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Specific Expression of BnDGAT1 Gene in Brassica napus

甘蓝型油菜BnDGAT1基因表达的特异性分析



全 文 :书西北植物学报!
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文章编号$
#"""*+"!&
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#
"*#%&*")
收稿日期$
!"#$*",*",
%修改稿收到日期$
!"#$*"%*"+
基金项目$国家自然科学基金"
$#!"#!&$
#%转基因生物新品种培育重大专项"
!"##-.""#"*""$
#%山西省农业科学院博士基金
"
/0122#!"+
#%山西省科技攻关项目"
!"#!"$##""$*!
#%山西省自然科学青年基金"
!"#$"!#"!+*$
#
作者简介$马燕斌"
#%,(
#!男!博士!助理研究员!主要从事植物基因功能研究&
3*4567
$
4
8
96:

;<
!
#)$=>?4
"
通信作者$李燕娥!学士!研究员!主要从事棉花分子遗传育种研究工作&
3*4567
$
7
8
@!,"
!
#!)=>?4
甘蓝型油菜
%/12!3!
基因表达的特异性分析
马燕斌#!$!吴
!
霞#!王
!
霞#!!杜春芳#!孙
!
璇#!王新胜#!范建春#!李燕娥#"
"
#
山西省农业科学院棉花研究所!山西运城
"++"""
%
!
山西运城学院生命科学系!山西运城
"++"""
%
$
农业部黄土高原作物基因
资源与种质创制重点实验室!太原
"$"""#
#

!
要$该研究从甘蓝型油菜中克隆获得了二酰甘油酰基转移酶基因"
!"#$
#!命名为
%&!"#$#
!并对该基因编
码的氨基酸序列(蛋白结构域和系统进化树进行分析&结果表明$该基因编码的氨基酸序列包含二酰甘油酰基转
移酶等多个功能结构域!并具有

个疏水跨膜结构区&系统进化分析表明!
0:ABCD#
与芥菜(拟南芥(旱金莲中
ABCD#
系统进化关系相对较近&利用定量
EFG

%&!"#$#
基因的
GHC
转录表达分析表明!在不同组织和角
果的不同发育阶段!
%&!"#$#
基因的表达具有组织特异性!且在角果不同发育阶段!其
GHC
转录水平随着角果
发育的成熟表达明显下调&
关键词$油菜%二酰甘油酰基转移酶%表达分析
中图分类号$
I,)
文献标志码$
C
"
#
$%&&%()
#
*$++&,-,%/12!3!.$-$&-%($44-"$/$
5
64
JC/5:96:
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KL.65
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KCHB.65
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X
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8
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D56
8
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X
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X
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7
P
7
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8
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ABCD
#
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,
-)5:W
:54@W%&!"#$#
P
@:@=DM@546:?5>6WQ@
[
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!
X
V?U@6:W?456:Q5:W
X
M
8
7?
P
@:@U6>UV@@;@V@5:57
8
\@W=
DM@0:ABCD#
X
V?U@6:;5Q
X
V@W6>U@WUM5UUM@546:?Q@
[
N@:>@Q;@V@>?4
X
?Q@W?OQ@Y@V57>?4
X
7@U@7
8
ON:>*
U6?:57W?456:Q
!
5:W@6
P
MUM
8
WV?
X
M?96>UV5:Q4@49V5:@QUVN>UNV@Q;@V@W@U@>U@W9
8
1]1LT=EM
8
7?
P
@:@U6>
UV@@5:57
8
Q6Q6:W6>5U@WUM5U0:ABCD#;@V@>7?Q@V;6UM0
^
ABCD#
!
CUABCD#5:WD4ABCD#UM5:;6UM
?UM@V
X
75:U=T:5WW6U6?:
!
@<
X
V@QQ6?:
X
V?O67@Q?O%&!"#$#;@V@V@Q
X
@>U6Y@7
8
5:57
8
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P
V@57*U64@EFG
5QQ5
8
QO?VW6OO@V@:U?V
P
5:6\5U6?:U6QQN@Q5:WW@Y@7?
X
4@:UQU5
P
@Q?OV5
X
@
X
?W=D6QQN@*Q
X
@>6O6>@<
X
V@QQ6?:
QM?;@WUM5UUM@UV5:Q>V6
X
U6?:@<
X
V@QQ6?:7@Y@7Q6:7@5O5:WO7?;@V;@V@M6
P
M@VUM5:UM5U6:V??U5:WQU@4=
J?V@?Y@V
!
UM@@<
X
V@QQ6?:7@Y@7Q?OGHCUV5:Q>V6
X
U6?:?O
X
?W;@V@
P
V5WN57
8
W?;:*V@
P
N75U@W5UW6OO@V@:UW@*
Y@7?
X
4@:U57QU5
P
@Q?O
X
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3$
4
5,*6+
$
V5
X
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"
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,
-)
#%
ABCD
%
UV5:Q>V6
X
U6?:@<
X
V@QQ6?:5:57
8
Q6Q
!!
植物种子产生的油是人类热量来源的营养物之
一!三酰甘油"
DCB
#是种子油脂贮存的主要成分!
其生物合成的生化途径涉及多个亚细胞器官的协同
作用和重要酶的参与!种子细胞的内质网是
DCB
合成的场所!而
DCB
在油体内的积累则是通过内
质网膜类似于出芽而形成的*#*!+&二酰甘油酰基转
移酶"
ABCD
#是重要的内质网构成膜蛋白质!对生
物体内脂质代谢途径具有重要影响!是催化二酰甘
油与脂肪酸酰基反应生成
DCB
的关键限速酶*!*$+&
该酶存在
$
种类型!分别为
ABCD#
(
ABCD!
以及
ABCD$
*
+
+
&其中!编码
ABCD#
蛋白的基因首先从
老鼠中被克隆*&+!继而在拟南芥中也被克隆*)+!当前
在哺乳动物(植物等的脂肪酸代谢中研究较多%
ABCD$
为可溶性蛋白!在花生的子叶中被首先发
现!目前研究较少*,+&
ABCD#
参与生物体内大多数
DCB
的合成!研
究发现!在拟南芥(玉米中
ABCD#
的特异氨基酸突
变可以引起种子不同油含量的变化**#"+&当在烟草
中过表达拟南芥
!"#$#
基因时!烟叶中
DCB

量增加了
!"
倍!脂肪酸增加了
&=_
%该酶在种子
萌发(叶片衰老等发育过程的脂类代谢中也发挥作
用*##+&在拟南芥中过量表达
!"#$#
时!转基因株
系中
ABCD#
活性提高了
#"_
"
,"_
!且种子油分
沉积和平均粒重明显增加*#!+&在野生型酵母和拟
南芥中过表达卫矛
!"#$#
基因时!
DCB
含量均表
现为增加!其中前者的积累量达到了
&
倍*#$*#++&另
外!
GHC
转录分析表明!桐树
!"#$#
基因在不同
组织中表达水平基本相似*#&+&而有证据表明!在叶
片衰老过程中!
DCB
的积累与
!"#$#
基因表达量
的增加相关*#)+&此外!有研究表明!低氮含量条件
能够诱导硅藻
DCB
的积累!同时
!"#$#
的转录
水平的显著增加*#,+!可能与
!"#$#
基因的表达能
够被脱落酸途径的
#%.+
转录因子激活有关*#+&
油菜是重要的油料作物之一!在食用(饲用等方
面具有重要作用&目前!已知甘蓝型油菜
ABCD#
的基因序列是从小孢子中克隆的*#%*!"+!通过细胞悬
浮培养进行脂肪酸代谢研究表明!蔗糖能够诱导
ABCD#
在一定时间内促进
DCB
含量的增加*!#+!

ABCD#
蛋白能够形成四聚体*!!*!$+&本研究对甘
蓝型油菜
!#"$#
基因系统进化树以及编码蛋白高
级结构等进行分析预测!并对其在不同组织(角果不
同发育阶段的
GHC
转录水平等进行研究!为探讨
该基因在油脂代谢过程中的调控提供理论依据&
#
!
材料和方法
!=!
!

!

试验材料为油菜不育系
IC
(恢复系
IG
及其
杂交种
I,
!均由山西农业科学院棉花研究所油菜研
究组提供!并在棉花研究所农场田间种植!严格套袋
授粉&在各材料花期时分别取根(茎(叶(花等组织
样品!角果取样时间分别为自交授粉后
+
(

(
#!
(
#)

!"W
!用液氮迅速冷冻!
("`
保存备用&
!78
!
9:/
提取及其
%;:/
合成
分别取不同组织样品约
"=#
P
!利用
DV6\?7

剂"
T:Y6UV?
P
@:
!
L1C
#提取总
GHC
!经
AH5Q@T
处理
去除
AHC
污染(电泳检测质量及分光光度计测定
GHC
浓度后!取等量总
GHC
进行反转录!合成
>A*
HC
第一链!
(!"`
保存备用&
!7<
!
12!3!
基因的克隆及相关生物信息学分析

IC
油菜
>AHC
为模板!根据一个推定的编码
!"#$#
基因的
31D
序列"
CR#)++$+=#
#以及近缘材
料比对后设计引物$
ABCD#*R
"
&a*CDBBFBCDDDD*
BBCDDF*$a
#和
ABCD#*G
"
&a*DFCBBCFCDBBCD*
FFDDDB*$a
#%
EFG
扩增条件为
%+`
预变性
+46:
后进行循环扩增%
+`
变性
$&Q
!
&`
退火
+"Q
!
,!
`
延伸
+"Q
!共
+"
个循环%
,!`
总延伸
#"46:
!
#)`
保存
#46:
后进行凝胶电泳!回收获得预期大小的
!"#$#
目的条带!并与
X
JA#*D
载体"
D5Z5G5
!
25*
X
5:
#连接!转化大肠杆菌后!经酶切与
EFG
鉴定选
出正确克隆后测序&氨基酸比对及系统进化树分析
利用
AHCJCH
软件进行!跨膜结构域及蛋白高级
结构分别利用
1]1LT

FEb4?W@7Q$="
软件进行
分析&
!7=
!
12!3!
基因的实时定量
>?9
分析
通过比较分析
!"#$#
基因序列保守区!设计
定量
EFG
引 物 "表
#
#!内 参 为 油 菜
%&#+/*&
"
CR####!
#&实时定量
EFG
体系共
!&
#
S
!按试剂
盒"
06?*G5W6I 1/0G BV@@:1N
X
@V46!
06?*
G5W
!
b@V>N7@Q
!
FC
!
L1C
#说明书进行&反应程序

%&`
预变性
&Q
%
%&`
变性
&Q
!
&&`
退火
#"Q
!

!
!
实时荧光定量
>?9
分析用引物
D597@#
!
EV64@VQ?OV@57*U64@EFG
引物
EV64@V
序列
1@
[
N@:>@
"
&a
#
$a
#
片段长度
3<
X
@>U@WQ6\@
,
9
X
用途
ENV
X
?Q@
0:C>U6:*R
0:C>U6:*G
BDDBFDCDFFCBBFDBDDFD
CFDBFDFDDCBFFBDFDFF
$"" T:U@V:57V@O@V@:>@
P
@:@
0:ACBD#*R
"
GD*EFG
#
0:ACBD#*G
"
GD*EFG
#
FDCCDDFCBFDBCDCCBBDFB
BDCDCBCCBCDFFFFDDDFCCF
!#$ G@57*U64@EFG
%&%#
#"

!!!!!!!!!!!
马燕斌!等$甘蓝型油菜
%&!"#$#
基因表达的特异性分析
,!`
延伸
#"Q
!
"`!Q
!
+"
个循环&反应在
C
X
*
X
76@W06?Q
8
QU@4Q1U@
X
]:@E7NQ
DJ荧光定量
EFG

上进行!
$
次重复!定量结果采用
!
(
$$
FU法进行分析&
!
!
结果与分析
87!
!
油菜
12!3!
基因的克隆及氨基酸序列分析
克隆获得的油菜
!"#$#
基因"图
#
#!其完整
的编码序列为
#&!+
个核苷酸&利用
AHCJCH


!"#$#
基因编码
&",
个氨基酸!并进行不同植
物氨基酸序列比较分析"图
!
#&另外!通过
HF0T
X
V?U@6:975QU
分析表明!该氨基酸序列中第
,"
"
&")
个氨基酸为二脂酰甘油酰基转移酶的特征结构%第
!))
"
+%,
个氨基酸是
CG3#
结构域!即酰基辅酶
C
胆固醇酰基转移酶结构!该结构域与类脂化合物代
谢作用相关%第
!#$
"
+%)
个氨基酸为
J0]CD

构域!即膜结合酰基转移酶结构!表明该蛋白属于
J0]CD
超家族成员*#++&进一步分析发现!该氨基
酸序列
H
端序列包含有
05Q6>4?U6O
保守结构域"
%
#(

#
!
油菜
!"#$#
基因的克隆电泳
R6
P
=#
!
B@7@7@>UV?
X
M?V@Q6Q?OV5
X
@
!"#$#
P
@:@54
X
76O6>5U6?:

!
!
油菜
ABCD#
推定氨基酸序列分析
重复
S
为亮氨酸结构域!
E
(
1
表示脯氨酸"
EV?
#和丝氨酸"
1@V
#%
HF0T
中登录编码为拟南芥
CUABCD#
"
CR"&#+%
#(
芥菜型油菜
0
^
ABCD#
"
CC/+",+
#(蓖麻
G>ABCD#
"
3L$%#&%#
#(大豆
B4ABCD#
"
HE*""#!$,)+
#&
%
=
保守结构%
&
=
酰基辅酶
C
结合位点%

=
脂肪酸蛋白特征%
(
=ACB
结合位点%
)
=
内质网检索基序
R6
P
=!
!
JN7U6
X
7@576
P
:4@:U5:57
8
Q6Q?OW@WN>@W546:?5>6WQ@
[
N@:>@Q?O0:ABCD#6:V5
X
@
DM@V@
P
6?:?O5>?:Q@VY@7@N>6:@V@
X
@5U;5Q45Vc@W9
8
O6Y@>5
X
6U577@UU@V?OS
%
DM@>V6U6>57EV?5:W1@VV@Q6WN@Q;@V@W@Q>V69@W9
8
>5
X
6U57
7@UU@VQ?OE5:W1=HF0T5>>@QQ6?::N49@VQ5V@#(0*12
,
)*)/3(4*(&(CUABCD#
"
CR"&#+%=#
#!
%())*+(
5
-&+6(0
^
ABCD#
"
CC/+",+=#
#!
7*+*&-)+288-&*)G>ABCD#
"
3L$%#&%#
#!
"4
9
+*&68(:B4ABCD#
"
HE*""#!$,)+
#
=DM@5WY5:>@WW?456:>?:Q6QU
?O95Q6>4?U6O
"
%
#!
5>
8
7*F?C96:W6:
P
Q6U@
"
&
#!
UM@O5UU
8X
V?U@6:Q6
P
:5UNV@
"

#!
ACB*96:W6:
P
"
(
#
5:W3G*ATG
"
)
#
")%#
西
!

!

!

!

!

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
$$

C>
8
7*F?C
结合位点"
&
#(脂肪酸蛋白特征"

#(
ACB
结合位点"
(
#以及内质网检索基序"
)
#&另
外!该氨基酸序列还包含有一个重要的亮氨酸"
S
#
拉链结构域!并存在关键的脯氨酸
EV?
和丝氨酸
1@V
&
878
!
油菜
;./@!
系统进化树分析
对克隆获得的油菜
!"#$#
基因的推测氨基酸
序列与芥菜(拟南芥(旱金莲以及果蝇等推测的
ABCD
的氨基酸序列进行系统进化树分析!结果表
明!油菜与十字花科芥菜和拟南芥的
ABCD
进化关
系较近!具有较高的相似性"
)=!&_
#%而与金莲花
科"旱金莲#(大戟科"蓖麻(油桐#(菊科"斑鸠菊(向
日葵#(茄科"烟草#(蝶形花科"大豆#以及禾本科"水
稻(玉米(大麦(乌拉尔图小麦#等系统进化关系相对
较远"图
$
#&
87<
!
油菜
12!3!
基因编码蛋白的结构分析
利用克隆基因
!"#$#
所编码的氨基酸序列!

#.J3=C
蛋白结构为模板!对该蛋白的高级结构
与蛋白特性分析&结果表明!该蛋白序列中第
##!
"
&""
的氨基酸序列能够与
#.J3=C
蛋白相吻合!
能够折叠形成具有
#"

*
*
螺旋的高级蛋白结构域
"图
+
#&进一步通过
1]1LT
在线软件分析预测表
明!该基因编码的蛋白具有

个疏水跨膜结构!分别

1
##
*3
#+"
(
A
#)!
*Z
#+
(
1
#%!
*d
!#+
(
R
!!!
*b
!++
(
R
$&,
*R
$,%
(
Z
+#%
*E
++#
(
H
++)
*3
+)以及
B
+,#
*S
+%$
&
87=
!
油菜
12!3!
基因组织表达特异性分析
定量
EFG
分析
!"#$#
基因在油菜不同组织
中的转录表达!同时!为确定组织特异性表达的可靠
性!本试验选取
$
个材料进行表达分析&结果表明!
油菜
!"#$#
基因表达具有组织特异性%在花和叶

$
!
油菜
0:ABCD#
的系统进化树分析
图中括号内为
B@:05:c
登录号
R6
P
=$
!
EM
8
7?
P
@:@U6>UV@@?O
X
V@W6>U@W546:?5>6WQ@
[
N@:>@QOV?4V5
X
@
B@:05:c5>>@QQ6?::N49@V6:
X
5V@:UM@Q@Q

+
!
油菜
ABCD#
的蛋白质构象
左图不同颜色表示不同
*
*
螺旋!右图为相应
*
*
螺旋的实心分子立体结构图
R6
P
=+
!
EV?U@6:>?:O?V45U6?:?OV5
X
@0:ABCD#
*
*M@76<6:W6>5U@W9
8
W6OO@V@:U>?7?VQ6:UM@7@OU
X
6>UNV@=DM@Q?76WUMV@@*W64@:Q6?:574?7@>N75V
QUVN>UNV@W65
P
V54?O>?VV@Q
X
?:W6:
P*
*M@76<;@V@QM?;@W6:UM@V6
P
MU
X
6>UNV@
#)%#
#"

!!!!!!!!!!!
马燕斌!等$甘蓝型油菜
%&!"#$#
基因表达的特异性分析
组织中相对表达量较高!在茎和根组织中相对表达
量较低"图
&
#&以叶中的表达量为
#
标准化各个组
织的表达!在
IC
材料中!
!"#$#
在花(茎和根中
的相对表达量约分别是叶中表达量的
+=)%
(
"=#)

"="&
倍%在
IG
材料中!
!"#$#
在花(茎和根中的
相对表达量分别约是叶中的
#=+
(
"=!$

"=##
倍%
而在
I,
材料中!
!"#$#
花(茎和根中的相对表达
量分别约是叶中表达量的
"=+!
(
"="$

"=!#
倍&
87A
!
油菜
12!3!
基因在角果不同发育阶段的表
达特性
利用
!"#$#
基因的共同引物作为定量分析引
物!分别对严格自交授粉后
+
"
!"W
不同发育阶段
的角果
!"#$#
基因表达进行分析&结果表明!在
IG

I,
角果发育成熟的不同过程中!
!"#$#

对表达量均逐渐降低"图
)
#&其中!在油菜
IG

I,
授粉后
+W
!
!"#$#
基因相对表达水平较高!授
粉后
W
该基因相对表达量分别为
+W
表达量的
"=!
倍和
"=$%
倍!授粉后
#!
(
#)

!"W
分别约下
降为
"=!!
倍和
"=!&
倍(
"=#+
倍和
"=")
倍(
"="+


"=!"
倍&该结果说明
!"#$#
相对表达量与角
果发育过程密切相关!该基因表达水平在角果发育

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油菜
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基因的组织特异性表达分析
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对人等哺乳动物的
ABCD#
蛋白
H
端功能研
究表明!该段序列位于细胞质中!能够与
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互作进行正向调节作用!且该区段自身能形成二聚
体或四聚体*#%+&本研究克隆的油菜
!"#$#
基因
编码的氨基酸也含有完整的结构域!但部分氨基酸
略有差异!这一结果说明在遗传进化过程中!不同甘
蓝型油菜材料中某一基因碱基的突变或增减后的编
码蛋白不影响或可以满足必要的遗传发育!该基因
序列的变化能够正常遗传!且这也是同一物种内遗
传多样性得以保留的必要条件&其中!
H
端特有的
$
个精氨酸
G
基序"
95Q6>4?U6O
#被
bGG
代替%
F



个跨膜结构域也决定了其能够锚定于内质网膜
上*#,!++%并且!亮氨酸"
S
#拉链结构域中的脯氨酸
EV?
和丝氨酸
1@V
!保证了该特征区域对蛋白结合能
起到调节作用*#,!++&而在
ABCD#
蛋白的高级结构
预测中!具有的
#"

*
螺旋可能与其具有的跨膜特
性紧密相关!并在空间结构上能够形成类似孔道特
征的结构!其功能有待进一步证实&
二酰甘油酰基转移酶
ABCD#
在催化合成
DCB
的过程中由于起主导性作用而被广泛研
究*!&+&对桐树(卫矛等植物中
GHC
转录水平研究
表明
!"#$#
基因在花中表达量要高于叶中的表达
量*#+*#&+&而在蓝蓟属中!
;
,
!"#$#
基因的表达极
其广泛!且在老叶片中表现为增加趋势*!++&本研究

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基因在
IC

I0
花中相对表达量较
高于叶中!而在
I,
杂交种花中的相对表达量却低
于叶中!该结果可能与不同亲本间杂交后形成的杂
合基因组中!相关转录因子调控等位基因转录表达
的强弱程度有关&另外!从授粉后角果发育
+W

!"#$#
表达相对较高!而随着角果发育的生长!在
W
时表现为急剧减少的表达趋势!可推测在油菜

DCB
积累量的多少极有可能受角果发育初期
!"#$#
基因的转录表达水平决定!但仍需进一步
分析油菜籽粒不同发育过程中
!"#$#
基因的转
录!并通过测定相应阶段
DCB
积累的含量多少进
行研究&
本研究通过同源克隆获得了油菜
!"#$#

因!其完整的编码序列均为
#&!+
个核苷酸!编码
&",
个氨基酸!具有

个疏水跨膜结构!该蛋白属于
J0]CD
超家族成员&并且!该氨基酸
H
端序列包
含有
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保守结构域(
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结合位点(
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脂肪酸蛋白特征(
ACB
结合位点以及内质网检索基
序&另外!该氨基酸序列还包含有一个重要的亮氨
酸"
S
#拉链结构域&系统树进化树分析表明!
ABCD#
能够形成一个独立进化分支&在
GHC

录水平上!该基因表达具有组织特异性%但是!在角
发育的过程中!
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基因的转录表现为明显的
下调表达&
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