全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$国家基础科学人才培养基金"
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#
作者简介$王瑞鑫"
#00"(
#!女!在读硕士研究生!主要从事植物生物技术与分子生物学研究
2)34-5
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7
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#!*+;<3
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通信作者$陈崇顺!博士!硕士生导师!主要从事植物生物技术与分子生物学研究
2)34-5
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洋桔梗品种遗传多样性的
$%&
分析
王瑞鑫!韦银凤!李
!
琳!付晓佳!李
!
爽!陈崇顺"
"南京师范大学 生命科学学院%江苏省生物多样性与生物技术重点实验室!南京
!#""!%
#
摘
!
要$该研究以洋桔梗"
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(
)*+,
-
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#
!
个品种(玛丽艾基粉色)和(圣剑白底紫边)为试材!提取叶片
@AB
!经过
!/%C
"
%
0#1
"
双酶切*连接*预扩增*选择性扩增!建立了洋桔梗的
BDEF
最佳反应体系&并以
*$
个常
用引物组合进行扩增!得到
#$
个多态性条带!从中筛选出扩增条带较多且多态性较好的
$
个引物组合"
!)BGB
%
0)GHG
!
)BGG
%
0)GBG
!
)BIG
%
0)GHH
!
)BGH
%
0)GBI
#!其多态位点百分率均值为
!$+%*J
利用上述
$
个引
物组合!以最佳反应体系为基础!构建了
&
个常见洋桔梗品种的
BDEF
指纹图谱!统计
&
个品种各
$
个引物组合在
#"""
#
%""K
L
区间
&
个区段的扩增条带!并将各个品种的
BDEF
指纹图谱转换成各品种
$
组
&
位数构成的
!M
位
特异数字指纹!极大地方便了种质比较及鉴定& 个品种间的遗传相似系数介于
"+*M%
#
"+M*"M
之间!平均值为
"+&&$*
研究结果为进一步进行洋桔梗的种质研究及利用奠定了基础
关键词$洋桔梗&
BDEF
&最佳反应体系&引物筛选&指纹图谱&特异数字指纹&遗传相似系数
中图分类号$
N&M0
文献标志码$
B
$%&$()*
+
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+
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6
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!)BGH
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L
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7
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L
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7
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7
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7
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L
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L
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X
!!
洋桔梗+
!"#$%&
(
)*+,
-
.%)"&
"
C4R+
#
U=-//+
,
又名草原龙胆!是龙胆科草原龙胆属多年生宿根草
本花卉!生产上常作一*二年生栽培+#,洋桔梗原产
于美洲!花姿高雅秀丽!妩媚动人!插花效果好!瓶插
寿命长!现作为国际流行的切花品种广泛种植+!)%,
但洋桔梗未开花时!不同品种的形态特征很相似&同
时!缺少能够区别不同种质的有效方法!给生产应用
等带来诸多不便因此!进行洋桔梗品种遗传多样
性及种质鉴定研究是十分必要的
BDEF
"
43
L
5-R->?R84
7
3>/Y5>/
7
Y=
L
<5
X
3<8)
L
=-.3
!扩增片段长度多态性#技术是由
<`.
等+$,在
CDEF
和
CBF@
基础上发展起来的一种选择性扩
增限制性酶切片段的方法+)*,!其实验过程包括酶
切*连接*预扩增*选择性扩增*变性聚丙烯酰胺凝胶
电泳及银染等它是对全基因组进行多态性分析的
一种分子标记技术+&)M,!既克服了
CDEF
技术复杂*
CBF@
稳定性差的缺点!同时又兼二者之长!具有多
态性好*稳定性高等特点+0,目前!其已广泛应用于
物种多样性研究+#")#%,*物种进化分析*品种鉴定+#$,*
遗传图谱构建+#,等多个方面
本研究首先以本实验室保存的洋桔梗(玛丽艾
基粉色)和(圣剑白底紫边)
!
个品种为试材!优化
BDEF
的主要反应条件!建立最佳反应体系&然后对
*$
个常用引物组合+#*,进行筛选&再利用筛选出的扩
增条带较多且多态性较好的引物组合!以最佳反应
体系为基础!构建 (玛丽艾基粉色)*(圣剑白底紫
边)*(玛丽艾基绿色)*(露西塔
#
白底粉边)*(露西
塔
!
白色)*(雪莱香槟色)和(维纳斯粉色)
&
个常见
洋桔梗品种的
BDEF
指纹图谱*转化为特异数字指
纹*进行品种间遗传相似系数比较等遗传多样性分
析!为进一步对洋桔梗的种质研究利用奠定基础
#
!
材料和方法
@+@
!
试验材料
&
个常见洋桔梗品种$(玛丽艾基粉色)*(圣剑
白底紫边)*(玛丽艾基绿色)*(露西塔
#
白底粉边)*
(露西塔
!
白色)*(雪莱香槟色)和(维纳斯粉色)购
于昆明缤纷园艺有限公司及南京市花卉商店
@:A
!
叶片基因组
2B$
提取及检测
取洋桔梗新鲜叶片
#""3
7
!在研钵中加入液氮
充分研磨成细粉!利用植物基因组
@AB
快速抽提
试剂盒提取基因组
@AB
!在
$a
下保存备用
对提取的
@AB
进行检测$取

$
E@AB
!加入
#
$
E*bE<4?-/
7
K9RR>8
!进行
#J
的琼脂糖凝胶水
平电泳&取
!
$
E@AB
!用超微量分光光度计
c@)
!"""
测定浓度!根据
B
!*"
%
B
!M"
的比值判断
@AB
纯
度+#&,对符合要求的样品用
??V
!
c
稀释至
%"
/
7
%
$
E
!在
$a
下保存备用
@+C
!
酶切及连接
@:C:@
!
基因组
2B$
的
1"&9
!
!
73)
!
双酶切
!
双
酶切采用
!"+"
$
E
反应体系!为确定适合基因组
@AB
的酶切时间和酶切温度!本研究设置
%=
*
=
*
0=
*
#!=
等
$
个酶切时间梯度和
%S
*
$S
*
S
等
%
个酶量梯度+#M,体系为
@AB
模板

$
E
"约
#"
/
7
#!
!/%C
"
"
#"S
%
$
E
#
"+%
$
E
%
"+$
$
E
%
"+
$
E
!
0#1
"
"
#"S
%
$
E
#
"+%
$
E
%
"+$
$
E
%
"+
$
E
!
#"b
K9RR>8H4/
7
<
$
E
!用
??V
!
c
补足至
!"+"
$
E
置
于恒温水浴锅中
%&a
分别酶切
%=
*
=
*
0=
*
#!=

然后置于
*a
水浴
!"3-/
终止反应!冰浴待用
进行
#J
琼脂糖凝胶水平电泳!检查酶切效果
@+C+A
!
酶切片段与接头的连接
!
!/%C
"
接头序列
为
d)BBHHIIHBGIGBIHGHBG)%d
和
%d)GGB)
HIGIHGBIBHIGHG)d
!
0#1
"
接头序列为
d)
IBGIBHIBIHGGHIBI)%d
和
%d)HBGHGBIIB)
GHGBH)d
连接采用
!"+"
$
E
反应体系!
!/%C
"
接头"

$
3<5
%
E
#
#
$
E
!
0#1
"
接头"
"
$
3<5
%
E
#
#
$
E
!
H
$
@ABE-
7
4.>
"
#"S
%
$
E
#
#
$
E
!
#"bH
$
@AB
E-
7
4.>K9RR>8!
$
E
!酶切的
@AB#"
$
E
!用
??V
!
c
补足至
!"+"
$
E
设置
!a
和
%&a!
个连接温
度!
*
和
#!=!
个连接时间进行连接对连接产物
进行预扩增后!根据电泳结果筛选最佳连接条件
@+D
!
预扩增及其产物检测
将连接产物用
??V
!
c
稀释
"
倍*

倍*
#"
倍分
别用于预扩增采用
!+"
$
E
体系!连接产物
%
$
E
!
"
$
3<5
%
E!/%C
"
引物"
d)IBGHIGIHBG)
GBBHHGB)%d
#
#
$
E
!
"
$
3<5
%
E0#1
"
引物"
d)
IBHIBIHGGHIBIHBBG)%d
#
#
$
E
!
#"bFGC
K9RR>8!+
$
E
!
!
$
3<5
%
E ]
7
G5
!
#+
$
E
!
!
$
3<5
%
E?AHF."+!
$
E
!
S
%
$
E3
4
@AB
聚合酶
"+$
$
E
!用
??V
!
c
补足至
!+"
$
E
预扩增程序为
0$a
变性
!3-/
&
0$a
变性
%".
!
a
退火
%".
!
&!
a
延伸
!3-/
!
%"
个循环&
!a
延伸
#"3-/
!
$a
保
温在反应结束后!取

$
E
预扩增产物!进行
#J
琼脂糖凝胶水平电泳!检查扩增效果
@+E
!
选择性扩增
@+E+@
!
选择性扩增反应
!
将预扩增产物用
??V
!
c
稀释
#
倍用于选择性扩增选择性扩增引物为
M
条
!/%C
"
"
!/%C
"
e BBG
%
BBI
%
BGB
%
BGH
%
*!%#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
BGG
%
BII
%
BIG
%
BGI
#引物和
M
条
0#1
"
"
0#1
"
eGBB
%
GBG
%
GBI
%
GBH
%
GHB
%
GHG
%
GHI
%
GHH
#
引物!共
*$
个引物组合采用
!+"
$
E
体系!预扩
增产物
%
$
E
!
/%C
"
引物"
"
$
3<5
%
E
#
$
E
!
0#1
"
引物"
"
$
3<5
%
E
#
#
$
E
!
#"bFGCK9RR>8!+
$
E
!
]
7
G5
!
"
!
$
3<5
%
E
#
+
$
E
!
?AHF.
"
!
$
3<5
%
E
#
"+!
$
E
!
3
4
@AB
聚合酶"
S
%
$
E
#
"+$
$
E
!用
??V
!
c
补足至
!+"
$
E
选择性扩增程序为
0$a
变性
!
3-/
&
0$a
变性
%".
!
*a
退火"每个循环结束后退
火温度降低
"+&a
#
%".
!
&!a
延伸
!3-/
!
#%
个循
环&
0$a
变性
%".
!
*a
退火
%".
!
&!a
延伸
!
3-/
!
%
个循环&
!a
延伸
!"3-/
!
$a
保温+#M,
@+E+A
!
扩增产物的检测
!
利用
*J
变性聚丙烯酰
胺凝胶电泳!检测扩增产物!
&"O
恒功率预电泳
$"
3-/
!使整个胶板温度均匀"
"a
左右#将选择性
扩增产物与
E<4?-/
7
K9RR>8
"
0MJ
去离子甲酰胺!
#"
33<5
%
E2@HB
!
"+!J
溴酚蓝和二甲苯青#按体积
比
#f#
混合!
0a
变性
3-/
!冰浴待用每个泳
道加样

$
E
!
*"O
恒功率电泳!电泳结束后通过银
染检测扩增产物+#0,
@+F
!
引物的筛选
胶板干燥后及时记录!将电泳图谱上清晰且可
重复出现的条带记为-
#
.!同一位置没有条带的记为
-
"
.!生成-
"
.和-
#
.组成的原始矩阵根据扩增条带
数量和多态性筛选引物!确定较优引物组合
@:G
!
$%&
指纹图谱的构建*特异数字指纹的转换
及遗传相似系数的计算
采用上述最佳反应条件及筛选出的引物组合!
进行扩增*电泳!构建
BDEF
指纹图谱对聚丙烯
酰胺凝胶电泳的银染结果进行拍照!并且只统计能
够清晰分辨的条带+!",统计各品种
$
个引物组合
在
#"""
#
%""K
L
区间
&
个区段的扩增条带!将各品
种
BDEF
指纹图谱转换成各品种由
!M
位数构成的
特异数字指纹
将上述-
"
.*-
#
.原始矩阵数据输入
AHUQU
!+#"
软件!计算各品种间的遗传相似系数
!
!
结果与分析
A:@
!
$%&
最佳反应体系的建立及引物的筛选
基因组
@AB
提取的样品电泳结果显示$提取
得到的基因组
@AB
长度在
#"""K
L
左右!条带整
齐清晰"图
#
#!用
c@)!"""
测得所提取
@AB
的浓
度!根据
B
!*"
%
B
!M"
比值判断其纯度!符合
BDEF
试
验下游操作的要求对酶切条件的处理!得到最佳
条件为酶切时间
*=
*酶量
$S
在对不同条件下连
接产物预扩增后发现!在
!a
*连接
#!=
时!获得
的条带最亮"图
!
#连接产物用于预扩增时!
%
个稀
释倍数均能得到预扩增产物!其中连接产物不稀释
时!条带最亮!预扩增效果最好对试验过程的不同
条件探索后!建立的
BDEF
最佳反应体系如下$
!
#
"酶切体系
!
@AB
"
%"/
7
%
$
E
#

$
E
!
!/%C
"
"
#"S
%
$
E
#
"+$
$
E
!
0#1
"
"
#"S
%
$
E
#
"+$
$
E
!
#"b
K9RR>8H4/
7
<
$
E
!用
??V
!
c
补足至
!"+"
$
E
酶
切时间
*=
!酶切温度
%&a

!
!
"连接体系
!
酶切产物
#"
$
E
!
!/%C
"
接头
"

$
3<5
%
E
#
$
E
!
0#1
"
接头"
"
$
3<5
%
E
#
$
E
!
H
$
@ABE-
7
4.>
"
#"S
%
$
E
#
#
$
E
!
#"bH
$
@ABE-
7
4.>
K9RR>8!
$
E
!用
??V
!
c
补足至
!"+"
$
E
连接时间
#!=
!连接温度
!a

!
%
"预扩增体系
!
连接产物
%
$
E
!
!/%C
"
引物
"
"
$
3<5
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E
#
$
E
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0#1
"
引物"
"
$
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E
#
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!
"
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$
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"
!
$
3<5
%
E
#
"+!
$
E
!
3
4
@AB
聚合酶"

图
#
!
基因组
@AB
的凝胶电泳
]+@E#"""
&
#+
玛丽艾基粉色&
!+
圣剑白底紫边
D-
7
+#
!
I>5>5>;Y8<
L
=<8>.-.7
>/<3-;@AB
]+@E#"""
&
#+@<9K5>]48-4;=-F-/&
!+2:;45-K98Z59>F-;>
图
!
!
不同连接条件下预扩增产物的凝胶电泳检测
]+@E!"""
&
#
*
!+!a
!
*=
&
%
*
$+!a
!
#!=
&

*
+%&a
!
*=
&
&
*
M+%&a
!
#!=
&
#
*
%
*

*
&+
玛丽艾基粉色&
!
*
$
**
M+
圣剑白底紫边
D-
7
+!
!
F8>)43
L
5-R-;4Y-L
4YY>8/.8>/Y5-
7
4Y-]+@E!"""
&
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*
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M+2:;45-K98Z59>F-;>
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&
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王瑞鑫!等$洋桔梗品种遗传多样性的
BDEF
分析
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$
E
#
"+$
$
E
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!
c
补足至
!+"
$
E

!
$
"选择性扩增体系
!
预扩增产物"稀释
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$
E
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引物"
"
$
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$
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引物"
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!
c
补足至
!+"
$
E

*$
个引物组合选择性扩增结果表明!
*$
个引物
组合均能对
!
个品种(玛丽艾基粉色)和(圣剑白底
紫边)进行扩增分析电泳图谱!共获得
#$
个多态
性条带&筛选出多态性较好和扩增条带较多的
$
个
引物组合!分别为
!)BGB
%
0)GHG
*
!)BGG
%
0)GBG
*
!)BIG
%
0)GHH
和
!)BGH
%
0)GBI
!其平均多态位
点百分率为
!$+%*J

A:A
!
$%&
指纹图谱的构建*特异数字指纹的转换
及遗传相似系数的计算
采用上述最佳反应条件及筛选出的
$
个引物组
合!进行扩增*电泳!获得了
&
个洋桔梗品种清晰的
BDEF
指纹图谱"图
%
#统计指纹图谱中各个品种
$
个引物组合在
#"""
#
%""K
L
区间
&
个区段的扩
增条带!将各个品种的
BDEF
指纹图谱转换成各个
品种
$
个引物组合各
&
个区段共
!M
位数构成的特
异数字指纹"表
#
#利用
AHUQU!+#"
软件计算
出
&
个品种间的遗传相似系数"表
!
#在
"+*M%
#
图
%
!
&
个洋桔梗品种
$
个引物组合的
BDEF
指纹图谱
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&
#+
玛丽艾基粉色&
!+
玛丽艾基绿色&
%+
圣剑白底紫边&
$+
露西塔
#
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+
露西塔
!
白色&
*+
雪莱香槟色&
+
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"
*
%
*
&
*

分别为
!)BGB
%
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!
!)BGG
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!)BIG
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!)BGH
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玛丽艾基绿色
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露西塔
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粉边
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露西塔
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玛丽艾基粉色
@<9K5>]48-4;=-
F-/玛丽艾基绿色
]48-4;=-
E-3>I8>>/
圣剑白底紫边
2:;45-K98
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粉边
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F-/\F-;>
露西塔
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白色
C<.-Y4!
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@<9K5>]48-4;=-F-//
玛丽艾基绿色
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论
BDEF
*
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和
PUUC
是
%
种常用于物种多样
性研究*种质鉴定和遗传图谱构建的分子标记技术
至今!已有许多同时使用这
%
种分子标记的比较研
究!如
g=4/
7
等+!#,进行关于菊花遗传连锁图谱的研
究中!根据得到的连锁图谱发现!
CBF@
和
PUUC
多
态性水平比
BDEF
高!但是
BDEF
扩增的有效条带
总数比
CBF@
和
PUUC
高很多&
C>9/<[4
等+!!,关于
高丽参遗传变异的研究中发现!虽然
BDEF
*
CBF@
和
PUUC
检测出的种群分化水平均较低!但是在检
测高丽参遗传变异时!
BDEF
检测出更高的遗传变
异水平&
Z4?R48)G=45>.=Y<8-
等+!%,有关冠花贝母种群
遗传多样性研究表明!这
%
种方法均能检测出基因
组中
@AB
序列的多态性!
BDEF
技术检测出多态
@AB
标记达
00+J
!而
PUUC
*
CBF@
则分别是
M"+%J
与
M%+!J
!
BDEF
比
PUUC
*
CBF@
更有效
此前!本实验室建立了洋桔梗
PUUC
最佳反应体系!
并进行了相关遗传多样性分析+!$,利用该
PUUC
分
子标记成功检测出了受试的
$
个洋桔梗品种之间*
同一品种
D
#
代及
D
!
代之间的遗传多样性!但未能
检测出同一品种
D
#
代不同株系之间等的遗传多样
性本研究以洋桔梗
BDEF
最佳反应体系及筛选
出的
$
个最适引物组合!构建了受试的
&
个洋桔梗
品种多态性好*稳定性高的
BDEF
指纹图谱!有效
检测出了受试的
&
个洋桔梗品种间的遗传多样性
本研究结果为进一步进行洋桔梗的种质研究及利用
奠定了重要基础
为方便种质比较*鉴定!本研究还统计了该
BDEF
指纹图谱中各个品种
$
个引物组合"
!)BGB
%
0)GHG
*
!)BGG
%
0)GBG
*
!)BIG
%
0)GHH
和
!)BGH
%
0)GBI
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#"""
#
%""K
L
区间
&
个区段的扩增条
带!进一步将各个品种的
BDEF
指纹图谱转换成各
个品种
$
个引物组合各
&
个区段共
!M
位数构成的
特异数字指纹"(玛丽艾基粉色)的特异数字指纹为
#!##$$
*
#!!!#%$
*
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*
"###%%*
&(玛丽艾基绿
色)的特异数字指纹为
##!%$$
*
#!!!##%
*
!!##!#%
*
""##$%
#根据不同品种等的特异数字指纹!直接
比较它们的特异数字指纹差异!即可很容易地将它
们加以区分*鉴定与甘蔗+!",*西瓜+!,的相关研究
比较!本研究得到的特异数字指纹更加具体明确!且
该特异数字指纹是以扩增条带"不是差异条带#为基
础构建的因此!其可不以与其它种质比较为条件
而独立构建
有许多不同分类地位植物之间遗传相似系数的
研究!如番石榴属+!*,的两个种之间的遗传相似系数
在
"+!M
#
"+0M
之间!黑麦属+!&,的
#!
个种与亚种之
间的遗传相似系数在
"+$0
#
"+&0
之间!沙特阿拉伯
枣椰树+!M,的
#"
个品种之间的遗传相似系数在
"+*%
#
"+M$
之间同属的种与种*同属的种与亚种*同
种不同品种之间的遗传相似系数变幅范围越来越
小!遗传差异越来越小本研究利用
AHUQU!+#"
软件计算出
&
个洋桔梗品种间的遗传相似系数在
"+*M%
#
"+M*"M
之间!遗传相似系数变化幅度较
小!品种间遗传差异较小
在本研究的基础上!可深入探究
BDEF
分子标记
方法的敏感性!建立洋桔梗更多种质的特异指纹数据
库!进一步开展更多洋桔梗"不同品种间及同一品种
D
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代株间等#遗传多样性分析及种质鉴定研究
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