全 文 ：书犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１５０３０ 犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀
苏效双，占今舜，詹康，刘明美，赵国琦．苜蓿黄酮对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞增殖与抗氧化的影响．草业学报，２０１５，２４（１２）：１３９１４５．
ＳＵＸｉａｏＳｈｕａｎｇ，ＺＨＡＮＪｉｎＳｈｕｎ，ＺＨＡＮＫａｎｇ，ＬＩＵＭｉｎｇＭｅｉ，ＺＨＡＯＧｕｏＱｉ．Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｓｔｉｍｕｌｕｓａｎｄａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｅｆｆｅｃｔｏｆａｌｆａｌｆａｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ
ｏｎｄａｉｒｙｃｏｗｍａｍｍａｒｙｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｓｃｕｌｔｕｒｅｄ犻狀狏犻狋狉狅．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１５，２４（１２）：１３９１４５．
苜蓿黄酮对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞
增殖与抗氧化的影响
苏效双１，占今舜１，詹康１，刘明美１，２，赵国琦
（１．扬州大学动物科学技术学院，江苏 扬州２２５００９；２．江苏联合职业技术学院淮安生物工程分院，江苏 淮安２２３２００）
摘要：本试验旨在研究不同浓度苜蓿黄酮对体外培养奶牛乳腺上皮细胞增殖与抗氧化的影响。试验利用含不同浓
度０μｇ／ｍＬ（对照组）、２５μｇ／ｍＬ（试验Ⅰ）、５０μｇ／ｍＬ（试验Ⅱ）、７５μｇ／ｍＬ（试验Ⅲ）、１００μｇ／ｍＬ（试验Ⅳ）苜蓿黄酮
的培养基进行细胞培养。结果表明，１）细胞培养第３天，各组细胞增殖无显著差异，但第５天试验Ⅱ～Ⅳ组细胞增
殖能力极显著高于对照组和试验Ｉ组（犘＜０．０１）。２）试验Ⅱ～Ⅳ组一氧化氮（ＮＯ）水平明显高于对照组与试验Ⅰ
组，且差异极显著（犘＜０．０１）。试验Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅳ组的乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）活性显著低于对照组与试验Ⅲ组，且差异
极显著（犘＜０．０１），但对照组与试验Ⅲ组差异不显著。３）试验Ⅳ组细胞内过氧化氢酶（ＣＡＴ）含量极显著高于其他
各组（犘＜０．０１），而试验Ⅲ组丙二醛（ＭＤＡ）含量极显著低于其他各组（犘＜０．０１）；试验Ⅱ和Ⅲ组的谷胱甘肽过氧化
物酶（ＧＳＨＰＸ）活性极显著高于其他各组（犘＜０．０１），而各处理组细胞的超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）含量差异不显著。
４）试验Ⅱ和Ⅲ组细胞狆５３、犆犪狊狆犪狊犲３、犛犗犆犛３和犛犜犃犜１基因的相对表达量极显著低于对照组（犘＜０．０１）。因此，
苜蓿黄酮能够促进体外培养奶牛乳腺上皮细胞的增殖，提高细胞抗氧化的能力，抑制细胞凋亡，其中添加浓度为７５
μｇ／ｍＬ组效果最好。
关键词：苜蓿黄酮；乳腺上皮细胞；抗氧化；细胞增殖　　
犘狉狅犾犻犳犲狉犪狋犻狅狀狊狋犻犿狌犾狌狊犪狀犱犪狀狋犻狅狓犻犱犪狀狋犲犳犳犲犮狋狅犳犪犾犳犪犾犳犪犳犾犪狏狅狀狅犻犱狊狅狀犱犪犻狉狔犮狅狑犿犪犿
犿犪狉狔犲狆犻狋犺犲犾犻犪犾犮犲犾狊犮狌犾狋狌狉犲犱犻狀狏犻狋狉狅
ＳＵＸｉａｏＳｈｕａｎｇ１，ＺＨＡＮＪｉｎＳｈｕｎ１，ＺＨＡＮＫａｎｇ１，ＬＩＵＭｉｎｇＭｅｉ１，２，ＺＨＡＯＧｕｏＱｉ
１．犆狅犾犾犲犵犲狅犳犃狀犻犿犪犾犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔，犢犪狀犵狕犺狅狌犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犢犪狀犵狕犺狅狌２２５００９，犆犺犻狀犪；２．犑犻犪狀犵狊狌犑狅犻狀狋犐狀狊狋犻狋狌狋犲狅犳
犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔狅犳犘狉狅犳犲狊狊犻狅狀狅犳犎狌犪犻’犪狀犅犻狅犲狀犵犻狀犲犲狉犻狀犵犅狉犪狀犮犺，犎狌犪犻’犪狀２２３２００，犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｔｕｄｉｅｄｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｓｔｉｍｕｌｕｓａｎｄａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
ｏｆａｌｆａｌｆａｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｏｎｃｏｗｍａｍｍａｒｙｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｓｃｕｌｔｕｒｅｄ犻狀狏犻狋狉狅．Ｍｅｄｉａｗｉｔｈｆｉｖｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
ｏｆａｌｆａｌｆａｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｗｅｒｅｐｒｅｐａｒｅｄｔｏｃｕｌｔｕｒｅｄａｉｒｙｃｏｗｍａｍｍａｒｙｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｓ犻狀狏犻狋狉狅．Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｔｅｓｔｅｄ
ｗｅｒｅ：０μｇ／ｍＬ（ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ），２５μｇ／ｍＬ（ｔｒｉａｌｇｒｏｕｐⅠ），５０μｇ／ｍＬ（ｔｒｉａｌｇｒｏｕｐⅡ），７５μｇ／ｍＬ（ｔｒｉａｌ
ｇｒｏｕｐⅢ），１００μｇ／ｍＬ（ｔｒｉａｌｇｒｏｕｐⅣ）．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄ：１）Ｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｃｅｌｐｒｏ
ｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｆｉｖｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｄｕｒｉｎｇｔｈｅｆｉｒｓｔｔｈｒｅｅｄａｙｓｏｆｃｅｌｃｕｌｔｕｒｅ，ｂｕｔｔｈｅｃｅｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆ
ｔｒｉａｌｇｒｏｕｐｓⅡ－Ⅳ ｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｆｏｒｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐａｎｄｔｒｉａｌｇｒｏｕｐⅠ （犘＜０．０１）ａｔｄａｙ
第２４卷　第１２期
Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．１２
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
２０１５年１２月
Ｄｅｃ，２０１５
收稿日期：２０１５０１１６；改回日期：２０１５０４２０
基金项目：江苏省高校优势学科建设工程资助项目（ＰＡＰＤ），江苏省高校研究生科研创新计划项目（ＫＹＺＺ＿０３６７）和长三角地区生鲜乳质量安全
追溯体系关键技术研究应用项目（１４３９５８１０１００）资助。
作者简介：苏效双（１９９１），男，山东潍坊人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：１８７６５９０５９２３＠１６３．ｃｏｍ。占今舜（１９８５），男，江西玉山人，在读博士。Ｅｍａｉｌ：
ｚｈａｎｊｓ１０２３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ。 共同第一作者 Ｔｈｅｓｅａｕｔｈｏｒｓｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｄｅｑｕａｌｙｔｏｔｈｉｓｗｏｒｋ．
通信作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅｍａｉｌ：ｇｑｚｈａｏ＠ｙｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
５．２）ＴｈｅＮＯｌｅｖｅｌｓｏｆｔｒｉａｌｇｒｏｕｐｓⅡ－Ⅳ ｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐａｎｄｔｒｉａｌｇｒｏｕｐⅠ
（犘＜０．０１）．Ａｌｓｏ，ＬＤＨａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｇｒｏｕｐｓⅠ，Ⅱ，ａｎｄⅣ ｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐａｎｄ
ｔｈａｎｔｅｓｔｇｒｏｕｐⅢ （犘＜０．０１），ａｎｄｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐａｎｄｔｅｓｔｇｒｏｕｐⅢ ｗａｓｎｏｔｓｉｇｎｉｆｉ
ｃａｎｔ．３）ＩｎｔｒａｃｅｌｕｌａｒＣＡＴｃｏｎｔｅｎｔｏｆｔｒｉａｌｇｒｏｕｐⅣｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｅｏｔｈｅｒｇｒｏｕｐｓ（犘＜０．０１）．
ＴｈｅＭＡＤｃｏｎｔｅｎｔｏｆｇｒｏｕｐⅢ ｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈｅｏｔｈｅｒｇｒｏｕｐｓ（犘＜０．０１）．ＧＳＨＰＸａｃｔｉｖｉｔｙｏｆ
ｇｒｏｕｐｓⅡａｎｄⅢ ｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｅｏｔｈｅｒｇｒｏｕｐｓ（犘＜０．０１）．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉ
ｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｆｉｖｅｇｒｏｕｐｓｉｎｔｈｅｃｅｌＳＯＤｃｏｎｔｅｎｔ．４）Ｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆ狆５３，
犆犪狊狆犪狊犲３，犛犗犆犛３ａｎｄ犛犜犃犜１ｇｅｎｅｓｉｎｇｒｏｕｐｓⅡａｎｄⅢ ｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（犘＜
０．０１）．Ｉｎｓｕｍｍａｒｙ，ａｌｆａｌｆａｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｃａｎｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｂｏｖｉｎｅｍａｍｍａｒｙｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｓｃｕｌ
ｔｕｒｅｄ犻狀狏犻狋狉狅，ｉｍｐｒｏｖｅｃｅｌａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｃａｐａｃｉｔｙａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｃｅｌｕｌａｒａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｔｈｅｂｅｓｔｅｆｆｅｃｔｏｃｃｕｒｒｅｄａｔａ
ｄｏｓａｇｅｏｆ７５μｇ／ｍＬｏｆａｌｆａｌｆａｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ａｌｆａｌｆａｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；ｍａｍｍａｒｙｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｓ；ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ；ｃｅｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
紫花苜蓿具有营养价值高，适口性好，产量高，适应性强等优点，紫花苜蓿的茎、叶中含有５０多种丰富的营
养物质以及多种生物活性成分，其营养成分比大多数植物都要丰富，有“牧草之王”的美誉［１２］。黄酮（ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ）
为苜蓿中生物活性成分之一，其在一定剂量范围内对畜禽有明显的提高繁殖力、促进生长、增强机体免疫力和雌
激素样的作用［３］；对人体具有抗病毒、增强心血管功能、增强免疫力、抗肿瘤、抑菌、延缓衰老的作用［４］。细胞培养
技术是指从活体内取出与试验相关细胞或组织，在体外模拟体内生理环境，且建立无菌、适温和一定营养的条件，
使细胞生长和生存并维持其结构与功能完整性的一种方法。该方法的优点在于易于提供性状相似的试验对象和
耗资少，尤其对于大型经济动物来讲比较经济，现已被广泛应用于医药、农业等领域［５］。刘春龙等［６］研究发现，在
一定范围内的大豆黄酮和染料木素能够促进奶牛乳腺上皮细胞增殖，提高细胞抗氧化水平。陈静［７］研究发现，
１２．５～５０．０μｍｏｌ／Ｌ槲皮素能够上调奶牛乳腺上皮细胞存活率，提高抗氧化和抗凋亡的能力。然而利用细胞培
养的方法来研究苜蓿黄酮对乳腺上皮细胞的影响尚未见报道，因此，本试验通过添加苜蓿黄酮来探究其对体外培
养奶牛乳腺上皮细胞增殖与抗氧化的影响，为推广苜蓿黄酮在动物生产上的应用提供理论依据。
１　材料与方法
１．１　材料
奶牛乳腺上皮细胞由本试验室通过组织块培养法获得；苜蓿黄酮由陕西绿清生物工程有限公司提供；
ＤＭＥＭ／１２培养基和胎牛血清购于Ｇｉｂｃｏ公司；ＭＴＴ和双抗购于Ｓｉｇｍａ公司；二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）购于Ｓｏｌａｒ
ｂｉｏ公司；ＲＮＡ提取试剂盒购于天根生化科技有限公司；抗氧化指标试剂盒购于南京建成生物有限公司。
１．２　试验方法
１．２．１　细胞培养　　细胞培养从２０１４年１０月开始，细胞培养方法参照Ｎａｙｅｌｉ等［８］的奶牛乳腺上皮细胞培养
方法。
１．２．２　ＭＴＴ法测定细胞增殖　　以密度为０．８×１０４ 个／孔细胞接种到９６孔板，分为５组，每组５个重复即对
照组（基础培养基＋０μｇ／ｍＬ）、试验Ⅰ～Ⅳ组（基础培养基中分别加２５，５０，７５和１００μｇ／ｍＬ），其中苜蓿黄酮用
ＤＭＳＯ溶解，对照组和各试验组中的ＤＭＳＯ含量为２‰，细胞培养到第３天和第５天分别在每孔中加入２０μＬ
０．５％ＭＴＴ，再在培养箱中继续培养４ｈ，然后去除培养液，用磷酸盐缓冲液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）冲
洗２遍，每孔加入ＤＭＳＯ１５０μＬ于摇床混匀１０ｍｉｎ，最后在４９０ｎｍ（酶标仪）下测定ＯＤ值。
１．２．３　ＮＯ与ＬＤＨ含量的测定　　取密度为５×１０５ 个／孔细胞接种到１２孔板，处理方法同 ＭＴＴ法，培养５ｄ
后，根据所购买试剂盒中说明书进行测定各项指标，每组５个重复。
１．２．４　抗氧化指标的测定　　取密度为５×１０５ 个／孔细胞接种到１２孔板，处理方法同ＭＴＴ法，培养５ｄ后，根
据所购买试剂盒中说明书测定各项指标，每组５个重复。
０４１ 草　业　学　报 第２４卷
１．２．５　细胞总ＲＮＡ的提取和ｃＤＮＡ的合成　　取密度为１×１０６ 个／孔细胞接种到６孔板，处理方法同 ＭＴＴ
法，培养５ｄ后，根据ＲＮＡ提取试剂盒说明书进行组织总ＲＮＡ的提取，采用ＯｎｅＤｒｏｐ仪器进行总ＲＮＡ的浓度
和纯度的测定。然后采用Ｔａｋａｒａ反转录试剂盒进行ｃＤＮＡ的合成。试验在冰上进行，１０μＬ体系，反应条件为
３７℃，１５ｍｉｎ；８５℃，５ｓ；４℃。所得ｃＤＮＡ保存于－２０℃待测。
１．２．６　引物设计　　根据ＧｅｎｅＢａｎｋ中狆５３、犆犪狊狆犪狊犲３、犛犗犆犛３、犛犜犃犜１基因序列，采用Ｐｒｉｍｅｒ５．０软件设计，
引物由Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司合成（表１）。
表１　引物设计
犜犪犫犾犲１　犘狉犻犿犲狉犱犲狊犻犵狀
基因Ｇｅｎｅ 登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ 引物序列Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ 产物长度Ｐｒｏｄｕｃｔｌｅｎｇｔｈ（ｂｐ）
狆５３ ＮＭ＿１７４２０１．２ Ｆ：ＣＧＴＣＴＡＧＧＧＴＴＣＣＴＧＣＡＡＴＣ；Ｒ：ＣＴＣＡＣＡＡＣＣＴＣＣＧＴＣＡＴＧＴＧ １９４
犛犜犃犜１ ＮＭ＿００１０７７９００．１ Ｆ：ＴＴＣＡＡＣＡＴＴＣＴＧＧＧＣＡＣＴＣＡ；Ｒ：ＡＴＣＡＣＣＡＣＧＡＣＧＧＧＴＡＧＡＧＡ ２３６
犆犪狊狆犪狊犲３ ＮＭ＿００１０７７８４０．１ Ｆ：ＧＡＣＡＧＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＡ；Ｒ：ＡＧＣＣＴＧＴＧＡＧＣＧＴＧＣＴＴＴ １６７
犛犗犆犛３ ＮＭ＿１７４４６６．２ Ｆ：ＧＧＣＣＡＣＴＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＴＣＴＧＴ；Ｒ：ＴＣＣＡＧＧＡＡＣＴＣＣＣＧＡＡＴＧＧ ９９
β犪犮狋犻狀 ＮＭ＿１７３９７９．３ Ｆ：ＧＡＣＡＴＣＣＧＣＡＡＧＧＡＣＣＴＣＴＡ；Ｒ：ＡＣＡＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣ ２０５
１．２．７　ＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲ　　根据 ＴａＫａＲａ试
剂盒说明书进行冰上配制反应液（表２），后在
罗氏 ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ? ９６ＰＣＲ 仪上进行检测。
ＰＣＲ反应条件为，第１步预变性：９５℃３０ｓ。
第２步ＰＣＲ反应：进行以下循环４０次：９５℃５
ｓ，６０℃２０ｓ。第３步融解曲线分析：６５℃１５ｓ。
１．３　数据处理
用Ｅｘｃｅｌ对试验数据进行预处理，结果以
平均值±标准差表示，采用ＳＰＳＳ１７．０单因素
方差分析（ＡＮＯＶＡ），ＬＳＤ法多重比较，犘＜
０．０１表示差异极显著，犘＜０．０５表示差异显著。
基因相对表达量采用２－ΔΔＣｔ方法进行计算。
２　结果与分析
２．１　苜蓿黄酮对体外培养奶牛乳腺上皮细胞增殖的影响
表２　犚犜－犘犆犚反应液
犜犪犫犾犲２　犜犺犲狉犲犪犮狋犻狅狀犾犻狇狌犻犱狅犳狉犲犪犾狋犻犿犲犘犆犚
试剂
Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ
使用量
Ｖｏｌｕｍｅ
（μＬ）
终浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
（μｍｏｌ／Ｌ）
ＳＹＢＲ预混合试剂ＥｘＴａｑⅡ １０ １×
ＳＹＢＲ?ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑⅡ（ＴｌｉＲＮａｓｅＨＰｌｕｓ）２×
ＰＣＲ正向引物ＰＣＲｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒ（１０μｍｏｌ／Ｌ） ０．８ ０．４
ＰＣＲ反向引物ＰＣＲｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ（１０μｍｏｌ／Ｌ） ０．８ ０．４
ｃＤＮＡ模板ｃＤＮＡｔｅｍｐｌａｔｅ ２．０ １×
灭菌蒸馏水ＳｔｅｒｉｌｅｄＨ２Ｏ ６．４
总体积 Ｔｏｔａｌｖｏｌｕｍｅ ２０．０
　　从表３可以看出，培养３ｄ的乳腺细胞的各组增殖水平差异不显著，培养５ｄ的乳腺上皮细胞试验Ⅱ组、Ⅲ组
与Ⅳ组的增殖水平与对照组和试验Ⅰ组差异极显著（犘＜０．０１），但对照组与试验Ⅰ组差异不显著。说明高浓度
的苜蓿黄酮对奶牛乳腺上皮细胞的增殖效果明显，且试验Ⅲ组效果最显著。
表３　苜蓿黄酮对奶牛乳腺上皮细胞增殖的影响
犜犪犫犾犲３　犈犳犳犲犮狋狅犳犪犾犳犪犾犳犪犳犾犪狏狅狀狅犻犱狊狅狀狋犺犲犵狉狅狑狋犺狅犳犱犪犻狉狔犮狅狑犿犪犿犿犪狉狔犲狆犻狋犺犲犾犻犪犾犮犲犾
时间Ｔｉｍｅ（ｄ） 对照组ＣＫ Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ
３ ０．３７±０．０８ａ ０．３８±０．０６ａ ０．３８±０．０５ａ ０．３７±０．０４ａ ０．３９±０．０２ａ
５ ０．３９±０．０８Ｂｂ ０．３９±０．０１Ｂｂ ０．４１±０．０２ＡＢｂ ０．４６±０．０２Ａａ ０．４０±０．０２ＡＢｂ
　注：同行不同大写字母表示差异极显著（犘＜０．０１），不同小写字母表示差异显著（犘＜０．０５），下同。
　Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃａｐｉｔａｌｌｅｔｔｅｒｓｍｅａｎｈｉｇｈｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ（犘＜０．０１）ａｎｄｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｏｗｅｒｃａｓｅｌｅｔｔｅｒｓｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ
（犘＜０．０５），ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．
１４１第１２期 苏效双　等：苜蓿黄酮对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞增殖与抗氧化的影响
表４　苜蓿黄酮对奶牛乳腺上皮细胞犖犗和犔犇犎的影响
犜犪犫犾犲４　犈犳犳犲犮狋狅犳犪犾犳犪犾犳犪犳犾犪狏狅狀狅犻犱狊狅狀犖犗犪狀犱犾犪犮狋犪狋犲犱犲犺狔犱狉狅犵犲狀犪狊犲（犔犇犎）狅犳犱犪犻狉狔犮狅狑犿犪犿犿犪狉狔犲狆犻狋犺犲犾犻犪犾犮犲犾
项目Ｉｔｅｍｓ 对照组ＣＫ Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ
ＮＯ（μｍｏｌ／Ｌ） ８．７１±０．３４Ｄ ６．２１±０．４７Ｅ ９．６１±０．３１Ｃ １２．１９±０．２０Ｂ １４．７９±０．１１Ａ
ＬＤＨ （Ｕ／Ｌ） １０７８．８０±７６．１４Ａ ６７５．６０±６０．６８Ｃａ ５７３．２１±２１．１５Ｃｂ １１３８．０４±６１．８３Ａ ７９６．８９±３９．９７Ｂ
　　从表４可以看出，体外培养奶牛乳腺上皮细胞上清中ＮＯ水平，试验Ⅱ组、Ⅲ组与Ⅳ组明显高于对照组与试
验Ⅰ组，且差异极显著（犘＜０．０１）。试验Ⅰ组、Ⅱ组与Ⅳ组的体外培养乳腺上皮细胞的ＬＤＨ活性显著低于对照
组与试验Ⅲ组，且差异极显著（犘＜０．０１），但对照组与试验Ⅲ组差异不显著。乳腺上皮细胞上清中ＬＤＨ活性降
低说明添加苜蓿黄酮对保护细胞的完整性，防止细胞破裂死亡发挥了作用。
２．２　苜蓿黄酮对奶牛乳腺上皮细胞抗氧化作用的影响
从表５可以看出，乳腺上皮细胞内试验Ⅳ组的ＣＡＴ水平明显高于对照组、Ⅰ组、Ⅱ组与Ⅲ组（犘＜０．０１）。
ＳＯＤ水平５组差异不显著。试验Ⅱ组与Ⅲ组的ＧＳＨＰＸ活性显著高于对照组、试验Ⅰ组和Ⅳ组（犘＜０．０１），试
验Ⅱ组与试验Ⅲ组差异不显著（犘＞０．０５）。ＭＤＡ含量Ⅲ组明显低于对照组、试验Ⅰ组、Ⅱ组与Ⅳ组，且对照组与
试验Ⅱ组差异不显著。综上所述，苜蓿黄酮通过提高ＣＡＴ、ＧＳＨＰＸ的活性，来提高乳腺上皮细胞的抗氧化能
力，且在用量为试验Ⅱ组与试验Ⅲ组时效果比较明显。
表５　苜蓿黄酮对奶牛乳腺上皮细胞抗氧化作用的影响
犜犪犫犾犲５　犈犳犳犲犮狋狅犳犪犾犳犪犾犳犪犳犾犪狏狅狀狅犻犱狊狅狀犪狀狋犻狅狓犻犱犪狀狋狊狋犪狋狌狊狅犳犱犪犻狉狔犿犪犿犿犪狉狔犲狆犻狋犺犲犾犻犪犾犮犲犾
项目Ｉｔｅｍｓ 对照组ＣＫ Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ
ＣＡＴ（Ｕ／ｍＬ） ３．０９±０．８７ＢＣｂ ２．１０±０．１５Ｃ ５．０２±０．２９Ｂａ ３．８９±０．４１ＢＣａｂ ８．７７±０．１５Ａ
ＳＯＤ（Ｕ／ｍＬ） ２２．１５±０．６５ａ ２０．８８±０．７９ａ ２１．５５±０．７５ａ ２１．８８±０．４５ａ ２１．１５±１．８５ａ
ＧＳＨＰＸ（Ｕ／ｍＬ） ３０３．６３±２０．６７Ｂａｂ ３３７．４１±４６．２３Ｂａ ４２５．９２±３８．８８Ａ ４３４．６０±２７．１５Ａ ２８６．７２±１３．３８Ｂｂ
ＭＤＡ（ｎｍｏｌ／ｍＬ） ３．９４±０．３２Ｃ ８．３７±０．１４Ａ ３．１８±０．５３Ｃ １．７６±０．３３Ｄ ５．９１±０．８０Ｂ
２．３　基因狆５３、犆犪狊狆犪狊犲３、犛犗犆犛３、犛犜犃犜１的ＲＴ－ＰＣＲ结果
从表６可以看出，犛犗犆犛３基因的相对表达量分别是对照组的０．６９，０．４８，０．５０，０．９０倍，试验Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ
组显著低于对照组（犘＜０．０１），且试验Ⅱ组、Ⅲ组显著低于试验Ⅰ组、Ⅳ组，但试验Ⅱ组与试验Ⅳ组差异不显著
（犘＞０．０１），说明苜蓿黄酮降低了犛犗犆犛３基因的表达量。犛犜犃犜１基因的相对表达量分别是对照组的０．７９，
０．３４，０．８３，０．８９倍，显著低于对照组（犘＜０．０１），其中试验Ⅱ组含量显著低于Ⅰ组、Ⅲ组、Ⅳ组（犘＜０．０１），说明
苜蓿黄酮降低了犛犜犃犜１基因的表达量。狆５３、犆犪狊狆犪狊犲３基因的相对表达量，试验Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组显著低于对照
组与试验Ⅰ组，说明苜蓿黄酮降低了狆５３、犆犪狊狆犪狊犲３基因的表达量。
表６　奶牛乳腺上皮细胞狆５３、犆犪狊狆犪狊犲３、犛犗犆犛３、犛犜犃犜１的表达
犜犪犫犾犲６　犚犜－犘犆犚狅狀狆５３，犆犪狊狆犪狊犲３，犛犗犆犛３，犛犜犃犜１犻狀犱犪犻狉狔犮狅狑犿犪犿犿犪狉狔犲狆犻狋犺犲犾犻犪犾犮犲犾
项目Ｉｔｅｍｓ 对照组ＣＫ Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ
狆５３ １．００Ｂａ １．２８±０．１０Ａ ０．５８±０．０４Ｃ ０．８５±０．０６Ｂｂ ０．５９±０．０３Ｃ
犆犪狊狆犪狊犲３ １．００Ｂ １．３２±０．０８Ａ ０．７１±０．１０Ｃ ０．４０±０．０２Ｄ ０．４３±０．０３Ｄ
犛犗犆犛３ １．００Ａａ ０．６９±０．０４Ｂ ０．４８±０．０１Ｃ ０．５０±０．０２Ｃ ０．９０±０．０２Ａｂ
犛犜犃犜１ １．００Ａ ０．７９±０．０１Ｃ ０．３４±０．０４Ｄ ０．８３±０．０１ＢＣｂ ０．８９±０．０１Ｂａ
２４１ 草　业　学　报 第２４卷
３　讨论与结论
３．１　苜蓿黄酮对体外培养奶牛乳腺上皮细胞功能与增殖的影响
研究表明苜蓿黄酮具有一定的雌激素作用［９］，苜蓿黄酮对奶牛乳腺上皮细胞的增殖作用机制可能是苜蓿黄
酮中的活性成分作用于雌激素的受体，起到一定雌激素的作用，而雌激素具有促进乳腺管增生的作用，引起奶牛
乳腺上皮细胞的增殖。本试验表明培养３ｄ的乳腺细胞各组的增殖水平差异不显著，培养５ｄ的乳腺上皮细胞试
验Ⅱ组、Ⅲ 组、Ⅳ 组的增殖水平与对照组和试验Ⅰ组差异极显著（犘＜０．０１）。说明高浓度的苜蓿黄酮对奶牛乳
腺上皮细胞的增殖效果明显，且浓度在７５μｇ／ｍＬ时效果最显著。穆莹和江连洲
［１０］的研究表明大豆异黄酮对奶
牛乳腺上皮细胞的增殖具有明显的作用。ＮＯ作为血管舒张因子增加血流量有显著作用，乳腺上皮细胞分泌的
ＮＯ进入乳腺血管中增加血流量，促进泌乳。随着泌乳期的改变，乳腺中ＮＯ的含量会发生变化，其含量在泌乳
前期与妊娠后期达到最大，证明ＮＯ对促进泌乳具有重要作用［１１］。只有当细胞受损时ＬＤＨ才能在细胞培养上
清中检出，所以细胞培养上清中ＬＤＨ的浓度代表细胞的受损程度，本试验中添加苜蓿黄酮培养的奶牛乳腺上皮
细胞培养上清中试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ组的ＬＤＨ含量与对照组比较均有降低，说明苜蓿黄酮对奶牛乳腺上皮细胞具有
保护作用，对细胞增殖情况的检测也进一步得到证实。本试验中随着苜蓿黄酮添加剂量的升高，其ＮＯ的含量随
之上升，说明苜蓿黄酮对奶牛的泌乳性能有积极的影响。但ＮＯ作为自由基其含量过高会对机体造成损害，因此
需要控制细胞内ＮＯ的含量在正常范围值以内。
３．２　苜蓿黄酮对体外培养奶牛乳腺上皮细胞抗氧化能力的影响
机体在氧化反应过程中会产生自由基，自由基在机体内具有能量的传递等作用，但是自由基的活动失控及产
量过多时就会对机体产生损害。这些自由基具有强氧化作用，会使机体在组织水平，细胞水平或分子水平产生损
伤与破坏，最终导致疾病与衰老的发生［１２］。ＣＡＴ与ＧＳＨＰＸ都是机体内重要的抗氧化酶类，ＣＡＴ能够分解细
胞中羟自由基对细胞的内环境产生保护作用［１３］。ＧＳＨＰＸ含量的提高是动物机体抗氧化能力增强的标志之一；
ＭＤＡ是机体新陈代谢产生的自由基大量聚集引发细胞膜中不饱和脂肪酸过氧化的产物，细胞内 ＭＤＡ的水平可
反映机体内脂质过氧化的程度，测定其浓度可以判断细胞损伤的程度［１４］。因此，通过测定机体ＣＡＴ、ＧＳＨＰＸ
的活力与 ＭＤＡ的含量，在一定程度上可以反映机体的抗氧化能力［１５］。苜蓿黄酮中含有丰富的酚类物质，可与
过氧化自由基结合，阻断过氧化链式反应的进行，提高机体的抗氧化能力。本研究结果表明苜蓿黄酮通过提高奶
牛乳腺上皮细胞内ＣＡＴ、ＧＳＨＰＸ的活性，来提高奶牛乳腺上皮细胞的抗氧化能力。试验Ⅳ组可能因为苜蓿黄
酮添加量过高而引起其他的影响，需要进一步的探究。李宝兰等［１６］通过研究小鼠灌胃苜蓿黄酮后发现在小鼠的
肝脏和肾脏组织中，ＳＯＤ活性明显升高而 ＭＤＡ的含量显著降低。说明苜蓿黄酮可通过提高抗氧化酶的活性来
增强机体抗氧化的能力。卢志勇等［１７］研究发现，通过添加大豆异黄酮进行奶牛乳腺上皮细胞培养，可以显著提
升奶牛乳腺上皮细胞中ＣＡＴ、ＳＯＤ、ＧＳＨＰＸ的活性，显著降低 ＭＤＡ的含量，起到增强细胞抗氧化能力的作用。
近年研究表明，所有抗氧化剂都对体系有一定要求，大多数酚类抗氧化剂在高剂量下不但起不到抗氧化效果，反
而有助于氧化。因此，对于苜蓿黄酮的适宜添加量还需进一步的研究。
３．３　苜蓿黄酮对体外培养奶牛乳腺上皮细胞中狆５３、犆犪狊狆犪狊犲３、犛犗犆犛３、犛犜犃犜１基因表达的影响
Ｂｏｕé等［１８］在试验中发现染料木素在质量浓度小于０．５μｇ／Ｌ时，可以抑制乳腺癌细胞 ＭＣＦ７的增殖和生
长。吴健全等［１９］发现用５μｍｏｌ／Ｌ的染料木黄酮处理乳腺癌细胞后，癌细胞中血管内皮生长因子的 ｍＲＮＡ和蛋
白表达水平逐渐降低。Ｃａｉ等［２０］研究发现在突变型４～１８周龄的Ａｐｃｍｉｎ鼠的饲粮中添加０．２％苜蓿素，与对照
组相比，患肠癌的概率降低了３３％；进一步的试验发现苜蓿素对于抑制恶性胸腺癌细胞 ＭＤＡＭＢ４６８的生长具
有重要作用。狆５３与犛犜犃犜１基因在生物体内对于细胞周期与细胞凋亡有重要作用，且都能抑制细胞的癌变。
犛犜犃犜１还有抗感染，调节免疫系统等作用。缺失犛犜犃犜１的小鼠化学诱导的或者自发的肿瘤发生频率要比野生
型小鼠更高，并且抗肿瘤活性因子ＩＦＮα失活，由此ＳＴＡＴ１被认定为肿瘤抑制蛋白［２１］。犆犪狊狆犪狊犲３是Ｃａｓｐａｓｅ
家族中最重要的凋亡效应因子，犆犪狊狆犪狊犲３诱导凋亡执行的机理为，它对全部或部分关键性蛋白酶进行裂解，从而
使ＤＮＡ片断化，导致细胞凋亡。正常细胞中犆犪狊狆犪狊犲３以无活性酶原的形式存在，由凋亡刺激因素作用以激活，
３４１第１２期 苏效双　等：苜蓿黄酮对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞增殖与抗氧化的影响
激活的犆犪狊狆犪狊犲３可以活化ＤＮＡ修复酶、细胞骨架蛋白及核因子等，导致ＤＮＡ裂解、细胞皱缩、凋亡小体形成
和染色体浓缩等细胞形态的变化，最终引起细胞凋亡，对凋亡具有促进作用［２２］。张曼和王桂敏［２３］研究发现，菟
丝子黄酮可以通过降低Ｃａｓｐａｓｅ３蛋白的表达来抑制细胞凋亡的发生，对大鼠脑缺血再灌注损伤起到保护的作
用。细胞因子信号传导抑制蛋白３（ＳＯＣＳ３）可以对多种细胞因子和激素（包括ＬＩＦ，ＩＬ１１，生长激素，胰岛素和
瘦素）产生的信号传导过程进行负调节，这些信号传导过程的作用涉及启动免疫反应，控制炎症过程，调节生长发
育以及淋巴细胞的分化等方面［２４］。犛犜犃犜１可诱导凋亡蛋白的合成，Ｃａｓｐａｓｅ３前体可在体内或体外刺激的作用
下形成凋亡蛋白，进而水解其他蛋白质。犛犜犃犜１还可以与ｐ５３蛋白作用，该蛋白参与调节细胞凋亡和细胞周
期。平时机体由于缺氧、营养缺乏、ＤＮＡ受损或者癌基因被激活使得原来处在低水平表达的ｐ５３蛋白，表达水平
明显提升［２５］。本试验ＲＴ－ＰＣＲ结果表明，苜蓿黄酮通过下调犆犪狊狆犪狊犲３、犛犗犆犛３、狆５３、犛犜犃犜１的表达来起到阻
止细胞癌变，抑制细胞凋亡，减轻炎症反应等作用。
犚犲犳犲狉犲狀犮犲狊：
［１］　ＬｉＪＦ，ＳｕｎＸＨ，ＹｕａｎＸＪ，犲狋犪犾．Ｅｆｆｅｃｔｏｆａｄｄｉｎｇａｃｅｔｉｃａｃｉｄｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｑｕａｌｉｔｙａｎｄａｅｒｏｂｉｃｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｍｉｘｅｄｏａｔａｎｄａｌ
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ｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｓｗｈｉｌｅｎｏｔａｆｆｅｃｔｉｎｇｎｏｒｍａｌｃｅｌｓ．ＦｏｏｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１４，１６４：３６３３７０．
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ｈｅａｔｓｔｒｅｓｓ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１４，２３（３）：２１５２２３．
［６］　ＬｉｕＣＬ，ＬｉＺＱ，ＺｈａｎｇＦ，犲狋犪犾．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｄａｉｄｚｅｉｎａｎｄｇｅｎｉｓｔｅｉｎｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎｏｆｍａｍｍａｒｙｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌ
ｏｆｄａｉｒｙｃｏｗ犻狀狏犻狋狉狅．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｃｉｅｎｃｅｓ，２００８，３９（１１）：１５１７１５２２．
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ｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎｉｎｔｏｂｏｖｉｎｅｍａｍｍａｒｙｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｓａｎｄｍｏｄｕｌａｔｅａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｅｐｔｉｄｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，
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［９］　ＫｕｉｐｅｒＧＧＪＭ，ＬｅｍｍｅｎＪＧ，ＣａｒｌｓｓｏｎＢＯ，犲狋犪犾．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｏｆｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃｃｈｅｍｉｃａｌｓａｎｄｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎｓｗｉｔｈｅｓｔｒｏｇｅｎｒｅ
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４４１ 草　业　学　报 第２４卷
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ｈｕｍａｎｄｅｒｉｖｅｄｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｓ犻狀狏犻狋狉狅ａｎｄｉｎｎｕｄｅｍｉｃｅ犻狀狏犻狏狅．ＢｒｉｔｉｓｈＪｏｕｒｎａｌｏｆＣａｎｃｅｒ，２００４，９１（７）：１３６４１３７１．
［２１］　ＬｅｓｉｎｓｋｉＧＢ，ＡｎｇｈｅｌｉｎａＭ，ＺｉｍｍｅｒｅｒＪ，犲狋犪犾．ＴｈｅａｎｔｉｔｕｍｏｒｅｆｆｅｃｔｓｏｆＩＦＮαａｒｅａｂｒｏｇａｔｅｄｉｎａ犛犜犃犜１ｄｅｆｉｃｉｅｎｔｍｏｕｓｅ．
ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，２００３，１１２（２）：１７０１８０．
［２２］　ＧｕａｎＬＸ，ＺｈａｉＦＧ，ＮｉｅＹ，犲狋犪犾．Ｅｆｆｅｃｔｏｆ犘犪狀犪狓狇狌犻狀狇狌犲犳狅犾犻狌犿ｓａｐｏｎｉｎｓｆｒｏｍｓｔｅａｍｓａｎｄｌｅａｖｅｓｏｎｎｅｕｒｏｎａｌａｐｏｐｔｏｓｉｓ
ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ犮犪狊狆犪狊犲３ｉｎｆｏｃａｌｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａｉｎｊｕｒｙｒａｔｓ．ＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙａｎｄＣｌｉｎｉｃｓｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ，
２００８，２４（１）：３０３２．
［２３］　ＺｈａｎｇＭ，ＷａｎｇＧＭ．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｆｒｏｍ犆狌狊犮狌狋犪犮犺犻狀犲狀狊犻狊ｏｎａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ犅犮犾２，犅犪狓ａｎｄ犆犪狊狆犪狊犲３
ｉｎｒａｔｓｗｉｔｈｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙ．ＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙａｎｄＣｌｉｎｉｃｓｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ，２０１４，３０（５）：７８８１．
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ＰＰＡＲｇａｍｍａａｇｏｎｉｓｔｓａｎｄａｒｏｌｅｆｏｒ犛犗犆犛３ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ．ＢｒｉｔｉｓｈＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２０１０，１６０（８）：１８８９１８９１．
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