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Specific Expression of BnDGAT1 Gene in Brassica napus

甘蓝型油菜BnDGAT1基因表达的特异性分析



全 文 :书西北植物学报!
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#!"#!&
#%转基因生物新品种培育重大专项"
!"##-.""#"*"" #%山西省农业科学院博士基金 " /0122#!"+ #%山西省科技攻关项目" !"#!"##""*! #%山西省自然科学青年基金" !"#"!#"!+* # 作者简介马燕斌"
#%,(
#!男!博士!助理研究员!主要从事植物基因功能研究&
3*4567
4 8 96: ;< ! #)=>?4
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通信作者李燕娥!学士!研究员!主要从事棉花分子遗传育种研究工作& 3*4567
7
8
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甘蓝型油菜
%/12!3!
基因表达的特异性分析
马燕斌#!!吴 ! 霞#!王 ! 霞#!!杜春芳#!孙 ! 璇#!王新胜#!范建春#!李燕娥#" " # 山西省农业科学院棉花研究所!山西运城 "++""" % ! 山西运城学院生命科学系!山西运城 "++""" %
农业部黄土高原作物基因
资源与种质创制重点实验室!太原
""""# # 摘 ! 要该研究从甘蓝型油菜中克隆获得了二酰甘油酰基转移酶基因"
!"# #!命名为 %&!"##
!并对该基因编
码的氨基酸序列(蛋白结构域和系统进化树进行分析&结果表明该基因编码的氨基酸序列包含二酰甘油酰基转 移酶等多个功能结构域!并具有 个疏水跨膜结构区&系统进化分析表明! 0:ABCD# 与芥菜(拟南芥(旱金莲中 ABCD# 系统进化关系相对较近&利用定量 EFG 对 %&!"##
基因的
GHC
转录表达分析表明!在不同组织和角
果的不同发育阶段!
%&!"## 基因的表达具有组织特异性!且在角果不同发育阶段!其 GHC 转录水平随着角果 发育的成熟表达明显下调& 关键词油菜%二酰甘油酰基转移酶%表达分析
中图分类号 I,) 文献标志码
C
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4
5,*6+
V5 X @ " %())*+(&( , -) #% ABCD % UV5:Q>V6 X U6?:@< X V@QQ6?:5:57 8 Q6Q !! 植物种子产生的油是人类热量来源的营养物之 一!三酰甘油" DCB #是种子油脂贮存的主要成分! 其生物合成的生化途径涉及多个亚细胞器官的协同 作用和重要酶的参与!种子细胞的内质网是 DCB 合成的场所!而 DCB 在油体内的积累则是通过内 质网膜类似于出芽而形成的*#*!+&二酰甘油酰基转 移酶" ABCD #是重要的内质网构成膜蛋白质!对生 物体内脂质代谢途径具有重要影响!是催化二酰甘 油与脂肪酸酰基反应生成 DCB 的关键限速酶*!*+&
该酶存在
种类型!分别为 ABCD# ( ABCD! 以及 ABCD
*
+
+
&其中!编码
ABCD#
蛋白的基因首先从
老鼠中被克隆*&+!继而在拟南芥中也被克隆*)+!当前
在哺乳动物(植物等的脂肪酸代谢中研究较多%
ABCD 为可溶性蛋白!在花生的子叶中被首先发 现!目前研究较少*,+& ABCD# 参与生物体内大多数 DCB 的合成!研 究发现!在拟南芥(玉米中 ABCD# 的特异氨基酸突 变可以引起种子不同油含量的变化**#"+&当在烟草 中过表达拟南芥 !"##
基因时!烟叶中
DCB

量增加了
!"
倍!脂肪酸增加了
&=_
%该酶在种子
萌发(叶片衰老等发育过程的脂类代谢中也发挥作
用*##+&在拟南芥中过量表达
!"## 时!转基因株 系中 ABCD# 活性提高了 #"_ " ,"_ !且种子油分 沉积和平均粒重明显增加*#!+&在野生型酵母和拟 南芥中过表达卫矛 !"##
基因时!
DCB
含量均表
现为增加!其中前者的积累量达到了
&
倍*#*#++&另 外! GHC 转录分析表明!桐树 !"##
基因在不同
组织中表达水平基本相似*#&+&而有证据表明!在叶
片衰老过程中!
DCB
的积累与
!"## 基因表达量 的增加相关*#)+&此外!有研究表明!低氮含量条件 能够诱导硅藻 DCB 的积累!同时 !"##
的转录
水平的显著增加*#,+!可能与
!"## 基因的表达能 够被脱落酸途径的 #%.+ 转录因子激活有关*#+& 油菜是重要的油料作物之一!在食用(饲用等方 面具有重要作用&目前!已知甘蓝型油菜 ABCD# 的基因序列是从小孢子中克隆的*#%*!"+!通过细胞悬 浮培养进行脂肪酸代谢研究表明!蔗糖能够诱导 ABCD# 在一定时间内促进 DCB 含量的增加*!#+! 其 ABCD# 蛋白能够形成四聚体*!!*!+&本研究对甘
蓝型油菜
!#"# 基因系统进化树以及编码蛋白高 级结构等进行分析预测!并对其在不同组织(角果不 同发育阶段的 GHC 转录水平等进行研究!为探讨 该基因在油脂代谢过程中的调控提供理论依据& # ! 材料和方法 !=! ! 材 ! 料 试验材料为油菜不育系 IC (恢复系 IG 及其 杂交种 I, !均由山西农业科学院棉花研究所油菜研 究组提供!并在棉花研究所农场田间种植!严格套袋 授粉&在各材料花期时分别取根(茎(叶(花等组织 样品!角果取样时间分别为自交授粉后 + ( ( #! ( #) 和 !"W !用液氮迅速冷冻! ("` 保存备用& !78 ! 9:/ 提取及其 %;:/ 合成 分别取不同组织样品约 "=# P !利用 DV6\?7 试 剂" T:Y6UV? P @: ! L1C #提取总 GHC !经 AH5Q@T 处理 去除 AHC 污染(电泳检测质量及分光光度计测定 GHC 浓度后!取等量总 GHC 进行反转录!合成 >A* HC 第一链! (!"` 保存备用& !7< ! 12!3! 基因的克隆及相关生物信息学分析 以 IC 油菜 >AHC 为模板!根据一个推定的编码 !"##
基因的
31D
序列"
CR#)+++=# #以及近缘材 料比对后设计引物
ABCD#*R
"
&a*CDBBFBCDDDD*
BBCDDF*a #和 ABCD#*G " &a*DFCBBCFCDBBCD* FFDDDB*a
#%
EFG
扩增条件为
%+`
预变性
+46:
后进行循环扩增%
+`
变性
&Q ! &` 退火 +"Q ! ,! ` 延伸 +"Q !共 +" 个循环% ,!` 总延伸 #"46: ! #)` 保存 #46: 后进行凝胶电泳!回收获得预期大小的 !"##
目的条带!并与
X
JA#*D
载体"
D5Z5G5
!
25*
X
5:
#连接!转化大肠杆菌后!经酶切与
EFG
鉴定选
出正确克隆后测序&氨基酸比对及系统进化树分析
利用
AHCJCH
软件进行!跨膜结构域及蛋白高级
结构分别利用
1]1LT

FEb4?W@7Q=" 软件进行 分析& !7= ! 12!3! 基因的实时定量 >?9 分析 通过比较分析 !"##
基因序列保守区!设计
定量
EFG
引 物 "表
#
#!内 参 为 油 菜
%&#+/*&
"
CR####!
#&实时定量
EFG
体系共
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#
S
!按试剂
盒"
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X
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06?*
G5W
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L1C
#说明书进行&反应程序

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预变性
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变性
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退火
#"Q
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实时荧光定量
>?9
分析用引物
D597@#
!
EV64@VQ?OV@57*U64@EFG
引物
EV64@V
序列
1@
[
N@:>@
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#
a # 片段长度 3< X @>U@WQ6\@ , 9 X 用途 ENV X ?Q@ 0:C>U6:*R 0:C>U6:*G BDDBFDCDFFCBBFDBDDFD CFDBFDFDDCBFFBDFDFF "" T:U@V:57V@O@V@:>@
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0:ACBD#*R
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GD*EFG
#
0:ACBD#*G
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GD*EFG
#
FDCCDDFCBFDBCDCCBBDFB
BDCDCBCCBCDFFFFDDDFCCF
!# G@57*U64@EFG %&%# #" 期 !!!!!!!!!!! 马燕斌!等甘蓝型油菜
%&!"## 基因表达的特异性分析 ,!` 延伸 #"Q ! "`!Q ! +" 个循环&反应在 C X * X 76@W06?Q 8 QU@4Q1U@ X ]:@E7NQ DJ荧光定量 EFG 仪 上进行!
次重复!定量结果采用
!
(
FU法进行分析& ! ! 结果与分析 87! ! 油菜 12!3! 基因的克隆及氨基酸序列分析 克隆获得的油菜 !"#$# 基因"图 # #!其完整 的编码序列为 #&!+ 个核苷酸&利用 AHCJCH 推 测 !"#$# 基因编码 &", 个氨基酸!并进行不同植 物氨基酸序列比较分析"图 ! #&另外!通过 HF0T X V?U@6:975QU 分析表明!该氨基酸序列中第 ," " &") 个氨基酸为二脂酰甘油酰基转移酶的特征结构%第 !)) " +%, 个氨基酸是 CG3# 结构域!即酰基辅酶 C 胆固醇酰基转移酶结构!该结构域与类脂化合物代 谢作用相关%第 !#$ " +%) 个氨基酸为 J0]CD 结 构域!即膜结合酰基转移酶结构!表明该蛋白属于 J0]CD 超家族成员*#++&进一步分析发现!该氨基 酸序列 H 端序列包含有 05Q6>4?U6O 保守结构域" % #( 图 # ! 油菜 !"#$# 基因的克隆电泳 R6 P =# ! B@7@7@>UV? X M?V@Q6Q?OV5 X @ !"#$# P @:@54 X 76O6>5U6?: 图 ! ! 油菜 ABCD# 推定氨基酸序列分析 重复 S 为亮氨酸结构域! E ( 1 表示脯氨酸" EV? #和丝氨酸" 1@V #% HF0T 中登录编码为拟南芥 CUABCD# " CR"&#+% #( 芥菜型油菜 0 ^ ABCD# " CC/+",+ #(蓖麻 G>ABCD# " 3L$%#&%# #(大豆 B4ABCD# " HE*""#!$,)+ #& % = 保守结构% & = 酰基辅酶 C 结合位点% = 脂肪酸蛋白特征% ( =ACB 结合位点% ) = 内质网检索基序 R6 P =! ! JN7U6 X 7@576 P :4@:U5:57 8 Q6Q?OW@WN>@W546:?5>6WQ@ [ N@:>@Q?O0:ABCD#6:V5 X @ DM@V@ P 6?:?O5>?:Q@VY@7@N>6:@V@ X @5U;5Q45Vc@W9 8 O6Y@>5 X 6U577@UU@V?OS % DM@>V6U6>57EV?5:W1@VV@Q6WN@Q;@V@W@Q>V69@W9 8 >5 X 6U57 7@UU@VQ?OE5:W1=HF0T5>>@QQ6?::N49@VQ5V@#(0*12 , )*)/3(4*(&(CUABCD# " CR"&#+%=# #! %())*+( 5 -&+6(0 ^ ABCD# " CC/+",+=# #! 7*+*&-)+288-&*)G>ABCD# " 3L$%#&%# #! "4 9 +*&68(:B4ABCD# " HE*""#!$,)+ # =DM@5WY5:>@WW?456:>?:Q6QU ?O95Q6>4?U6O " % #! 5> 8 7*F?C96:W6: P Q6U@ " & #! UM@O5UU 8X V?U@6:Q6 P :5UNV@ " #! ACB*96:W6: P " ( # 5:W3G*ATG " ) # ")%# 西 ! 北 ! 植 ! 物 ! 学 ! 报 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!

C>
8
7*F?C
结合位点"
&
#(脂肪酸蛋白特征"

#(
ACB
结合位点"
(
#以及内质网检索基序"
)
#&另
外!该氨基酸序列还包含有一个重要的亮氨酸"
S
#
拉链结构域!并存在关键的脯氨酸
EV?
和丝氨酸
1@V
&
878
!
油菜
;./@!
系统进化树分析
对克隆获得的油菜
!"## 基因的推测氨基酸 序列与芥菜(拟南芥(旱金莲以及果蝇等推测的 ABCD 的氨基酸序列进行系统进化树分析!结果表 明!油菜与十字花科芥菜和拟南芥的 ABCD 进化关 系较近!具有较高的相似性" )=!&_ #%而与金莲花 科"旱金莲#(大戟科"蓖麻(油桐#(菊科"斑鸠菊(向 日葵#(茄科"烟草#(蝶形花科"大豆#以及禾本科"水 稻(玉米(大麦(乌拉尔图小麦#等系统进化关系相对 较远"图
#&
87<
!
油菜
12!3!
基因编码蛋白的结构分析
利用克隆基因
!"## 所编码的氨基酸序列! 以 #.J3=C 蛋白结构为模板!对该蛋白的高级结构 与蛋白特性分析&结果表明!该蛋白序列中第 ##! " &"" 的氨基酸序列能够与 #.J3=C 蛋白相吻合! 能够折叠形成具有 #" 个 * * 螺旋的高级蛋白结构域 "图 + #&进一步通过 1]1LT 在线软件分析预测表 明!该基因编码的蛋白具有 个疏水跨膜结构!分别 是 1 ## *3 #+" ( A #)! *Z #+ ( 1 #%! *d !#+ ( R !!! *b !++ ( R &,
*R
,% ( Z +#% *E ++# ( H ++) *3 +)以及 B +,# *S +%
&
87=
!
油菜
12!3!
基因组织表达特异性分析
定量
EFG
分析
!"## 基因在油菜不同组织 中的转录表达!同时!为确定组织特异性表达的可靠 性!本试验选取
个材料进行表达分析&结果表明!
油菜
!"## 基因表达具有组织特异性%在花和叶 图
!
油菜
0:ABCD#
的系统进化树分析
图中括号内为
B@:05:c
登录号
R6
P
= ! EM 8 7? P @:@U6>UV@@?O X V@W6>U@W546:?5>6WQ@ [ N@:>@QOV?4V5 X @ B@:05:c5>>@QQ6?::N49@V6: X 5V@:UM@Q@Q 图 + ! 油菜 ABCD# 的蛋白质构象 左图不同颜色表示不同 * * 螺旋!右图为相应 * * 螺旋的实心分子立体结构图 R6 P =+ ! EV?U@6:>?:O?V45U6?:?OV5 X @0:ABCD# * *M@76<6:W6>5U@W9 8 W6OO@V@:U>?7?VQ6:UM@7@OU X 6>UNV@=DM@Q?76WUMV@@*W64@:Q6?:574?7@>N75V QUVN>UNV@W65 P V54?O>?VV@Q X ?:W6: P* *M@76<;@V@QM?;@W6:UM@V6 P MU X 6>UNV@ #)%# #" 期 !!!!!!!!!!! 马燕斌!等甘蓝型油菜
%&!"## 基因表达的特异性分析 组织中相对表达量较高!在茎和根组织中相对表达 量较低"图 & #&以叶中的表达量为 # 标准化各个组 织的表达!在 IC 材料中! !"##
在花(茎和根中
的相对表达量约分别是叶中表达量的
+=)%
(
"=#)

"="&
倍%在
IG
材料中!
!"## 在花(茎和根中的 相对表达量分别约是叶中的 #=+ ( "=!

"=##
倍%
而在
I,
材料中!
!"## 花(茎和根中的相对表达 量分别约是叶中表达量的 "=+! ( "="

"=!#
倍&
87A
!
油菜
12!3!
基因在角果不同发育阶段的表
达特性
利用
!"## 基因的共同引物作为定量分析引 物!分别对严格自交授粉后 + " !"W 不同发育阶段 的角果 !"##
基因表达进行分析&结果表明!在
IG

I,
角果发育成熟的不同过程中!
!"## 相 对表达量均逐渐降低"图 ) #&其中!在油菜 IG 与 I, 授粉后 +W ! !"##
基因相对表达水平较高!授
粉后
W
该基因相对表达量分别为
+W
表达量的
"=!
倍和
"=% 倍!授粉后 #! ( #) 和 !"W 分别约下 降为 "=!! 倍和 "=!& 倍( "=#+ 倍和 "=") 倍( "="+ 倍 和 "=!" 倍&该结果说明 !"##
相对表达量与角
果发育过程密切相关!该基因表达水平在角果发育

&
!
油菜
!"## 基因的组织特异性表达分析 R6 P =& ! 3< X V@QQ6?:5:57 8 Q6Q?O!"##9
8
GD*EFG6:W6OO@V@:UU6QQN@Q

)
!
油菜
!"## 在角果不同发育过程中的表达 R6 P =) ! DV5:Q>V6 X U6?:7@Y@7Q?O!"##6:UM@
X
?W45UNV@W@Y@7?
X
4@:U
X
V?>@QQ
初期相对表达最高!角果发育后期相对表达较低&
! 讨 ! 论 对人等哺乳动物的 ABCD# 蛋白 H 端功能研 究表明!该段序列位于细胞质中!能够与 5> 8 7*F?C 互作进行正向调节作用!且该区段自身能形成二聚 体或四聚体*#%+&本研究克隆的油菜 !"##
基因
编码的氨基酸也含有完整的结构域!但部分氨基酸
略有差异!这一结果说明在遗传进化过程中!不同甘
蓝型油菜材料中某一基因碱基的突变或增减后的编
码蛋白不影响或可以满足必要的遗传发育!该基因
序列的变化能够正常遗传!且这也是同一物种内遗
传多样性得以保留的必要条件&其中!
H
端特有的
个精氨酸 G 基序" 95Q6>4?U6O #被 bGG 代替% F 端 的 个跨膜结构域也决定了其能够锚定于内质网膜 上*#,!++%并且!亮氨酸" S #拉链结构域中的脯氨酸 EV? 和丝氨酸 1@V !保证了该特征区域对蛋白结合能 起到调节作用*#,!++&而在 ABCD# 蛋白的高级结构 预测中!具有的 #" 个 * 螺旋可能与其具有的跨膜特 性紧密相关!并在空间结构上能够形成类似孔道特 征的结构!其功能有待进一步证实& 二酰甘油酰基转移酶 ABCD# 在催化合成 DCB 的过程中由于起主导性作用而被广泛研 究*!&+&对桐树(卫矛等植物中 GHC 转录水平研究 表明 !"##
基因在花中表达量要高于叶中的表达
量*#+*#&+&而在蓝蓟属中!
;
,
!"## 基因的表达极 其广泛!且在老叶片中表现为增加趋势*!++&本研究 中 %&!"##
基因在
IC

I0
花中相对表达量较
高于叶中!而在
I,
杂交种花中的相对表达量却低
于叶中!该结果可能与不同亲本间杂交后形成的杂
合基因组中!相关转录因子调控等位基因转录表达
的强弱程度有关&另外!从授粉后角果发育
+W

!"## 表达相对较高!而随着角果发育的生长!在 W 时表现为急剧减少的表达趋势!可推测在油菜 中 DCB 积累量的多少极有可能受角果发育初期 !"##
基因的转录表达水平决定!但仍需进一步
分析油菜籽粒不同发育过程中
!"## 基因的转 录!并通过测定相应阶段 DCB 积累的含量多少进 行研究& 本研究通过同源克隆获得了油菜 !"##

因!其完整的编码序列均为
#&!+
个核苷酸!编码
&",
个氨基酸!具有

个疏水跨膜结构!该蛋白属于
J0]CD
超家族成员&并且!该氨基酸
H
端序列包
含有
05Q6>4?U6O
保守结构域(
C>
8
7*F?C
结合位点(
!)%#
西
!

!

!

!

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