全 文 ：书犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１５１３１ 犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀
冯光燕，王学敏，付媛媛，方志红，高洪文，张新全．紫花苜蓿犕狊犠犚犓犢３３转录因子的分离及遗传转化研究．草业学报，２０１５，２４（１１）：４８５７．
ＦＥＮＧＧｕａｎｇＹａｎ，ＷＡＮＧＸｕｅＭｉｎ，ＦＵＹｕａｎＹｕａｎ，ＦＡＮＧＺｈｉＨｏｎｇ，ＧＡＯＨｏｎｇＷｅｎ，ＺＨＡＮＧＸｉｎＱｕａｎ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆ犕狊犠犚犓犢３３ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
ｆａｃｔｏｒａｎｄｉｔｓｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎ犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１５，２４（１１）：４８５７．
紫花苜蓿犕狊犠犚犓犢３３转录因子的
分离及遗传转化研究
冯光燕１，王学敏２，付媛媛２，方志红２，高洪文２，张新全１
（１．四川农业大学草业科学系，四川 温江６１１１３０；２．中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京１００１９３）
摘要：ＷＲＫＹ转录因子是植物特有的转录因子，广泛参与植物对多种逆境胁迫的反应。但是对紫花苜蓿中 ＷＲＫＹ
转录因子的研究还较少。本研究从紫花苜蓿中克隆了一个 ＷＲＫＹＩ类转录因子 犕狊犠犚犓犢３３。该基因ＣＤＳ全长
１５３６ｂｐ，编码５１２个氨基酸，结构分析显示犕狊犠犚犓犢３３包括两个 ＷＲＫＹ结构域和一个Ｃ２Ｈ２锌指结构（ＣＸ４Ｃ
Ｘ２３ＨＸＨ），表明其属于 ＷＲＫＹＩ族 ＷＲＫＹ转录因子。亚细胞定位预测 ＭｓＷＲＫＹ３３蛋白定位在细胞核。
犕狊犠犚犓犢３３基因受盐、干旱和冷胁迫诱导，暗示基因可能参与了这些逆境胁迫的调控。构建原核表达载体ｐＥＴ
犕狊犠犚犓犢３３，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明在大肠杆菌中表达了 ＭｓＷＲＫＹ３３蛋白。扩增犕狊犠犚犓犢３３编码区ｃＤＮＡ，以
ｐＢＩ１２１为基础载体，构建植物超表达载体ｐＢＩ１２１犕狊犠犚犓犢３３。采用农杆菌介导的愈伤组织培养法转化紫花苜
蓿。利用狀狆狋Ⅱ基因引物和载体特异引物检测抗性苗呈阳性，表明目的基因已成功导入紫花苜蓿基因组中。ｑＲＴ
－ＰＣＲ检测发现，犕狊犠犚犓犢３３基因在转基因株系中得到增强表达。本研究为进一步探索 ＷＲＫＹ转录因子基因在
紫花苜蓿抗逆性调控中的作用奠定了基础。
关键词：紫花苜蓿；犕狊犠犚犓犢３３；转录因子；遗传转化
犐狊狅犾犪狋犻狅狀狅犳犕狊犠犚犓犢３３狋狉犪狀狊犮狉犻狆狋犻狅狀犳犪犮狋狅狉犪狀犱犻狋狊犵犲狀犲狋犻犮狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀犻狀犕犲犱犻
犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪
ＦＥＮＧＧｕａｎｇＹａｎ１，ＷＡＮＧＸｕｅＭｉｎ２，ＦＵ ＹｕａｎＹｕａｎ２，ＦＡＮＧＺｈｉＨｏｎｇ２，ＧＡＯ ＨｏｎｇＷｅｎ２，ＺＨＡＮＧ
ＸｉｎＱｕａｎ１
１．犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犌狉犪狊狊犾犪狀犱犛犮犻犲狀犮犲，犆狅犾犾犲犵犲狅犳犃狀犻犿犪犾犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔，犛犻犮犺狌犪狀犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犠犲狀犼犻犪狀犵
６１１１３０，犆犺犻狀犪；２．犐狀狊狋犻狋狌狋犲狅犳犃狀犻犿犪犾犛犮犻犲狀犮犲，犆犺犻狀犲狊犲犃犮犪犱犲犿狔狅犳犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犛犮犻犲狀犮犲狊，犅犲犻犼犻狀犵１００１９３，犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋：ＰｌａｎｔｓｐｅｃｉｆｉｃＷＲＫＹｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ（ＴＦｓ）ａｒｅｗｉｄｅｌｙｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｖａｒｉｏｕｓｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．
Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｉｒｒｏｌｅｓｉｎａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｅｓａｒｅｓｔｉｌｎｏｔｗｅｌｋｎｏｗｎｉｎａｌｆａｌｆａ（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）．Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ａ
ＷＲＫＹｇｅｎｅ，ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ１５３６ｂｐＣＤＳｌｅｎｇｔｈｅｎｃｏｄｉｎｇａｐｕｔａｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄ５１２，ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓ
犕狊犠犚犓犢３３，ｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍａｌｆａｌｆａ．ＴｈｅａｌｉｇｎｍｅｎｔｒｅｓｕｌｔｓｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｔｈｅＭｓＷＲＫＹ３３ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｔａｉｎｓ
ｔｗｏｃｏｎｓｅｒｖｅｄＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎｓ（ＷＲＫＹｄｏｍａｉｎ）ｏｆ６０ａｍｉｎｏａｃｉｄｓａｎｄａＣ２Ｈ２ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｒｅｇｉｏｎ（ＣＸ４
ＣＸ２３ＨＸＨ），ｆａｌｉｎｇｉｎｔｏｇｒｏｕｐＩｏｆｔｈｅＷＲＫＹｐｒｏｔｅｉｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄ
ｔｈａｔＭｓＷＲＫＹ３３ｉｓａｎｕｃｌｅａｒｔａｒｇｅｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ犕狊犠犚犓犢３３ｇｅｎｅｗａｓｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙｓａｌｉｎ
第２４卷 第１１期
Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．１１
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
２０１５年１１月
Ｎｏｖ，２０１５
收稿日期：２０１５０３１０；改回日期：２０１５０５２０
基金项目：现代农业产业技术体系牧草产业体系（ＣＡＲＳ３５０１），国家自然科学基金项目（３１１０１７５５）和中国农业科学院科技创新工程（ＡＳＴＩＰ
ＩＡＳ１０）资助。
作者简介：冯光燕（１９８８），男，四川遂宁人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｆｇ６２５８６３３６＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｘｕｅｍｉｎ＠ｃａａｓ．ｃｎ，ｚｈａｎｇｘｑ＠ｓｉｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
ｉｔｙ（ＮａＣｌ），ｄｒｏｕｇｈｔ（ＰＥＧ）ａｎｄｃｏｌｄｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（４℃），ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔ犕狊犠犚犓犢３３ｇｅｎｅｍａｙｂｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎ
ｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎａｌｆａｌｆａ．Ｔｈｅｆｒａｇｍｅｎｔｅｎｃｏｄｉｎｇ１０２３９ＡＡｗａｓｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏ
ｐＥＴ３０α（＋）ｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓ，ａｎｄＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｔｈｅＭｓＷＲＫＹ３３
ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｕｌｄｂｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｃｅｌｓ．ＴｈｅｆｕｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｏｆ犕狊犠犚犓犢３３ｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍａｌｆａｌ
ｆａＲＮＡａｎｄｔｈｅｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＢＩ１２１犕狊犠犚犓犢３３ｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｐＢＩ１２１ｖｅｃｔｏｒ．
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｔｈｒｏｕｇｈｓｏｍａｔｉｃｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓｂｙ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊ｍｅｄｉａｔｅｄ
ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ狀狆狋ⅡｇｅｎｅａｎｄｖｅｃｔｏｒｓｅｑｕｅｎｃｅｗｅｒｅｔｅｓｔｅｄｂｙＰＣＲｉｎｔｈｅｇｅｎｏｍｅｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ
ａｎｄｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｈａｄｂｅｅｎｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ．ＴｈｅｑＲＴ－ＰＣＲｔｅｓｔｉｎｇｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅ犕狊犠犚犓犢３３
ｇｅｎｅｗａｓｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ．Ｔｈｉｓｓｔｕｄｙｗｉｌｌａｙａｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎ
ｏｆｔｈｅＷＲＫＹｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｉｎｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｉｎａｌｆａｌｆａ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪；犕狊犠犚犓犢３３；ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ；ｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
转录因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ），又称反式作用因子（ｔｒａｎｓａｃｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ），是指能够与真核基因的顺式作用
元件（ｃｉｓａｃｔｉｎｇｅｌｅｍｅｎｔ）发生特异性相互作用，并对转录有激活或抑制作用的ＤＮＡ结合蛋白。在植物中已发现
了多种转录因子，如ｂＺＩＰ类、ＥＲＦ类、ｂＨＬＨ类、ＷＲＫＹ类和ＮＡＣ类等。其中 ＷＲＫＹ蛋白是植物所特有的一
类转录因子家族，其结构域是一个６０个氨基酸左右的保守结构，且所有结构域均含有高度保守的 ＷＲＫＹＧＱＫ
氨基酸序列，并因此得名［１］。
ＷＲＫＹ转录因子在植物体中行使众多功能，大量研究证实植物 ＷＲＫＹ基因的主要生物学功能是调控植物
抗病反应及其信号转导途径的建立［２５］。此外，该类转录因子还与植物衰老以及胚胎发育等一系列生长发育过程
相关基因的表达调控具有重要联系［６７］。近年来，研究者发现，ＷＲＫＹ转录因子也参与了植物的非生物逆境胁迫
应答。犃狋犠犚犓犢３３超表达增强转基因材料的耐盐性［８］，犗狊犠犚犓犢０８基因受ＰＥＧ、ＮａＣｌ、ＡＢＡ的诱导表达，可以
增强转基因拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）抗渗透胁迫的能力［９］。大豆（犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓）的 ＷＲＫＹ转录因子在拟
南芥中过量表达可以增强转基因植株的抗冷能力（犠犚犓犢２１）和抗旱耐盐性（犠犚犓犢５４）［１０］。长叶红砂（犚犲犪狌
犿狌狉犻犪狋狉犻犵狔狀犪）中的两个ＷＲＫＹ基因受到干旱、高盐和冷胁迫等多种非生物胁迫的诱导［１１］。此外，ＷＲＫＹ转录
因子还参与高温［１２１３］、伤害［１４１５］、ＡＢＡ［８］、双氧水［９］、紫外线［１６］等非生物胁迫的调控。然而，与在生物胁迫中取得
的研究成果相比，ＷＲＫＹ转录因子在非生物胁迫中的研究还很少。
紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）是重要豆科牧草，不仅是家畜日粮中不可缺少的组分，而且是生态恢复、土壤改
良的优选植物。近年来，苜蓿干草消费逐年增加，同时紫花苜蓿种植面积也迅猛扩大，但干旱、高盐、冷害等非生
物胁迫极大影响其产量和品质的提高。过去对 ＷＲＫＹ转录因子家族的研究多集中于生物胁迫领域，且多以拟
南芥或水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）等模式植物为对象。紫花苜蓿属于异花授粉四倍体豆科牧草，其遗传转化困难，生长
周期长，基因功能的研究比较滞后，到目前为止，对紫花苜蓿 ＷＲＫＹ转录因子功能深入研究几乎是空白。对这
一重要豆科植物 ＷＲＫＹ转录因子的研究，不仅在理论上有助于我们了解 ＷＲＫＹ转录因子在牧草抗性调控中的
作用，而且有助于指导我们通过调控机制来增强牧草的抗逆能力。
１ 材料与方法
１．１ 实验材料
紫花苜蓿“中苜１号”为中国农业科学院北京畜牧兽医研究所育成品种。
ＤＮＡ聚合酶ＥｘＴａｑ、ＤＮＡＭａｋｅｒｓ、ｐＭＤ１８Ｔｖｅｃｔｏｒ、限制性内切酶、Ｔ４ＤＮＡ连接酶均购自Ｔａｋａｒａ公司
（Ｊａｐａｎ）；ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ购自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ（ＵＳＡ），Ｔｒｉｚｏｌ试剂购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＵＳＡ），ＳＭＡＲＴＴＭＲＡＣＥ
ｃＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ购自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（ＵＳＡ），ＡＢＡ购自Ｓｉｇｍａ（ＵＳＡ），大肠杆菌感受态细胞犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻
ＤＨ５α和ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ购自北京天根生化科技有限公司。氯仿、异丙醇、乙醇、ＮａＣｌ、ＰＥＧ６０００等均为国产
分析纯试剂。
９４第１１期 冯光燕 等：紫花苜蓿犕狊犠犚犓犢３３转录因子的分离及遗传转化研究
１．２ 实验方法
１．２．１ 材料的种植与处理 ２０１４年４月，将来自紫花苜蓿‘中苜一号’同一母株的枝条在温室内进行扦插，待
扦插苗长出叶片和根后，选取长势一致的幼苗移到１／２ＭＳ营养液中，一周换两次培养液，在温室中继续生长
３０ｄ。
选取长势一致的苜蓿幼苗进行干旱、高盐、低温和脱落酸胁迫人工模拟环境处理，具体处理方法如下：ＡＢＡ
激素处理：在１／２ＭＳ营养液中加入ＡＢＡ，浓度为１００μｍｏｌ／Ｌ，室温２５℃条件下将植株分别处理０，２，４，８，１２和
２４ｈ；干旱处理：将紫花苜蓿苗置于２０％ＰＥＧ６０００的１／２ＭＳ营养液中，室温２５℃作用条件下将植株分别处理
０，２，４，８，１２和２４ｈ；高盐处理：将紫花苜蓿苗置于含有２５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的１／２ＭＳ营养液中，室温２５℃作用
条件下分别处理０，２，４，８，１２和２４ｈ；冷处理：将种植于１／２ＭＳ液体培养基的紫花苜蓿放在４℃下处理０，２，４，
８，１２和２４ｈ。以上处理分别取其叶，－８０℃保存备用。
１．２．２ ＷＲＫＹ 基因３′末端序列、５′末端序列和全长ｃＤＮＡ 序列的克隆 用 ＴＲｉｚｏｌ试剂分别提取２５０
ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液处理２，４，８，１２和２４ｈ后的幼叶总ＲＮＡ后，按照质量比为１∶１∶１∶１∶１混合。根据ｃＤＮＡ
ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ说明书，用混合ＲＮＡ为模板制备ＲＡＣＥＲｅａｄｙｃＤＮＡ。根据转录组测序得到的类 ＷＲＫＹ基
因的Ｕｎｉｇｅｎｅ序列（未发表），分别设计５′ＲＡＣＥ（ＧＳＰ１）和３′ＲＡＣＥ（ＧＳＰ２）特异性引物ＧＳＰ１和ＧＳＰ２。利用这
些引物分别ＰＣＲ扩增出３′末端和５′末端序列，连接到ＰＭＤ１８Ｔ载体后，送英淮杰基公司测序。将所得序列拼
接出全长ｃＤＮＡ序列。
核酸及氨基酸序列分析、开放阅读框ＯＲＦ的查找和翻译用ＤＮＡＳｔａｒ６．１３软件进行分析，利用ＳｃａｎＰｒｏｓｉｔｅ
服务器（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｓｃａｎｐｒｏｓｉｔｅ／）对 ＷＲＫＹ蛋白进行功能预测。从ＧｅｎｅＢａｎｋ上下载其他
植物中的同源蛋白，利用 ＭＥＧＡ４软件ＮｅｉｇｈｂｏｒＪｏｉｎｉｎｇ法构建系统进化树。
１．２．３ ＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲ检测犠犚犓犢 基因的组织表达特异性 用ＴＲｉｚｏｌ试剂分别提取１．２．１中获得的各处
理ＲＮＡ，根据ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ试剂盒说明书分别反转录为ｃＤＮＡ。参考 ＴａＫａＲａ公司的ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘ
ＴａｑＴＭ试剂盒说明书，使用ＡＢＩＰＲＩＳＭ７５００ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ，ＵＳＡ）系统，采用两步法进行Ｒｅａｌ
ｔｉｍｅＰＣＲ扩增，第１步：９５℃预变性３０ｓ；第２步：９５℃５ｓ，６０℃３４ｓ，４０个循环。每次实验３个样品，每个样品
做３次重复。基因特异引物为Ｆ１／Ｒ１，以紫花苜蓿ＡＣＴ２基因为内参基因，引物为Ｆ２／Ｒ２。
根据得到的Ｃｔ值，将每种处理的０ｈ设为对照，２，４，８，１２和２４ｈ分别设为５个不同处理，利用２－△△Ｃｔ
法［１７］，分别计算犕狊犠犚犓犢３３基因在不同处理下的表达量。
１．２．４ 蛋白原核表达与鉴定 犕狊犠犚犓犢３３编码蛋白全长５１２ＡＡ，根据表位预测，决定以１０２３９ＡＡ作为免
疫原序列。以紫花苜蓿ｃＤＮＡ为模板，利用引物Ｆ３、Ｒ３进行ＰＣＲ扩增。用犈犮狅ＲⅤ和犈犮狅ＲⅠ双酶切表达载体
ｐＥＴ３０ａ以及ＰＣＲ产物。用１％琼脂糖电泳，回收目的片段。在Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用下，１６℃反应２ｈ。转化大
肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ，以Ｆ３、Ｒ３为引物进行菌液ＰＣＲ，挑选阳性克隆测序，正确插入目的基因的重组子
ｐＥＴ犠犚犓犢３３用于表达分析。阳性克隆菌液２０μＬ接种至３ｍＬＬＢ（含５０μｇ／ｍＬＫａｎ）培养基中３７℃过夜培
养。取３０μＬ过夜培养菌液加入到含３ｍＬＬＢ培养基中，３７℃震荡培养至ＯＤ６００约０．６；取部分液体作为未诱导
的对照组，余下的加入ＩＰＴＧ诱导剂至终浓度０．５ｍｍｏｌ／Ｌ作为实验组，两组继续３７℃震荡培养。在诱导１和３
ｈ时取菌体１ｍＬ，离心１００００ｒ／ｍｉｎ×３０ｓ收获沉淀，用１００μＬ１％ＳＤＳ重悬，混匀，１００℃１０ｍｉｎ。１００００
ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。
１．２．５ 构建植物表达载体 设计５′端包含犡犫犪Ⅰ酶切位点的上游引物和犅犪犿ＨＩ酶切位点的下游引物：Ｆ４和
Ｒ４，其中，下划线部分为酶切位点；用该引物从紫花苜蓿ｃＤＮＡ模板中扩增犕狊犠犚犓犢３３的全长阅读框，ＰＢＩ载体
和目的基因全长片段经犡犫犪Ⅰ和犅犪犿ＨＩ双酶切后回收产物，经Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，得到插入有犕狊犠犚犓犢３３
基因的ＰＢＩ１２１载体，转化犈．犮狅犾犻ＤＨ５α感受态细胞。测序验证序列正确性后用于后续试验。含有目的片段的
质粒载体的结构如图５Ａ所示。
１．２．６ 农杆菌转化及转基因植株筛选 提取 ＰＢＩ１２１犕狊犠犚犓犢３３质粒，使用冻融法转入农杆菌菌株
ＧＶ３１０１。挑选健康的叶片作为外植体，随后经７０％酒精２ｍｉｎ，０．１％的ＣｏＣｌ２５ｍｉｎ，灭菌水洗３次后，置于灭
０５ 草 业 学 报 第２４卷
菌的培养皿中。消毒好的叶片在农杆菌溶液，ＯＤ６００为０．６～０．８的重悬液（灭菌的ＹＥＰ）中侵染１５～３０ｍｉｎ，然
后放到无菌滤纸上，吸去多余液体。在共培培养基上生长一周。把外植体取出，放入灭菌水中清洗，重复以上过
程２～３次。随后转入筛选培养基上。２～３周后，愈伤组织转入诱导培养基上。３周后，胚将会发育成小枝、部分
胚长出幼根。小植株移入生根培养基上。
提取转基因植株的基因组ＤＮＡ，以狀狆狋Ⅱ基因引物Ｆ５／Ｒ５，以及转化载体特异引物Ｆ６／Ｒ６（载体３５Ｓ启动子
序列设计正向引物Ｆ６，犕狊犠犚犓犢３３基因序列设计反向引物Ｒ６）进行ＰＣＲ扩增检测。
实验中所用到的所有引物用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５．０软件设计，引物序列见表１。
表１ 实验中的引物序列
犜犪犫犾犲１ 犘狉犻犿犲狉狊犲狇狌犲狀犮犲狌狊犲犱犻狀狋犺犲狊狋狌犱狔
引物名称Ｎａｍｅｏｆｐｒｉｍｅｒ 引物序列（５′→３′）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｐｒｉｍｅｒｓ（５′→３′） 用途Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ＧＳＰ１ ＡＧＡＧＣＡＧＴＧＡＴＴＡＧＡＣＴＣＧＧＴＧＧＣＡ 犕狊犠犚犓犢３３克隆
犕狊犠犚犓犢３３ｃｌｏｎｉｎｇＧＳＰ２ ＡＧＡＣＣＣＴＧＧＣＡＧＡＡＣＡＡＧＡＡＧＣＡ
Ｆ１ ＡＧＣＡＡＧＡＧＡＡＴＧＴＣＡＡＧＧＣＡＧＡＡＧ 犕狊犠犚犓犢３３ＲＴ－ＰＣＲ引物
ＲＴ－ＰＣＲｆｏｒ犕狊犠犚犓犢３３Ｒ１ ＴＧＡＡＣＣＧＴＧＧＴＧＧＴＣＧＡＡＧＡ
Ｆ２ ＧＧＡＣＡＡＧＴＴＡＴＣＡＣＣＡＴＣＧＧ ＡＣＴ２ＲＴ－ＰＣＲ引物
ＲＴ－ＰＣＲｆｏｒＡＣＴ２Ｒ２ ＴＣＡＧＣＡＡＴＡＣＣＴＧＧＡＡＡＣＡＴＡＧ
Ｆ３ ＣＣＧＡＴＡＴＣＣＴＴＡＡＣＴＣＴＣＣＡＡＣＣＧ ｐＥＴ犕狊犠犚犓犢３３载体构建
ＶｅｃｔｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｐＥＴ犕狊犠犚犓犢３３Ｒ３ ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＧＴＣＣＡＴＣＴＡＡＡＣＣ
Ｆ４ ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＡＣＣＴＣＣＴＣＴＴＴＣＴＴＣＴＣＴＧＡＣＣ ＰＢＩ１２１犕狊犠犚犓犢３３载体构建
ＶｅｃｔｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＰＢＩ２１犕狊犠犚犓犢３３Ｒ４ ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＧＡＴＡＧＧＡＡＡＧＡＴＴＣ
Ｆ５ ＡＴＧＡＴＴＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＧＣＡＣＧＣＡＧ 狀狆狋Ⅱ基因扩增
Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ狀狆狋ⅡｇｅｎｅＲ５ ＴＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣＧＡ
Ｆ６ ＣＡＴＴＧＣＣＣＡＧＣＴＡＴＣＴＧＴＣＡＣＴＴＴＡＴＴＧ 载体特异引物扩增６１０ｂｐ
ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒＲ６ ＣＣＴＴＣＡＴＴＡＴＴＡＧＣＡＡＡＴＧＡＴＣＣＧＧＴ
注：表中下划线表示限制性酶切位点。
Ｎｏｔｅ：Ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｓｉｔｅ．
２ 结果与分析
２．１ 紫花苜蓿犠犚犓犢３３基因ｃＤＮＡ全长的克隆
根据高通量测序得到的３３５ｂｐ类 ＷＲＫＹＵｎｉｇｅｎｅ片段，利用ＲＡＣＥ技术，分别扩增目的基因的３′和５′端，
将特异性片段进行回收测序，获得３′端长度为６１０ｂｐ，５′端长度为１３９５ｂｐ的序列。利用ＤＮＡＭＡＮ６．０软件进
行序列拼接，获得全长为１８９１ｂｐ的ｃＤＮＡ序列。将该序列进行ＢＬＡＳＴ比对，发现该序列与蒺藜苜蓿（犕犲犱犻犮犪
犵狅狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪）、大豆等物种的 ＷＲＫＹ转录因子基因高度同源，认为获得的序列是一个 ＷＲＫＹ转录因子基因序
列。
２．２ 紫花苜蓿犠犚犓犢３３基因的生物信息学分析
该基因含有一个１５３６ｂｐ的读码框，编码５１２个氨基酸。该基因编码的蛋白质分子量为５７．１５ｋＤａ，蛋白等
电点为６．５，其中包含５１个强碱性氨基酸（Ｋ、Ｒ），５６个强酸性氨基酸（Ｄ、Ｅ），１０８个疏水氨基酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｗ、
Ｖ），２０３个极性氨基酸（Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ）。截型苜蓿（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ：ＸＰ＿００３５９９２８７）；拟南芥（ＢＡＥ９８４５６）；
大豆（ＸＰ＿００３５３８３２３）。
利用ＧｅｎＢａｎｋ上的ＢｌａｓｔＰ搜索到来源于不同物种的几个亲缘关系近的蛋白序列，并进行了比对分析。图１
中可见，该基因编码蛋白与其他物种同一亚族关系相近的蛋白同源性相对较高。与蒺藜苜蓿ＷＲＫＹ、大豆
１５第１１期 冯光燕 等：紫花苜蓿犕狊犠犚犓犢３３转录因子的分离及遗传转化研究
图１ 犕狊犠犚犓犢３３氨基酸序列与其他植物 犠犚犓犢蛋白的多序列联配
犉犻犵．１ 犕狌犾狋犻狆犾犲犪犾犻犵狀犿犲狀狋犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犕狊犠犚犓犢３３狑犻狋犺犻狋狊犺狅犿狅犾狅犵狅狌狊犻狀狅狋犺犲狉狆犾犪狀狋狊
图２ 犠犚犓犢基因家族犇犖犃序列的系统进化关系
犉犻犵．２ 犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狉犲犾犪狋犻狅狀狊犺犻狆狊狅犳犇犖犃狊犲狇狌犲狀犮犲狊狑犻狋犺犻狀狋犺犲犃狋犠犚犓犢犳犪犿犻犾狔
系统进化树根据犠犚犓犢 基因的核苷酸序列构建。图中序列包括目的基因犕狊犠犚犓犢３３、蒺藜苜蓿犕狋犠犚犓犢、水稻犗狊犠犚犓犢３３基因以及拟南芥中
的６６个犠犚犓犢 家族基因。Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｄａｔａ．Ｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎｃｌｕｄｅｄｔａｒｇｅｔｇｅｎｅ犕狊犠犚犓犢３３，犕犲犱犻犮犪犵狅狋狉狌狀
犮犪狋狌犾犪犕狋犠犚犓犢，犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪犗狊犠犚犓犢３３ａｎｄ６６犠犚犓犢ｆａｍｉｌｙｇｅｎｅｓｆｒｏｍ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊．
２５ 草 业 学 报 第２４卷
犠犚犓犢３３在氨基酸水平上的相似性分别为９２％
和７１％。进一步对同源区进行序列分析，该蛋白
含有２个包括６０个氨基酸在内的 ＷＲＫＹ 保守
结构域（ＷＲＫＹＧＫＫ）和２个Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２锌指结
构。将该蛋白序列与拟南芥中的 ＷＲＫＹ转录因
子进行聚类分析，发现其与拟南芥的 ＷＲＫＹ３３
和 ＷＲＫＹ２５聚为一类，属于第Ｉ类 ＷＲＫＹ蛋白
（图２）。说明该基因可能具有犠犚犓犢３３基因的
相似功能。因此将该基因命名为犕狊犠犚犓犢３３。
用ＰｒｏｔＣｏｍｐ９．０软件（ｈｔｔｐ：／／ｌｉｎｕｘ１．ｓｏｆｔ
ｂｅｒｒｙ．ｃｏｍ／ａｌ．ｈｔｍ）进行亚细胞定位预测分析，
该蛋白定位在细胞核的可能性为７．６６，细胞膜的
可能性为１．５３，定位于其他亚细胞结构的可能性
都小于１（表２）。因此该蛋白最有可能定位于细
胞核中。
２．３ 犕狊犠犚犓犢３３基因的表达分析
利用ｑｕａｎｔｉｔｉｖｅＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲ对紫花苜蓿
表２ 犕狊犠犚犓犢３３蛋白亚细胞定位分析
犜犪犫犾犲２ 犘狉犲犱犻犮狋犻狅狀狅犳狆狉狅狋犲犻狀狊狌犫犮犲犾狌犾犪狉
犾狅犮犪犾犻狕犪狋犻狅狀狅犳犕狊犠犚犓犢３３
定位Ｌｏｃａｔｉｏｎｗｅｉｇｈｔｓ ＬｏｃＤＢ
Ｐｏｔ
ＬｏｃＤＢ
Ｎｅｕｒａｌ
Ｎｅｔｓ
Ｐｅｎ
ｔａｍｅｒｓ
Ｉｎｔｅ
ｇｒａｌ
细胞核Ｎｕｃｌｅａｒ ０．０ ５．０ ０．００ １．００ ７．６６
细胞膜Ｐｌａｓｍａｍｅｍｂｒａｎｅ ０．０ ０．０ １．００ ０．０２ １．５３
细胞外Ｅｘｔｒａｃｅｌｕｌａｒ ０．０ ０．０ １．００ ０．１９ ０．００
细胞质Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ０．０ ０．０ ０．００ ２．２４ ０．０８
线粒体 Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ０．０ ０．０ ０．００ １．０３ ０．００
内质网Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｒｅｔｉｃ ０．０ ０．０ ０．００ ０．３９ ０．００
过氧化物酶体Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ ０．０ ０．０ １．００ ０．００ ０．１４
高尔基体Ｇｏｌｇｉ ０．０ ０．０ ０．００ ０．５２ ０．００
叶绿体Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ０．０ ０．０ ０．００ ０．００ ０．００
液泡Ｖａｃｕｏｌａｒ ０．０ ０．０ ０．００ ０．０８ ０．５９
犕狊犠犚犓犢３３基因在非生物逆境胁迫下的基因表达进行了检测。结果显示，盐（ＮａＣｌ），干旱（ＰＥＧ模拟）和冷
（４℃）胁迫均能诱导犕狊犠犚犓犢３３基因表达上调（图３）。其中冷胁迫对基因的诱导较强，到处理１２ｈ表达丰度提
高了１５倍以上（图３Ｃ）。干旱处理下，处理４ｈ基因表达开始明显上调，并一直维持上升的趋势到２４ｈ（图３Ｂ）。
表明该基因可能直接或间接的参与了植物对这些非生物逆境的响应。同时，还进行了ＡＢＡ处理诱导，发现当紫
花苜蓿受到ＡＢＡ胁迫时，表达呈一个相对缓慢的上升趋势。随着处理时间的延长，犕狊犠犚犓犢３３基因的表达量
逐渐上升，在１２ｈ的表达量达到最大值。随后表达量开始出现缓慢下降（图３Ｄ）。
图３ 犕狊犠犚犓犢３３的基因表达分析
犉犻犵．３ 犌犲狀犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犕狊犠犚犓犢３３
Ａ：ＮａＣｌ处理ＮａＣｌｔｒｅａｔｍｅｎｔ；Ｂ：ＰＥＧ处理ＰＥＧｔｒｅａｔｍｅｎｔ；Ｃ：冷处理Ｃｏｌｄｔｒｅａｔｍｅｎｔ；Ｄ：ＡＢＡ处理ＡＢＡｔｒｅａｔｍｅｎｔ．
３５第１１期 冯光燕 等：紫花苜蓿犕狊犠犚犓犢３３转录因子的分离及遗传转化研究
２．４ 犕狊犠犚犓犢３３的蛋白原核表达
图４ 犕狊犠犚犓犢３３融合蛋白犛犇犛－犘犃犌犈
电泳考马斯亮蓝染色检测
犉犻犵．４ 犆狅狅犿犪狊狊犻犲狊狋犪犻狀犲犱犛犇犛－犘犃犌犈犵犲犾犻犾狌狊狋狉犪狋犻狀犵犕狊犠犚犓犢３３
犎犻狊狋犪犵犳狌狊犻狅狀狆狉狅狋犲犻狀犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犻狀犈．犮狅犾犻
１：未经ＩＰＴＧ诱导Ｎｏｎｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；２：ＩＰＴＧ诱导３ｈＩｎｄｕｃｅｄｂｙＩＰＴＧ
ｆｏｒ３ｈ；３：ＩＰＴＧ诱导１ｈＩｎｄｕｃｅｄｂｙＩＰＴＧｆｏｒ１ｈ；Ｍ：Ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ．
将目的片段连接ｐＥＴ３０ａ构成重组子，转化大肠
杆菌ＢＬ２１，测序检测证明序列正确，没有发生突变。
表明蛋白表达载体已经构建成功。将含有阳性质粒大
肠杆菌表达菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株系，用１ｍｍｏｌ／Ｌ
ＩＰＴＧ诱导表达，并在诱导的０，１和３ｈ分别取样。
结果显示，含有 ＭｓＷＲＫＹ３３片段的表达载体菌体蛋
白在诱导后有特异性条带出现。该表达蛋白在４５
ＫＤａ附近，分子量与预期相同（图４）。表明该蛋白可
以在大肠杆菌中诱导表达。这为进一步的蛋白表达研
究奠定了基础。
２．５ 犕狊犠犚犓犢３３基因的遗传转化
本研究将来自紫花苜蓿的犕狊犠犚犓犢３３ｃＤＮＡ全
长片段通过农杆菌介导的遗传转化的方法同源导入紫
花苜蓿进行超量表达。首先将 犕狊犠犚犓犢３３ｃＤＮＡ 全长片段克隆到植物双元表达载体ＰＢＩ１２１中，如图５Ａ所
示。通过限制性内切酶犡犫犪Ⅰ／犅犪犿ＨⅠ双酶切检测，获得与预期大小相符１５００ｂｐ左右的条带（图５Ｂ）。再将酶
切阳性的克隆测序检测，插入序列完整，无缺失，无突变，表明犕狊犠犚犓犢３３基因已经成功克隆到植物表达载体
中。
图５ 紫花苜蓿遗传转化过程
犉犻犵．５ 犜犺犲犵犲狀狅犿犻犮狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀狅犳犪犾犳犪犾犳犪
Ａ：犕狊犠犚犓犢３３超表达载体构建示意图Ｓｋｅｔｃｈｍａｐｏｆｏ
ｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｖｅｃｔｏｒｏｆ犕狊犠犚犓犢３３ｇｅｎｅ；Ｂ：表 达 载 体
ｐＢＩ１２１犕狊犠犚犓犢３３的酶切鉴定Ｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＢＩ１２１犕狊犠犚犓犢３３；Ｍ：ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ１５０００；１：
犅犪犿ＨＩ／犡犫犪Ⅰ双酶切ｐＢＩ１２１犕狊犠犚犓犢３３Ｄｏｕｂｌｅｅｎｚｙｍｅｄｉ
ｇｅｓｔｉｏｎｏｆｖｅｃｔｏｒｐＢＩ１２１犕狊犠犚犓犢３３ｂｙ犅犪犿ＨＩ／犡犫犪Ⅰ；２：
对照（没有酶切的质粒）Ｃｏｎｔｒｏｌ（ｎｏｎｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）；Ｃ－Ｈ：农杆菌
介导的紫花苜蓿遗传转化 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒ
ｍａｔｉｏｎｏｆａｌｆａｌｆａ；Ｃ：叶片外植体Ｌｅａｆｓｅｇｍｅｎｔｓａｆｔｅｒｃｏｃｕｌｔｉ
ｖａｔｉｏｎｗｉｔｈ犃．狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊；Ｄ：愈伤组织发育Ｃａｌｕｓｅｓｆｏｒｍｅｄ
ｆｒｏｍｌｅａｆｓｅｇｍｅｎｔｓａｆｔｅｒ犃．狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａ
ｔｉｏｎａｎｄｋａｎａｍｙｃｉｎｓｅｌｅｃｔｉｏｎ；Ｅ：成熟胚长出，小图为出芽的
胚 Ｍａｔｕｒｅｅｍｂｒｙｏｓｆｏｒｍｅｄ．Ｉｎｓｅｒｔｅｄｆｉｇｕｒｅｓｈｏｗｅｄｔｈｅｓｐｒｏｕ
ｔｉｎｇｅｍｂｒｙｏ；Ｆ：继代培养，胚生成叶片Ｐｌａｎｔｌｅｔ／ｓｈｏｏｔｒｅｇｅｎｅｒ
ａｔｅｄｏｎｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ；Ｇ：幼苗生根，抗性植株形成，小
图为转基因植株ＧＵＳ染色Ｒｏｏｔｓｅｍｅｒｇｅｄｆｒｏｍｅｍｂｒｙｏｓａｎｄ
ｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｌａｎｔｆｏｒｍｅｄ．ＩｎｓｅｒｔｅｄｆｉｇｕｒｅｓｈｏｗｅｄｔｈｅＧＵＳ
ｓｔａｉｎｉｎｇｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ；Ｈ：移入温室的转基因植株
Ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅｇｒｏｗｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ犕．狊犪狋犻狏犪ｐｌａｎｔｓ．
采用紫花苜蓿叶片为外植体，用转化了ｐＢＩ１２１犕狊犠犚犓犢３３的农杆菌侵染后，在筛选培养基上培养（图
５Ｃ），外植体切口处诱导出愈伤组织（图５Ｄ）；愈伤组织继续培养，长出幼胚（图５Ｅ）；幼胚逐渐发育成为成熟胚，并
长出幼叶（图５Ｆ），移到生根培养基上，在生根培养基上长出幼根（图５Ｇ）。再生苗经ＧＵＳ组织化学染色，显示蓝
色，表明目的基因在紫花苜蓿植株中成功表达（图５Ｇ小图）。通过初步筛选，共获得７株阳性转基因植株。将这
些阳性幼苗移入人工气候室，进行炼苗，待植株强壮后，移入室外生长（图５Ｈ）。
４５ 草 业 学 报 第２４卷
为进一步检测转化阳性植株，对转基因材料进行了分子水平检测。以未转化的植株作为对照，提取转基因植
株ＤＮＡ，对Ｔ－ＤＮＡ中狀狆狋Ⅱ基因以及载体特异引物进行ＰＣＲ检测。结果表明，筛选出的７株阳性植株均扩增
出ＰＣＲ产物，且扩增产物与目的片段大小吻合（图６Ａ）。
进一步的，对ＤＮＡ检测阳性的株系进行了目的基因表达量的ｑＲＴ－ＰＣＲ检测。结果显示，所有受检株系
的犕狊犠犚犓犢３３表达都上调，其中株系１，２，１９的表达丰度最高（图６Ｂ），可以作为下一步基因功能验证的候选材
料。
图６ 转基因植株的分子检测
犉犻犵．６ 犕狅犾犲犮狌犾犪狉犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋狊犫狔犘犆犚
Ａ：ＤＮＡ水平检测ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｕｎｄｅｒＤＮＡｌｅｖｅｌ；Ｍ：ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ２０００；ＣＫ：野生型对照Ｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｏｆｗｉｌｄｔｙｐｅ；Ｂ：目的基因的ｑＲＴ－ＰＣＲ 检测
ｑＲＴ－ＰＣＲｆｏｒｔａｒｇｅｔｇｅｎｅ．
３ 讨论
ＷＲＫＹ转录因子是植物中一个庞大的基因家族，到目前为止，在拟南芥中共发现７４个 ＷＲＫＹ基因［１８］，水
稻中共发现１０２个［１９］（一说为１１４个），大豆中１９７个［２０］，大麦（犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲）中４５个［２１］等等。在最近的一
项研究中，从蒺藜苜蓿的基因组中搜索到了２８个 ＷＲＫＹ转录因子基因［２２］。所有的 ＷＲＫＹ蛋白均含有一个或
两个 ＷＲＫＹ结构域。最初根据所含 ＷＲＫＹ结构域的数目和锌指结构的特征将 ＷＲＫＹ蛋白划分３组：第Ⅰ组
含有两个 ＷＲＫＹ结构域，其锌指结构为Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２（ＣＸ４５ＣＸ２２２３ＨＸ１Ｈ）；第Ⅱ组含有一个 ＷＲＫＹ结构域，
锌指结构与第１组相同；第Ⅲ组也只含一个 ＷＲＫＹ结构域，锌指结构为Ｃｙｓ２Ｈｉｓ／Ｃｙｓ（ＣＸ７ＣＸ２３ＨＸ１
Ｃ）［２３］。关于 ＷＲＫＹ分类方式也不一而足，其中Ｚｈａｎｇ和 Ｗａｎｇ［２４］对迄今为止已克隆到的所有 ＷＲＫＹ 超级家
族基因进行了聚类分析，除了上述的根据 ＷＲＫＹ域和锌指结构的分类之外，分析结构显示，根据第二类型的
ＷＲＫＹ蛋白结构域内所包含的其他较为保守的结构域又可进一步将其分为ａ、ｂ、ｃ、ｄ和ｅ５个亚类。本研究以
模式植物拟南芥中的 ＷＲＫＹ转录因子为参考基因，对犕狊犠犚犓犢３３基因的进化地位进行了分析。根据Ｚｈａｎｇ
和 Ｗａｎｇ［２４］进行的进化分析，进化树将犕狊犠犚犓犢３３、犕狋犠犚犓犢和拟南芥的６６个 ＷＲＫＹ基因共同分为７类，分
别是 ＷＲＫＹＩ、ＷＲＫＹＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩｃ、ＩＩｄ、ＩＩｅ和 ＷＲＫＹ Ⅲ，犕狊犠犚犓犢３３和 犕狋犠犚犓犢紧紧聚在一起，共同归在
ＷＲＫＹＩ类。因此，紫花苜蓿 ＷＲＫＹ３３基因可能具有 ＷＲＫＹＩ类转录因子相似的功能，尤其是与犃狋犠犚犓犢３３
相似的功能。在系统进化分析中，我们还引入了水稻的犠犚犓犢３３基因，但是，该基因并没有如我们预期的那样
与犃狋犠犚犓犢３３和犕狊犠犚犓犢３３聚类在一起，而是聚在了ＩＩｂ亚族。究其原因，可能是水稻与拟南芥中 ＷＲＫＹ的
编号各自独立，编号相同的基因并没有进化和功能上的相关性。
转录因子只有在细胞核中才能发挥其功能。本研究利用生物在线软件ＳｏｆｔｂｅｒｒｙＰｒｏｔＣｏｍｐ对犕狊犠犚犓犢３３
的亚细胞定位进行了预测。该软件将几种蛋白定位预测方法结合在一起，包括基于网络的细胞核预测，与已知定
位信息的同源蛋白比较，特定功能蛋白多肽预测，以及搜索定位特异 ｍｏｔｉｆ等。该软件与其他预测软件相比较，
具有独立的植物蛋白和动物／真菌蛋白识别器，极大的提高了识别的准确性。用该软件的分析结果表明，
５５第１１期 冯光燕 等：紫花苜蓿犕狊犠犚犓犢３３转录因子的分离及遗传转化研究
犕狊犠犚犓犢３３定位于细胞核，这与 ＭｓＷＲＫＹ３３的转录因子身份是相符的。当然这一预测结果还需要后续试验
做进一步证明。
如前所述，犕狊犠犚犓犢３３基因属于 ＷＲＫＹＩ亚族，与拟南芥犃狋犠犚犓犢３３基因的亲缘关系非常近。这暗示其
很可能具有与犃狋犠犚犓犢３３相似的功能。以往对 ＷＲＫＹ转录因子的研究多集中在抗病性上。有研究显示，犃狋
犠犚犓犢３３与植物的真菌抗性相关，病原菌诱导基因的表达以及异源表达基因能够增强植物抵御病原菌的能
力［２５２６］。也有少量针对非生物胁迫的研究，如Ｌｉ等［１３］在对 ＷＲＫＹ２５、２６和３３的研究中（这３个基因均属于
ＷＲＫＹⅠ类）发现，３基因与植物的耐热性调控相关，在植物的耐热性中功能互作，协同相关。玉米（犣犲犪犿犪狔狊）
中与犃狋犠犚犓犢３３同源的基因犣犿犠犚犓犢３３受高盐、干旱、冷胁迫和ＡＢＡ的诱导，基因增强表达提高植物的耐盐
性［２７］。因此我们认为犕狊犠犚犓犢３３基因可能也参与了非生物胁迫的调控。根据这一预测，对该基因对不同非生
物逆境的响应进行了研究，发现干旱、盐、冷均可以诱导 ｍＲＮＡ的累积（图３）。暗示犠犚犓犢３３基因可能参与了
这些逆境调控。于是我们进行了基因的遗传转化，在此基础上，后续我们将对该基因继续深入进行抗逆功能研
究，期望揭示紫花苜蓿 ＷＲＫＹ转录因子基因在抗非生物逆境中的作用。
犚犲犳犲狉犲狀犮犲狊：
［１］ ＲｕｓｈｔｏｎＰＪ，ＴｏｒｔｅｓＪＴ，ＰａｒｎｉｓｋｅＭ，犲狋犪犾．ＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｏｆｅｌｉｃｉｔｏｒｉｎｄｕｃｅｄＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓｗｉｔｈｅｌｉｃｉｔｏｒｒｅｓｐｏｎｓｅｅｌｅ
ｍｅｎｔｓｉｎｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｓｏｆｐａｒｓｌｅｙＰＲ１ｇｅｎｅｓ．ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ，１９９６，１５（２０）：５６９０５７００．
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