱基左右的
非编码 RNA,它在转录水平调控基因的表达,在植
物抗逆境胁迫的调节网络中发挥了重要作用。 通
过对小麦 miRNAs的研究,可以扩展小麦抵抗自然
灾害的途径,减少损失。 有报道表明 miR156 作为
保守的 miRNA在多种植物中参与到抗逆反应[1],
Xin等[2]发现不同小麦品种的 miR156 在不同时间
点分别受到白粉菌和热胁迫的诱导, 尽管对
miR156 家族个别成员的研究已经有了相关报道,
但对小麦 miR156 的整个家族的报道较少,对它们
在小麦受到非生物胁迫网络中发挥的作用还不清
楚。 本研究拟明确小麦中 miR156 家族成员,并选
取机械伤害、冷害和对植物损害较大的 UV-B三种
处理方法,探索 miR156 家族成员在不同的非生物
胁迫中的作用。
1　 材料与方法
1. 1　 材料
小麦“水源 11”由西北农林科技大学旱区作物
逆境生物学国家重点实验室提供。 将小麦种子在
温室培养(75%湿度,26 / 20℃昼夜温度,光照强度
为 3 000 lx),10 d后对幼苗分别进行 4℃和伤口处
理,并于处理后 0、2、6、12、24 h 取样,其中伤处理
时在叶片中间用刀片划 4 至 5 cm 的伤口;UV-B
处理时用实验紫外灯(Philips TL30W / 01,峰值 310
~ 315 nm)照射幼苗,照射时采用醋酯纤维素膜滤
去 290 nm以下的紫外线,于照射后 0、2、6、12、24 h
取样,将采集处理过的样品迅速放入液氮中冷冻,
　
植物病理学报 43 卷
并移入 -80℃中储存,用于总 RNA 提取。 每种处
理进行 3 次生物学重复。 其中一部分 0 h 和 24 h
的 3 种处理样品用于 Northern blot的检测,其余样
品用于 qRT-PCR使用。
1. 2　 方法
1. 2. 1　 测序数据分析　 通过本实验室前期对小麦
(Triticum aestivum)水源 11 苗期进行 Solexa 高通
量测序,得到候选的 miRNA,对候选的 miRNA 和
miRBase18( http: / / www. mirbase. org / )中其他物
种的保守 miRNA 进行前体和成熟体的多序列比
对,筛选出 miR156 家族的候选成员,同时根据所
得到的序列查找测序的 Reads 来分析其在小麦中
的表达量,并对比家族成员间的表达差异。
1. 2. 2　 Northern blot 分析 　 对 miRNA 成熟体反
向互补设计探针。 总 RNA采用 TRIZOL(美国 In-
vitrogen公司)的方法提取,并用 1. 5%琼脂糖凝胶
电泳检测 RNA的完整性,用紫外分光光度计测定
其浓度。 取从叶片中分离的 60 μg 总 RNA,在
15%Urea-PAGE变性胶分离 2. 5 h,电转 30 min到
Hybond-N + 尼龙膜上,进行紫外交联,用 γ-32P-
ATP标记 DNA探针,杂交 12 h,洗膜(2 × SSC 和
1% SDS)3 次,每次 20 min,压膜 24 h,然后在磷酸
成像仪(FLA-7000 FUJIFILM)上扫屏。 取得的放
射信号采用 Image Quant软件分析。
1. 2. 3　 qRT-PCR分析　 将分离的总 RNA 进行反
转录反应,取 3 μg RNA 用于反转录 ( Prime-
ScriptTM RT reagent Kit, 大连 TaKaRa 有限公司)
在 60℃反应。 qRT-PCR 采用 U6 作为内参基因。
其扩增条件如下:95℃ 3min;95℃ 10 s,60℃ 10 s,
72℃ 30 s;35 个循环。 定量引物 miR156a 正向 5′-
CGCGATGACAGAAGAGAGTG-3′,miR156b∗正向
5′-TGGCGCCATGGTTAATAGTATAG-3′, miR156c∗
正向 5′-GTGCACCCTCTCTCTGTCAGC-3′,miR156d∗
正向 5′-TTGACGCTCACTCCTCTTT-CTG-3′。 反向采
用通用引物5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。
2　 结果
2. 1　 小麦中miR156 家族成员
通过 Solexa高通量测序发现候选 miRNAs,分
别与小麦、拟南芥、大麦、玉米、杨树、蓖麻等进行比
对,发现了 5 个miR156 候选成员,其中 3 个分别命
名为 miR156b∗、miR156c∗和 miR156d∗。 通过比
对发现 miR156b∗存在于大麦的 miR156 前体上,
miR156c∗和 miR156d∗与玉米 miR156d∗高度相
似。 将以上 5 个miRNA序列分别与拟南芥、大麦、
玉米、杨树、蓖麻等进行保守性比对发现,miR156a
在以上植物中均存在,而 miR156k 仅仅存在于小
麦中。 同时测序结果表明,除 miR156k 表达量极
低外,其他 4 个 miRNAs表达量较高(表 1)。
2. 2　 Northern blot 分析 miR156 家族在 3 种胁
迫下的表达变化
为了鉴定受不同非生物胁迫诱导的小麦
miR156 家族单个成员表达量变化,对 5 个 miR156
家族成员进行了 Northern blot 分析,结果显示:在
小麦受到 3 种胁迫处理 24 h 后,除 miR156k 因在
小麦中表达量过低,难以用 Northern blot 分析外,
其他 4 个 miR156 家族成员在受到非生物胁迫时
均呈现不同的表达变化(图 1)。 在冷诱导时,除
miR156a变化不明显外,其他 3 个成员的表达显著
下调;在 UV-B胁迫后,miR156a和 miR156d∗均呈
上调表达,而 miR156b∗和 miR156c∗的表达却明
显受到抑制;在伤害胁迫时,miR156a和 miR156d∗
显著下调,miR156b∗和 miR156c∗的表达变化却并
Table 1　 Analysis of five members of miR156 family in wheat
miRNA Sequence / 5′-3′ Length / nt Conserved in other plants Reads
miR156a UGACAGAAGAGAGUGAGCACA 21 High level 2 530
miR156b∗ UAAGAGCAUGGUUAAUAGUAUAG 23 Medium level 1 210
miR156c∗ GCUCACCCUCUCUCUGUCAGC 21 Medium level 798
miR156d∗ GCUCACUCCUCUUUCUGUCAGC 22 Medium level 1 321
miR156k UUGACAGAAGAGAGUGAGCA 20 Low level 39
202
　
　 2 期 　 　 王 冰,等:MircoRNA156 家族在小麦非生物胁迫中的表达分析
不明显。
Fig. 1　 Analysis of the expressions of miR156
family in wheat response to three abi-
otic stresses by Northern blot
U6 served as the control.
2. 3　 qRT-PCR验证
为了进一步具体分析 miR156 成员在受到单
一胁迫后的表达趋势变化情况,我们对受胁迫诱导
的小麦 miR156 家族成员进行了 qRT-PCR 分析。
结果如图 2,冷诱导时,miR156d∗表现出明显下调
趋势, miR156a的表达显著上升,而其他 2 个成员
的表达则受轻微调控,但差异不显著;在受 UV-B
胁迫后,miR156a和 miR156d∗均显著上调表达,而
miR156b∗和 miR156c∗的表达却明显受抑;在伤害
处理后 miR156c∗和 miR156d∗的表达显著下调,
而其他 2 个成员表达变化不明显。
3　 讨论
鉴定 miRNAs家族成员及解析其在胁迫环境
中的作用,对揭示复杂的 miRNAs调控网络具有重
要意义。 目前,在 miRBase 数据库中报道了 44 个
小麦 miRNA家族,其中 20 多个 miRNA 家族在不
同植物中非常保守,因此,它们在植物的各种生理
活动中可能承担重要作用。 为了分析这些保守
miRNA家族在不同胁迫条件下的作用,本研究基
于 Yao 等[3]对小麦保守 miRNAs 的研究,在本实
验室已经构建的小麦水源 11miRNAs数据库中,挑
选了 miR156 家族,利用 Northern blot 进行横向分
析,单个 miR156 家族成员受到 3 种胁迫后的的诱
导和 qRT-PCR纵向分析,即受单一胁迫后家族成
员的整体表达趋势变化情况,结果表明,miR156 家
族不同成员参与了复杂的非生物胁迫调控网络,并
在其中发挥了重要作用。
Fig. 2　 Analysis of the expressions of miR156 family in wheat
response to three abiotic stresses by qRT-PCR
A: Under the wound treatment; B: Under the cold treatment; C: Under the UV-B treatment.
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　 　 前期的研究已证明 miR156 在拟南芥中受到
冷诱导,根据其前体结构预测其可能也受到 UV-B
的诱导[4],本研究中,miR156b∗受 UV-B处理后显
著下调表达,受冷诱导调控并不明显。 但 miR156a
成员受冷胁迫后表达明显上调,miR156d∗成员表
达则强烈受到抑制。 结果表明在不同的植物中参
与冷胁迫的 miR156 成员有所不同。
　 　 在单一胁迫中,同一 miRNA 家族的不同成员
可能发挥相似作用,但也可能扮演不同角色。 本研
究中,四个家族成员在受到 UV-B 处理后,均受到
不同程度的调控,表明 miR156 家族成员均参与了
UV-B的 miRNA 调控途径,它们虽同属于 miR156
家族,但可能因其靶标不同,功能上存在差异,导致
在调节网络中的作用不同。
研究发现,miR156d∗成员在 3 种胁迫中均受
调控表达,表明该成员在 miRNAs非生物胁迫调控
网络中 miR156d∗成员承担更为广泛和重要的角
色。 并且 miR156d∗成员在冷和伤诱导中可能具
有相似的调控作用,但与在 UV-B胁迫中的作用不
同。 而 miR156b∗ 仅受 UV-B 调控表达,表明
miR156b∗在 UV-B 胁迫的 miRNA 网络调控作用
较大,但是否仅参与 UV-B胁迫调控仍需进一步分
析证明。
另外,寻找靶标及验证其功能是研究 miRNA
调节网络的重要组成部分,报道表明在拟南芥中已
发现 miR156 家族成员的调控的目标基因家族是
SBP-like 转录因子家族, 包括 SPL2、 SPL3 和
SPL10 等,主要是调控花器官分化和开花时间,对
植物生理生长十分重要[5]。 Xin 等[2]发现在小麦
中发现了 2 个 miR156a 的预测靶标,但是二者具
体关系在小麦中还未具体明确。 miR156 家族成员
在多种胁迫中发挥作用,其调控的靶标更多。 因
此,今后我们将通过研究鉴定 miR156 家族成员的
靶标基因,并分析其功能,以解析 miR156 家族成
员在非生物胁迫调控网络中的作用。
参考文献
[1] 　 Sunkar R, Chinnusamy V, Zhu J, et al. Small RNAs
as big players in plant abiotic stress responses and nu-
trient deprivation[ J] . Trends Plant Sci. , 2007, 12:
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[2] 　 Xin M, Wang Y, Yao Y, et al. Diverse set of mi-
croRNAs are responsive to powdery mildew infection
and heat stress in wheat (Triticum aestivum L. ) [J] .
BMC Plant Biol. , 2010, 10: 123.
[3] 　 Yao Y, Guo G G, Ni Z F, et al. Cloning and charac-
terization of microRNAs from wheat (Triticum aesti-
vum L. ) [J] . Genome Biology, 2007, 8(6): 96.
[4] 　 Phillips J R, Dalmay T, Bartels D. The role of small
RNAs in abiotic stress[J] . FEBS Letters, 2007, 581:
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[5] 　 Schwab R, Palatnik J F, Riester M. Specific effects of
microRNAs on the plant transcriptome[J], Dev. Cell,
2005, (8): 517 -527.
责任编辑:曾晓葳
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