全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 43(2): 143-148(2013)
收稿日期: 2012-06-18; 修回日期: 2012-12-15
基金项目: 公益性行业(农业)科研专项(201003065); 国家自然科学基金资助项目(31100366); 江苏省农业科技自主创新项目(CX
(10)415); 江苏省自然科学基金资助项目(BK2011270)
通讯作者: 周益军,研究员,主要从事植物病毒研究; Tel: 025-84390391, E-mail: yjzhou@ jaas. ac. cn
共同第一作者: 季英华,男,助理研究员,主要从事粉虱传双生病毒研究; Tel: 025-84390394, E-mail: jiyinghua@ jaas. ac. cn;
周晓伟,男,硕士研究生,主要研究方向为番茄黄化曲叶病毒。
番茄黄化曲叶病毒 V 2 基因原核表达及
多克隆抗体制备
季英华1#, 周晓伟1,2#, 蔡振东1,2, 程兆榜1, 周益军1∗
( 1江苏省农业科学院植物保护研究所, 南京 210014; 2南京师范大学生命科学学院, 南京 210046)
摘要:通过 PCR的方法,从番茄黄化曲叶病毒江苏分离物 DNA中扩增到 V2 基因,并克隆到 pMD18-T载体,序列测定结果
显示其与报道的 XH2 分离物序列完全一致,核苷酸序列全长 351 bp,编码 115 个氨基酸,推测分子量约 13 kD。 将该 V2 基
因亚克隆到原核表达载体 PET32a中获得重组表达载体 PET32a-V2,转化大肠杆菌 BL21(DE3),IPTG可诱导 1 个分子量约
为 32 kDa的融合蛋白(含 His标签)表达,经 Ni + NTA亲和柱纯化,获得纯化的重组蛋白,免疫家兔制备 TYLCV-V2 蛋白
的多克隆抗体 Anti-V2,间接 ELISA测定 Anti-V2 的效价达 1∶ 655 360,Western blot及 DIBA分析结果表明 Anti-V2 可与 V2
蛋白发生特异血清反应,可为进一步研究 V2 蛋白的功能提供参考。
关键词:番茄黄化曲叶病毒; 原核表达; 多克隆抗体
Prokaryotic expression of V 2 gene of Tomato yellow leaf curl virus and preparation
of its polyclonal antibody 　 JI Ying-hua1, ZHOU Xiao-wei1,2, CAI Zhen-dong1,2, CHENG
Zhao-bang1, ZHOU Yi-jun1 　 ( 1 Institute of Plant Protection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014,
China; 2College of Life Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China)
Abstract: V2 gene of Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) was amplified by PCR from the diseased sam-
ples collecting from Jiangsu Province and cloned into pMD18-T vector. The sequencing result showed that V2
gene had 351nt and encoded 115 amino acids with a Mr of 13 kD. Sequence comparison showed that the V2
gene shared 100% sequence identities with XH2, an isolate of TYLCV reported in Jiangsu in 2007. V2 gene
was inserted into prokaryotic expression vector pET32a to produce recombinant plasmid pET32a-V2, and the
recombinant plasmid was introduced into Escherichia coli strain BL21 (DE3) . SDS-PAGE analysis confirmed
that V2 fusion protein was expressed after induction by IPTG. The recombinant V2 protein was purified with
Ni + NTA affinity column and used to immunize rabbits for production of polyclonal antibodies. Finally poly-
clonal antibody, anti-V2, was obtained with titer above 1∶ 655 360. The V2 protein was successfully detected
by western blot in prokaryotic expression products and in infected tomato by dot immunobinding assay with an-
ti-V2. Based on the antibody, further researches on the function of V2 protein could be carried out.
Key words: Tomato yellow leaf curl virus; prokaryotic expression; polyclonal antibodies
中图分类号: S436. 412; S432. 41　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2013)02-0143-06
　 　 番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl vi-
rus, TYLCV)是一种由烟粉虱传播的植物病毒,分
类上属于双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金黄色
花叶病毒属(Begomovirus),该病毒 1964 年在以色
列就有发生危害报道[1],近年来随着全球气候变
化、耕作制度的改变、各地贸易交流的频繁及媒介
　
植物病理学报 43 卷
烟粉虱的大发生,TYLCV 在世界范围内蔓延扩
散,给番茄等作物造成了严重的危害[2 ~ 5]。
在我国,番茄黄化曲叶病毒于 2006 年在上海
首次发生危害[6],随后浙江[7]、江苏[8]、安徽[9]、山
东[10]、河北[11]等陆续报道,给我国的番茄生产造
成惨重损失。 2006 ~ 2008 年浙江省 2 万 hm2 番茄
发病,损失超过 10 亿元;2007 ~ 2008 年江苏省大
面积出现该病危害,重病田块病株率超过 80% ;山
东寿光,2009 年因该病危害近 2. 7 万 hm2 番茄严
重减产或绝收。 受该病威胁,很多农户被迫改种其
他作物,使番茄产业发展受到严重影响。
番茄黄化曲叶病毒是一种单组分病毒(只有
DNA-A),基因组为单链环状 DNA,共编码 6 个蛋
白(V1、V2、C1、C2、C3、C4)。 其中病毒链编码的
V2 蛋白在病毒侵染过程中是必需的,但其并不直
接参与病毒的侵染和运动[12]。 Zrachya 等[12]发现
V2 是一个基因沉默抑制子,可以抑制本氏烟的局
部基因沉默,但其并不能抑制 siRNAs 的积累。
Glick等[13]研究发现 V2 与寄主的 SGS3 互作是其
具有抑制子特征所必需的,但是对于这一抑制子的
作用方式,如对系统沉默的影响、对已建立沉默的
回复及对沉默信号传导的影响等等,尚未见报道。
本研究克隆了 TYLCV V2 基因,原核表达、纯化并
制备了多克隆抗体,可为该基因的后续功能研究打
下基础。
1　 材料与方法
1. 1　 试验试剂
受体菌 Escherichia coli DH5α 和表达菌 BL21
(DE3)均由本实验室保存;表达载体 pET32a 为
Novagen公司产品;硝酸纤维素膜购自 Amersham-
Phamacia公司,Taq DNA 聚合酶、限制性内切酶、
T4-DNA连接酶、pMD18-T克隆载体为 TaKaRa 公
司产品;PCR凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购
自 AxyGEN公司;碱性磷酸酯酶(AP)标记的羊抗
兔 IgG 二抗、福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂、
IPTG购自 Sigma; 其余试剂均为国产分析纯。
1. 2　 引物设计及 TYLCV V2 基因的克隆
根 据 已 公 布 的 TYLCV 江 苏 分 离 物
(GU111505)全长序列,设计 PCR 引物:TY_V2_F
( 5′-GGggtaccATGTGGGATCCACTTCTAAAT-3′,
含 KpnⅠ酶切位点)和 TY_V2_R(5′-GCgtcgacT-
CAGGGCTTCGATACATTCT-3′,含 SalⅠ酶切位
点),送上海英骏生物技术有限公司合成。 选择江
苏兴化采集的 TYLCV 感病番茄为材料,使用
CTAB法提取总 DNA,进行 PCR 扩增,PCR 反应
程序为:94℃预变性 2 min;94℃ 45 s,50℃ 45 s,
72℃ 1 min,30 个循环;72℃延伸 10 min。 PCR 产
物于 1%琼脂糖凝胶上电泳分析,凝胶回收试剂盒
回收,回收产物连接 pMD18-T载体,获得重组质粒
pMD18-T-V2,转化大肠杆菌 DH5α。 重组质粒经
序列测定确认基因序列未突变且读码框正确后连
接表达载体。
1. 3　 V2 基因原核表达载体构建
重组质粒 pMD18-T-V2 的 V2 基因片段经 Sal
Ⅰ和 KpnⅠ酶切后定向插入经同样酶切的 pET32a
表达载体中,获得重组表达载体 pET32a-V2,转化
大肠杆菌 BL21(DE3),经酶切、测序验证无误后进
行诱导表达。
1. 4　 V2 在 pET32a 表达系统中的表达与蛋白纯
化及多克隆抗体制备
pET32a-V2 在大肠杆菌 BL21 (DE3)中采用
IPTG诱导表达,Ni + NTA亲和柱纯化,SDS-PAGE
电泳分析蛋白表达及纯化结果[14]。 纯化的蛋白免
疫健康雄性新西兰大白兔制备多克隆抗体:取 0. 5
mL纯化蛋白(蛋白含量约 0. 5 mg),加入等体积
的佐剂,用针头反复抽吸至完全乳化,于兔后背皮
下三点注射。 皮下注射 3 周,每周 1 次,每次注射
点前移。 3 周后耳缘静脉注射,每次免疫剂量为 1
mL(蛋白含量约 0. 5 mg),共注射 3 周,每周 1 次,
最后一次注射 10 d 后心脏采血并收集抗血清,分
装, -70℃保存。
1. 5　 多克隆抗体效价测定
以大肠杆菌中诱导表达的 V2 蛋白为抗原,采
用间接 ELISA法测定抗血清中抗体的效价[15 ~ 17]。
1. 6　 Western blot
参照 Xiong等[18]、Zhang等[19]方法:样品蛋白
SDS-PAGE电泳后,经电转仪恒压 15V 45 min 转
移到硝酸纤维素膜上,用含 5%脱脂奶粉的 PBST
溶液 4℃封闭过夜,清洗后加入兔多克隆抗体
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　 2 期 　 　 季英华,等:番茄黄化曲叶病毒 V 2 基因原核表达及多克隆抗体制备
(1∶ 3 000),于摇床 37℃反应 1. 5 h,PBST 洗 3 次;
再加 AP标记的羊抗兔 IgG(1∶ 3 000),37℃摇床反
应 1. 5 h,PBST洗 3 次,加入底物 BCIP / NBT,室温
反应至条带清晰,立即用双蒸水终止反应,拍照。
1. 7　 检测番茄病样
采用 DIBA(Dot immunobinding assay)方法检
测番茄病株体内 V2 蛋白[18 ~ 20]:取番茄叶片总蛋
白提取液(鲜重 /体积 = 0. 1 g / 200 μL)3 ~ 10 μL
于硝酸纤维素膜上,晾干,用含 1% 脱脂奶粉的
PBST 4℃封闭过夜,加入一抗 anti-V2(1∶ 3 000),
37℃孵育 1. 5 h,PBST 洗膜 4 次,将膜放入用 3%
奶粉封闭液稀释的 AP 标记的羊抗兔 IgG 二抗
(1∶ 8 000)中,37℃孵育 1. 5 h,PBST 洗膜 4 次,加
底物 BCIP / NBT 显色至条带清晰,立即用双蒸水
终止反应,拍照。
2　 结果与分析
2. 1　 TYLCV V2 基因的克隆及原核表达载体构建
提取感病番茄叶片总 DNA,用 PCR 扩增到一
条特异的 300 ~ 400 bp 的 DNA 片段,其大小与预
期相符,PCR 产物克隆到 pMD18-T 载体,获得重
组质粒 pMD18-T-V2,序列测定结果显示所扩增到
的基因片段大小为 351 bp,与已经报道的 TYLCV
江苏分离物(GU111505)V2 基因大小相同,核苷酸
序列也完全一致,表明所克隆到的基因为 TYLCV
V2 基因。
pMD18-T-V2 中的 V2 基因经酶切、连接到原
核表达载体 pET32a的多克隆位点上,获得重组质
粒 pET32a-V2。 双酶切分析结果显示 pET32a-V2
可切出大小约为 351 bp 的插入片段,序列测定结
果显示 pET32a-V2 中的 V2 基因序列未突变、读码
框正确且没有移码,表明 V2 基因的原核表达载体
pET32a-V2 构建成功。
2. 2　 重组蛋白的表达、纯化、SDS-PAGE电泳
原核表达载体 pET32a-V2 导入大肠杆菌
BL21(DE3)中,挑取单克隆于 LB液体培养基中培
养,并用 1 mmol / L IPTG 诱导表达后进行 SDS-
PAGE分析,与未诱导对照相比,含重组质粒的菌
液在 32 kDa左右处出现一条较高浓度的特异诱导
表达条带,与预期的 V2 融合蛋白分子量相当,表
明 TYLCV V2 基因已经在大肠杆菌 BL21(DE3)
中融合表达。 表达产物经 Ni + NTA亲和层析柱纯
化获得约 32 kDa 的特异单一条带(图 1-A),说明
V2 融合蛋白纯化成功。
2. 3　 多克隆抗体的效价
将纯化后的蛋白免疫新西兰大白兔,获得多克
隆抗体 Anti-V2,以免疫前的兔血清为阴性对照,
用间接 ELISA法测定 Anti-V2 效价,结果显示多克
隆抗体 Anti-V2 的效价达到 1 ∶ 655 360(216 × 10)
(表 1),表明该抗血清效价相对较高。
Fig. 1　 SDS-PAGE (A) and Western blot (B) analysis of recombinant protein
Lane M: Protein molecular weight marker; Lane 1: Non-induced bacterial lysate;
Lane 2: pET32a vector transformed BL2l(DE3) induced by IPTG;
Lane 3: Bacterial lysate after 1 mmol / L IPTG induction; Lane 4: Purified recombinant protein.
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植物病理学报 43 卷
Table 1　 Titre determination of anti-V2 polyclonal antibody by ELISA
Sample
Diluted multiple( ×10)
29 210 211 212 213 214 215 216 217
Immune serum 3. 32 2. 48 1. 73 1. 20 0. 68 0. 51 0. 33 0. 23 0. 18
Normal serum 0. 24 0. 39 0. 14 0. 18 0. 16 0. 09 0. 09 0. 10 0. 15
P / N 13. 72 6. 40 12. 64 6. 65 4. 26 5. 74 3. 91 2. 43 1. 23
2. 4　 Western blot分析
用多克隆抗体 Anti-V2 对原核表达产物进行
Western blot分析(图 1-B),结果显示,Anti-V2 能
与 pET32a-V2 诱导菌总蛋白在 32 kDa 发生特异
性反应,与提纯的 32 kDa 蛋白(V2 融合蛋白)也
有特异性反应,与 PET32 空载体诱导菌总蛋白在
19 kDa发生特异性反应(His标签),与未诱导宿主
菌总蛋白无反应。 说明多克隆抗体 Anti-V2 可以
特异的与 V2 融合蛋白及 His标签结合。
2. 5　 DIBA检测植物体内 V2 蛋白
分别选择健康番茄及感染 TYLCV 的番茄作
为材料,用抗体 Anti-V2 进行 DIBA 检测。 结果显
示:与健康番茄样品相比,发病番茄样品可以观察
到明显的印迹信号,表明有检测到 V2 蛋白 (图
2)。 以上结果说明所制备的抗体 Anti-V2 能够特
异的检测相应蛋白,可以进一步应用于后续研究。
Fig. 2 　 Detection of V2 protein in tomato
leaves by DIBA
CK +1, CK +2: Positive control of TYLCV-infected tomato
plants; CK-: Negative control of healthy tomato plants.
3　 讨论
原核表达技术是植物病毒研究中常用的一种
蛋白表达技术,利用该技术可以在体外快速获得大
量的病毒蛋白,为病毒蛋白功能研究提供便利。 本
试验利用原核表达技术在体外表达了 TYLCV V2
蛋白,并制备了 V2 的抗血清,为后续的 V2 基因功
能研究打下了基础。
在菜豆金色花叶病毒属内已有很多病毒的 V2
(AV2)蛋白有过原核表达及抗体制备的研究,如
在 Kokhran 棉花曲叶病毒(Cotton Leaf curl Kokh-
ran virus-Dabawali, CLCuKV-Dab)中,其 V2 基因
在大肠杆菌中表达、纯化,并应用于体外结合实验,
证实其与 CP存在互作,参与病毒运动[21]。 在中国
番茄黄化曲叶病毒中,AV2 蛋白也通过 pET-32a
载体在大肠杆菌中进行了表达,并且纯化制备了多
克隆抗体,效价达 1∶ 500 000,与本研究制备的 anti-
V2 效价相近[22]。
近年来番茄黄化曲叶病毒在我国大面积发生
危害,给番茄生产造成了惨重的损失,已有研究显
示我国发生的番茄黄化曲叶病毒属于以色列株
系[23],但是序列比对分析发现其与以色列株系的
代表性分离物(TYLCV-is,X15656)也存在差异,
以 XH2 分离物为例,其与 TYLCV-is 的序列同源
性只有 97. 95% ,其中 V2 基因中有 3 个位点发生
突变。 有报道在 TYLCV-is中 V2 是一个基因沉默
抑制子,可以明显的抑制局部基因沉默[12],而在
TYLCV-XH2 中,V2 也具有基因沉默抑制子的特
征,但是其对局部沉默的抑制效果相对较弱(未发
表数据),作为病毒抵抗寄主防卫反应的一种重要
策略,基因沉默抑制子在病毒侵入寄主的过程中起
着重要的作用,基因沉默抑制子上的差异会对其致
病乃至发生流行都会产生影响,因此有必要针对我
国发生的 TYLCV V2 基因功能展开研究,了解我
国 TYLCV的致病机理及流行规律,为病害的控制
提供新的途径或可借鉴的思路。
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　 2 期 　 　 季英华,等:番茄黄化曲叶病毒 V 2 基因原核表达及多克隆抗体制备
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责任编辑:于金枝
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