全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 3期，2007年 6月 417
莱茵衣藻Nfr-4突变株中类胡萝卜素含量的变化及其对藻生长的影响
徐田枚 1，张洪涛 1，吾甫尔 ·米吉提 1,*，艾山江 ·阿不都拉 1，ЧунаевАС2
1 新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830046；2 Кафедра генетики и селекции,Сан
кт -Петербурский Унивесцтет, Санкт -Петербург 199034, Россия
提要：文章对相同条件下培养的莱茵衣藻野生型 CC-137和八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase，PDS)基因突变株
Nfr-4的生长进行分析；并用反相高效液相色谱分析总有色类胡萝卜素以及叶绿素含量变化，结果表明两者生长的差异明
显；Nfr-4突变株的单细胞叶绿素和总有色类胡萝卜素含量高于野生型CC-137的。
关键词：莱茵衣藻；Nfr-4突变株；类胡萝卜素
Change in Carotenoid Contents of Chlamydomonas reinhardtii Mutant Strain
Nfr-4 and Its Effect on Alge Growth
XU Tian-Mei1, ZHANG Hong-Tao1, Ghopur MIJIT1,*, Hasanjan ABUDULA1, CHUNAEV AS 2
1Collage of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China; 2Department of Genetics and Breeding, Saint
Petersburg State University University, Saint Petersburg 199034, Russia
Abstract: The differences of the growth curves and total contents of coloured carotenoid and chlorophyll
between Chlamydomonas reinhardtii wild-type CC-137 and mutant strain Nfr-4 were analyzed respectively.
The changes in contents of carotenoid and chlorophyll were detected by revese phyase-HLPC. It was demon-
strated that the total amount of chlorophyll and total coloured carotenoid were higher in mutant Nfr-4 than those
in wild-type CC-137 under identical growth conditions, and the growth curves of the two strains were evidently
different.
Key words: Chlamydomonas reinhardtii; mutant strain Nfr-4; carotenoid
收稿 2006-11-15 修定 2007-05-23
资助 国家自然科学基金(3 04 7 0 91 7 )。
* 通讯作者(E-mail：gmijit2001@yahoo.com.cn；Tel：
09 91 -85 83 06 3)。
莱茵衣藻为单细胞真核生物，隶属于绿藻门
等鞭毛纲团藻目衣藻属(Chlamydornonas)。衣藻
结构简单，培养条件简单且标准，生长周期短，
生长迅速，光合效率高，因而具有“绿色酵母”
之称。其光合色素和光合器官的结构与高等植物
非常相似，以之得到的研究结果可以直接用于解
释高等植物光合作用机制。因此，它已成为光合
遗传研究中的模式生物。
类胡萝卜素是植物、藻类、真菌和细菌合成
的四萜类化合物(四十碳类异戊二烯)的前体。类
胡萝卜素在保护光合生物免受光氧化损伤中起作
用。类胡萝卜素生物合成途径的研究已经比较深
入，其中各种酶的基因也基本上得到克隆。高等
植物番茄(Pecker 等 1992)、拟南芥(Wetzel和
Rodermel 1998)、大豆(Bartley等 1991)和烟草
(Fester等2002)及低等植物蓝藻(Chamovitz等1993)
的八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase，
PDS)基因已经克隆。但至今尚未见有关PDS基因
发生突变的莱茵衣藻突变株的报道(McCarthy等
2004)。
Nfr-4是对达草灭(norflurazon)有抗性的莱茵
衣藻突变株，与其它突变株不同的是在该突变株
中不积累 PDS的底物八氢番茄红素(phytoene) (吾
甫尔 ·米吉提等 2003a)。对达草灭具有抗性的 7个
莱茵衣藻突变株(Nfr-1~Nfr-7)进行遗传学分析的结
果表明，其抗性性质均由核基因发生突变导致
的，且为隐型突变。生化遗传性质分析显示，除
Nfr-4突变株外，其余 6个抗性突变株积累八氢番
茄红素(吾甫尔 ·米吉提等 2003b)。生化遗传分析
也表明Nfr-4突变株为PDS基因突变株(吾甫尔 ·米
吉提等 2003a)，且为启动子突变(待发表资料)。
McCarthy等(2004)的报道中说没有找到莱茵衣藻
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PDS基因突变的突变株，他们推测莱茵衣藻 PDS
基因突变可能是致死突变，迄今为止也未见到其
它有关莱茵衣藻 PDS基因突变株的报道。本文对
莱茵衣藻野生型CC-137和Nfr-4突变株中各种类胡
萝卜素、总有色类胡萝卜素以及叶绿素含量的变化
差异作了对比实验。
材料与方法
莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)野生型
CC-137 由圣彼得堡国立大学分子生物所提供，
Nfr-4突变株为我们课题组获得的达草灭抗性突变
株 。
培养莱茵衣藻的 TAP培养基、L2min基本培
养基、L2min N-培养基的配制和培养均按照Harris
(1989)书中的方法。
将 2个品系 CC-137和Nfr-4以相同的接种量
(约 5×106个细胞)接种到液体TAP培养基中，光照
条件(光照度为 100 µmol·m-2·s-1)下置于室温 18~22
℃的摇床上培养(120 r·min-1)。从接种当天开始，
每天于15:00~16:00之间对两品系的生物量进行血
球板细胞计数。连续计数 10 d，重复 3 次。
在固体 TAP培养基中活化品系 3~5 d后，用
液体 TAP在试管内稀释少量藻体。将试管内的悬
浮液用移液管移到含有40~50 mL液体TAP培养基
的三角瓶中，置于摇床中光照培养 3~4 d，如用
L2min基本培养基培养则需要 4~5 d。用血球板细
胞计数求得处于对数生长期的细胞浓度，并从两
品系的培养液中各取约 5×106个细胞；以 3 580×g
离心收集细胞，用 95%的二甲基甲酰胺将细胞悬
浮，并置于暗处 5 min；以 5 370×g离心 5 min，
取上清液；用分光光度计分析上清液中叶绿素和
总有色类胡萝卜素的含量。按计算公式：总有色
类胡萝卜素含量(µg·mL-1)=[OD461-(0.046×OD664)]和
叶绿素含量(µg·mL-1)=OD664×11.92 计算(Chamovitz 等
1993)。
用反相高效液相色谱仪分析叶绿素和各种类
胡萝卜素。实验方法和色谱条件按照文献
(McCarthy 等 2004)的方法进行，各色谱峰的鉴别
分别根据保留时间以及各吸收峰的特征吸收光谱进
行鉴定。
实验结果
1 莱茵衣藻的生长进程
图 1表明，野生型CC-137在第 6天达到最高
细胞浓度 7.35×106个 ·mL-1，此后细胞开始衰老，
细胞浓度降低。而此时Nfr-4突变株的细胞浓度高
达 10.22×106个 ·mL-1，且细胞浓度继续升高，最
高细胞浓度 12.35×106个 ·mL-1出现在第 8天，此
后细胞浓度持续下降。
2 莱茵衣藻的叶绿素和总有色类胡萝卜素总量的
变化
相同的细胞浓度下，Nfr-4突变株比野生型
CC-137的颜色明显更绿一些，这显示野生型 CC-
137与Nfr-4突变株的叶绿素和类胡萝卜素含量可
能存在差异。色素含量的检测结果(图 2)表明，相
对于野生型 CC-137而言，Nfr-4突变株的叶绿素
和总有色类胡萝卜的含量都更高。野生型的叶绿
素与总有色类胡萝卜素的比值为 1.514；而突变株
图 1 莱茵衣藻野生型CC-137和Nfr-4突变株的生长进程
Fig.1 The growth curves of C. reinhardtii wild-type
CC-137 and mutant Nfr-4
图 2 莱茵衣藻野生型CC-137与Nfr-4突变株中叶绿素和
总有色类胡萝卜素含量的比较
Fig.2 Comparison of total coloured carotenoid and total
chlorophyll in C. reinhardtii wild-type
CC-137 and mutant Nfr-4
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的叶绿素与总有色类胡萝卜素的比值为 1.536，两
者差异不大。
3 莱茵衣藻中叶绿素和各种类胡萝卜素含量的变化
为了证实色素定性的正确性，我们对各色素
的特征吸收光谱与文献中发表的吸收光谱(Rodrigo
等 2004)进行对比分析(表 1)。
Nfr-4突变株的新黄质(neoxanthin)、叶黄素
(lutein)和玉米黄质(zeaxanthin)的含量显著高于野生
表 1 莱茵衣藻中各种类胡萝卜素和叶绿素的鉴定
Table 1 Identification of various carotenoid and chlorophyll in C. reinhardtii
实测的吸收峰值 /nm 文献中的吸收峰值 /nm (Rodrigo等 2004)
色素 保留时间 /min
吸收峰Ⅰ 吸收峰 Ⅱ 吸收峰Ⅲ 吸收峰Ⅰ 吸收峰Ⅱ 吸收峰Ⅲ
新黄质 414 436 466 7.3 412 434 464
紫黄质 418 441 471 8.0 418 440 470
花药黄质 421 444 470 9.2
叶黄素 424 448 476 10.4 422 446 474
玉米黄质 424 452 477 11.6 424 452 478
β-胡萝卜素 427 453 478 18.6 427 454 478
叶绿素 a 15.6
叶绿素 b 14.6
型CC-137的，分别高出56.25%、80.24%和183.33%；
Nfr-4突变株中的叶绿素 a和叶绿素 b也明显提高
20.36%和 60.59%；而紫黄质(violaxanthin)在Nfr-
4突变株中含量只比野生型 CC-137提高 6.42%。
所测定的8种色素中只有Nfr-4突变株中的花药黄
质(antheraxanthin)和 β-胡萝卜素的含量比野生型
CC-137的低，分别降低 4.03%和 52.28%。
叶绿素和各种类胡萝卜素在两品系中所占的
比例也有变化。新黄质在野生型 CC-137 中占
11.03%，在 Nfr-4突变株中的比例为 13.67%；
叶黄素、玉米黄质和叶绿素 b 的比例在野生型
CC-137中分别为 8.95%、0.84%和 13.50%，在
Nfr-4突变株中分别升高到占总含量的 12.79%、
1.89%和 17.18%。野生型 CC-137中紫黄质、花
药黄质和叶绿素 a的比例均比 Nfr-4突变株中的
高，变化最显著的是β-类胡萝卜素，野生型CC-
137占总量的 16.20%，而 Nfr-4突变株中只占
6 . 1 3 %。
讨　　论
有关莱茵衣藻叶绿素和类胡萝卜素生物合成
的结构基因研究的报告已很多，但莱茵衣藻类胡
萝卜素生物合成过程中的关键酶基因——PDS基
因的表达调控及其突变对类胡萝卜素生物合成途径
造成的影响的研究尚未见报道(McCarthy等2004)。
我们的实验初步证明，莱茵衣藻Nfr-4突变
株为 PDS的启动子突变株(待发表资料)，此种突
变造成 PDS表达水平的升高，因而对该突变株的
类胡萝卜素生物合成造成影响，以致叶绿素和类
胡萝卜素的含量明显有变化，其中变化最为显著
的是各种叶黄素的含量。
从本文结果可知，在Nfr-4突变株中叶绿素
a和叶绿素 b的含量都明显升高，并且其叶黄素循
环库(紫黄质+花药黄质+玉米黄质)的含量也明显
升高，但相对于野生型 CC-137而言，(紫黄质 +
花药黄质 +玉米黄质)/叶绿素 a和叶黄素 /叶绿素
a的比值却有所下降，这可能是Nfr-4突变株中叶
绿素 a含量升高的幅度比紫黄质+花药黄质+玉米
黄质和叶黄素的大造成的(表 2)。而在相同条件下
新黄质 /叶绿素 a 的比值却升高，其原因可能是
PDS的启动子突变造成 PDS表达水平升高，从而
引起细胞中的 PDS含量增加所致。因为 PDS是多
种类胡萝卜素生物合成的限速酶之一，其含量的
增加会促进其生物合成速率。新黄质和隐黄质分
别是类胡萝卜素生物合成途径中α-胡萝卜素分支
与 β-胡萝卜素分支上的 2个最终叶黄素产物，叶
黄素与叶黄素循环中的3种叶黄素都为类胡萝卜素
生物合成途径的中间产物，它们作为上游底物的
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积累程度不及终产物的积累水平高。
Nfr-4突变株的叶绿素和总有色类胡萝卜素含
量都明显高于野生型，大约分别为野生型的 1.53
倍和 1.54倍。但两者的叶绿素与总有色类胡萝卜
素的比值几乎没有什么变化，这可能是叶黄素和
叶绿素是按一定的比例结合到光系统 I (PS I)的捕
光复合体 I (LHC I)和光系统 II (PS II)的捕光复合
体 II (LHC II)中的缘故。一般认为，组装主要
LHC II大约需要 7个叶绿素 a、6个叶绿素 b、2
个叶黄素和 1个新叶黄质(Hobe等 2000)。相对于
主要 LHC II言，次要 LHC II上结合的叶绿素较
少，叶绿素 a/叶绿素 b的比值较高并且富含紫黄
质。一般认为，所有的 LHC蛋白都至少含有 3个
类胡萝卜素结合位点，这些结合位点偏向于与叶
黄素、紫黄质和新黄质结合(Croce等 1999)。叶
黄素除了与叶绿素紧密相连，是辅助捕光色素以
外，还能保护 LHC免受光氧化损伤，因而使突
变株中的 LHC量增多，表现出相同细胞浓度的
Nfr-4突变株颜色比野生型 CC-137深。同时在相
同的培养条件下两品系的生长明显不同，Nfr-4突
变株生长时间长，细胞浓度高；而野生型生长期
较短，细胞浓度相对较低。这些也证明各种类胡
罗卜素具有极佳的保护作用，这对光合生物生长
显然是有利的。
莱茵衣藻Nfr-4突变株中类胡萝卜素总含量升
高，叶绿素含量也同时升高。叶绿素含量升高可
能是类胡萝卜素特别是各种叶黄素含量升高的结
果。叶黄素含量变化可能是类胡萝卜素生物合成
途径中的关键酶基因 PDS的启动子发生突变和提
高该基因表达水平的结果。迄今，人们对类胡萝
卜素生物合成途径中的基因调控问题还知之甚少，
尚须深入探讨。
参考文献
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表 2 莱茵衣藻Nfr-4突变株与野生型CC-137的各种色素之间比率
Table 2 Ratios of various pigment contents in C. reinhardtii mutant Nfr-4 and wild-type CC-137
品系 叶绿素 a/叶绿素 b (紫黄质 +花药黄质 +玉米黄质)/ 叶绿素 a 叶黄素 /叶绿素 a 新黄质 /叶绿素 a
CC-137 2.434±0.08 0.4866±0.001 0.3946±0.002 0.325±0.002
Nfr-4 1.874±0.004 0.4551±0.007 0.2658±0.002 0.422±0.002
　　实验重复 4 次。