全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA摇 41(3): 305鄄309(2011)
收稿日期: 2009鄄04鄄15; 修回日期: 2011鄄01鄄15
基金项目: 重庆市科技攻关项目(CSTC, 2010AA1023); 农业部公益性行业(农业)科研专项( nyhyzx07鄄007); 西南大学博士基金项目
(SWUB2008058); 中央高校基本科研业务费专项资金项目(XDJK2010C068)
通讯作者: 司 军, 博士, 副教授, 主要从事蔬菜抗病育种及优良性状的分子标记等工作; E鄄mail: sijunxx@163. com。
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研究简报
结球甘蓝抗根肿病 SSR分子连锁图谱的构建
司 军*, 李成琼, 任雪松, 宋洪元, 宋 明, 王小佳
(西南大学园艺园林学院,重庆市蔬菜学重点实验室,南方山地园艺学教育部重点实验室, 重庆 400715)
Construction of a molecular linkage map for clubroot resistance in cabbage using
SSR markers (Brassica oleracea L. var. capitata) 摇 SI Jun, LI Cheng鄄qiong, REN Xue鄄song,
SONG Hong鄄yuan, SONG Ming, WANG Xiao鄄jia摇 (College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest
University, Chongqing Key Laboratory of Olericulture, Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous Re鄄
gions,Ministry of Education, Chongqing 400715)
Abstract: 180 F2 individuals derived from the single cross between the resistant 15R and the susceptible 14S
cabbage inbred lines were genotyped using simple sequence repeat (SSR) . Ninety鄄five primer pairs were used
to detect the polymorphism between parents 15R and 14S, and 60(63. 2% ) of them showed polymorphism.
The molecular linkage map was constructed with the 60 SSR primers. The results showed that 4 SSR markers
were not linkaged; and 4 SSR markers had a segregation distortion; the other 52 SSR markers distributed a鄄
mong 9 linkage groups in cabbage spanning a 12. 56 cM region of chromosome, and an average distance be鄄
tween markers was 11. 9 cM.
Key words: Brassica oleracea L. var. capitata; clubroot; SSR; linkage map; construction
文章编号: 0412鄄0914(2011)03鄄0305鄄05
摇 摇 结球甘蓝(Brassica oleracea L. var. capitata)
简称甘蓝,是我国重要的蔬菜作物之一。 甘蓝根肿
病是 由 芸 苔 根 肿 菌 ( Plamodiophora brassicae
Woron. )侵染引起的一种世界性真菌病害。 近年
来,该病在我国的发病面积急剧增加,造成甘蓝产
量和品质大幅度降低,选育抗病品种成为防治根肿
病的重要途径之一。
因甘蓝对根肿病抗性属于数量性状遗传[1],由
多基因控制,易受环境影响。 利用常规育种方法改
良甘蓝对根肿病的抗性非常缓慢,很难满足农业生
产和市场的需要。 如果选用分子标记构建甘蓝抗
病基因饱和遗传图谱,把大量甘蓝抗病虫基因或数
量性状位点(quantitative trait locus,QTL)定位在染
色体上,在此基础上进行精细定位和克隆单个
QTL,再利用分子标记辅助育种,将给传统育种带
来革命性的变化。
到目前为止,甘蓝类作物的遗传图谱己构建了
十几张,绝大多数标记为 RFLP标记,其次是 RAPD
标记,还有少量同工酶标记以及 SCAR 和 STS 等
基于 PCR的标记,大多对抗根肿病育种意义不大。
本研究的目的就是在不同的环境下,利用不同的鉴
定方法对甘蓝材料进行抗根肿病鉴定,同时选用
SSR标记初步构建甘蓝抗根肿病的分子连锁图谱,
为进一步的根肿病基因定位和分子标记辅助选择
奠定基础。
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植物病理学报 41 卷
1摇 材料与方法
1. 1摇 试验材料
以抗根肿病自交系 R15 和感根肿病自交系
S14 组配的 180 个 F2 单株做为作图群体。
1. 2摇 DNA提取
甘蓝叶片 DNA的提取采取改良的 CTAB法。
1. 3摇 SSR分析
SSR引物按照 http: / / www. uk. crop. net 网站
上公布的序列,由北京生物工程有限公司合成;
SSR反应体系基本组成为:1 伊 Buffer (含 20. 00
mmol / L MgCl2 )、50. 00 滋mol / L dNTPs、0. 40 U
Taq DNA 聚合酶、0. 4 滋mol / L SSR 引物、1 滋L
DNA(60. 00ng / 滋L),加 ddH2O 至终体积 10. 00
滋L。 SSR鄄PCR扩增程序为 94益变性 45 S, 60益退
火, 72益延伸 1 min,每个循环低 0. 5益,20 个循
环;94益变性 45 S,55益退火 45 S,72益延伸 1 min,
15 个循环;72益延伸 10 min,4益保存。 反应产物
进行 10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳,之后用硝酸银
染色。
1. 4摇 SSR数据的转换
统计在亲本之间产生多态性,并且在 F2 群体
中有分离的条带。 记载原则是:抗病亲本用 A 表
示,感病亲本用 B 表示。 对于共显性标记,如果带
型和 A相同,则记为 1,如果带型和 B相同,则记为
2,如果带型为杂合型,则记为 3,缺失带型,则记为
0;对于显性标记,如果 B对 A显性,B带型和 F1 带
型无法区别,将 B带型和 F1 带型作为一种带型,记
为 4,不出现带型记为 1。 反之,如果 A 对 B 显性,
A带型和 F1 带型无法区别,将 A带型和 F1 带型作
为一种带型,记为 5,不出现带型记为 2。 对所有 F2
单株带型,共显性标记按孟德尔比例 1 颐 2 颐 1,显性
标记按 3颐 1 进行 字2 检验。
1. 5摇 连锁分析与图谱构建
图谱构建分析所用软件为 MAPMAKER /
EXP3. 0,用 group 命令(LOD逸3. 0,重组率小于
50)把所有标记划分为可能的连锁群,用 sequence
选定后再用 compare 命令排序,最后用 try 命令确
定个别标记的位置,采用 Kosambi函数将重组值转
换成图距(cenntiMorgan,cM),确定相应的连锁群
并依次建立分子标记遗传连锁图谱,并用 Map鄄
Draw软件将图谱信息绘制成连锁遗传图谱。
2摇 结果与分析
2. 1摇 SSR分析
本试验共选用了 95 对 SSR 引物,筛选出两亲
本 15R和 14S间表现多态性的引物 60 对,多态性
引物比例为 63. 2% ,其中共显性标记 55 个,显性标
记 5 个。
2. 2摇 群体标记分析结果
利用 60 对 SSR引物,对 180 个 F2 单株作图群
体进行标记基因型检测,对所有 F2 单株带型按孟
德尔分离比例,共显性按 1颐 2颐 1,显性标记按 3颐 1 进
行 字2 试验。 51 对引物的试验结果符合 1 颐 2 颐 1 结
果,为共显性标记,4 对引物的试验结果不符合
1颐 2颐 1结果,偏离孟德尔分离比例,偏分离比率为
6. 7% 。 5 对引物的试验结果符合 3 颐 1 结果,为显
性标记(表 1)。
Table 1摇 Genotype segregation distortion of detected four primers
Name of
primer
Genotype(number)
Homozygote from
allele of 15R
Heterozygote Homozygote from
allele of 14S
Deletion
Total
(number)
Chi鄄square
test(字2)
OL11鄄G11 45 97 28 10 170 6. 79**
OL12鄄D09 47 88 28 17 163 5. 47*
OL13鄄A10 35 106 34 5 175 7. 83**
OL10鄄G06 38 97 31 14 166 5. 35*
字20. 05,1 =3. 84,字20. 01,1 =6. 63,“*冶 and “**冶mean level of significance (P =0. 05,P =0. 01) .
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摇 3 期 司 军,等:结球甘蓝抗根肿病 SSR分子连锁图谱的构建
Fig. 1摇 SSR linkage map of cabbage
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植物病理学报 41 卷
2. 3摇 SSR分子连锁图谱的构建
利用 Mapmaker / Exp 3. 0 进行连锁分析时,其
中有 4 个 SSR 标记没连锁上。 其余 52 个标记分
布于甘蓝的 9 条染色体上,覆盖甘蓝基因组
653. 2 cM,标记间平均距离为 12. 56 cM(图 1)。
引物 OL10鄄F06 对 F2 作图群体基因型检测表现为
共显性(图 2),引物 OL10鄄D03 对 F2 作图群体基
因型检测表现为显性(图 3)。
3摇 讨论
一般认为,一个基本的染色体连锁框架图要求
标记间平均距离不大于 20 cM,如果构建连锁图谱
的目的是为了进行主效基因定位,其平均距离要求
在 10 ~ 20 cM或更小[2]。 用于 QTL定位的连锁其
平均距离要求在 10 cM 以下,如果为了基因克隆,
则要求目标区域标记的平均距离在 1 cM 以下。
据报道 B. olercea 图谱长度一般在 800 ~ 1 100 cM
左右,本研究得到的甘蓝遗传图谱总长度为 653. 3
cM,明显小于 Landry等[3](1 112 cM,201 个标记)
和 Camargo等[4](1 002 cM,112 个标记)利用亚种
间 F2 代所构建的图谱。 本研究所构建的图谱比
Voorrips等[5](615 cM,92 个标记)利用亚种间 DH
群体所构建的图谱长度要长。
图谱大小除与基因组大小有关外,尚与所用
的群体种类有关。 遗传图谱大小的差异反映了
作图群体双亲间遗传差异的大小,当双亲间遗传
距离大,差异位点多,且在染色上均匀分布时,构
建的遗传图谱较长,更接近基因组实际大小。 本
研究为了获得抗根肿病完整遗传信息,所使用的
双亲是 15R 和 14S 两个结球甘蓝栽培种的高代
纯化自交系,相对目前报导的用甘蓝 伊青花菜、
甘蓝 伊等亚种间配置杂交后代得到的分离群体
而言,本研究所有的双亲间的亲缘关系相对较
近,双亲基因组间同源性较强,导致差异位点少,
甚至有些片段缺少异质性,这可能也是致使构建
的连锁群总长度减少的原因。
Fig. 2摇 Genotype detection of primer OL10鄄F06 in the mapping population
Fig. 3摇 Genotype detection of primer OL10鄄D03 in the mapping population
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摇 3 期 司 军,等:结球甘蓝抗根肿病 SSR分子连锁图谱的构建
参考文献
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责任编辑:
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