全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
!"#$)"+)#&
&修改稿收到日期$
!"#$)##)#$
基金项目$棉花生物学国家重点实验室开放课题"
12!"#%3#(
#
作者简介$王永强"
#4&!
#!男!在读博士研究生!主要从事棉花分子遗传方面的研究
5)67.8
$
970
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.70
:
*"!
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"
通信作者$张寒霜!研究员!主要从事棉花遗传育种工作
5)67.8
$
?70/?@70
:
A?70
:!
#!+,><6
棉花耐盐相关基因
12345$
的克隆与表达分析
王永强#!!何晓亮%!刘建光#!杜淑凤#!赵俊丽#!赵贵元#!张寒霜#"
"
#
河北省农林科学院棉花研究所 国家棉花改良中心河北分中心!农业部黄淮海半干旱区棉花生物学与遗传育种重点实验室!石
家庄
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&
!
中国农业科学院棉花研究所 棉花生物学国家重点实验室!河南安阳
$**"""
&
%
河北科技大学 生物科学与工程学
院!石家庄
"*""#&
#
摘
!
要$
BCD
结构蛋白是真核生物中一类重要的转录因子!参与基因转录(细胞骨架建成和信号传导等许多发育
调控过程该研究利用
EF)G1E
方法从棉花陆地棉耐盐材料
H#*
中克隆得到了
#
个新的转录因子
!"#$%&
"
IJ0)
270K
登录号为
LM+"#!"&
#
!"#$%&
基因包含一个
+!(N
O
的开放阅读框!编码
!"&
个氨基酸残基!分子量为
!%,!
KP
生物信息学分析发现!
"#$%&
基因含有
!
个完整的
BCD
结构域!
I?BCD7
与可可(蓖麻(欧洲大叶杨中该蛋
白的亲缘关系最近!相似性在
(&Q
以上实时定量
G1E
分析显示!盐诱导后在棉花耐盐材料)
H#*
*的根和叶中
!"#$%&
基因表达量均比敏盐材料)中棉所
#!
*高!而且响应时间早!说明
!"#$%&
基因与棉花耐盐性密切相关!推
测
!"#$%&
基因在棉花响应盐胁迫过程中具有重要作用
关键词$棉花&耐盐&
BCD
&表达模式
中图分类号$
R(&*
&
R(&4
文献标志码$
3
$%"&(&!)*
+
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H#*
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4-
5
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5
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87
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/78]/]_J//
&
BCD
&
Ja
O
_J//.<0
O
7]]J_0
!!
BCD
编码结构最早发现于线虫
6(*)##
+
#
,和
.1))%
+
!
,基因!及大鼠
(,6)#
+
%
,基因!以这
%
个基因首
字母命名
BCD
编码结构+$,!它是锌指结构蛋白的一
种!富含半胱氨酸!可结合
!
个
[0
!b
!具有双锌指结
构!是一类重要发育调控因子!参与转录激活调控(神
经递质和细胞骨架的生物合成以及核质穿梭等+*,
植物中最早报道的
BCD
蛋白是
GBCD)#
"最初也
称为
YM%
#!该蛋白在向日葵花粉中特异表达+,进
一步研究发现!
GBCD)#
参与花粉萌发和花粉管生
长+(,之后
D@0^J81
等+&,在向日葵中发现了另一类
BCD
蛋白
SBCD#
!该蛋白含有
!
个
BCD
结构域!在
许多类型细胞中均有表达!并参与细胞有丝分裂过
程
3K.
;
等+4,研究发现烟草
T]BCD#
能与
G78)
N结合!并参与调节类苯基丙烷合成途径与木质
素合成途径
!""+
年!
F?<67/1
等+#",对烟草
SBCD#
蛋白的研究发现该蛋白可通过促进肌动蛋
白细丝的聚合来增强肌动蛋白细胞骨架的稳定性
棉花"
!-,,
85
(+."(3,+7+.
#是重要的纤维作
物!目前从棉花中克隆的
#$%
相关基因的报道有多
个!其中罗明等+##,从陆地棉)徐州
#$!
*胚珠中克隆
到
!"#$%#
!通过
EF)G1E
和
T<_]?J_0
杂交分析表
明该基因与纤维发育有关
H70
等+#!,研究表明
SBCD#7
在纤维伸长期和次生壁形成期具有重要
功能!过表达该基因能使纤维相对于对照变长变细
巫岳+#%,从棉花的
>PT3
文库中分离得到
*
个棉花
#$%
基因!分别命名为
!"#$%!
"
!"#$%+
!实时荧
光定量
G1E
分析显示!
*
个
#$%
基因在不同组织
中的表达量有差异!推测这
*
个基因具有不同的功
能
[?70
:
等+#$,利用
YYH
技术选到与耐盐相关的
$+&
条
@0.5YF/
!其中发现
!"#$%
受到盐胁迫后显
著下降这些结果表明
#$%
基因家族是一个大的
基因家族!具有多种生物调节功能
本研究通过
>PT3)3MBG
技术获得了盐胁迫
下差异表达片段序列信息!通过电子克隆和
EF)
G1E
克隆得到了
#
个编码
BCD
家族蛋白的基因!
通过克隆陆地棉
BCD
蛋白的编码基因
!"#$%&
!并
对其盐胁迫后的表达情况进行分析!旨在为进一步
认识该基因的功能奠定基础
#
!
材料和方法
:,:
!
材
!
料
本试验所用棉花为陆地棉!盐敏感材料)中棉所
#!
*"
[DY#!
#由中国农业科学院棉花研究所提供!
河北省农林科学院棉花研究所种植保存&耐盐材料
)
H#*
*由河北省农林科学院棉花研究所提供种子
经硫酸脱绒后!先以
",#Q
升汞消毒
#"6.0
!用无菌
蒸馏水洗净后!在培养箱中催芽!培养至四叶期后!
用
!""66<8
%
BT718
进行处理!分别在处理后
"
(
#
(
%
(
+
(
#!
和
!$?
!取处理后棉花植株的根和叶!用铝
箔包好!液氮速冻后
&"c
保存
:,;
!
基因克隆和序列分析
采用
G_<6J
:
7ET3
提取试剂盒!提取盐敏感材
料)中棉所
#!
*和耐盐材料)
H#*
*各处理后根和叶
的
ET3
!
>PT3
合成按照
F7L7E7
公司反转录试剂
盒操作说明进行根据
5YF
比对和
PT3/]7_
软件
拼接获得全长
>PT3
序列!使用
G_.6J_G_J6.J_*,"
软件设计特异引物"表
#
#!以经
!""66<8
%
BT718
处
理
!$?
的)
H#*
*叶片
>PT3
为模板!进行
EF)G1E
扩
增!扩增产物回收!由上海生工公司测序
:,<
!
生物信息学分析
对获得的基因
>PT3
进行
287/]
"
?]]
O
$%%
999,
O
?
;
]%#比对!并登陆
?]]
O
$%%
N87/],0>N.,
086,0.?,
:
<`
%
287/],>
:
.
进行氨基酸序列同源比对!
采用
PT3D3T
软件对序列进行多重比较!然后用
D5I3*
构建进化树和编辑并生成报告图形
:=>
!
12345$
在不同材料中的表达分析
实时定量
EF)G1E
在
R)F\S5E
定量
G1E
仪
"
3078
;
].KXJ07
!
IJ_670
;
#上进行!使用
=
G1E/%,"
版软件对结果进行分析实时定量
EF)G1E
反
应体系参考全式金
F_70/Y]7_]I_JJ0
=
G1EY@
O
J_)
D.a
试剂盒推荐体系!扩增条件为
4*c
预变性
*
6.0
&
4$c
变性
#*/
!
*&c
退火
#*/
!
(!c
延伸
#*
/
!
$"
个循环&以棉花
H./]<0J%
基因"
3M"!$(#+
#为
内参来进行标准化用软件
G_.6J_
O
_J6.J_*,"
设
计
9(,7-*1%
基因和
!"#$%&
基因的引物"表
#
#
采用
$
:
F
比较定量法进行定量分析!每一样品做
%
表
:
!
本试验引物
F7N8J#
!
G_.6J_/@/J^ .0]?./]J/]
引物
G_.6J_
引物序列
YJ
=
@J0>J
"
*d
%
%d
# 用途
M@0>].<0
I?BCD7)M#
I?BCD7)E#
3FII1I313FF1133II
FF31I31F13I1FI133F1F1
克隆基因全长
IJ0J>8<0J
I?BCD7)M!
I?BCD7)E!
I11IF13III113313F1
11II31III131FF1FFI
荧光定量
G1ER@70].]7].`J
_J78)].6JG1E
H./]<0J%)M
H./]<0J%)E
133I31FI3FFFI1IFFF113
I1I1333IIFFIIFIF1FF1
荧光定量
G1E
内参
F?J
.0]J_078_JZJ_J0>J
%&%!
#!
期
!!!!!!!!!!!!
王永强!等$棉花耐盐相关基因
!"#$%&
的克隆与表达分析
次重复
!
!
结果与分析
;=:
!
12345$
基因克隆
盐胁迫下!通过
>PT3)3MBG
技术获得)
H#*
*
和)中棉所
#!
*差异表达片段序列!从中选取盐处理
后表达量增加的片段!进一步通过
5YF
比对(
PT3/]7_
软件拼接技术和
EF)G1E
方法!成功克隆
该基因的全长"图
#
#该基因含有
+!(N
O
完整开放
阅读框!编码
!"&
个氨基酸!分子量为
!%,!KP
!包
含有
!
个保守的
BCD
结构域!将其命名为
!"#$/
%&
!
IJ0270K
登录号为
LM+"#!"&

;,;
!
生物信息学分析
与雷蒙德氏棉"
!-,,
85
(+.3&(.-*;((
#基因组
进行
287/]
比对!结果表明
!"#$%&
基因的
PT3
序
列全长
!!+*N
O
!位于
#!
号染色体!含有
*
个外显
子和
$
个内含子保守结构域分析表明该基因含有
!
个完整的
BCD
结构域!分别位于氨基酸
(
"
+4
和
#"4
"
#+4
之间
将获得的陆地棉
!"#$%&
翻译的氨基酸序列
与已克隆的陆地棉其他
(
个
BCD
结构的氨基酸序
列进行比较!比对结果显示该基因翻译的氨基酸序
列与
I?BCD$
相似度最低!仅为
$&,$Q
!与
I?BCD+
相似度最高!达到
&",(Q
"图
!
#通过系统进化树
分析发现获得的
!"#$%&
翻译的氨基酸序也与陆
地棉
I?BCD+
进化关系最近"图
%
#将该氨基酸序
列与蓖麻"
()(*+,)-..+*(,
#(可可"
0"1-23-.&
)&)&-
#(欧洲大叶杨"
4-
5
+6+,73()"-)&3
5
&
#(大麦
"
9-3;1+.<+6
=
&31
#(小麦"
03(7()+.&1,7(<+.
#(苜
蓿"
%1;()&
=
-73+*)&7+6&
#(烟草"
>()-7(&*&7&2&/
)+.
#(拟南芥"
?3&2(;-
5
,(,7"&6(&*&
#
&
个物种同源
基因的氨基酸序列进行
287/]
O
比对以及系统进化
树 分析序列比对发现其与许多物种的
BCD
结构
图
#
!
棉花
!"#$%&
基因全
>PT3
的克隆
箭头所指为
EFG1E
产物
M.
:
,#
!
18<0J70^ .^J0].Z.>7].<0>PT3Z<_!"#$%&.0><]]<0
F?J7__<9//?<9]?J]7_
:
J]Z_7
:
6J0]/
图
!
!
陆地棉不同
BCD
氨基酸序列比对
括号的编号为基因登录号&下同
M.
:
,!
!
38.
:
06J0].^ /J
=
@J0>J/F?J7>>J//.<0T<,97/
:
.`J0.0N_7>KJ]/
&
F?J/76J7/NJ8<9
$&%!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
蛋白有很高的相似性"图
$
#&进化树结果分析表明!
I?BCD7
与蓖麻(可可(欧洲大叶杨的
BCD
蛋白分
为一支!一致性在
(&Q
以上!大麦和小麦的
BCD
蛋
白聚为一支!其余为一支"图
*
#
;=<
!
12345$
基因在不同耐盐性棉花中的表达
为进一步分析
!"#$%&
基因在盐胁迫下的表
达情况!选用盐敏感材料)中棉所
#!
*和耐盐材料
)
H#*
*为研究对象!利用实时荧光定量
G1E
对
!"/
#$%&
基因分别在
!
个材料的根和叶中进行表达分
析结果显示!在)
H#*
*和)中棉所
#!
*的根中!
!"/
#$%&
基因表达量都呈先上升后下降的趋势&但在
)
H#*
*的根中
!"#$%&
表达量急剧上升!
#?
即达
最大值!并且变化幅度比较大!接近未处理时的
+
倍!随后迅速降低到未处理水平!在
#!?
时表达量
图
%
!
陆地棉不同
BCD
进化树
M.
:
,%
!
G?
;
8<
:
J0J].>]_JJ.^ /J
=
@J0>J/图
$
!
不同植物
BCD
氨基酸序列比对
M.
:
,$
!
38.
:
06J0].^ /J
=
@J0>J/O
870]//
O
J>.J/
图
*
!
不同植物
BCD
进化树
M.
:
,*
!
G?
;
8<
:
J0J].>]_JJ.^ /J
=
@J0>J/O
870]//
O
J>.J/
*&%!
#!
期
!!!!!!!!!!!!
王永强!等$棉花耐盐相关基因
!"#$%&
的克隆与表达分析
图
+
!
盐胁迫下
!"#$%&
在
H#*
和中棉所
#!
不同组织中的相对表达量及其荧光定量
G1E
溶解曲线图
3,H#*
根&
2,H#*
叶&
1,
中棉所
#!
根&
P,
中棉所
#!
叶&
3d
(
2d
(
1d
(
Pd
分别为
3
(
2
(
1
(
P
所对应的荧光定量
G1E
的溶解曲线&
"
表示处理与对照间存在显著性差异!
7
检验
4
&
","#
M.
:
,+
!
EJ87].`JJa
O
_J//.<070^ G1E6J8]>@_`J<]]<0@0^J_/78]/]_J//
3,H#*_<<]
&
2,H#*8J7Z
&
1,[DY#!_<<]
&
P,[DY#!8J7Z
&
3d
!
2d
!
1d
!
Pd7_J
=
@70].]7].`J_J78)].6JG1E6J8]
>@_`J/!
2
!
170^ P
!
_J/
O
J>].`J8
;
&
"
.0^.>7]J/.
:
0.Z.>70]^.ZZJ_J0>J/
!
7)]J/]4
&
","#
略微升高!
$?
时又恢复到未处理水平"图
+
!
3
#&
而在)中棉所
#!
*根中
!9#$%&
表达量呈逐步上升
趋势!在
%?
达到最大值!接近未处理时的
!,*
倍!
随后降低到未处理水平"图
+
!
1
#在)
H#*
*和)中
棉所
#!
*的叶中!
!"#$%&
基因在)
H#*
*叶中表达
量先逐步升高然后逐渐降低!表达量在
+?
达到最
大值!达到未处理时的
*
倍"图
+
!
2
#&在)中棉所
#!
*
叶中表达量迅速升高持续到
%?
!然后逐渐降低!但
在
!$?
时又升高!达到未处理时的
!,*
倍"图
+
!
P
#上述结果表明!
!"#$%&
基因在棉花的根和叶
中均有表达并且盐胁迫诱导表达增强在耐盐材料
)
H#*
*中
!"#$%&
基因上调表达更为显著!进一步
说明
!"#$%&
基因参与了棉花耐盐代谢调控
%
!
讨
!
论
土壤盐碱化是影响植物生长的重要非生物胁迫
因素之一在植物对盐胁迫的应答过程中!转录因
子发挥着重要作用盐胁迫时!转录因子会与相应
的顺式作用元件结合!启动下游相应基因的转录表
达!减轻胁迫给植物带来的伤害目前已报道了许
多类与盐胁迫相关的转录因子!如
SELU
(
DU1
(
PE52
(
DU2
(
NHBH
(
T31
(
N[CG
(
1!H!
等然而!
仍有许多盐胁迫基因未被鉴定
BCD
蛋白广泛存在于真核生物中!是一类具有
#
个或多个锌指结构的蛋白质家族!其家族中的蛋
白质通过
BCD
结构域与一些结构蛋白(激酶(转录
因子等多种蛋白相互作用!参与细胞的发育(分化调
节及多种基因的转录调控等+#*,植物
BCD
蛋白家
族早期研究主要集中在向日葵(烟草和拟南芥等植
物中!研究表明植物
BCD
蛋白都能结合肌动蛋白!
发挥转录因子作用+#+,已报道的
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并且表达量明显低于耐盐材料由此可见
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关!可能对植物提高耐盐性有一定作用
截至目前!尽管在植物中已经克隆得到了许多
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