全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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-
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$国家自然科学基金"
(##%*1"
!
(#%"""
#&河南中医学院博士科研基金"
2344!"##+"
#
作者简介$赵
!
乐"
#1(%)
#!男!博士!讲师!主要从事药用植物分子生物学研究
5+67.8
$
9:7;8<#1(%
!
#!&,=;6
丹参病程相关蛋白基因
12$%
的克隆与表达分析
赵
!
乐#!马利刚#!王志霜!!申
!
业!!郑晓珂#
"
#
河南中医学院 药学院!郑州
*$""*&
&
!
中国中医科学院 中药资源中心!北京
#""""
#
摘
!
要$病程相关蛋白"
>?
#的产生与积累是植物体应对生物或非生物胁迫的主要特征之一该研究以人工培养的
丹参幼苗为材料!通过分析丹参转录组数据!根据丹参病程相关蛋白基因
!"#"
的序列设计特异性引物!采用逆转
录聚合酶链式反应"
?@+>A?
#从丹参中获得
!"#"
基因的开放阅读框"
B?C
#!命名为
#$!"#"+#
"
D<0270E
注册号
FC("%*
#!并进行原核表达和纯化结果表明$"
#
#
$!"#"+#
基因
B?C
为
*G
H
!编码
#$(
个氨基酸!其蛋白质
分子质量为
#,%(EI
"
!
#通过蛋白结构预测(序列多重比对和构建进化树等生物信息学分析!发现
#$!"#"+#
基
因具有保守序列"
D+J+D+D+J+D
#和"
F+K+J+5+J+L
#!其编码蛋白与葡萄等双子叶植物中的
>?#"
蛋白同源性较高
"
%
#经异丙基
"
+I+
硫代半乳糖苷"
M>@D
#诱导!含有表达载体
H
5@%!7+36>?#"+#
的大肠杆菌"
%&()*+(+,-.+
2N!#
#可诱导表达融合蛋白&对影响蛋白表达的
*
个因素优化结果表明!
36>?#"+#
蛋白的最佳表达条件为$
M>@D
终浓度
",*66;8
%
N
(起始宿主菌密度
K
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为
",(
(诱导温度
%"O
(诱导时间
(:
!并得到纯化的
36>?#"+#
蛋白
该结果为进一步研究
#$!"#"+#
基因在丹参抗病方面的生物学功能和培育丹参抗病品种奠定了基础
关键词$丹参&病程相关蛋白&生物信息学分析&原核表达&条件优化
中图分类号$
P($
&
P(&
文献标志码$
K
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)
*(!+,
-
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2
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A:.07
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1905.*:5
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H
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H
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D+J+D+
D+J+D
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F+K+J+5+J+L
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H
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T
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H
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Z
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H
].6.97].;0;XH
Y!!
植物在受到真菌(细菌和病毒等病原微生物侵
染或受到非生物胁迫时会诱导表达并积累病程相关
"
H
7]:;
T
<0!
>?
#蛋白!这类蛋白是植物防
御体系的重要组成部分)#*
>?
蛋白为多基因编
码!根据氨基酸序列的相似程度(血清学关系和生物
学活性!目前分为
#
类)!*它们在不同的植物中表
现为几丁质酶(葡聚糖苷酶(蛋白酶抑制剂(内肽酶
和过氧化物酶等!在植物自我防御机制中作为可被
诱导的组分发挥作用
随着对
>?
蛋白研究的深入!发现
>?
蛋白不
仅在被侵染组织中诱导表达!而在整个植株中都有
表达!与系统获得性抗性"
/
Z
/]<67].=7=
a
W.Y<^ Y<+
/./]70=<
!
3K?
#有关!被认为是
3K?
的一个显著标
志
>?#"
类蛋白属于类核糖核酸酶!可以降解
?VK
!有抗细菌和抗真菌的活性)%*!有关病毒)*+$*(
细菌)&*(真菌)+1*等病原菌诱导
>?#"
蛋白表达的研
究已有广泛报道!作为植物防御系统中的可诱导表
达组分!
>?#"
蛋白受多种病原菌的诱导表达!同时
>?#"
蛋白在不同组织(器官及发育时期都有表达!
属于组成型表达植物激素和防御相关的信号分
子!包括茉莉酸)#"*(脱落酸)##*(水杨酸)#!*(赤霉素(
茉莉酸甲酯(乙烯也能够调节
>?#"
蛋白的表达
丹参"
#,./+,$+.0+-**(+2,2W0
T
<
#为唇形科鼠
尾草属多年生草本植物!以其干燥根及根茎入药!在
临床上被广泛应用于心脑血管疾病以及各种炎症的
治疗!是重要的大宗药材!也是栽培面积较大的药材
之一在人工栽培条件下!由于药田生态环境中生
物群落多样性差(丰富度低!病虫害优势种群突出!
常常发生严重的病虫害!导致药材产量下降!品质变
劣!降低丹参药用品质!影响临床药效近年来!有
关丹参的研究多集中在二萜类化合物丹参酮合成途
径关键基因的克隆上)#%+#**!而对于丹参抗病基因的
研究则少有报道
在对课题组前期得到的大量丹参转录组数据的
分析中!发现多个植物病程相关基因!本研究采用逆
转录聚合酶链式反应"
?@+>A?
#从丹参中得到了植物
病程相关蛋白基因
!"#"
的
=IVK
全长!将其构建得
到含有
#$!"#"+#
的重组质粒
H
5@%!7+36>?#"+#
!导
入大肠杆菌
2N!#
"
I5%
#中!进行体外诱导表达!并对
M>@D
浓度(诱导时间(温度等培养条件进行优化!
筛选
36>?#"+#
蛋白的最适表达条件!为进一步研
究
#$!"#"+#
基因在丹参抗病中的生物学功能奠
定基础
#
!
材料和方法
$,$
!
试验材料
丹参"
#,./+,$+.0+-**(+2,2W0
T
<
#种子采自陕
西商洛!种植于人工气候箱内!光照强度为
%"""
8b
!光周期为光照
#&:
%黑暗
(:
!温度
!$O
种子
萌发!长出
*
片真叶后!移至培养罐中!每个培养罐
*
颗幼苗!每隔
%^
换
#
次
R;7
T
870^
营养液!培养
&"^
的丹参幼苗做为实验材料!取根(茎(叶!样品
采集后液氮冷冻!保存于
)("O
冰箱中表达宿主
菌
%3-.+2N!#
"
I5%
#及原核表达载体
H
5@+%!7
"
c
#为本实验室保存
$,=
!
方
!
法
$>=>$
!
0412$%7$
基因克隆与序列分析
!
采用
@Y+
.9;8
法从丹参根中提取总
?VK
!用
V70;IY;
H
!"""
进行含量测定!用
#`
琼脂糖凝胶电泳检测
?VK
完
整性以提取的
?VK
为模板!以
;8.
T
;
"
@^
#
#(
H
Y.6为反转录引物!按照
?<\@Y70/=Y.
H
]7/<
试剂盒"
C公司#说明合成
=I+
VK
根据转录组数据中
!"#"
基因的序列信息!利
用
>Y.6设计
!"#"
基因编码区的特异引物!正向
引物
36>?+#"+S#
"
$d+ADDKK@@AK@DDD@D@+
DK@AK+%d
!下划线部分为
%-?
#
酶切位点#&反向
引物
36>?+#"+S!
"
$d+AADA@ADKD@D@KD@A+
DDDD@@+%d
!下划线部分为
7(-
#
酶切位点#!以
反转录得到的丹参
=IVK
为模板!扩增
#$!"#"+#
基因的
B?C
!用
#`
的琼脂糖凝胶电泳检测
>A?
产
物!用琼脂糖凝胶回收试剂盒"天根公司#回收目的
片段!将回收的
>A?
产物与
H
D5S+@57/
Z
\<=];Y
连接!转化
IR$
$
菌株!在含有氨苄青霉素的
N2
平
板上进行培养!挑取单克隆!经菌液
>A?
和电泳检
测后!挑选阳性克隆送北京华大基因公司测序!将测
序结果与转录组数据中的
!"#"
基因序列进行比
1"#
&
期
!!!!!!!!!!!
赵
!
乐!等$丹参病程相关蛋白基因
!"#"
的克隆与表达分析
对!保存序列一致的阳性克隆!准备构建原核表达
载体
通过
5b>K3
Z
在线服务器的
A;6
H
W]<
H
M
%
S_
"
:]]
H
$%%
_H
7/
Z
,;Y
T
%
=;6
H
W]<
+
H
.
%#预 测
#$!"#"+#
基因编码蛋白质的相对分子量与理论等
电点!
@7Y
T
<]>#,#/"
:]]
H
$%%
___,=G/,^]W,
E^
%
/%
@7Y
T
<]>
%#预测该蛋白的亚细胞定位!
3.
T
078>*,#/"
:]]
H
$%%
___,=G/,^]W,^E
%
/.=%
3.
T
078>
%#进行信号肽分析!
@SRSS/\,!,"
"
:]]
H
$%%
___,=G/,^]W,^E
%
/%
@S+
RSS
%#进行跨膜域分析!
>Y<^.=]>Y;]<.0/"
:]]
H
$%%
___,
H
Y<^.=]
H
Y;]<.0,;Y
T
%#进行二级结构
预测!
3UM33SBI5N
"
:]]
H
$%%
/_.//6;^<8,H
7/
Z
,
;Y
T
%#进行三维同源建模用
IVKSKV
软件对序
列进行多重比对!用
A8W/]78U
软件与其他植物
>?#"
蛋白的氨基酸序列进行比较!采用
S5DK*
软件的相邻连接法"
0<.
T
:G;Y+
-
;.0.0
T
#构建系统进化
树!
G;;]/]Y7
H
重复次数为
#"""
次
$>=>=
!
0412$%7$
原核表达载体的构建与鉴定
!
用限制性内切酶
%-?
#
和
7(-
#
分别对原核表达
载体
H
5@+%!7
"
c
#和测序正确的
H
D5S+@57/
Z
+
36>?#"+#
质粒进行双酶切!琼脂糖凝胶电泳检测
并切胶回收载体片段和目的基因片段!
@
*
IVK
连
接酶
#&O
连接过夜连接产物转化
%3-.+2N!#
"
I5%
#感受态细胞!在含有氨苄青霉素的
N2
平板
上培养过夜!挑取单克隆!经菌液
>A?
和双酶切鉴
定!挑选阳性克隆送北京华大基因公司测序
$>=>?
!
0412$%7$
的诱导表达
!
挑取测序正确的
阳性克隆!接种于含氨苄青霉素的
N2
液体培养基
中!
%O
培养过夜后!按照
#e#""
比例稀释到含氨
苄青霉素的
N2
液体培养基中!
!"Y
%
6.0
振荡培养
至对数生长期"
K
&""
为
",&
#!然后针对诱导温度"
#$
(
!"
(
!$
(
%"
(
%O
#(诱导时间"
*
(
&
((
!":
#(
M>@D
浓
度"
,#
(
",*
(
",(
(
#,"66;8
%
N
#!及
K
&""
"即诱导起
始宿主菌密度
",*
(
",&
(
",(
(
#,"
#这
*
个影响原核
表达产物积累的因素!当研究其中
#
种因素时!固定
其他
%
个因素不变!分别分析了这
*
个因素对丹参
36>?#"+#
重组蛋白表达的影响
$>=>@
!
重组
AB4C$%7$
蛋白的纯化
!
根据优化的
诱导表达条件!在大肠杆菌中大量 表 达 重 组
36>?#"+#
蛋白!获得菌体!超声破碎!破碎液在
*
O
!
#!"""Y
%
6.0
离心
%"6.0
!取上清液经
",*$
%
6
滤膜过滤!采用
V.
!c亲和层析方法!利用
V.3<
H
:7+
Y;/<&C7/]C8;_>WY.X.=7].;03
Z
/]<6
"
D5R<78]:+
=7Y<
#树脂对滤液进行纯化!然后用不同浓度的咪唑
梯度洗脱!
3I3+>KD5
电泳检测洗脱样品!收集单
一目的条带样品进行透析!透析后样品经超滤管浓
缩!用
2Y7^X;Y^
方法对蛋白进行定量!冷冻干燥!
)"O
保存
!
!
结果与分析
=>$
!
0412$%+$
的基因克隆与序列分析
通过对课题组前期得到的丹参转录组数据进行
分析!根据
!"#"
基因
B?C
设计特异性引物!扩增
得到
$""G
H
左右的条带"图
#
#!与转录组数据中
!"#"
基因开放阅读框"
B?C
#大小一致!测序结果
表明
#$!"#"+#
基因的
BC?
为
*G
H
!编码
#$(
个氨基酸!分子量为
#,%(EI
!等电点
H
M
为
$,!%

3.
T
078>*,#/预测!
36>?#"+#
蛋白不含
信号肽!
@7Y
T
<]>#,#/预测!显示
36>?#"+#
蛋白定位于细胞质!
@SRSS/预测该蛋白不
含跨膜域用
>Y<^.=]>Y;]<.0
对
36>?#"+#
蛋白的
二级结构进行预测!结果显示在该蛋白中
$
+
螺旋结
构占
!#,$!`
!
"
+
折叠占
%*,(#`
!无规则卷曲占
*%,&`
"图
!
!
K
#用
3UM33+SBI5N
以樱桃的
78T
<0>YW7\#
蛋白为模板"
>I2MI
$
#<"1
#!预测
36>?#"+#
蛋白的三维结构"图
!
!
2
#结果显示
36>?#"+#
蛋白包含一个
A
端由
!(
个氨基酸组成
的
$
螺旋!

个
"
折叠以及
V
端在
"
#
和
"
!
折叠之
间的
#
个的短
$
螺旋保守的
>+8;;
H
基序"
D+J+D+
D+J+D
#位于
"
!
和
"
%
之间!
A
端有"
F+K+J+5+J+L
#
的保守序列"图
!
!
K
#三级结构与已经报道的
>?#"
家族蛋白的空间结构具有很高的相似性!
"
+
折
叠在
$
+
螺旋间反向平行排列!构成紧凑的
$
+
"
+
$
夹
心结构!具有疏水作用和稳定的多重氢键!这个紧凑
的结构可能决定了
>?
蛋白的高稳定性
将
36>?#"+#
与
VA2MD<0270E
中
!"
种植物
图
#
!
>A?
扩增
#$!"#"+#
基因的开放阅读框
C.
T
,#
!
>A?76
H
8.X.=7].;0;X#$!"#"+#
T
<0<;
H
<0Y<7^.0
T
XY76<
S,IN!"""
&
#,#$!"#"+#B?C
"("#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
!
!
36>?#"+#
蛋白的结构预测
K,
二级结构预测&
2,
三维结构预测
C.
T
,!
!
>Y<^.=].;0;X36>?#"+#
H
Y;]<.0/]YW=]WY<
K,3<=;0^7Y
Z
/]YW=]WY<
H
Y<^.=].;0
&
2,>Y<^.=].;0;X]:Y<<+^.6<0/.;078/]YW=]WY<
图
%
!
36>?#"+#
蛋白与其他物种
>?#"
蛋白的系统进化树分析
C.
T
,%
!
>:
Z
8;
T
<0<].=]Y<<;X36>?#"+#
H
Y;]<.070^ >?#"
H
Y;]<.0/XY;6;]:H
<=.>?#"
蛋白进行比对!采用
S5DK*
软件构建系统
进化树!结果"图
%
#显示!
>?#"
聚为两类!一类是单
子叶植物
>?#"
!另一类是双子叶植物
>?#"
!
36>?#"+#
归属于双子叶植物类!与葡萄(人参亲缘
关系最近
=>=
!
0412$%7$
基因的原核表达载体构建与鉴定
用限制性内切酶
%-?
#
和
7(-
#
分别对原核
表达载体
H
5@+%!7
"
c
#和测序正确的
H
D5S+@
57/
Z
+36>?#"+#
质粒进行双酶切!连接得到重组质
粒
H
5@%!7+36>?#"+#
!然 后 转 化
%3-.+ 2N!#
"
I5%
#!挑取单克隆进行菌液
>A?
和双酶切鉴定!
都有
$""G
H
左右的目的条带"图
*
#!阳性克隆测序
结果显示与目的基因
#$!"#"+#
序列一致!未发生
移码突变!表明已成功将
#$!"#"+#
基因克隆到原
核表达载体
H
5@+%!7
上
=>?
!
AB4C$%7$
蛋白的原核表达条件的优化
=>?>$
!
D4E8
浓度对
AB4C$%7$
表达的影响
!
保持
诱 导时间
(:
(诱导温度
%"O
及起始
K
&""
为
",&
不
图
*
!
原核表达载体
H
5@%!7+36>?#"+#
鉴定
S,IN#""""
&
#,%-?
#
和
7(-
#
双酶切
H
5@%!7+36>?#"+#
载体&
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阳性克隆的
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产物
C.
T
,*
!
@:<.^<0].X.=7].;0;X
H
Y;E7Y
Z
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Y\<=];Y
H
5@%!7+36>?#"+#
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H
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T
Z
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#
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#
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H
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H
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变!在
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N
这
*
个
M>@D
浓
度下!观察发现
M>@D
浓度在
",#
&
#,"66;8
%
N
对
36>?#"+#
表达量影响不明显"图
$
#
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!
诱导温度对
AB4C$%7$
表达的影响
!
保持
#("#
&
期
!!!!!!!!!!!
赵
!
乐!等$丹参病程相关蛋白基因
!"#"
的克隆与表达分析
诱导时间
(:
(
M>@D
浓度
",*66;8
%
N
及起始
K
&""
为
",&
不变!不同诱导温度"
#$O
(
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(
!$O
(
%"
O
(
%O
#下!发现温度对
36>?#"+#
表达影响明
显!
"
&
%"O
诱导均有利于可溶性蛋白的表达!而
#$O
和
%O
时蛋白表达量减少"图
&
#
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!
1
F%%
对
AB4C$%7$
表达的影响
!
保持诱导时
间
(:
(诱导温度
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及
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浓度
",*66;8
%
N
不变!观察到在不同起始菌密度"
K
&""
为
",*
(
",&
(
",(
(
#,"
#时加入诱导剂
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对
36>?#"+#
表达有
图
$
!
不同
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浓度对
36>?#"+#
蛋白表达的影响
S,
蛋白分子量标准&
A#
&
A*,
含
H
5@%!7
空载体的
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菌株&
#
&
*,
分别在
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(
",*
(
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(
#,"66;8
%
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浓度诱导的含
H
5@%!7+36>?#"+#
质粒的
%3-.+
菌株
箭头显示为重组
36>?#"+#
蛋白
C.
T
,$
!
5XX<=];X^.XX@D=;0=<0]Y7].;0/;0
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H
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#)*,%3-.+=;0]7.0/
H
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%
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!
YH
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Z
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7YY;_//:;_]:?#"+#
H
Y;]<.0
图
&
!
不同诱导温度对
36>?#"+#
蛋白表达的影响
S,
蛋白分子量标准&
A,
含
H
5@%!7
空载体的
%3-.+
菌株&
#
&
$,
分别在
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!
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!
$O
!
%"O
!
%O
诱导的含
H
5@%!7+
36>?#"+#
质粒的
%3-.+
菌株箭头显示为重组
36>?#"+#
蛋白
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T
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5XX<=];X^.XXH
H
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H
Y;]<.0
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&
#)*,%3-.+=;0]7.0/
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表达量最高"图

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!
诱导时间对
AB4C$%7$
表达的影响
!
保持
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(
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浓度
",*66;8
%
N
及起始
K
&""
",(
不变!研究诱导时间"
*
(
&
(
(
(
!":
#对
36>?#"+#
表达的影响!观察到诱导时间对蛋白表
达量有明显影响!随着诱导时间的延长!蛋白表达量
有随之增加的趋势"图
(
#
=>@
!
重组
AB4C$%7$
蛋白的纯化
根据优化的条件!
M>@D
浓度
",*66;8
%
N
(起
图

!
不同起始宿主菌密度"
K
&""
#对
36>?#"+#
蛋白表达的影响
S,
蛋白分子量标准&
A#
&
A*
$含
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5@%!7
空载体的
%3-.+
菌株&
#
&
*,
分别在
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&""
为
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(
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(
",(
(
#,"
条件下诱导的含
H
5@%!7+
36>?#"+#
质粒的
%3-.+
菌株箭头显示为重组
36>?#"+#
蛋白
C.
T
,
!
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K
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#
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H
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图
(
!
不同诱导时间对
36>?#"+#
蛋白表达的影响
S,
蛋白分子量标准&
A#
&
A*,
含
H
5@%!7
空载体的
%3-.+
菌株&
#
&
*,
分别诱导
*
(
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((
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的含
H
5@%!7+36>?#"+#
质粒的
%3-.+
菌株箭头显示为重组
36>?#"+#
蛋白
C.
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H
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学
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卷
图
1
!
重组
36>?#"+#
蛋白的纯化
S,
蛋白分子量标准&
#,
含
H
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空载体的
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菌株作为对照&
!,
优化条件下诱导的含
H
5@%!7+36>?#"+#
质粒的
%3-.+
菌株&
%
(
*,
纯化后的重组
36>?#"+#
蛋白"
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蛋白
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H
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为
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(诱导时间
(:
!将重
组
36>?#"+#
蛋白在大肠杆菌中大量表达!收集大
肠杆菌菌体!超声破碎!破碎液经过离心取上清液!
采用
V.
!c亲和层析方法!利用
V.3<
H
:7Y;/<&C7/]
C8;_>WY.X.=7].;03
Z
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"
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36>?#"+#
"图
1
#!
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法测得纯化蛋白浓度为
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T
,
6N
)#

%
!
讨
!
论
丹参为多年生草本植物!以根入药!在人工栽培
条件下!易受到各种病虫害的危害!若长期大量使用
农药!一方面易使病虫害产生抗药性!另一方面农药
残留会降低丹参的药用品质!影响丹参临床药效
因此从丹参自身挖掘抗性相关基因!培育抗病品种!
才是缓解丹参病虫害的根本途径本研究从丹参中
克隆得到病程相关蛋白
#"
基因
#$!"#"+#
!对其核
酸及其推测的氨基酸序列分析发现!
#$!"#"+#
基
因编码蛋白的
V
端有典型的富含甘氨酸的
>+8;;
H
基序"
D+J+D+D+J+D
#!
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端有"
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#的保
守序列!说明
36>?#"+#
蛋白是
>?#"
蛋白家族中
的成员"
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)
!
*
(
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#$
*
#
36>?#"+#
蛋白不含信号肽!作为细胞质蛋白发挥作用!这与其
他
>?
家族蛋白不同!其它
>?
家族蛋白大多是位
于胞外!具有信号肽序列!先是作为蛋白前体合成!
然后在分泌过程中形成成熟蛋白)#&*
大肠杆菌是常用的外源蛋白质表达系统之一!
影响外源蛋白可溶性表达的因素有多方面!要增加
可溶性蛋白的表达量!除了合理的选择酶切位点(表
达载体(宿主菌(试剂外!还可以通过改变培养条件
来提高外源蛋白的可溶性表达量!如改变
M>@D
浓
度)#*(诱导温度)#(*(诱导时宿主菌的密度"
K
&""
#
)
#1
*
和诱导时间)#(*等本研究将目的基因
#$!"#"+#
构建 到 表 达 载 体
H
5@%!7
上!形 成 重 组 质 粒
H
5@%!7+36>?#"+#
!然后转化
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"
I5%
#!
进行蛋白表达
H
5@%!7
载体是带有
V+
端硫氧还蛋
白"
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,
@7
T
#编码序列的融合表达载体!当外源
重组蛋白在
%3-.+
中以不溶形式存在时!和
@Yb
,
@7
T
序列融合后!可增加重组蛋白的溶解性)!"*&此
外!表达宿主菌
2N!#
"
I5%
#可以增加存在于细胞质
中蛋白质的二硫键的形成!使得蛋白的可溶性更好!
同时!利用
H
5@%!7
载体表达的重组蛋白
V
端带有
&
个
R./@7
T
标签!方便后续重组蛋白的纯化)#(*
M>@D
浓度(温度(起始菌密度"
K
&""
#和诱导时
间是影响原核表达的主要因素!本研究发现!
M>@D
浓度在
",#
&
#,"66;8
%
N
对
36>?#"+#
蛋白表达
量影响不明显!最终选择
M>@D
浓度为
",*66;8
%
N
温度对
36>?#"+#
表达量有明显影响!从
#$
&
%O
均能得到重组蛋白!但是
#$O
时温度过低!不
利于蛋白表达!在
%"O
时表达量最高!虽然在
%O
时也有蛋白表达!但是和
%"O
条件下相比!表达量
却有所降低!这可能是
%O
条件下大肠杆菌细胞各
种代谢旺盛!生长加快!影响外源重组蛋白的表达!
而且有可能使重组蛋白积累形成包涵体!而在
!$
&
%"O
培养会形成可溶的(有活性的重组蛋白!最终
选择诱导温度为
%"O
)
!#
*
随着诱导时间的延长!
36>?#"+#
的表达量也随之增加!
*:
时表达量最
低!
(:
与
!*:
时表达量较高!但是诱导时间过长!
重组蛋白的可溶性降低!可能形成包涵体!最终选择
(:
作为最终诱导时间)!!*
本研究用分子克隆方法得到丹参
#$!"#"+#
基因!通过构建原核表达载体!在大肠杆菌中得到成
功表达!在优化表达体系为
M>@D
浓度
",*66;8
%
N
(起始宿主菌密度
K
&""
为
",(
(诱导温度
%"O
(诱
导时间
(:
的条件下!
36>?#"+#
在大肠杆菌中能
够得到很好的表达!采用
V.
!c亲和层析得到了纯化
的目的蛋白!为进一步研究
36>?#"+#
蛋白的生物
学活性!抗体制备和
#$!"#"+#
基因在丹参抗病方
面的生物学功能奠定了基础
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