全 文 ：书犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１５２８８ 犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀
魏树强，孙振元，代小梅，钱永强．多年生黑麦草犔狆犌犆犛基因克隆及其在烟草中的初步功能验证．草业学报，２０１６，２５（４）：１２１１３２．
ＷＥＩＳｈｕＱｉａｎｇ，ＳＵＮＺｈｅｎＹｕａｎ，ＤＡＩＸｉａｏＭｅｉ，ＱＩＡＮＹｏｎｇＱｉａｎｇ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｉｎｔｏｂａｃｃｏｏｆ犔狆犌犆犛ｆｒｏｍｐｅｒｅｎｎｉａｌ
ｒｙｅｇｒａｓｓ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１６，２５（４）：１２１１３２．
多年生黑麦草犔狆犌犆犛基因克隆及其在
烟草中的初步功能验证
魏树强，孙振元，代小梅，钱永强
（中国林业科学研究院林业研究所，国家林业局林木培育重点实验室，北京１０００９１）
摘要：本研究以多年生黑麦草‘高帽２号’叶片为试材，根据同源基因的ＣＤＳ序列设计简并引物，采用ＲＴ－ＰＣＲ和
ＲＡＣＥ技术，克隆了多年生黑麦草γ谷氨酰基半胱氨酸合成酶基因犔狆犌犆犛。该基因全长为１６７４ｂｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登
录号：ＫＪ５５１８４４），具有完整的开放阅读框（ＯＲＦ），共１１２５ｂｐ；对其氨基酸序列特性、结构以及与其他８种同源基因
氨基酸序列间的同源性进行了研究，预测该蛋白分子量为４２．８６ｋＤａ，属于不稳定类蛋白质，其蛋白质二级结构以
α螺旋为主；蛋白质氨基酸序列与其他８种同源基因氨基酸序列间同源性都比较高；此外，成功构建了该基因的正、
反义植物表达载体ｐＣＡＭＢＩＡＵｂｉ犔狆犌犆犛＋和ｐＣＡＭＢＩＡＵｂｉ犔狆犌犆犛－，并通过农杆菌介导法获得转正、反义基
因烟草。对转基因植株和野生型烟草进行镉离子胁迫试验，生理生化指标测试结果表明镉离子胁迫处理１０ｄ后，
转犔狆犌犆犛＋植株中 ＭＤＡ含量低于野生型，光合色素含量与ＰＯＤ、ＳＯＤ、ＣＡＴ活性均高于野生型；而转犔狆犌犆犛－
植株中 ＭＤＡ含量高于野生型，光合色素含量与ＰＯＤ、ＳＯＤ、ＣＡＴ活性均低于野生型。综上所述，犔狆犌犆犛基因在烟
草中的过量表达可以提高植株的耐镉胁迫能力，为进一步利用该基因转化多年生黑麦草培育抗重金属植株奠定基
础。
关键词：多年生黑麦草；γ谷氨酰基半胱氨酸合成酶；基因克隆；功能验证　　
犕狅犾犲犮狌犾犪狉犮犾狅狀犻狀犵犪狀犱犮犺犪狉犪犮狋犲狉犻狕犪狋犻狅狀犻狀狋狅犫犪犮犮狅狅犳犔狆犌犆犛犳狉狅犿狆犲狉犲狀狀犻犪犾狉狔犲犵狉犪狊狊
ＷＥＩＳｈｕＱｉａｎｇ，ＳＵＮＺｈｅｎＹｕａｎ，ＤＡＩＸｉａｏＭｅｉ，ＱＩＡＮＹｏｎｇＱｉａｎｇ
犚犲狊犲犪狉犮犺犐狀狊狋犻狋狌狋犲狅犳犉狅狉犲狊狋狉狔，犆犺犻狀犲狊犲犃犮犪犱犲犿狔狅犳犉狅狉犲狊狋狉狔，犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔狅犳犜狉犲犲犅狉犲犲犱犻狀犵犪狀犱犆狌犾狋犻狏犪狋犻狅狀，犛狋犪狋犲犉狅狉犲狊狋狉狔
犃犱犿犻狀犻狊狋狉犪狋犻狅狀，犅犲犻犼犻狀犵１０００９１，犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋：ＤｅｇｅｎｅｒａｔｅｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄｕｓｉｎｇＣＤＳｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｇｅｎｅｓａｎｄｔｈｅγｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓ
ｔｅｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｇｅｎｅ犔狆犌犆犛ｗａｓｃｌｏｎｅｄｆｒｏｍｐｅｒｅｎｎｉａｌｒｙｅｇｒａｓｓ（犔狅犾犻狌犿狆犲狉犲狀狀犲）ｕｓｉｎｇＲＴ－ＰＣＲａｎｄＲＡＣＥ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｗｉｔｈｌｅａｖｅｓｏｆ‘ＴｏｐｈａｔⅡ’ａｓｔｈｅｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌ．Ｔｈｅｆｕｌｌｅｎｇｔｈｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆ犔狆犌犆犛ｇｅｎｅｗａｓ１６７４
ｂｐ（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ：ＫＪ５５１８４４）ｗｉｔｈａｃｏｍｐｌｅｔｅｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）ｏｆ１１２５ｂｐ．Ａｍｉｎｏ
ａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｉｄｅｎｔｉｔｙ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｉｔｈａｍｉｎｏａｃｉｄｓｏｆ８ｏｔｈｅｒｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｇｅｎｅｓｗｅｒｅ
ｓｔｕｄｉｅｄａｎｄｐｒｅｄｉｃｔｅｄ．Ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｗａｓ４２．８６ｋＤａ（ｕｎｓｔａｂｌｅｐｒｏｔｅｉｎ）ａｎｄｉｔｓｍａｉｎｓｅｃｏｎｄａｒｙ
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｂｅｉｎｇａｎａｌｐｈａｈｅｌｉｘ．Ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｈａｄｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｈｉｇｈｈｏｍｏｌｏｇｙｗｉｔｈ８ｏｔｈｅｒｈｏ
ｍｏｌｏｇｏｕｓａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｎｄｈａｄｈｉｇｈｅｒｈｏｍｏｌｏｇｙｗｉｔｈｇｒａｍｉｎａｃｅｏｕｓｐｌａｎｔｓ，ｓｕｃｈａｓｗｈｅａｔ（犜狉犻狋犻犮狌犿
犪犲狊狋犻狏狌犿），ｓｔｉｆｆｂｒｏｍｅ（犅狉犪犮犺狔狆狅犱犻狌犿犱犻狊狋犪犮犺狔狅狀）ａｎｄＪａｐａｎｅｓｅｒｉｃｅ（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪ＪａｐｏｎｉｃａＧｒｏｕｐ）．Ｉｎａｄｄｉ
第２５卷　第４期
Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．４
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
１２１－１３２
２０１６年４月
收稿日期：２０１５０６０５；改回日期：２０１５０７０６
基金项目：国家８６３项目（２０１１ＡＡ１００２０９０２）资助。
作者简介：魏树强（１９８３），男，山东临沂人，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｗｅｉｓｈｕｑｉａｎｇ２００８＠１６３．ｃｏｍ
通信作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅｍａｉｌ：ｓｕｎｚｙ＠ｃａｆ．ａｃ．ｃｎ
ｔｉｏｎ，ｓｅｎｓｅａｎｄａｎｔｉｓｅｎｓｅｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＣＡＭＢＩＡＵｂｉ犔狆犌犆犛＋ａｎｄｐＣＡＭＢＩＡＵｂｉ犔狆犌犆犛－ｗｅｒｅ
ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄａｎｄｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏｏｂｔａｉｎｅｄｂｙａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｔｒａｎｓ
ｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏｗｉｔｈ犔狆犌犆犛＋ｇｒｅｗｆａｓｔｅｒａｎｄｆｌｏｗｅｒｅｄｅａｒｌｉｅｒｔｈａｎｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏｗｉｔｈ犔狆犌犆犛－．Ｅｘ
ｐｏｓｅｄｔｏＣｄ２＋ｓｔｒｅｓｓ（１０ｄａｙｓ），ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｔｅｓｔｓｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃａｎｄｗｉｌｄｔｙｐｅｔｏｂａｃｃｏｓｈｏｗｅｄ
ｔｈａｔｔｈｅＭＤＡｃｏｎｔｅｎｔｏｆ犔狆犌犆犛＋ｔｒａｎｓｇｅｎｅｔｉｃｐｌａｎｔｓｗａｓｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈｅｗｉｌｄｔｙｐｅ，ａｎｄＰＯＤ，ＳＯＤａｎｄＣＡＴ
ａｃｔｉｖｉｔｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｏｆｔｈｅｗｉｌｄｔｙｐｅ．Ｉｎｃｏｎｔｒａｓｔ，ｔｈｅＭＤＡｃｏｎｔｅｎｔｏｆ犔狆犌犆犛－ｔｒａｎｓｇｅｎｅｔｉｃｐｌａｎｔｓｗａｓ
ｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｅｗｉｌｄｔｙｐｅａｎｄＰＯＤ，ＳＯＤａｎｄＣＡＴａｃｔｉｖｉｔｙｌｏｗｅｒ．Ｉｎｓｕｍｍａｒｙ，ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅ犔狆犌犆犛
ｇｅｎｅｉｎｔｏｂａｃｃｏｐｌａｎｔｓｃｏｕｌｄｉｍｐｒｏｖｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏＣｄ２＋ｓｔｒｅｓｓａｎｄｌａｙｔｈｅｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａ
ｔｉｏｎｏｆｐｅｒｅｎｎｉａｌｒｙｅｇｒａｓｓｃｕｌｔｉｖａｒｓａｂｌｅｔｏｔｏｌｅｒａｔｅｈｅａｖｙｍｅｔａｌｓ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｐｅｒｅｎｉａｌｒｙｅｇｒａｓｓ；γｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ；ｇｅｎｅｃｌｏｎｅ；ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
在植物抗氧化系统中，谷胱甘肽（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ，ＧＳＨ）是植物应对活性氧引起的氧化破坏中最为重要的细胞
内物质，其在硫的运输调控、信号转导、代谢物质的结合、外源化学物质的解毒［１］和一些植物悬浮培养细胞和叶片
中胁迫响应基因（例如，ＰＲ１，ＧＳＴ，ＧＰＸ，ＣＨＳ，ＰＡＬ，ＳＯＤ等）的表达中起到了重要的调控作用［２］。谷胱甘肽是
植物螯合肽合成的底物［３４］，在低温、重金属、氧化等环境胁迫下，ＧＳＨ的积累水平随着胁迫时间延长而增加［５６］，
而植物螯合肽富含Ｃｙｓ，通过其巯基与金属结合而形成硫醇盐，能够提高植物对重金属的抗性，解除重金属对植
物的毒害作用，并维持细胞内环境中金属离子浓度的相对稳定［３，７９］。因此，通过在植物中过量表达ＧＳＨ合成相
关基因能够提高植物对非生物胁迫的抗性。
谷胱甘肽的合成是以氨基酸和ＡＴＰ为底物，在γ谷氨酰基半胱氨酸合成酶（γｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，
γＥＣＳ）和谷氨酸合成酶（ＧＳＨｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，ＧＳ）催化条件下完成的，其中γ谷氨酰基半胱氨酸的合成是谷胱甘肽
合成过程中的限速步骤［３］。在烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿）［１０］、番茄（犔狔犮狅狆犲狉狊犻犮狅狀犲狊犮狌犾犲狀狋狌犿）［１１］、豌豆（犘犻狊狌犿狊犪
狋犻狏狌犿）［１２］和水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）［１３］中过量表达γＥＣＳ或ＧＳ基因，能够提高它们对非生物胁迫的抗性，并且其
体内谷胱甘肽的含量决定了其对逆境的抵抗能力，而当谷胱甘肽合成被抑制时，高山离子芥（犆犺狅狉犻狊狆狅狉犪犫狌狀
犵犲犪狀犪）愈伤组织对冷害的抵抗能力下降［１４］。
在重金属胁迫下，草坪草的生长受到显著抑制［１５］。本研究以多年生黑麦草（犔狅犾犻狌犿狆犲狉犲狀狀犲）为材料，利用
γ谷氨酰基半胱氨酸合成酶（又称作谷氨酸半胱氨酸连接酶，ＧＣＳ）基因的同源保守序列设计简并引物，采用
ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎｄｓ）法克隆了ＧＳＨ合成的关键酶基因，对其进行生物信息学分析及预测，
并利用农杆菌介导法转化烟草验证该基因的功能，为进一步培育具有抗重金属等非生物胁迫特性的多年生黑麦
草新种质资源奠定良好基础。
１　材料与方法
１．１　试验材料
１．１．１　植物材料　　将多年生黑麦草‘高帽２号’成熟种子播种于中国林业科学研究院温室大棚，２个月后取其
新鲜叶片作为总ＲＮＡ提取的实验材料，用液氮速冻，置于－８０℃超低温冰箱保存。
１．１．２　菌株和载体　　普通连接载体ｐＥＡＳＹＴ３ＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ和感受态ｔｒａｎｓ１ｔ１（Ｔｒａｎｓ１Ｔ１ＰｈａｇｅＲｅｓｉｓｔａｎｔ
ＣｈｅｍｉｃａｌｙＣｏｍｐｅｔｅｎｔＣｅｌ）均购自北京全式金生物技术有限公司。载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１Ｕｂｉ、根癌农杆菌
（犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊）菌种ＥＨＡ１０５均由本实验室保存。
１．１．３　主要生化试剂　　ＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙＭｉＮｉＫｉｔ（５０）、ＤＮａｓｅＩ、ＴａｋａＲａＬＡＴａｑＤＮＡ聚合酶、ＥｃｏｒＩ、ＫｐｎＩ、
ＱｕｉｃｋＣｕｔＢａｍＨＩ、Ｔ４ＤＮＡ连接酶、ＳＭＡＲＴｅｒＴＭ ＲＡＣＥｃＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ均购自ＴａＫａＲａ公司。Ｑｕａ
ｎｔＳｃｒｉｐｔＲＴＫｉｔ、Ｄ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ、普通琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自北京天根科技有
限公司。寡核苷酸引物合成和所克隆基因片段测序均由北京华大生物技术有限公司完成。
２２１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．４
１．２　试验方法
１．２．１　总ＲＮＡ的提取与ｃＤＮＡ第一链的合成　　采用ＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙＭｉＮｉＫｉｔ（５０）ＲＮＡ提取试剂盒（ＴａＫａ
Ｒａ公司）提取多年生黑麦草叶片总ＲＮＡ。经ＤＮａｓｅＩ（ＴａＫａＲａ公司）处理后，利用ＮａｎｏＤｒｏｐ８０００检测在２６０，
２８０及２３０ｎｍ处的吸光值，确定总ＲＮＡ的纯度及浓度，利用１．２％的琼脂糖电泳检测总ＲＮＡ的完整性。检测
获得的高质量总ＲＮＡ，在ＱｕａｎｔＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ的作用下，以Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１５为引物进行反转录，合成ｃＤ
ＮＡ第一链（ＱｕａｎｔＳｃｒｉｐｔＲＴＫｉｔ试剂盒，天根），－２０℃保存备用。
１．２．２　犔狆犌犆犛中间片段的克隆　　根据ＧｅｎＢａｎｋ上已注册的印度芥菜（犅狉犪狊狊犻犮犪犼狌狀犮犲犪）（ＡＪ００５５８７．１）、小麦
（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）（ＡＹ８６４０６４．１）、日本水稻（犗．狊犪狋犻狏犪ＪａｐｏｎｉｃａＧｒｏｕｐ）（ＡＪ５０８９１６．２）、玉米（犣犲犪犿犪狔狊）
（ＡＪ３０２７８３．１）、芦苇（犘犺狉犪犵犿犻狋犲狊犪狌狊狋狉犪犾犻狊）（ＦＪ４６３８７２．１）ＧＣＳ基因的ＣＤＳ序列设计简并引物犔狆犌犆犛Ｚ５１［５′
Ｔ（Ｔ／Ｃ）ＧＡＡＡＣＡＴＴＡＣＡＴＣＡＡＡＣＴＴＧＴＧＣ３′］和犔狆犌犆犛Ｚ３１［５′ＡＣＣＡＡＣＣＴＣＣＴＴＧＴＡ（Ｔ／Ｃ）ＣＣＴＣＴ
ＴＣ３′］进行ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ扩增参数为９４℃３ｍｉｎ，９４℃３０ｓ，５２℃３０ｓ，７２℃２ｍｉｎ；３０次循环。回收目的片
段分别连接到ｐＥＡＳＹＴ３克隆载体，并转化至Ｔｒａｎｓ１Ｔ１ＰｈａｇｅＲｅｓｉｓｔａｎｔＣｈｅｍｉｃａｌｙＣｏｍｐｅｔｅｎｔＣｅｌ，取阳性
克隆进行菌液ＰＣＲ、酶切鉴定并测序。
１．２．３　犔狆犌犆犛５′端和３′端的克隆　　根据测序得到的序列信息设计 ＲＡＣＥ引物犔狆犌犆犛Ｓ５１（５′ＣＣＣＴＴ
ＧＧＧＣＡＴＴＡＴＴＧＧＴＡＴＣＴＣＡＣＴＣ３′）和犔狆犌犆犛Ｘ３１（５′ＧＴＣＧＧＧＴＴＧＣＴＧＴＡＴＧＡＴＧＡＧＧＡＧＴ３′），使用
ＳＭＡＲＴｅｒＴＭ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ 所 提 供 的 ＵＰＭ 引 物 （５′ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴ
ＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ３′）经ＰＣＲ获得两端片段序列。ＰＣＲ扩增参数为９４℃３ｍｉｎ，
９４℃３０ｓ，６８℃３０ｓ，７２℃２ｍｉｎ，２５个循环。
１．２．４　犔狆犌犆犛全长的克隆　　将获得的基因序列进行拼接，在ＮＣＢＩ网站进行比对，确认为目的基因序列后，
利用ＮＣＢＩ网站上的ＯＲＦＦｉｎｄｅｒ软件获取ＯＲＦ序列，在ＯＲＦＡＴＧ前设计５′端特异引物犔狆犌犆犛５１（５′ＡＡＧ
ＧＡＧＡＡＣＴＧＧＡＧＡＡＴＣＧＧＣＡＣＡ３′），ＯＲＦ３′端 ＴＡＧ 之后设计３′序列保守区引物犔狆犌犆犛３１（５′ＧＣＣＧ
ＣＡＡＧＡＣＣＡＧＡＡＧＧＡＡＧＴ３′）。ＰＣＲ扩增参数为９４℃３ｍｉｎ，９４℃３０ｓ，５６℃３０ｓ，７２℃２ｍｉｎ，３０个循环。
ＰＣＲ产物经回收、连接、转化、菌斑ＰＣＲ、酶切检测鉴定和测序。
１．２．５　序列分析　　利用ＮＣＢＩ网站ＰｒｏｔｅｉｎＣｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎＤｏｍａｉｎ程序对犔狆犌犆犛编码的蛋白质序列进行蛋白
质保护域和保守性分析；利用在线软件ＥｘＰＡＳｙＰｒｏｔＰａｒａｍｔｏｏｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）预测基因所编码蛋白
质的氨基酸组成、分子量、理论等电点，利用ＳＯＰＭＡ（ｈｔｔｐ：／／ｎｐｓａｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉｂｉｎ／ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ？
ｐａｇｅ＝ｎｐｓａ＿ｓｏｐｍａ．ｈｔｍｌ）预测其蛋白质二级结构。
１．２．６　植物表达载体的构建　　首先对基因全长和载体进行酶切位点分析，选择目的基因内部没有相应酶切位
点的酶ＢａｍＨＩ和ＫｐｎＩ，在目的基因上游ＰＣＲ引物５′端加上ＢａｍＨＩ酶切位点，设计构建正义载体所用上游引
物ＺＢ（５′ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＴＧ３′）；在下游ＰＣＲ引物５′端加上ＫｐｎＩ酶切点，设计构建正义载
体所用下游引物ＺＫ（５′ＧＧＴＡＣＣＴＣＡＧＴＡＴＡＡＣＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡ３′）；在上游ＰＣＲ引物５′端加上ＫｐｎＩ酶切
位点，设计构建反义载体所用上游引物ＦＫ（５′ＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＴＧＴ３′）；下游ＰＣＲ引物５′端
加上ＢａｍＨＩ酶切位点，设计构建反义载体所用下游引物ＦＢ（５′ＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＴＡＴＡＡＣＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡ
３′）。用携带犔狆犌犆犛基因的Ｔ载体质粒作为模板进行ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ扩增参数为９４℃３ｍｉｎ，９４℃３０ｓ，５８℃
３０ｓ，７２℃２ｍｉｎ，３０个循环。对扩增产物进行胶回收，重新连接到ｐＥＡＳＹＴ３载体上，经转化、过夜培养、质粒
ＤＮＡ酶切、测序，确定获得含酶切位点的目的基因正、反义片段，分别将其连接入ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１Ｕｂｉ植物表达
载体上，经双酶切鉴定目的基因的正反义植物表达载体是否构建成功。
１．２．７　叶盘法转化烟草及抗性植株的筛选　　制备根癌农杆菌ＥＨＡ１０５感受态细胞，利用获得的无菌、生长良
好的‘珊西’烟草幼苗（无菌培养３０ｄ）叶盘进行转化。将剪好的烟草叶盘在含目的基因的农杆菌液中侵染１５
ｍｉｎ，用无菌滤纸吸干液体后，将侵染后的叶盘置于铺有一层无菌滤纸的 ＭＳ培养基（ＭＳ＋２．０ｍｇ／Ｌ６ＢＡ＋０．２
ｍｇ／ＬＩＡＡ，ｐＨ５．８）上黑暗条件下２８℃共培养２ｄ后，将叶盘转入含有抗生素的再生培养基（ＭＳ＋２．０ｍｇ／Ｌ６
ＢＡ＋０．２ｍｇ／ＬＩＡＡ＋５００μｇ／ｍＬＣａｒｂ＋５０μｇ／ｍＬＫａｎ，ｐＨ５．８）进行分化培养，以未转化的烟草叶盘作对照；
３２１第２５卷第４期 草业学报２０１６年
待再生芽长至２ｃｍ高时，切下移入生根培养基（ＭＳ＋２００μｇ／ｍＬＣａｒｂ＋７５μｇ／ｍＬＫａｎ，ｐＨ５．８）诱导生根；３周
后获得再生植株；继续培养３０ｄ后，去封口膜，室内炼苗３～５ｄ后，移栽至营养土∶草炭∶蛭石（３∶１∶１）花盆中
培养，然后置于温室常规管理。
１．２．８　转基因植株的分子检测　　采用Ｔｒｉｚｏｌ法提取抗性烟草植株和野生型烟草的总ＲＮＡ，反转录成ｃＤＮＡ
第一链后，利用引物ＺＢ（５′ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＴＧ３′）、ＺＫ（５′ＧＧＴＡＣＣＴＣＡＧＴＡＴＡＡＣＡＡＴ
ＴＣＣＴＣＧＡ３′）和 ＦＫ（５′ＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＴＧＴ３′）、ＦＢ（５′ＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＴＡＴＡＡＣＡＡＴ
ＴＣＣＴＣＧＡ３′）进行 ＲＴＰＣＲ扩增鉴定转基因烟草植株。以烟草 犖狋犃犮狋犻狀为内参，犖狋犃犮狋犻狀Ｆ引物（５′→３′）：
ＴＡＧＴＡＡＧＣＡＡＣＴＧＧＧＡＣＧ，犖狋犃犮狋犻狀Ｒ引物（５′→３′）：ＣＴＣＴＧＡＧＣＣＡＡＴＧＧＴＡＡＴ。
１．２．９　Ｔ０ 代烟草表型观测　　对野生型烟草和转基因烟草的生长状况进行观察。２个月后，分别随机选取８
株野生型烟草（ＣＫ）和 Ｔ０ 代阳性正、反义转基因株系进行株高测量。
１．２．１０　转正、反义犔狆犌犆犛烟草耐镉胁迫试验设计　　实验在中国林业科学研究院科研温室内进行。正、反义
转基因烟草和野生型烟草植株由无菌苗移栽于温室草炭土基质中，常规养护管理。生长２个月后，随机选取野生
型烟草（ＣＫ）和Ｔ０ 代阳性正反义转基因株系（Ｌ＋、Ｌ－）进行重金属Ｃｄ２＋处理，Ｃｄ２＋由ＣｄＣｌ２·２．５Ｈ２Ｏ（分析
纯）提供。处理液ＣｄＣｌ２ 溶液浓度为５ｍｇ／Ｌ，每３ｄ浇灌１次。每处理３次重复。分别在处理０和８ｄ后测定野
生型烟草（ＣＫ）和Ｔ０ 代阳性正反义转基因株系（Ｌ＋、Ｌ－）的光合色素含量、丙二醛含量、抗坏血酸过氧化物酶
（ＡＰＸ）活性、过氧化物酶（ＰＯＤ）活性和过氧化氢酶（ＣＡＴ）活性，参照刘俊祥［１６］的方法测定。选取烟草同一部位
上生长叶龄相似的叶子，取样时间为早晨８：００－９：００，每个株系３个重复。
１．３　统计分析
利用Ｅｘｃｅｌ２００７进行数据整理、标准差的计算和作图，利用ＳＰＳＳ１３．０进行Ｄｕｎｃａｎ多重对比。
２　结果与分析
　　图１　犔狆犌犆犛克隆电泳图
　　犉犻犵．１　犃犵犪狉狅狊犲犵犲犾犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊犳狅狉狋犺犲犮犾狅狀犲狅犳犔狆犌犆犛
　　　Ａ：中间片段ＰＣＲ产物；Ｂ：５′端酶切产物；Ｃ：３′端酶切产物；Ｄ：基因全
长酶切产物；Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ（Ｄ２０００）；１：ＰＣＲ产物；２，３，４：酶切产物。Ａ：
Ｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｏｆｍｉｄｄｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅ；Ｂ：Ｔｈｅｄｉｇｅｓｔｅｄｐｒｏｄｕｃｔｏｆ５′ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅ；Ｃ：Ｔｈｅｄｉｇｅｓｔｅｄｐｒｏｄｕｃｔｏｆ３′ｓｅｑｕｅｎｃｅ；Ｄ：Ｔｈｅｄｉｇｅｓｔｅｄｐｒｏｄ
ｕｃｔｏｆｆｕｌｌｅｎｇｔｈｓｅｑｕｅｎｃｅ；Ｍ：ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ（Ｄ２０００）；１：Ｐｒｏｄｕｃｔｏｆ
ＰＣＲ；２，３，４：Ｔｈｅｄｉｇｅｓｔｅｄｐｒｏｄｕｃｔ．
２．１　犔狆犌犆犛中间片段的克隆
从多年生黑麦草叶片中提取，获得高质量总
ＲＮＡ，利用设计的引物进行中间片段扩增，琼脂糖凝
胶电泳结果如图１Ａ所示，获得约９００ｂｐ大小的核苷
酸序列，与预计目的条带大小相符；经胶回收、载体连
接、转化，挑取阳性克隆、摇菌过夜，经菌落ＰＣＲ，选取
携带目的条带的阳性克隆菌液进行测序，获得长９１１
ｂｐ的核苷酸序列。将测序获得的ｃＤＮＡ核苷酸序列，
用Ｂｌａｓｔ软件将其与ＧｅｎＢａｎｋ中的所有序列进行同源
性比对，发现其与小麦、高粱γ谷氨酰基半胱氨酸合
成酶的一致性约在９１％，与日本水稻、玉米的一致性
为９０％，并初步确定其为犌犆犛２超级家族基因序列的
一部分。这表明已经从多年生黑麦草叶片中分离出
γ谷氨酰基半胱氨酸合成酶基因的中间片段。
２．２　犔狆犌犆犛５′端和３′端的克隆
根据已获得的中间片段核苷酸序列，设计特异性引物犔狆犌犆犛Ｓ５１进行５′ＲＡＣＥＰＣＲ扩增，如图１Ｂ，获得
４０３ｂｐ的ＤＮＡ片段。扩增产物经胶回收、载体连接、转化，挑取阳性克隆、摇菌过夜后，提取质粒ＤＮＡ并酶切，
将具有单一目的条带的阳性克隆菌液送交公司测序。在ＮＣＢＩ网站上用Ｂｌａｓｔ软件将测序结果与ＧｅｎＢａｎｋ中的
所有序列进行同源性比对（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｂｌａｓｔｘ＆ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝
ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ｂｌａｓｔｈｏｍｅ），发现其与二穗短柄草（犅狉犪犮犺狔狆狅犱犻狌犿犱犻狊狋犪犮犺狔狅狀）的一致性达到９１％，
与印度水稻、日本水稻、玉米、短花药野生稻γ谷氨酰基半胱氨酸合成酶的一致性都达到了８８％，并初步确定其
４２１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．４
为犌犆犛２超级家族基因序列的一部分。以上结果表明已从多年生黑麦草中获得了目的基因的５′端片段。
根据已获得的中间片段核苷酸序列，设计特异性引物犔狆犌犆犛Ｓ３１进行３′ＲＡＣＥＰＣＲ扩增，如图１Ｃ，获得约
７５０ｂｐ的ＤＮＡ片段。扩增产物经胶回收、载体连接、转化，挑取阳性克隆、摇菌过夜，提取质粒ＤＮＡ并酶切，选
取携带单一目的条带的阳性克隆菌液进行测序。在ＮＣＢＩ网站上用Ｂｌａｓｔ软件将测序结果与ＧｅｎＢａｎｋ中的所有
序列进行同源性比对，发现其与小麦、日本水稻、玉米、乌拉图小麦、芦苇γ谷氨酰基半胱氨酸合成酶的一致性都
在９０％以上，并初步确定其为犌犆犛２超级家族基因序列的一部分。
２．３　犔狆犌犆犛的全长克隆
利用ＤＮＡＭＡＮ软件将克隆得到的犔狆犌犆犛中间片段、３′端和５′端核苷酸序列进行拼接，获得了全长为１６７４
ｂｐ的核苷酸序列。为检验拼接是否准确，设计了基因的特异引物犔狆犌犆犛３１和犔狆犌犆犛５１，如图１Ｄ，ＰＣＲ扩增
出约１４００ｂｐ的条带，将ＰＣＲ产物回收、连接、测序，获得长为１３９８ｂｐ的核苷酸序列，经测序发现与拼接结果一
图２　犔狆犌犆犛全长核苷酸与氨基酸序列
犉犻犵．２　犜犺犲犳狌犾犾犲狀犵狋犺狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳犮犇犖犃狀狌犮犾犲狅狋犻犱犲犪狀犱犪犿犻狀狅犪犮犻犱犳狅狉犔狆犌犆犛
致 。对犔狆犌犆犛全长进行分析，如图２所示，发现
图３　犔狆犌犆犛蛋白质二级结构模型预测
犉犻犵．３　犛犲犮狅狀犱犪狉狔狊狋狉狌犮狋狌狉犲狆狉犲犱犻犮狋犻狅狀犿狅犱犲犾狊狅犳犔狆犌犆犛狆狉狅狋犲犻狀
　
犔狆犌犆犛全长包含一个长度为１１２５ｂｐ的开放阅读
框（ｏｐｅｎｇｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ），在１４５～１２６９ｂｐ之间，推
测编码３７４个氨基酸；５′非翻译区长１４４ｂｐ，３′非翻
译区长４０５ｂｐ。多年生黑麦草 犔狆犌犆犛 基因在
ＧｅｎＢａｎｋ上 获 得 的 核 苷 酸 序 列 的 登 录 号 为：
ＫＪ５５１８４４。
将获得的犔狆犌犆犛的核苷酸序列在ＮＣＢＩ上经
ＢＬＡＳＴ分析发现，得分靠前的有小麦γ谷氨酸半
５２１第２５卷第４期 草业学报２０１６年
图４　犔狆犌犆犛所编码氨基酸序列与其他８个物种同源氨基酸序列间的比对
犉犻犵．４　犎狅犿狅犾狅犵狅狌狊犮狅犿狆犪狉犻狊狅狀狅犳狋犺犲犱犲犱狌犮犲犱犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳犔狆犌犆犛狑犻狋犺狅狋犺犲狉８狊狆犲犮犻犲狊
　Ａｔ：拟南芥犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪；Ｂｄ：二穗短柄草犅狉犪犮犺狔狆狅犱犻狌犿犱犻狊狋犪犮犺狔狅狀；Ｂｊ：印度芥菜犅狉犪狊狊犻犮犪犼狌狀犮犲犪；；Ｌｊ：百脉根犔狅狋狌狊犼犪狆狅狀犻犮犪；Ｌｐ：多年生
黑麦草犔狅犾犻狌犿狆犲狉犲狀狀犲；Ｎｔ：烟草犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿；Ｏｓ：日本水稻犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪ＪａｐｏｎｉｃａＧｒｏｕｐ；Ｔａ：小麦犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿；Ｚｍ：玉米犣犲犪犿犪狔狊．
６２１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．４
胱氨酸合成酶（ＧＳＨ１）ｍＲＮＡ全长序列、二穗短柄草γ谷氨酰基半胱氨酸连接酶ＢｍＲＮＡ序列、日本水稻γ谷
氨酸半胱氨酸合成酶基因ｍＲＮＡ序列、芦苇γ谷氨酸半胱氨酸合成酶（ＧＣＳ）ｍＲＮＡ全长序列，犔狆犌犆犛的核苷
酸序列与它们的一致性都达到了８８％以上，说明该基因属于谷氨酸半胱氨酸连接酶家族２（ｇｌｕｔａｍａｔｅｃｙｓｔｅｉｎｅ
ｌｉｇａｓｅｆａｍｉｌｙ２，ＧＣＳ２），也被称为γＥＣＳ，其催化谷胱甘肽从头生物合成的第一步反应，是谷胱甘肽合成的限速
酶。
２．４　犔狆犌犆犛编码蛋白质性质与结构分析
犔狆犌犆犛所编码蛋白质含有３７４个氨基酸，其亲水性氨基酸占氨基酸总量的３０．２％，疏水氨基酸占４３．４％，碱性
氨基酸占总氨基酸的１２．８％，酸性氨基酸占总氨基酸含量的１３．６％，其分子式为Ｃ１９３３Ｈ２９８６Ｎ５１０Ｏ５５５Ｓ１９，推测其分
图５　基于犌犆犛基因所编码氨基酸序列９个物种的系统发生树
犉犻犵．５　犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲犫犪狊犲犱狅狀犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲狊犮狅犱犻狀犵犫狔犌犆犛犵犲狀犲狅犳９狊狆犲犮犻犲狊
　
子 质量为４２８５９．２Ｄａ，理论等电点ｐＩ＝５．３９；不稳定
图６　狆犈犃犛犢犜３犔狆犌犆犛正义、反义载体和狆犆犃犕犅犐犃１３０１
犝犫犻载体的犓狆狀犐、犅犪犿犎犐双酶切电泳
犉犻犵．６　犜犺犲狊犲狀狊犲／犪狀狋犻狊犲狀犮犲狅犳狆犈犃犛犢犜３犔狆犌犆犛犪狀犱
狆犆犃犕犅犐犃１３０１犝犫犻狑犲狉犲犱犻犵犲狊狋犲犱狑犻狋犺犓狆狀犐犪狀犱犅犪犿犎犐
　　　Ｍ１：ＭａｒｋｅｒＤＭ１００００；Ｍ２：ＭａｒｋｅｒＤ２０００；１：ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１Ｕｂｉ质
粒对照；２：ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１Ｕｂｉ质粒双酶切产物；３：ｐＥＡＳＹＴ３犔狆犌犆犛＋
质粒对照；４：ｐＥＡＳＹＴ３犔狆犌犆犛＋质粒双酶切产物；５：ｐＥＡＳＹＴ３
犔狆犌犆犛－质粒对照；６：ｐＥＡＳＹＴ３犔狆犌犆犛－质粒双酶切产物。１：ＣＫ
ｏｆｐＣＡＭＢＩＡ１３０１Ｕｂｉｐｌａｓｍｉｄ；２：ＰｒｏｄｕｃｔａｆｔｅｒｐＣＡＭＢＩＡ１３０１Ｕｂｉ
ｐｌａｓｍｉｄｗａｓｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈＫｐｎＩａｎｄＢａｍＨＩ；３：ＣＫｏｆｐＥＡＳＹＴ３
犔狆犌犆犛＋ｐｌａｓｍｉｄ；４：ＰｒｏｄｕｃｔａｆｔｅｒｐＥＡＳＹＴ３犔狆犌犆犛＋ｐｌａｓｍｉｄｗａｓ
ｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈＫｐｎＩａｎｄＢａｍＨＩ；５：ＣＫｏｆｐＥＡＳＹＴ３犔狆犌犆犛－ｐｌａｓ
ｍｉｄ；６：ＰｒｏｄｕｃｔａｆｔｅｒｐＥＡＳＹＴ３犔狆犌犆犛－ ｐｌａｓｍｉｄｗａｓｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈ
ＫｐｎＩａｎｄＢａｍＨＩ．
系数为４７．６３，属于不稳定类蛋白质。如图３所示，
犔狆犌犆犛所编码蛋白由４６．２６％的α螺旋（ａｌｐｈａｈｅ
ｌｉｘ）、３５．２９％的无规则卷曲（ｒａｎｄｏｍｃｏｉｌ）、１２．８３％的
延伸主链（ｅｘｔｅｎｄｅｄｓｔｒａｎｄ）和５．６１％的β转角组成，
由此看出，α螺旋是犔狆犌犆犛蛋白的主要组成部分，其
他二级结构则散布犔狆犌犆犛蛋白α螺旋结构之间。
２．５　犔狆犌犆犛蛋白同源性分析
将犔狆犌犆犛的核苷酸序列翻译成氨基酸序列，提
交ＮＣＢＩ并进行在线比对（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．
ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ），发现其与小麦γ谷氨酸半胱氨酸
合成酶、二穗短柄草γ谷氨酰基半胱氨酸连接酶Ｂ、芦
苇γ谷氨酸半胱氨酸合成酶序列一致性最高，达
９５％。如图４所示，选择与其氨基酸序列一致性较高
和具有代表性的８个物种的氨基酸进行比对，发现该
基因Ｎ端具有很强的保守性。
利用 ＭＥＧＡ４．０版本 Ｋｉｍｕｒａ双参数模型，ＮＪ
法构建进化树，结果如图５所示，发现多年生黑麦草
犔狆犌犆犛基因所编码蛋白质氨基酸序列与同为禾本科
７２１第２５卷第４期 草业学报２０１６年
小麦同源性最高，与拟南芥和印度芥菜的同源性最低。
图７　狆犆犃犕犅犐犃犝犫犻犔狆犌犆犛正义和反义载体
犓狆狀犐和犅犪犿犎犐双酶切检测电泳
犉犻犵．７　犜犺犲狊犲狀狊犲／犪狀狋犻狊犲狀犮犲狅犳狆犆犃犕犅犐犃犝犫犻犔狆犌犆犛
狑犲狉犲犱犻犵犲狊狋犲犱狑犻狋犺犓狆狀犐犪狀犱犅犪犿犎犐
　　　Ｍ：ＭａｒｋｅｒＤＭ１００００；１：ｐＣＡＭＢＩＡＵｂｉ犔狆犌犆犛质粒对照；２：ｐＣＡＭ
ＢＩＡＵｂｉ犔狆犌犆犛＋质粒双酶切产物；３：ｐＣＡＭＢＩＡＵｂｉ犔狆犌犆犛－质粒
双酶切产物。１：ＣＫｏｆｐＣＡＭＢＩＡＵｂｉ犔狆犌犆犛ｐｌａｓｍｉｄ；２：Ｐｒｏｄｕｃｔａｆｔｅｒ
ｐＣＡＭＢＩＡＵｂｉ犔狆犌犆犛＋ｐｌａｓｍｉｄｗａｓｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈＫｐｎＩａｎｄＢａｍＨＩ；
３：ＰｒｏｄｕｃｔａｆｔｅｒｐＣＡＭＢＩＡＵｂｉ犔狆犌犆犛－ ｐｌａｓｍｉｄｗａｓｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈ
ＫｐｎＩａｎｄＢａｍＨＩ．
图８　７个转犔狆犌犆犛＋基因株系和４个转犔狆犌犆犛－
基因株系的犚犜－犘犆犚检测结果
犉犻犵．８　犚犜－犘犆犚犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳１１狋狉犪狀狊犳狅狉犿犲犱犾犻狀犲狊
　
图９　转犔狆犌犆犛＋／－烟草和野生型（犆犓）
生长２个月后株高对比
犉犻犵．９　犜犺犲犮狅犿狆犪狉犻狊狅狀狅犳犺犲犻犵犺狋犳狅狉狑犻犾犱狋狔狆犲狋狅犫犪犮犮狅
犪狀犱狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狋狅犫犪犮犮狅狑犻狋犺犔狆犌犆犛＋／－
　　　不同大写字母表示差异极显著（犘＜０．０１）；不同小写字母表示差异显
著（犘＜０．０５），下同。Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃａｐｉｔａｌｌｅｔｔｅｒｓｍｅａｎｖｅｒｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓａｔ犘＜０．０１；Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｍａｌｌｅｔｔｅｒｓｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓａｔ犘＜０．０５，ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．
２．６　犔狆犌犆犛基因正、反义植物表达载体的构建
为构建犔狆犌犆犛基因正、反义植物表达载体，首先
分别构建ｐＥＡＳＹＴ３犔狆犌犆犛 正义和反义载体。经
ＰＣＲ扩增获得犔狆犌犆犛的正义基因片段（５′与３′端加
有酶切位点ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩ）和反义基因片段（５′与３′
端加有酶切位点ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ），分别与克隆载体先
后经过ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩ酶切的ＩｐＥＡＳＹＴ３大片段连
接，经转化、涂板、挑单克隆、摇菌后，提取质粒，分别再
利用 ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩ对含目的基因的重组载体
ｐＥＡＳＹＴ３犔狆犌犆犛＋和ｐＥＡＳＹＴ３犔狆犌犆犛－进行质
粒双酶切，电泳结果如图６所示，从克隆载体ｐＥＡＳＹ
Ｔ３上分别切下带酶切位点的长约１．１ｋｂ的正反义基
因片段。
同时，利用 ＫｐｎＩ对ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１Ｕｂｉ载体进
行单酶切，１．２％琼脂糖凝胶电泳后，对酶切产物进行
回收，用ＢａｍＨＩ对回收产物再次进行酶切，如图６，
获得ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１Ｕｂｉ载体大片段；将上一步胶回
收获得的带酶切位点的正、反义基因片段分别与胶回
收获得的ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１Ｕｂｉ载体大片段连接，经转
化、涂板、挑单克隆、摇菌后，提取质粒，分别再用Ｋｐｎ
Ｉ、ＢａｍＨＩ对含目的基因的重组载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１
Ｕｂｉ犔狆犌犆犛＋和ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１Ｕｂｉ犔狆犌犆犛－进行
质粒双酶切，电泳结果如图７所示，检测发现１．１ｋｂ
左右的条带，将阳性克隆送交华大公司测序，ＤＮＡ 测
序结果与目的基因序列一致，这表明犔狆犌犆犛的正反
义植物表达载体构建成功。
２．７　转基因植株的分子检测
农杆菌侵染后的烟草叶盘，在抗性培养基上经过
分化再生形成抗性植株。据统计，抗性筛选共获得７
株转正义基因植株和４株转反义基因植株。采用Ｔｒ
ｉｚｏｌ法提取所有抗性烟草植株和野生型烟草的总
ＲＮＡ，反转录成ｃＤＮＡ第一链后，利用引物ＺＢ、ＺＫ和
ＦＫ、ＦＢ进行 ＲＴ－ＰＣＲ扩增，以烟草 犖狋犃犮狋犻狀为内
参，鉴定抗性转基因植株。如图８所示，转基因烟草扩
增出１条约为１１００ｂｐ的犔狆犌犆犛片段，而野生型对照
无此条带，由此筛选出５个转正义基因阳性株系和３
个转反义基因阳性株系，表明犔狆犌犆犛在转录水平正
常表达。
２．８　Ｔ０ 代烟草表型观测
ＲＴ－ＰＣＲ检测为阳性的正反义转基因烟草经过
扩繁后，进行常规养护管理，均能够正常生长。２个月
８２１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．４
后，随机分别选取８株野生型烟草（ＣＫ）和 Ｔ０ 代阳性
　　图１０　生长２个月的转犔狆犌犆犛＋／－烟草和野生型（犆犓）植株
犉犻犵．１０　犜狑狅犿狅狀狋犺狊狅犳狑犻犾犱狋狔狆犲犪狀犱狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狋狅犫犪犮犮狅
狑犻狋犺犔狆犌犆犛＋犪狀犱犔狆犌犆犛－
　　　Ａ：２个月后３种类型的烟草的生长状况Ｔｈｅｇｒｏｗｉｎｇｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆ２
ｍｏｎｔｈｓｆｏｒｔｈｒｅｅｔｙｐｅｓｏｆｔｏｂａｃｃｏ；Ｂ：转犔狆犌犆犛＋烟草已形成的花序
Ｔｈｅｆｏｒｍｉｎｇｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏｗｉｔｈ犔狆犌犆犛＋．
正、反义转基因株系进行株高测量，发现转犔狆犌犆犛＋
基因烟草的平均高为（３２．１±２．５）ｃｍ，显著高于转
犔狆犌犆犛－烟草和对照（图９），且转犔狆犌犆犛＋烟草提前
进入花期，而转犔狆犌犆犛－烟草和对照均未开花（图
１０），这可能是因为犔狆犌犆犛＋的过量表达促进了转基
因烟草的生长和发育。
２．９　转正、反义犔狆犌犆犛烟草耐镉胁迫能力鉴定
分别在处理０和８ｄ后测定野生型烟草（ＣＫ）和
Ｔ０ 代阳性正反义转基因株系（Ｌ＋、Ｌ－）的光合色素
含量、丙二醛含量、抗坏血酸过氧化物酶活性、过氧化
物酶（ＰＯＤ）活性和过氧化氢酶（ＣＡＴ）活性。结果表
明，胁迫前转犔狆犌犆犛－烟草植株中光合色素的含量显
著低于野生型（图１１Ａ），且于胁迫处理后，与野生型植
株光合色素的含量均低于转犔狆犌犆犛＋烟草；胁迫处理
后的转犔狆犌犆犛＋烟草 ＭＤＡ含量显著低于野生型与
转犔狆犌犆犛－烟草（图１１Ｂ），表明其膜系统所受伤害小；胁迫处理后的犔狆犌犆犛＋烟草的抗氧化物质活性 ＡＰＸ、
ＰＯＤ和ＣＡＴ均显著高于野生型与转犔狆犌犆犛－烟草（图１１Ｃ、Ｄ、Ｅ），表明转犔狆犌犆犛＋烟草的抗氧化能力增强。
综上所述，犔狆犌犆犛基因在烟草中的过量表达可以提高植株的耐镉胁迫能力，为进一步利用该基因转化多年生黑
麦草培育抗重金属植株奠定基础。
图１１　镉胁迫下转正、反义犔狆犌犆犛烟草与野生型植株
的光合色素含量、丙二醛含量、过氧化物酶（犘犗犇）活性、抗坏
血酸过氧化物酶（犃犘犡）活性和过氧化氢酶（犆犃犜）活性
犉犻犵．１１　犜犺犲犮狅狀狋犲狀狋狅犳犮犺犾狅狉狅狆犺狔犾，犕犇犃，狋犺犲犪犮狋犻狏犻狋狔狅犳
狆犲狉狅狓犻犱犪狊犲，犃犘犡，犆犃犜犻狀犾犲犪狏犲狊狅犳狑犻犾犱狋狔狆犲犪狀犱
狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狋狅犫犪犮犮狅狑犻狋犺犔狆犌犆犛＋犪狀犱犔狆犌犆犛－
　
９２１第２５卷第４期 草业学报２０１６年
３　结论与讨论
本研究获得全长为１６７４ｂｐ的基因犔狆犌犆犛（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＫＪ５５１８４４），并对其所编码蛋白质结构和功能
进行了分析和预测。所获得的犔狆犌犆犛序列以及该序列所编码蛋白质的性质、二级结构分析都表明，该基因属于
谷氨酸半胱氨酸连接酶家族２，其催化谷胱甘肽从头生物合成的第一步反应，是谷胱甘肽合成的限速酶。犔狆犌犆犛
所编码蛋白与小麦、烟草、水稻、印度芥菜中同源蛋白的同源性都达到了８１％以上。通过该基因在烟草中过量表
达以及镉胁迫生理试验验证了该基因抗重金属胁迫的功能，从而为通过基因工程方法提高多年生黑麦草对重金
属胁迫等非生物胁迫的抗性奠定了良好的基础。
谷胱甘肽在植物应对外界的非生物胁迫中有着非常重要的作用。重金属超富集植物犜犺犾犪狊狆犻犵狅犲狊犻犵犲狀狊犲在
自然条件下产生过量谷胱甘肽，被认为是其能够耐受由Ｃｄ２＋和Ｎｉ２＋所引起的氧化胁迫的一个重要特征。镉超
富集植物东南景天（犛犲犱狌犿犪犾犳狉犲犱犻犻）在被污染立地条件下的适应性也是由于谷胱甘肽的过量生产，而不是植物
螯合肽［１７］。此外，谷胱甘肽生物合成的增加在遏兰菜（犜犺犾犪狊狆犻犮犪犲狉狌犾犲狊犮犲狀狊）对重金属镉的积累［１８］和菥属
（犜犺犾犪狊狆犻）超富集植物对镍的积累有着非常重要的作用［１９］，而在转基因杨树中过量表达来源于细菌的γ谷氨酸
半胱氨酸合成酶基因，则提高了其谷胱甘肽的含量和对重金属锌的吸收能力［２０］。谷胱甘肽二镉复合物是酿酒酵
母（犛犪犮犮犺犪狉狅犿狔犮犲狊犮犲狉犲狏犻狊犻犪犲）和一些并不产生植物螯合肽的外生菌根真菌有效的Ｃｄ２＋转运载体，其细胞内的
Ｃｄ２＋的解毒依赖于此将金属排至液泡中［２１］。在烟草［１０］、水稻［１３］、印度芥菜［２２］中过量表达编码γＥＣＳ或ＧＳ蛋
白基因，能够提高它们对非生物胁迫的抗性，且在印度芥菜中的过量表达还增加了其对谷胱甘肽、植物螯合肽、重
金属镉的积累［２３］。
然而，也有研究结果表明，提高谷胱甘肽的含量并不总会增加其对重金属的抗性［２４］，这可能是因为谷胱甘肽
独自并不能支撑起由重金属胁迫引起的复杂抗性机制［５］。植物螯合肽的过量产生会使得拟南芥中的谷胱甘肽耗
尽，这于转基因植株对Ｃｄ２＋的抗性和积累能力具有负面影响［２５］。在拟南芥中过量表达编码酵母谷胱甘肽还原
酶基因犌犛犎１和大蒜（犃犾犾犻狌犿狊犪狋犻狏狌犿）犃狊犘犆犛１，单基因和双基因转基因植株对亚砷酸盐和砷酸盐的抗性及积累
能力都得到了提高［２６］；与转犃狊犘犆犛１单基因拟南芥相比，转犃狊犘犆犛１／犌犛双基因的拟南芥对重金属具有更高的
抗性和积累量。这表明，植物螯合肽的合成能力和保持细胞溶质状态稳定与氧化还原动态平衡的能力赋予了植
物对金属的抗性和积累特性。
有研究表明，谷胱甘肽还参与调控植物细胞中的 Ｈ２Ｏ２ 水平［２７］，减轻了逆境对植物所造成的伤害。这与本
研究的结果相似，胁迫处理后的转犔狆犌犆犛＋烟草不仅光合色素含量增加，而且抗氧化物质活性（ＳＯＤ、ＰＯＤ和
ＣＡＴ）均显著高于野生型与转犔狆犌犆犛－烟草，这表明犔狆犌犆犛基因在烟草中的过量表达提高了烟草的抗氧化能
力和光合色素的合成水平，从而增强植株的耐镉胁迫能力。
此外，本研究发现转犔狆犌犆犛＋烟草的株高明显高于转犔狆犌犆犛－烟草和对照，这表明犔狆犌犆犛＋的过量表达
促进了转基因烟草的生长。有研究表明，谷胱甘肽是谷氧还蛋白发挥作用的重要辅助因子，而谷氧还蛋白能够调
控花的发育［２８］，而本研究也发现转犔狆犌犆犛＋烟草植株有早开花表型。也有研究报道虽然外施谷胱甘肽对烟草
的生长影响很小［２９］，但是γＥＣＳ基因的过量表达提高了转γＥＣＳ基因水稻的产量［３０］。由此可以推测γＥＣＳ基
因的过量表达不仅影响植物的抗重金属能力，而且能够影响植物的生长发育。本研究为利用基因工程手段培育
抗重金属胁迫的多年生黑麦草新品种提供了重要的理论基础。
犚犲犳犲狉犲狀犮犲狊：
［１］　ＧｉｌＳ，ＴｕｔｅｊａＮ．Ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓａｎｄａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｍａｃｈｉｎｅｒｙｉｎａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｃｒｏｐｐｌａｎｔｓ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ
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０３１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．４
２０２．
［４］　ＲａｕｓｅｒＷＥ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｍｅｔａｌｃｈｅｌａｔｏｒｓｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｐｌａｎｔｓ：ｔｈｅｃａｓｅｆｏｒｏｒｇａｎｉｃａｃｉｄｓ，ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ，ｐｈｙｔｏｃｈｅｌ
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ｌｏｃａｔｉｏｎａｎｄｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｐｏｐｌａｒ．ＮｅｗＰｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ，２０１５，２０５（１）：２４０２５４．
［１２］　ＲｉｖｅｒａＢｅｃｅｒｒｉｌＦ，ＶａｎＴｕｉｎｅｎＤ，ＭａｒｔｉｎＬａｕｒｅｎｔＦ，犲狋犪犾．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｎｇｅｓｉｎ犘犻狊狌犿狊犪狋犻狏狌犿Ｌ．ｒｏｏｔｓｄｕｒｉｎｇａｒｂｕｓｃｕｌａｒ
ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｂｕｆｆｅｒｉｎｇｏｆｃａｄｍｉｕｍｓｔｒｅｓｓ．Ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａ，２００５，１６（１）：５１６０．
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ａｎｃｅｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｒｉｃｅｐｌａｎｔｓｔｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｓｔｒｅｓｓｅｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１３，１７０（６）：６１０６１８．
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Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００８，５７（１）：９１７．
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ｔｈｅｃａｄｍｉｕｍｈｙｐｅｒａｃｃｕｍｕｌａｔｏｒ犛犲犱狌犿犪犾犳狉犲犱犻犻．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００７，１６４（１１）：１４８９１４９８．
［１８］　ＢｏｏｍｉｎａｔｈａｎＲ，ＤｏｒａｎＰＭ．Ｃａｄｍｉｕｍｔｏｌｅｒａｎｃｅａｎｄａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅｄｅｆｅｎｓｅｓｉｎｈａｉｒｙｒｏｏｔｓｏｆｔｈｅｃａｄｍｉｕｍｈｙｐｅｒａｃｃｕｍｕｌａｔｏｒ，
犜犺犾犪狊狆犻犮犪犲狉狌犾犲狊犮犲狀狊．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００３，８３（２）：１５８１６７．
［１９］　ＦｒｅｅｍａｎＪＬ，ＰｅｒｓａｎｓＭ Ｗ，ＮｉｅｍａｎＫ，犲狋犪犾．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｐｌａｙｓａｒｏｌｅｉｎｎｉｃｋｅｌｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎ犜犺犾犪狊狆犻
狀犻犮犽犲犾ｈｙｐｅｒａｃｃｕｍｕｌａｔｏｒｓ．ＰｌａｎｔＣｅｌ，２００４，１６（８）：２１７６２１９１．
［２０］　Ｂｉｔｔｓａ′ｎｓｚｋｙＡ，ＫｍｉｖｅｓＴ，ＧｕｌｎｅｒＧ，犲狋犪犾．Ａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｏｐｌａｒｓｗｉｔｈｅｌｅｖａｔｅｄｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｃｏｎｔｅｎｔｔｏｔｏｌｅｒａｔｅｚｉｎｃ
（２＋）ｓｔｒｅｓｓ．ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２００５，３１（２）：２５１２５４．
［２１］　ＬｉＺ，ＬｕＹ，ＺｈｅｎＲ，犲狋犪犾．Ａｎｅｗｐａｔｈｗａｙｆｏｒｖａｃｕｏｌａｒｃａｄｍｉｕｍｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎｉｎ犛犪犮犮犺犪狉狅犿狔犮犲狊犮犲狉犲狏犻狊犻犪犲：ＹＣＦ１ｃａｔａｌｙｚｅｄ
ｔｒａｎｓｐｏｒｔｏｆｂｉｓ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎａｔｏ）ｃａｄｍｉｕｍ．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，１９９７，９４（１）：４２４７．
［２２］　ＦｌｏｃｃｏＣＧ，ＬｉｎｄｂｌｏｍＳＤ，ＥｌｉｚａｂｅｔｈＡＨ，犲狋犪犾．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｅｎｚｙｍｅｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｅｎｈａｎｃｅｓｔｏｌ
ｅｒａｎｃｅｔｏｏｒｇａｎｉｃｐｏｌｕｔａｎｔｓｉｎ犅狉犪狊狊犻犮犪犼狌狀犮犲犪．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈｙｔｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ，２００４，６（４）：２８９３０４．
［２３］　ＲｅｉｓｉｎｇｅｒＳ，ＳｃｈｉａｖｏｎＭ，ＴｅｒｒｙＮ，犲狋犪犾．Ｈｅａｖｙｍｅｔａｌｔｏｌｅｒａｎｃｅａｎｄａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｉｎｉｎｄｉａｎｍｕｓｔａｒｄ（犅狉犪狊狊犻犮犪犼狌狀犮犲犪Ｌ．）
ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｌγｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｏｒｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈｙｔｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ，
２００８，１０（５）：４４０４５４．
［２４］　ＸｉａｎｇＣ，ＷｅｒｎｅｒＢＬ，ＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎＥＭ，犲狋犪犾．Ｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｒｅｖｉｓｉｔｅｄｉｎ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓｗｉｔｈａｌｔｅｒｅｄｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｌｅｖｅｌｓ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００１，１２６（２）：５６４５７４．
［２５］　ＬｅｅＳ，ＭｏｏｎＪＳ，ＫｏＴ，犲狋犪犾．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狆犺狔狋狅犮犺犲犾犪狋犻狀ｓｙｎｔｈａｓｅｐａｒａｄｏｘｉｃａｌｙｌｅａｄｓｔｏｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ
ｔｏｃａｄｍｉｕｍｓｔｒｅｓｓ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００３，１３１（２）：６５６６６３．
［２６］　ＧｕｏＪ，ＤａｉＸ，ＸｕＷ，犲狋犪犾．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ犌犛犎１ａｎｄ犃狊犘犆犛１ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｓｔｈｅｔｏｌｅｒａｎｃｅａｎｄａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆ
ｃａｄｍｉｕｍａｎｄａｒｓｅｎｉｃｉｎ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪．Ｃｈｅｍｏｓｐｈｅｒｅ，２００８，７２（７）：１０２０１０２６．
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１３１第２５卷第４期 草业学报２０１６年
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２３１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．４