全 文 ：犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１５４７０ 犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀
李小冬，舒健虹，于二汝，吴佳海，蔡一鸣，王小利．高羊茅在低氮胁迫下的蛋白组学分析．草业学报，２０１６，２５（３）：６７７６．
ＬＩＸｉａｏＤｏｎｇ，ＳＨＵＪｉａｎＨｏｎｇ，ＹＵＥｒＲｕ，ＷＵＪｉａＨａｉ，ＣＡＩＹｉＭｉｎｇ，ＷＡＮＧＸｉａｏＬｉ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎ
ｔｈｅｌｅａｖｅｓｏｆｔａｌｆｅｓｃｕｅ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１６，２５（３）：６７７６．
高羊茅在低氮胁迫下的蛋白组学分析
李小冬１，舒健虹１，于二汝２，吴佳海１，蔡一鸣１，王小利１
（１．贵州省草业研究所，贵州 贵阳５５０００６；２．贵州省油料研究所，贵州 贵阳５５０００６）
摘要：为了研究高羊茅在低氮胁迫条件下的蛋白水平变化，我们采用ｉＴＲＡＰ技术分析了氮胁迫３０ｄ的高羊茅叶片
中蛋白组学的变化。一共检测到５９５个差异蛋白（２９５个上调，３００个下调），分别参与了多个不同的代谢途径。在
高严谨筛选标准下，氮代谢、氧化还原反应以及胁迫相关代谢等多个途径的基因被明显上调表达。通过生理生化
测定发现，叶绿素、可溶性蛋白以及游离氨基酸的含量显著下降，而过氧化物酶（ＰＯＤ）、超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）以
及谷胱甘肽合成酶（ＧＳ）等活性氧清除酶活性显著升高。采用荧光定量ＰＣＲ的方法验证蛋白组学数据发现所有挑
选的基因都具有相同的变化趋势。分析显著富集的１４３３基因家族的表达，发现其都能被低氮胁迫诱导，因此胁
迫相关的基因可能是调节高羊茅抵抗多种不同逆境的关键基因。本文首次在高羊茅中采用蛋白组学的方法分析
低氮胁迫条件下基因的表达变化，获得重要候选基因，并对其应用进行了讨论。
关键词：高羊茅；低氮胁迫；蛋白组学；表达分析　　
犘狉狅狋犲狅犿犻犮犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狀犻狋狉狅犵犲狀狊狋狉犲狊狊狉犲狊狆狅狀狊犻狏犲狆狉狅狋犲犻狀狊犻狀狋犺犲犾犲犪狏犲狊狅犳狋犪犾犳犲狊犮狌犲
ＬＩＸｉａｏＤｏｎｇ１，ＳＨＵＪｉａｎＨｏｎｇ１，ＹＵＥｒＲｕ２，ＷＵＪｉａＨａｉ１，ＣＡＩＹｉＭｉｎｇ１，ＷＡＮＧＸｉａｏＬｉ１
１．犌狌犻狕犺狅狌犐狀狊狋犻狋狌狋犲狅犳犘狉犪狋犪犮狌犾狋狌狉犲，犌狌犻狔犪狀犵５５０００６，犆犺犻狀犪；２．犌狌犻狕犺狅狌犐狀狊狋犻狋狌狋犲狅犳犗犻犾犆狉狅狆狊，犌狌犻狔犪狀犵５５０００６，犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｔｈｏｒｏｕｇｈｌｙｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｃｈａｎｇｅｓｏｆｔａｌｆｅｓｃｕｅｉｎｌｏｗｎｉｔｒｏｇｅｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，
ｗｅａｎａｌｙｚｅｄｔｈｅｐｒｏｔｅｏｍｅｏｆｔｈｅｌｅａｖｅｓｆｒｏｍ３０ｄａｙｏｌｄｐｌａｎｔｓｅｘｐｏｓｅｄｔｏｌｏｗｎｉｔｒｏｇｅｎｓｔｒｅｓｓｕｓｉｎｇｔｈｅｉＴＲＡＰ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｉｎｔｏｔａｌ，５９５ｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｙａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ（２９５ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄａｎｄ３００ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ），
ｗｈｉｃｈｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｄｉｎｄｉｖｅｒｓｅｍｅｔａｂｏｌｉｃｐａｔｈｗａｙｓ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏａｓｔｒｉｃｔｓｅｌｅｃｔｉｏｎｓｔａｎｄａｒｄ，ｗｅｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄｔｈａｔ
ｔｈｅｇｅｎｅｓｒｅｌａｔｅｄｔｏｒｅｄｏｘｒｅａｃｔｉｏｎｓａｎｄｓｔｒｅｓｓｅｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓ
ｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌ，ｓｏｌｕｂｌｅｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｆｒｅｅａｍｉｎｏａｃｉｄｄｒａｍａｔｉｃａｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄ，ｗｈｉｌｅｒｅ
ａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｃａｖｅｎｇｉｎｇｅｎｚｙｍｅｓｓｕｃｈａｓＰＯＤ，ＳＯＤａｎｄＧＳｗｅｒｅｈｉｇｈｌｙａｃｔｉｖｅ．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｏｆａｆ
ｆｅｃｔｅｄｇｅｎｅｓ，ｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｒｅａｌｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＲＴ－ＰＣＲ，ｃｏｉｎｃｉｄｅｄｗｉｔｈｔｈｅｐｒｏｔｅｏｍｉｃｄａｔａ．Ｎｏ
ｔａｂｌｙ，ｍｏｓｔｏｆｔｈｅ１４３３ｆａｍｉｌｙｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅｅｎｒｉｃｈｅｄｂｙｎｉｔｒｏｇｅｎｓｈｏｒｔａｇｅ，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇｔｈａｔｔｈｅｓｅｉｎｖｏｌｖｅ
ｔｈｅｋｅｙｇｅｎｅｓｔｈａｔｔａｋｅｐａｒｔｉｎｄｉｖｅｒｓｅｓｔｒｅｓｓｅｓｉｎｔａｌｆｅｓｃｕｅ．Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｗｅｐｒｏｖｉｄｅｐｒｏｔｅｏｍｉｃｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｆｏｒｔａｌｆｅｓｃｕｅｓｕｂｊｅｃｔｅｄｔｏｌｏｗｎｉｔｒｏｇｅｎａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ．Ｗｅａｌｓｏｈｉｇｈｌｉｇｈｔｓｏｍｅｏｆｔｈｅｋｅｙｇｅｎｅｓｉｎｖｏｌｖｅｄａｎｄｄｉｓ
ｃｕｓｓｔｈｅｉｒｐｏｔｅｎｔｉａｌｕｓｅｓ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｔａｌｆｅｓｃｕｅ；ｎｉｔｒｏｇｅｎｓｔｒｅｓｓ；ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ；ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
第２５卷　第３期
Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．３
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
６７－７６
２０１６年３月
收稿日期：２０１５０９２９；改回日期：２０１５１１１６
基金项目：国家自然基金项目“高羊茅光周期调控基因ＦａＣＯＮＳＴＡＮＳ特异性表达与生物学功能分析”（３１３６０５７６）资助。
作者简介：李小冬（１９８４），男，湖南邵阳人，副研究员，博士。Ｅｍａｉｌ：ｌｉｘｉａｏｄｏｎｇｚｌ＠１６３．ｃｏｍ
通信作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｘｉａｏｌｉｚｈｅｎｙｕａｎ＠１２６．ｃｏｍ
非生物胁迫限制植物的生长发育与作物产量，植物主要通过两种方式来抵御这些伤害：一种是形成抵抗能力
强生理活性弱的成熟种子等特殊形态以躲避不利环境；二是通过激活一些可逆的调节机制（如抗逆基因的表达）
增强植物本身的抵抗力［１２］。耐低氮胁迫新品种的培育是减少农作物生产投入成本的一个主要方面。研究植物
在低氮胁迫条件下的分子响应机制将大大加快抗逆育种的进程。
通过转录组、蛋白组以及代谢组学等高通量生物信息学分析方法已经成功鉴定出许多参与逆境反应的功能
基因，它们参与了碳、氮以及油脂代谢等多个过程，在模式植物以及农作物中，已经成功发现了逆境胁迫调节过程
中许多关键酶的功能［３］。蛋白质是植物功能的体现者与执行者，其调节植物的抗逆性不仅体现在改变酶的催化
活性，而且部分可以作为转录因子调节其他基因的表达。作为大分子物质，蛋白质能够调节胞内物质的组成与浓
度，进而影响植物的渗透压等。因此，蛋白组的数据往往比转录组或者芯片分析的结果更可靠［４５］。
前人对氮代谢的研究主要集中在对植物根系的影响。根系发育和根吸收氮元素的能力是影响植物对氮元素
吸收能力的两个主要因素。氮元素对植物发育也有重要影响：随着氮素水平的增加，根系生物量和根系活力呈增
加的趋势，根系总量增加主要表现在侧根数目明显增多［６］；而在低氮条件下，植物也倾向于根系生长，但是在增加
相同生物量的情况下，根茎比重值增大，而且不利于侧根生长［７８］，对大部分收获籽实和营养体的农作物不利。植
物氮元素的代谢主要存在两种机制：一种叫 ＨＡＴＳ（ｈｉｇｈａｆｆｉｎｉｔｙｔｒａｎｓｐｏｒｔｓｙｓｔｅｍ），是在低氮条件下植物启动
组成型和诱导型表达的功能基因促进氮元素吸收；另一种是ＬＡＴＳ（ｌｏｗａｆｆｉｎｉｔｙｔｒａｎｓｐｏｒｔｓｙｓｔｅｍ），是在高氮条
件下减缓植物吸收氮元素的机制［９１０］，因此，这些不同机制导致了农作物不同品种对氮的吸收和利用具有显著的
差异，相关的研究在玉米（犣犲犪犿犪狔狊）、油菜（犅狉犪狊狊犻犮犪犮犪犿狆犲狊狋狉犻狊）和小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）等农作物中都有报
道［１０１３］。
氮元素吸收的分子模式在拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）中已经有很好的研究成果，氮不仅是一种重要的矿
物质元素，而且还作为一种重要的外部信号调节氮代谢基因的表达［１４１７］。氮元素作为生物体主要元素之一，其代
谢过程往往与其他信号途径互作。磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（ＰＥＰＣ）是有机酸代谢途径的关键酶，有报道称ＰＥＰＣ
在１２ｍｍｏｌ／Ｌ硝酸盐处理２ｈ后表达显著下调，另外淀粉合成的关键基因腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶
（ＡＧＰＳ２）的表达同样受硝酸盐的抑制［１８］。
在牧草类作物中，关于蛋白组学的研究在苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）已经有开展，但是在禾本科牧草中的报道
还很少。本研究通过蛋白组学的方法分析高羊茅（犉犲狊狋狌犮犪犪狉狌狀犱犻狀犪犮犲犪）在低氮胁迫条件下表达谱的变化，共检
测到５９５个差异蛋白，这些蛋白参与氮代谢、细胞氧化还原和逆境相关等多个不同的代谢途径。生理生化测定发
现，叶绿素、可溶性蛋白以及游离氨基酸的含量显著下降，而过氧化物酶（ＰＯＤ）、超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）以及谷
胱甘肽合成酶（ＧＳ）等酶活性在胁迫条件下显著升高，并采用荧光定量ＰＣＲ的方法对随机挑选的候选基因进行
了表达水平的分析。本研究为在禾本科牧草中研究氮代谢以及通过转基因技术培育抗性种质资源提供候选基因
与技术储备。
１　材料与方法
１．１　材料
本研究采用２００５年贵州省草业研究所育成的国家牧草新品种黔草１号高羊茅（登记号：２９９）为试验材料。
本实验Ｈｏａｇｌａｎｄ水培液所用的无机盐均购自上海国药公司，ＲＮＡ提取试剂盒购自Ａｘｙｇｅｎ公司，ＲＮＡ反转录
试剂盒购自ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司，荧光定量ＰＣＲ试剂盒购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。
１．２　方法
１．２．１　试验材料的准备和非生物胁迫处理　　从新鲜收获的黔草１号高羊茅中选取３００粒饱满的种子，用
５０℃温水浸泡过夜，加５０ｍＬ７５％酒精搅动、浸泡３０ｓ进行表面消毒，用１００ｍＬ无菌水冲洗３次。在培养皿底
铺垫２～３张灭菌滤纸，加入４～５ｍＬ无菌蒸馏水，然后将消毒好的种子均匀点播于滤纸上，放入光照培养箱中
发芽７ｄ，每天补加３～４ｍＬ无菌水使滤纸保持湿润，萌发后将幼苗放置在装有 Ｈｏａｇｌａｎｄ营养液的水培装置中
培养３０ｄ进行低氮胁迫处理：将幼苗分别转移到无氮水培液（低氮胁迫，营养液中ＮＯ３－被Ｃｌ－取代）和正常水培
８６ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．３
液中（对照，标准 Ｈｏａｇｌａｎｄ营养液）进行生长处理，低氮胁迫１５ｄ，每３ｄ更换１次营养液，同时为了缩小温室内
微环境的影响，栽植盆进行定期旋转。剪取胁迫与对照的高羊茅叶片，用液氮速冻，保存在－８０℃的冰箱中待用。
植株培养条件参考文献［１９］，具体为光照１６ｈ，黑暗８ｈ，生长温度２２℃。
１．２．２　蛋白酶解与ｉＴＲＡＱ标记　　蛋白酶解采用ＦＡＳＰ程序，参照文献［２０］，打断后的多肽采用４ｐｌｅｘ／８
ｐｌｅｘｉＴＲＡＱ（ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）试剂进行标记，实验程序参照试剂盒说明书。操作过程如下：将２００μｇ蛋白样
品溶解到３０μＬＳＴＤ缓冲液中（４％ＳＤＳ，１００ｍｍｏｌ／ＬＤＴＴ，１５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．０）。采用ＵＡ缓冲液
（８ｍｏｌ／ＬＵｒｅａ尿素，１５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．０）进行超滤透析去除ＤＴＴ和小分子量蛋白（３０ｋＤ）。然后
加入１００μＬ０．０５ｍｏｌ／Ｌ碘乙酰胺到ＵＡ缓冲液中，黑暗条件孵育２０ｍｉｎ用来封闭多肽残基的Ｃ端。用１００μＬ
ＵＡ缓冲液润洗３次，然后用１００μＬＤＳ缓冲液［５０ｍｍｏｌ／Ｌ三乙基碳酸氢铵（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ），
ｐＨ８．５］润洗２次。用４０μＬＤＳ缓冲液溶解，加入２μｇ胰蛋白酶（ｐｒｏｍｅｇａ，美国）３７℃暗光条件下酶解过夜后
收集起来备用。采用紫外分光的方法在２８０ｎｍ利用消光系数计算蛋白浓度。将ｉＴＲＡＱ试剂融入７０μＬ乙醇，
加入待标记的样品组织，标记完成后冷冻真空抽干备用。
１．２．３　蛋白分离与色谱分析　　将ｉＴＲＡＱ标记好的蛋白利用通用电气医疗集团生命科学部（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ，
美国）的ＡＫＴＡ蛋白自动纯化系统进行纯化。将标记好的多肽冲洗溶解于２ｍＬＡ缓冲液中（２５％ＡＣＮ中加入
１０ｍｍｏｌ／ＬＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ２．７），加入到４．６×１００ｍｍ多聚磺乙基的分离柱中（５μｍ，２００?）（ＰｏｌｙＬＣ，美国）。
洗脱采用０％～１０％ Ｂ缓冲液（２５％ ＡＣＮ 中加入５００ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ和１０ｍｍｏｌ／ＬＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ２．７）以１
ｍＬ／ｍｉｎ的流速洗脱２ｍｉｎ，１０％～２０％Ｂ缓冲液洗脱２５ｍｉｎ，２０％～４５％Ｂ缓冲液洗脱５ｍｉｎ，５０％～１００％Ｂ
缓冲液洗脱５ｍｉｎ。每ｍｉｎ的样品都单独收集，通过在２１４ｎｍ条件下监测吸光值，将相似的样品混合最终形成
１０个样品池进行脱盐处理，每个样品通过浓缩再溶解到４０μＬ０．１％（ｖ／ｖ）三氟乙酸中保存在－８０℃备用。
１．２．４　液相质谱分析　　将制备好的样品上样到ｎａｎｏＬＣＭＳ／ＭＳ液相质谱联用分析仪中分析。具体过程如
下：取１０μＬ（约５μｇ）样品溶液注射到Ｃ１８反相色谱柱（１５ｃｍ长，内径７５μｍ），内部填充５μｍＲＰＣ１８树脂混
合液Ａ（０．１％甲酸），洗脱时采用线性浓度的Ｂ缓冲液 （８０％ 氰化甲烷和０．１％ 甲酸溶液），以流速２５０ｍＬ／ｍｉｎ
分离超过１４０ｍｉｎ。质谱数据是根据扫描３００～１８００ｍ／ｚ范围丰度最高的高能诱导解离（ＨＣＤ）片段。
１．２．５　数据库比对分析质谱数据　　采用ＭＡＳＣＯＴ和ＰｒｏｔｅｏｍｅＤｉｓｃｏｖｅｒｅｒ１．３软件进行分析，差异蛋白的序
列根据ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ数据库获得，通过ＮＣＢＩＢＬＡＳＴ与ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ数据库比对与功能注释，阈值小于１０－３的序列
进行Ｂｌａｓｔ２ＧＯ与 ＧＯ分析，阈值设为１０－６。ＢＬＡＳＴ无结果的未注释基因通过ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ３搜索ＥＢＩ数据库
获取已知蛋白的模体，通过ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎＧＯ进行注释。代谢途径分析通过比对ＫＥＧＧ数据库。
１．２．６　生理生化指标的测定　　用０．８ｃｍ打孔器取低氮胁迫处理组和对照组的高羊茅叶片各１０片，称重后，
加入５ｍＬ８０％ 丙酮溶液进行萃取，分别测定６６３，６４６以及４７０ｎｍ下的吸光值，叶绿素ａ（Ｃｈｌａ）与叶绿素ｂ
（Ｃｈｌｂ）的计算方法分别为：Ｃｈｌａ＝１２．２１ＯＤ６６３－２．８１ＯＤ６４６；Ｃｈｌｂ＝２０．１３ＯＤ６４６－５．０３ＯＤ６６３，总叶绿素（Ｔ
Ｃｈｌ）为Ｃｈｌａ＋Ｃｈｌｂ。取１００ｍｇ处理组和对照组新鲜叶片，加液氮磨碎，加入１ｍＬ提取缓冲液（甲醇∶水＝
１∶１）超声处理３０ｍｉｎ，１３２００ｒ／ｍｉｎ，４℃离心１０ｍｉｎ，上清液用来进行可溶性蛋白和游离氨基酸含量的测定，测
定分析是由北京艾米诺医药研究公司分析完成，详细操作程序参考文献［２１］。氧化还原酶活性采用试剂盒测定，
称取１００ｍｇ新鲜处理组和对照组的叶片，加１ｍＬ预冷的ＰＢＳ提取缓冲液，４℃，用研钵磨碎，超氧化物歧化酶
（ＳＯＤ）和谷氨酰胺合成酶（ＧＳ）分别采用试剂盒Ｓ０１０２和Ｓ００５５（碧云天，北京）测定，过氧化物酶（ＰＯＤ）活性采
用试剂盒Ａ０８４３（南京建成）测定，测定过程均按照试剂盒说明书进行。
１．２．７　高羊茅总ＲＮＡ提取与反转录ＰＣＲ荧光定量分析　　ＲＮＡ提取与反转录ＰＣＲ参考文献［２２］，ＲＮＡ提
取采用 ＴａＫａＲａＲＮＡｉｓｏＲｅａｇｅｎｔ试剂盒，具体操作过程参照试剂盒说明书。ＲＮＡ的反转录应用 ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ
ＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ完成，用１μＬＤＮａｓｅ处理ＲＮＡ，每样品取５μｇＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡ，具体程
序参照试剂盒说明书。应用荧光定量ＰＣＲ技术验证筛选的候选基因的表达变化。具体方法如下，将合成的ｃＤ
ＮＡ稀释２０倍作为荧光定量ＰＣＲ的模板。ＰＣＲ的程序为：９５℃５ｍｉｎ，９５℃１０ｓ，５８℃１０ｓ，７２℃３０ｓ，４５个循
环，７２℃１０ｍｉｎ，从６５℃缓慢升温到９５℃，每０．５℃收集一次荧光信号用于制作溶解曲线，荧光定量引物利用在
９６第２５卷第３期 草业学报２０１６年
线软件ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／Ｓｃｉｔｏｏｌｓ／Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／Ｐｒｉｍｅｒｑｕｅｓｔ设计，引物序列参照表１。试验方法和程
序参照文献［２０］，采用２－ΔΔｃｔ算法，每个样品３个生物学重复，每个生物学重复３个技术重复。
表１　本实验中使用的引物
犜犪犫犾犲１　犘狉犻犿犲狉狊狌狊犲犱犻狀狋犺犻狊狊狋狌犱狔
基因名称Ｇｅｎｅｎａｍｅ 左引物序列（５′－３′）Ｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ 右引物序列（５′－３′）Ｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ
１４３３Ａ ＡＴＧＡＧＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＡＧＡＴＣＡＡＧ ＣＧＡＡＣＡＡＴＡＣＡＧＧＴＡＧＣＴＧＣＧＡＡＴ
１４３３Ｂ ＴＡＧＴＧＡＴＧＡＧＴＧＧＣＧＧＴＴＴＡＧＴＴＧＡ ＡＴＡＡＧＧＴＣＡＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＡＡＴＣＡＡ
１４３３Ｃ ＴＴＧＣＣＴＡＣＣＣＴＧＧＡＴＡＡＧＡＴＣＴＡＡＧ ＴＡＡＴＡＡＡＣＣＣＡＧＴＣＧＴＡＴＣＧＣＴＴＡＧ
１４３３Ｄ ＣＡＡＧＡＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＣＴＡＣＣＡ ＧＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＧＡＴＧ
ＣＬ１６３．Ｃｏｎｔｉｇ２ ＣＣＴＴＴＡＣＴＡＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＴＡＴＣＡＧＡＡ ＣＣＣＴＴＧＴＴＧＧＡＧＴＴＧＧＧＴＧＡ
Ｕｎｉｇｅｎｅ１４０４２ ＴＣＴＣＣＡＣＧＣＴＣＧＡＣＧＡＣＣＡＣ ＡＡＣＧＡＣＡＡＣＧＡＡＣＴＴＧＣＣＴＧＡＴ
ＣＬ３７８７．Ｃｏｎｔｉｇ１ ＣＣＣＡＧＣＡＧＡＴＧＣＣＡＣＡＡＧＧ ＣＣＴＴＣＴＧＧＡＡＧＴＣＧＣＣＡＡＡＣＡＴ
ＣＬ４９２４．Ｃｏｎｔｉｇ１ ＡＧＡＣＧＧＡＣＡＧＣＡＡＣＣＡＣＴＧＣ ＣＴＣＣＡＣＧＧＡＣＴＧＣＡＴＡＣＴＣＡＣＡＴ
ＣＬ１５６４．Ｃｏｎｔｉｇ１ ＣＧＴＡＴＧＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＴＡＣＡＴ ＴＡＴＴＴＧＧＡＴＧＧＡＡＧＧＡＴＧＴＧＴＣＡＧＡ
ＣＬ７１１９．Ｃｏｎｔｉｇ２ ＣＡＡＣＧＧＣＧＧＡＡＧＧＡＴＴＡＧＧＴ ＣＣＡＣＴＴＧＧＡＧＣＧＧＡＴＧＡＧＧＡ
ＣＬ７７４３．Ｃｏｎｔｉｇ１ ＣＣＧＡＧＧＣＴＧＴＴＣＡＧＡＡＧＡＴＧＣ ＣＡＧＣＧＡＡＴＣＣＡＡＧＡＡＣＧＧＴＡＧＡ
ＣＬ１０９００．Ｃｏｎｔｉｇ１ ＧＧＧＴＣＡＧＣＧＡＧＡＡＧＡＴＡＡＣＧＡＡ ＡＣＧＧＡＣＧＡＧＧＴＡＧＡＣＧＡＧＣＡＧ
Ｕｎｉｇｅｎｅ１８７８６ ＡＡＧＣＡＴＴＧＣＧＴＡＴＧＴＣＴＧＧＧＧ ＣＡＴＧＧＡＴＡＣＣＣＡＡＴＣＣＴＧＡＧＴＧＡＡ
Ｕｎｉｇｅｎｅ１１５４７ ＧＡＣＡＡＣＣＣＴＧＣＴＡＡＣＣＣＧＡＡ ＣＣＣＧＴＴＣＣＡＡＴＴＣＣＡＣＣＡＡＴ
Ｕｎｉｇｅｎｅ１８８０６ ＧＣＡＡＣＧＣＣＴＡＣＴＴＣＣＡＧＣＧ ＣＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＣＣＡＣＣＴＣＣＴＣ
１．３　数据分析
采用Ｅｘｃｅｌ与ＰｏｗｅｒＰｏｉｎｔ完成实验数据作图及统计分析。
２　结果与分析
２．１　高羊茅蛋白组数据总体描述
我们采用了ｉＴＲＡＱ技术分析了高羊茅叶片在低氮胁迫条件下蛋白组的变化，在差异基因阈值设为＞１．２倍
或者＜０．８３倍，并且犘＜０．０５情况下，我们共检测到５９５个蛋白表达有显著变化，其中有２９５个蛋白上调表达，
３００个基因下调表达，对所有氮胁迫诱导差异表达基因进行ＧＯ功能聚类（ＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙｄａｔａｂａｓｅ，ｈｔｔｐ：／／ｇｅ
ｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ）。在细胞组分聚类分析中，蛋白主要定位于细胞质（７７）、细胞器（６１）、质膜（２５）（图１Ａ）；在生物
过程聚类中参与最多的依次为代谢过程（５８）、细胞过程（４０）、单有机体过程（１８）、逆境反应（１３）等过程（图１Ｂ）；
在分子功能聚类分析中发现具有结合功能（５１）和催化功能（４５）的基因占据大部分（图１Ｃ）。
２．２　差异基因代谢途径分析
高羊茅在低氮胁迫条件下，有几个代谢途径的基因呈现明显的变化。其中氮代谢途径的基因，在高严谨筛选
条件下（表达差异倍数＞１．５，或者＜０．６７），共有１０个蛋白（ＣＬ１０３５９．Ｃｏｎｔｉｇ４＿Ａｌ、ＣＬ５７７６．Ｃｏｎｔｉｇ１＿Ａｌ、Ｕｎｉ
ｇｅｎｅ１２８４３＿Ａｌ、ＣＬ５５２７．Ｃｏｎｔｉｇ１＿Ａｌ、ＣＬ８６８９．Ｃｏｎｔｉｇ１＿Ａｌ、ＣＬ８７０８．Ｃｏｎｔｉｇ２＿Ａｌ、Ｕｎｉｇｅｎｅ９０８３＿Ａｌ、Ｕｎｉ
ｇｅｎｅ２３７０２＿Ａｌ、ＣＬ１１１３６．Ｃｏｎｔｉｇ１＿Ａｌ 和ＣＬ３４０．Ｃｏｎｔｉｇ１１＿Ａｌ）被上调１．５２～２．２４倍，另外５个蛋白（Ｕｎｉ
ｇｅｎｅ６５１６＿Ａｌ、Ｕｎｉｇｅｎｅ２３４７４＿Ａｌ、Ｕｎｉｇｅｎｅ２１２６１＿Ａｌ、Ｕｎｉｇｅｎｅ４２０４０＿Ａｌ 和 ＣＬ７６８８．Ｃｏｎｔｉｇ１＿Ａｌ）被下调了
０．４８～０．６３倍（表２）。这些基因参与氮元素的吸收、固定、同化、转运等多个过程。
在低氮胁迫条件下，植株不仅会出现生长缓慢、叶片变黄、分蘖数减少等显著的表型变化，同时在生理生化上
也有显著差异。在研究中发现，严格筛选条件下，共有５个蛋白（Ｕｎｉｇｅｎｅ２４１１１＿Ａｌ、Ｕｎｉｇｅｎｅ３９８５４＿Ａｌ、
ＣＬ７８４．Ｃｏｎｔｉｇ２＿Ａｌ、ＣＬ６３１８．Ｃｏｎｔｉｇ１＿Ａｌ 和 Ｕｎｉｇｅｎｅ１６３５０＿Ａｌ）的表达上调，有一个蛋白ＣＬ２２４．Ｃｏｎｔｉｇ５＿Ａｌ
下调表达，这６个基因都参与了细胞内氧化还原调节（表３）。
０７ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．３
表２　氮代谢途径的基因表达变化
犜犪犫犾犲２　犈狓狆狉犲狊狊犻狅狀犮犺犪狀犵犲狊狅犳犵犲狀犲狊狉犲狊狆狅狀狊犻犫犾犲犳狅狉狀犻狋狉狅犵犲狀犿犲狋犪犫狅犾犻狊犿
基因名称
Ｇｅｎｅｎａｍｅ
蛋白名称
Ｐｒｏｔｅｉｎｎａｍｅ
物种名称
Ｐｌａｎｔｓｐｅｃｉｅｓ
变化值
Ｆｏｌｄｃｈａｎｇｅ
ＣＬ１０３５９．Ｃｏｎｔｉｇ４＿Ａｌ 苏氨酸肽链内切酶Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ 大麦犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲ｓｕｂｓｐ．犞狌犾犵犪狉犲 ２．２４４３
ＣＬ５７７６．Ｃｏｎｔｉｇ１＿Ａｌ 枯草杆菌蛋白酶Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎｌｉｋｅｐｒｏｔｅａｓｅ 二穗短柄草犅狉犪犮犺狔狆狅犱犻狌犿犱犻狊狋犪犮犺狔狅狀 ２．０８１１
Ｕｎｉｇｅｎｅ１２８４３＿Ａｌ 液泡加工酶４Ｖａｃｕｏｌａｒｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｅｎｚｙｍｅ４ 拟斯卑尔脱山羊草犃犲犵犻犾狅狆狊狊狆犲犾狋狅犻犱犲狊 １．９６３６
ＣＬ５５２７．Ｃｏｎｔｉｇ１＿Ａｌ 鸟嘌呤脱氨酶Ｇｕａｎｉｎｅｄｅａｍｉｎａｓｅ 大麦犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲ｓｕｂｓｐ．犞狌犾犵犪狉犲 １．８５５１
ＣＬ８６８９．Ｃｏｎｔｉｇ１＿Ａｌ 受伤诱导的Ｂｏｗｍａｎｂｉｒｋ型抑制剂Ｂｏｗｍａｎｂｉｒｋｔｙｐｅｗｏｕｎｄｉｎ
ｄｕｃｅｄｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
大麦犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲ｓｕｂｓｐ．犞狌犾犵犪狉犲 １．６２１０
ＣＬ８７０８．Ｃｏｎｔｉｇ２＿Ａｌ ２６Ｓ蛋白酶体非ＡＴＰ酶调节亚基６２６ｓｐｒｏｔｅａｓｏｍｅｎｏｎＡＴＰａｓｅ
ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｓｕｂｕｎｉｔ６
节节麦犃犲犵犻犾狅狆狊狋犪狌狊犮犺犻犻 １．５８６９
Ｕｎｉｇｅｎｅ９０８３＿Ａｌ 天门冬氨酸氨基甲酰１Ａｓｐａｒｔａｔｅｃａｒｂａｍｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ１ 二穗短柄草犅狉犪犮犺狔狆狅犱犻狌犿犱犻狊狋犪犮犺狔狅狀 １．５５３９
Ｕｎｉｇｅｎｅ２３７０２＿Ａｌ 天冬氨酸蛋白酶猪笼草蛋白类似酶１Ａｓｐａｒｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｎｅｐｅｎ
ｔｈｅｓｉｎ１ｌｉｋｅ
高粱犛狅狉犵犺狌犿犫犻犮狅犾狅狉 １．５５２０
ＣＬ１１１３６．Ｃｏｎｔｉｇ１＿Ａｌ ２６Ｓ蛋白酶体非 ＡＴＰ酶调节亚基１３２６ｓｐｒｏｔｅａｓｏｍｅｎｏｎＡＴ
Ｐａｓｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｓｕｂｕｎｉｔ１３
乌拉尔图小麦犜狉犻狋犻犮狌犿狌狉犪狉狋狌 １．５３８０
ＣＬ３４０．Ｃｏｎｔｉｇ１１＿Ａｌ 天冬氨酸蛋白酶猪笼草蛋白酶１Ａｓｐａｒｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｎｅｐｅｎｔｈｅｓｉｎ１ 大麦犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲ｓｕｂｓｐ．犞狌犾犵犪狉犲 １．５２４２
Ｕｎｉｇｅｎｅ６５１６＿Ａｌ ＡＴＰ依赖的ＣＬＰ蛋白酶蛋白水解亚单位类叶绿体蛋白ＡＴＰｄｅ
ｐｅｎｄｅｎｔＣＬＰｐｒｏｔｅａｓｅｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｓｕｂｕｎｉｔｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｉｃｌｉｋｅ
大麦犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲ｓｕｂｓｐ．犞狌犾犵犪狉犲 ０．６３９８
Ｕｎｉｇｅｎｅ２３４７４＿Ａｌ ＡＴＰ依赖的ＣＬＰ蛋白酶衔接蛋白ＡＴＰｄｅｐｅｎｄｅｎｔＣＬＰｐｒｏｔｅａｓｅ
ａｄａｐｔｏｒｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ
二穗短柄草犅狉犪犮犺狔狆狅犱犻狌犿犱犻狊狋犪犮犺狔狅狀 ０．６３７２
Ｕｎｉｇｅｎｅ２１２６１＿Ａｌ 硝酸还原酶Ｎｉｔｒａｔｅｒｅｄｕｃｔａｓｅ 二穗短柄草犅狉犪犮犺狔狆狅犱犻狌犿犱犻狊狋犪犮犺狔狅狀 ０．６２６６
Ｕｎｉｇｅｎｅ４２０４０＿Ａｌ 间α胰蛋白酶抑制剂重链ｈ３Ｉｎｔｅｒａｌｐｈａｔｒｙｐｓｉｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒｈｅａｖｙ
ｃｈａｉｎｈ３
蓖麻犚犻犮犻狀狌狊犮狅犿犿狌狀犻狊 ０．６１２０
ＣＬ７６８８．Ｃｏｎｔｉｇ１＿Ａｌ 铁氧还原蛋白亚硝酸还原酶前体Ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎｎｉｔｒｉｔｅｒｅｄｕｃｔａｓｅｐｒｅｃｕｒｓｏｒ 大麦犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲ｓｕｂｓｐ．犞狌犾犵犪狉犲 ０．４８６７
图１　高羊茅底单处理条件下差异蛋白的生物信息预测
犉犻犵．１　犌犲狀犲狅狀狋狅犾狅犵狔犪狀狀狅狋犪狋犻狅狀狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋犻犪犾狔
犲狓狆狉犲狊狊犲犱狆狉狅狋犲犻狀狊犻狀狋犪犾犳犲狊犮狌犲犻狀狋犺犲
犾狅狑狀犻狋狉狅犵犲狀犮狅狀犱犻狋犻狅狀
　图中数字表示每个类别中包含的蛋白数目。Ｔｈｅｆｉｇｕｒｅｓｓｔａｎｄｆｏｒ
ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｃｏｎｔａｉｎｅｄｉｎｅａｃｈｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ．
１７第２５卷第３期 草业学报２０１６年
表３　氧化还原反应途径的基因表达变化
犜犪犫犾犲３　犈狓狆狉犲狊狊犻狅狀犮犺犪狀犵犲狊狅犳狉犲犱狅狓犵犲狀犲狊狌狀犱犲狉犱犻犳犳犲狉犲狀狋犖犾犲狏犲犾狊
基因名称
Ｇｅｎｅｎａｍｅ
蛋白名称
Ｐｒｏｔｅｉｎｎａｍｅ
物种名称
Ｐｌａｎｔｓｐｅｃｉｅｓ
变化值
Ｆｏｌｄｃｈａｎｇｅ
Ｕｎｉｇｅｎｅ２４１１１＿Ａｌ ＮＡＤＨ脱氢酶ＮＡＤＨｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ 毛竹犘犺狔犾犾狅狊狋犪犮犺狔狊犲犱狌犾犻狊 １．７５
Ｕｎｉｇｅｎｅ３９８５４＿Ａｌ ｉｍｍｕｔａｎｓ蛋白ｉｍｍｕｔａｎｓｐｒｏｔｅｉｎ 水稻粳稻组犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪ＪａｐｏｎｉｃａＧｒｏｕｐ １．６９
ＣＬ７８４．Ｃｏｎｔｉｇ２＿Ａｌ 蛋白质ＳＲＧ１ＰｒｏｔｅｉｎＳＲＧ１ 大麦犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲ｓｕｂｓｐ．犞狌犾犵犪狉犲 １．５５
ＣＬ６３１８．Ｃｏｎｔｉｇ１＿Ａｌ 伯胺氧化酶Ｐｒｉｍａｒｙａｍｉｎｅｏｘｉｄａｓｅ 大麦犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲ｓｕｂｓｐ．犞狌犾犵犪狉犲 １．５５
Ｕｎｉｇｅｎｅ１６３５０＿Ａｌ ＮＡＤＰ依赖的乙醛脱氢酶ＮＡＤＰａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ 二穗短柄草犅狉犪犮犺狔狆狅犱犻狌犿犱犻狊狋犪犮犺狔狅狀 １．５０
ＣＬ２２４．Ｃｏｎｔｉｇ５＿Ａｌ 过氧化物酶５１Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ５１ 大麦犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲ｓｕｂｓｐ．犞狌犾犵犪狉犲 ０．５９
除了氮代谢以及氧化还原反应途径外，胁迫相关的基因也有明显的变化，在高严谨筛选条件下，共有１５个蛋
白显著被诱导，只有１个蛋白的表达被抑制（表４）。在这些上调表达的基因中，高羊茅１４３３家族蛋白如
ＣＬ２１０．Ｃｏｎｔｉｇ４＿Ａｌ、ＣＬ２１０．Ｃｏｎｔｉｇ７＿Ａｌ、ＣＬ２１０．Ｃｏｎｔｉｇ２＿Ａｌ、Ｕｎｉｇｅｎｅ６９２５＿Ａｌ 在低氮胁迫条件下，其表达呈
现整体被诱导的趋势。具有一致变化趋势的除１４３３蛋白外，还有３个谷胱甘肽转移酶（ＣＬ４６８．Ｃｏｎｔｉｇ２＿Ａｌ、
ＣＬ４６８．Ｃｏｎｔｉｇ１＿Ａｌ 和ＣＬ４６３１．Ｃｏｎｔｉｇ２＿Ａｌ）以及２个胁迫相关蛋白（ＣＬ１１６４１．Ｃｏｎｔｉｇ１＿Ａｌ和ＣＬ３９１３．Ｃｏｎｔｉｇ３
＿Ａｌ）。这些关键基因的上调表达说明其在高羊茅氮代谢过程中起到重要的调节作用。
表４　胁迫相关途径的基因表达变化
犜犪犫犾犲４　犈狓狆狉犲狊狊犻狅狀犮犺犪狀犵犲狊狅犳狊狋狉犲狊狊狉犲犾犪狋犲犱犵犲狀犲狊
基因名称
Ｇｅｎｅｎａｍｅ
蛋白名称
Ｐｒｏｔｅｉｎｎａｍｅ
物种名称
Ｐｌａｎｔｓｐｅｃｉｅｓ
变化值
Ｆｏｌｄｃｈａｎｇｅ
ＣＬ２１０．Ｃｏｎｔｉｇ４＿Ａｌ １４３３类似蛋白ｇｆ１４ａ类似基因１４３３ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎｇｆ１４ａｌｉｋｅ 小麦犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿 ２．２６１９
ＣＬ８４５７．Ｃｏｎｔｉｇ１＿Ａｌ 普遍胁迫蛋白３７３９Ｕｎｉｖｅｒｓａｌｓｔｒｅｓｓｐｒｏｔｅｉｎ３７３９ 球茎大麦犎狅狉犱犲狌犿犫狌犾犫狅狊狌犿 １．５３８４
ＣＬ４６８．Ｃｏｎｔｉｇ２＿Ａｌ 谷胱甘肽转移酶Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ 大麦犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲ｓｕｂｓｐ．犞狌犾犵犪狉犲 ２．１２９８
ＣＬ１１６４１．Ｃｏｎｔｉｇ１＿Ａｌ 胁迫调节蛋白Ｓｔｒｅｓｓｒｅｇｕｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ 乌拉尔图小麦犜狉犻狋犻犮狌犿狌狉犪狉狋狌 １．９６８１
ＣＬ４６８．Ｃｏｎｔｉｇ１＿Ａｌ 谷胱甘肽转移酶Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ 犃犾狅狆犲犮狌狉狌狊犿狔狅狊狌狉狅犻犱犲狊 １．８１８４
ＣＬ２１０．Ｃｏｎｔｉｇ７＿Ａｌ １４３３蛋白１４３３ｐｒｏｔｅｉｎ 二穗短柄草犅狉犪犮犺狔狆狅犱犻狌犿犱犻狊狋犪犮犺狔狅狀 １．６９７５
Ｕｎｉｇｅｎｅ６９２５＿Ａｌ １４３３类似蛋白１４３３ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎ 玉米犣犲犪犿犪狔狊 １．６９４６
ＣＬ２１０．Ｃｏｎｔｉｇ２＿Ａｌ １４３３蛋白１４３３ｐｒｏｔｅｉｎ 二穗短柄草犅狉犪犮犺狔狆狅犱犻狌犿犱犻狊狋犪犮犺狔狅狀 １．６２５０
Ｕｎｉｇｅｎｅ１２２４９＿Ａｌ 果聚糖６果糖Ｆｒｕｃｔａｎ６ｆｒｕｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ 黑麦草犔狅犾犻狌犿狆犲狉犲狀狀犲 １．５２４７
ＣＬ３９１３．Ｃｏｎｔｉｇ３＿Ａｌ 胁迫相关蛋白Ｓｔｒｅｓｓｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ 水稻籼组犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪ＩｎｄｉｃａＧｒｏｕｐ １．５４２８
ＣＬ４６３１．Ｃｏｎｔｉｇ２＿Ａｌ 谷胱甘肽转移酶Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ 小麦犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿 １．５５１５
Ｕｎｉｇｅｎｅ２５０３８＿Ａｌ 半胱氨酸蛋白酶Ｃｙｓｔｅｉｎｅｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ 大麦犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲ｓｕｂｓｐ．犞狌犾犵犪狉犲 １．５８５０
ＣＬ１０５６９．Ｃｏｎｔｉｇ２＿Ａｌ 半胱氨酸蛋白酶１前体Ｃｙｓｔｅｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅ１ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ 大麦犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲ｓｕｂｓｐ．犞狌犾犵犪狉犲 １．５０５７
Ｕｎｉｇｅｎｅ６７７８＿Ａｌ 线粒体抑制素复合蛋白２Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｐｒｏｈｉｂｉｔｉｎｃｏｍｐｌｅｘｐｒｏｔｅｉｎ２ 高粱犛狅狉犵犺狌犿犫犻犮狅犾狅狉 １．６５５７
Ｕｎｉｇｅｎｅ５７３＿Ａｌ 木质部半胱氨酸蛋白酶２类似蛋白Ｘｙｌｅｍｃｙｓｔｅｉｎｅｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ２ｌｉｋｅ 大麦犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲ｓｕｂｓｐ．犞狌犾犵犪狉犲 ０．５３２１
ＣＬ７０８４．Ｃｏｎｔｉｇ１＿Ａｌ ｈａｒｐｉｎ诱导蛋白１ｈａｒｐｉｎｉｎｄｕｃｅｄｐｒｏｔｅｉｎ１ 水稻粳稻组犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪ＪａｐｏｎｉｃａＧｒｏｕｐ １．５４０４
２．３　高羊茅在胁迫条件下生理生化的改变
为了验证蛋白组学的结果，我们测定了低氮胁迫条件下，高羊茅叶片中叶绿素、可溶性蛋白、氨基酸等的含
量，以及ＰＯＤ、ＳＯＤ、ＧＳ等酶的活性。氮胁迫显著降低了叶片中叶绿素的含量，在对照材料鲜叶中，叶绿素ａ、叶
绿素ｂ以及总叶绿素含量依次为（１．４５±０．１２），（０．６７±０．１１）和（２．１２±０．２２）ｍｇ／ｇ（图２Ａ）。低氮胁迫条件下
其含量分别降低到（０．８０±０．１６），（０．４８±０．０８）和（１．２８±０．２２）ｍｇ／ｇ，暗示低氮胁迫能够显著降低光合作用的
２７ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．３
效率（图２Ａ）。
与叶绿素含量变化类似，在低氮胁迫下，可溶性蛋白的含量也显著降低了４７％（图２Ｂ）。在检测的１９种游离
氨基酸中，只有色氨酸的含量增加４倍，而其余氨基酸含量下降了２０％～８０％（图２Ｃ）。另外，低氮胁迫打破了细
胞内的氧化还原平衡，ＰＯＤ、ＴＳＯＤ和ＧＳ的活性被分别上调了１．４３，２．０７和１．７８倍（图２Ｄ）。这些生理生化水
平的变化与蛋白组学中检测到调节氮代谢以及氧化还原反应蛋白水平的变化可能存在密切的联系。
图２　氮胁迫条件下高羊茅生理生化变化
犉犻犵．２　犘犺狔狊犻狅犾狅犵犻犮犪犾犪狀犱犫犻狅犮犺犲犿犻犮犪犾犮犺犪狀犵犲狊犻狀狋犪犾犳犲狊犮狌犲狌狀犱犲狉犾狅狑狀犻狋狉狅犵犲狀犮狅狀犱犻狋犻狅狀
　Ｃｈｌａ：叶绿素ａＣｈｌｏｒｏｐｈｙｌａ；Ｃｈｌｂ：叶绿素ｂＣｈｌｏｒｏｐｈｙｌｂ；ＴＣｈｌ：总叶绿素Ｔｏｔａｌｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌ；ＰＯＤ：过氧化物酶Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＴＳＯＤ：总超氧化物
歧化酶Ｔｏｔａｌｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ；ＧＳ：谷胱甘肽合成酶Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ．
图３　荧光定量犘犆犚验证蛋白组数据
犉犻犵．３　犞犪犾犻犱犪狋犻狅狀狅犳狆狉狅狋犲狅犿犻犮犱犪狋犪犫狔狉犲犪犾狋犻犿犲
犳犾狌狅狉犲狊犮犲狀犮犲狇狌犪狀狋犻狋犪狋犻狏犲犚犜－犘犆犚
　
３７第２５卷第３期 草业学报２０１６年
２．４　荧光定量验证蛋白组学数据及１４３３基因表达分析
为了验证蛋白数据的可靠性，我们随机挑选了１２个基因，采用荧光定量ＰＣＲ方法分析其在低氮胁迫条件下
的表达变化。包括３个上调表达的基因（Ｕｎｉｇｅｎｅ１８８０６、ＣＬ１６３．Ｃｏｎｔｉｇ２和 Ｕｎｉｇｅｎｅ１４０４２）和８个下调的基因
（ＣＬ１５６４．Ｃｏｎｔｉｇ１、ＣＬ７１１９．Ｃｏｎｔｉｇ２、ＣＬ３７８７．Ｃｏｎｔｉｇ１、ＣＬ１０９００．Ｃｏｎｔｉｇ１、Ｕｎｉｇｅｎｅ１８７８６、ＣＬ４９２４．Ｃｏｎｔｉｇ１、
ＣＬ７７４３．Ｃｏｎｔｉｇ１和Ｕｎｉｇｅｎｅ１１５４７）。所有挑选的基因的表达变化趋势与蛋白组相同。然而，蛋白差异筛选标准
为大于 １．２ 或 者 小 于 ０．８ 的 前 提 下，有 ４ 个 基 因 （Ｕｎｉｇｅｎｅ１８８０６、ＣＬ１６３．Ｃｏｎｔｉｇ２、Ｕｎｉｇｅｎｅ１４０４２ 和
Ｕｎｉｇｅｎｅ１１５４７）的荧光定量变化倍数小于２。说明这些基因在低氮胁迫条件下的表达只受到轻微的激活或抑制，
或者最终的蛋白含量受到了转录后翻译的影响。
上述挑选的上调表达基因定量ＰＣＲ验证结果，虽然具有和蛋白组数据相同的变化趋势，但是其诱导的幅度
并不大（小于２），为了检验上调表达数据的可靠性，我们对１４３３基因家族在低氮胁迫条件下的表达变化也进行
了验证。４个被检测的１４３３基因 ＣＬ２１０．Ｃｏｎｔｉｇ４＿Ａｌ、ＣＬ２１０．Ｃｏｎｔｉｇ７＿Ａｌ、ＣＬ２１０．Ｃｏｎｔｉｇ２＿Ａｌ 和 Ｕｎｉ
ｇｅｎｅ６９２５＿Ａｌ分别命名为１４３３Ａ、１４３３Ｂ、１４３３Ｃ和１４３３Ｄ，在低氮胁迫后４个基因都显著被诱导２．７～
１１．３倍，说明蛋白组的数据是可信的。
３　讨论与结论
氮元素是限制植物生长发育的关键因素之一，和２０世纪７０年代相比，植物的产量已经增长了一倍，其中氮
肥是主要贡献因素之一。然而氮肥的大量使用直接导致了植物氮利用效率的下降［２３］。通过改良氮利用效率是
减少氮肥使用的主要方法之一，植物对氮元素的吸收利用受到其自身的精细调控，通过调节基因的表达、关键酶
活性以及代谢物的含量，可以改变植物应对不同氮营养水平的能力［２４２５］。牧草类作物相对于其他农作物受贫瘠
土壤胁迫的危害更加严重，然而相应的理论研究还比较滞后。本文采用ｉＴＲＡＱ的方法鉴定高羊茅叶片在低氮
胁迫条件下蛋白水平的变化，获得了氮高效利用的候选基因，该研究在禾本科牧草类植物中处于领先地位，为在
其他牧草类作物中开展类似研究提供了很好的借鉴作用。
在高羊茅低氮处理的蛋白组数据中，氮代谢途径蛋白发生了明显变化（表１），相应的生理生化测定结果也表
明低氮胁迫显著降低了叶绿素含量、可溶性蛋白和游离氨基酸的水平（图２Ａ～Ｃ），说明在低氮胁迫条件下，光合
作用速率、蛋白质的翻译与合成等都受到显著的影响。类似的研究在水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）中也有报道，在低氮胁
迫条件下，水稻气体交换、光合效率、光合色素的含量、可溶性蛋白等都不同程度受到抑制［２６］。另外在小麦低氮
诱导的蛋白谱中同样也发现了光合作用、氮代谢相关蛋白表达的变化［２７］。
光合中心Ⅱ（ＰＳⅡ）的活性在低氮条件下被减弱，进而会导致植物细胞体内的活性氧化物质的积累，出于对
不利环境的应激反应，植物细胞会激活活性氧清除系统以保护自身不受伤害［２８］。我们的研究发现低氮处理下，
高羊茅体内氧化还原代谢途径的关键蛋白都明显上调（表３），通过测定相应酶的活性发现ＰＯＤ、ＳＯＤ与ＧＳ活性
都显著增强（图２Ｄ），说明低氮胁迫间接地导致了植物细胞受到活性氧伤害在植物界中具有一定的普遍性。与其
他植物一样，在高羊茅中，低氮胁迫能够激活活性氧清除系统。
低氮条件下，胁迫相关蛋白明显诱导，他们分别具有不同的功能，定位于不同的亚细胞器，参与不同的代谢途
径。因此，低氮胁迫可能与其他胁迫存在广泛的互作，而这些基因则可能具有调节植物多种抗性的功能。其中最
显著的是１４３３蛋白，在前人研究中，１４３３能够调控植物对非生物胁迫（干旱、高温、高盐等）和生物胁迫（病虫
害）的应答［２９］。在本研究中，我们一共发现了４个高羊茅１４３３蛋白受低氮胁迫条件诱导（表４），并且其表达水
平也得到荧光定量ＰＣＲ的验证（图３Ｃ），说明１４３３蛋白在高羊茅应对低氮胁迫的反应中可能起到至关重要的
作用，为我们创制氮高效高羊茅新品种提供了重要的基因资源。
犚犲犳犲狉犲狀犮犲狊：
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６７ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．３