全 文 ：书犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１４２３２ 犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀
张丽君，刘龙龙，畅志坚，郭彬，崔林．燕麦隐性核不育ｃＳＳＲ标记的开发及其验证．草业学报，２０１５，２４（７）：１４６１５４．
ＺｈａｎｇＬＪ，ＬｉｕＬＬ，ＣｈａｎｇＺＪ，ＧｕｏＢ，ＣｕｉＬ．ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＳＳＲｍａｒｋｅｒｓｆｏｒｒｅｃｅｓｓｉｖｅｇｅｎｅｔｉｃｍａｌｅｓｔｅｒｉｌｉｔｙｉｎｏａｔｓ．
ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１５，２４（７）：１４６１５４．
燕麦隐性核不育犮犛犛犚标记的开发及其验证
张丽君１，刘龙龙１，畅志坚２，郭彬３，崔林１
（１．山西省农业科学院农作物品种资源研究所，农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，山西 太原０３００３１；２．山西省
农业科学院作物研究所，山西 太原０３００３１；３．山西省晋中市寿阳县乡镇农产品质量安全监管站，山西 寿阳０４５４００）
摘要：构建燕麦隐性核不育转录组数据库，开发ｃＳＳＲ标记，丰富燕麦分子标记数据库，并对隐性核不育相关ｃＳＳＲ
标记进行验证，为充分利用燕麦种质资源及深入研究隐性核不育奠定基础。对燕麦雄性不育近等基因系ＣＡＭＳ１
进行转录组测序，利用软件对得到的ＥＳＴ序列进行ＳＳＲ位点查找和分析，开发ｃＳＳＲ引物。并用ＣＡＭＳ１×品燕２
号Ｆ２ 代群体对所开发的雄性不育相关的ｃＳＳＲ引物进行验证。通过转录组测序获得的ＥＳＴ序列中６４０９条存在
ＳＳＲ位点，７３６条序列中有２个及２个以上ＳＳＲ位点；在所有ＳＳＲ位点中三核苷酸、二核苷酸重复序列最多，分别
为４３４０（５６．６６％）和１７６８（２４．３０％）个。三核苷酸重复中，ＣＣＧ／ＣＧＧ（２６．６８％）、ＡＧＧ／ＣＴＴ（２１．２９％）、ＡＧＣ／ＣＴＧ
（１８．４８％）出现的频率较多，二核苷酸重复中，以 ＡＧ／ＣＴ（６０．６３％）和 ＡＣ／ＧＴ（２６．２４％）出现的频率较高；根据开
发的ｃＳＳＲ设计了１３３４４对ｃＳＳＲ引物，选择与雄性不育相关且能设计引物的２１条序列合成４５对ＳＳＲ引物。ＰＣＲ
检测表明，３２对引物（７１％）有扩增产物，其中１１对ｃＳＳＲ引物在亲本间的扩增产物具有多态性，７对引物在可育和
不育性状池间存在差异。本研究对燕麦雄性不育近等基因系ＣＡＭＳ１进行了转录组测序，根据得到的ＥＳＴ序列开
发了１３３４４对ｃＳＳＲ引物，并利用ＣＡＭＳ１×品燕２号Ｆ２ 代群体进行有效性检测，３２对引物有扩增产物，７个标记
可用于燕麦雄性不育材料的分子检测。
关键词：燕麦；ｃＳＳＲ；ＳＳＲ标记　　
犇犲狏犲犾狅狆犿犲狀狋犪狀犱犳狌狀犮狋犻狅狀犪犾狏犲狉犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犮犛犛犚犿犪狉犽犲狉狊犳狅狉狉犲犮犲狊狊犻狏犲犵犲狀犲狋犻犮犿犪犾犲
狊狋犲狉犻犾犻狋狔犻狀狅犪狋狊
ＺＨＡＮＧＬｉＪｕｎ１，ＬＩＵＬｏｎｇＬｏｎｇ１，ＣＨＡＮＧＺｈｉＪｉａｎ２，ＧＵＯＢｉｎ３，ＣＵＩＬｉｎ１
１．犆狉狅狆犌犲狉犿狆犾犪狊犿犚犲狊狅狌狉犮犲狊犚犲狊犲犪狉犮犺犐狀狊狋犻狋狌狋犲，犛犺犪狀狓犻犃犮犪犱犲犿狔狅犳犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犛犮犻犲狀犮犲狊；犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔狅犳犆狉狅狆犌犲狀犲犚犲
狊狅狌狉犮犲狊犪狀犱犌犲狉犿狆犾犪狊犿犈狀犺犪狀犮犲犿犲狀狋狅狀犔狅犲狊狊犘犾犪狋犲犪狌，犕犻狀犻狊狋狉狔狅犳犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犲，犜犪犻狔狌犪狀０３００３１，犆犺犻狀犪；２．犐狀狊狋犻狋狌狋犲狅犳犆狉狅狆
犛犮犻犲狀犮犲，犛犺犪狀狓犻犃犮犪犱犲犿狔狅犳犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犛犮犻犲狀犮犲狊，犜犪犻狔狌犪狀０３００３１，犆犺犻狀犪；３．犙狌犪犾犻狋狔犪狀犱犛犪犳犲狋狔犛狌狆犲狉狏犻狊犻狅狀狅犳犜狅狑狀狊犺犻狆犃犵
狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犛狋犪狋犻狅狀，犛犺狅狌狔犪狀犵０４５４００，犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋：ＴｈｅｏｂｊｅｃｔｉｖｅｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｗａｓｔｏｄｅｖｅｌｏｐｎｅｗｃＳＳＲｍａｒｋｅｒｓｆｒｏｍａｎｏａｔ（犃狀犲狀犪狊犪狋犻狏犪）ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ
ｇｅｎｅｓｍａｌｅｓｔｅｒｉｌｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｄａｔａｂａｓｅ．ＥＳＴｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍａＲＮＡＳｅｑｏｆｏａｔｍａｌｅｓｔｅｒｉｌｅｎｅａｒ
ｉｓｏｇｅｎｉｃｌｉｎｅＣＡＭＳ９ｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｓｅａｒｃｈｆｏｒＳＳＲｓｕｓｉｎｇｓｏｆｔｗａｒｅ．ｃＳＳＲｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ
ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｏｓｅｒｅｌａｔｅｄｔｏｍａｌｅｓｔｅｒｉｌｉｔｙｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｗｉｔｈａＦ２ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｏｆｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄＣＡＭＳ９ａｎｄ
Ｐｉｎｙａｎ２．６４０９ＥＳＴｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｈａｄＳＳＲｌｏｃｉａｎｄ７３６ｏｆｔｈｅｓｅｓｅ
第２４卷　第７期
Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．７
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
２０１５年７月
Ｊｕｌｙ，２０１５
收稿日期：２０１４０５０８；改回日期：２０１５０１０７
基金项目：山西省农科院博士基金项目（ＹＢＳＪＪ２０９），山西省自然基金项目（２０１４０１１０３０１），山西省国际合作项目（２０１４０８１０３２１）和国家燕麦荞
麦产业技术体系（ＣＡＲＳ０８Ａ１）项目资助。
作者简介：张丽君（１９８１），女，河北行唐人，助理研究员，博士。Ｅｍａｉｌ：ｌｉｊｕｎ．ｚｈａｎｇ９１１＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅｍａｉｌ：ｓｘｃｕｉｌｉｎ＠１６３．ｃｏｍ
ｑｕｅｎｃｅｓｈａｄ２ｏｒｍｏｒｅｌｏｃｉ．Ｍｏｓｔｏｆｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｍｏｔｉｆｓｗｅｒｅｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（５６．６６％）ａｎｄｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
（２４．３０％）．Ｆｏｒｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ＣＣＧ／ＣＧＧ（２６．６８％），ＡＧＧ／ＣＴＴ（２１．２９％），ＡＧＣ／ＣＴＧ（１８．４８％），ＡＡＧ／
ＣＴＴ （８．１８％）ａｎｄ ＡＣＣ／ＧＧＴ （８．１１％）ｗｅｒｅｔｈｅ ｍｏｓｔｆｒｅｑｕｅｎｔｒｅｐｅａｔｓ．Ｆｏｒｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ＡＧ／ＣＴ
（６０．６３％）ａｎｄＡＣ／ＧＴ（２６．２４％）ｗｅｒｅｔｈｅｍｏｓｔｆｒｅｑｕｅｎｔ．ＢａｓｅｄｏｎｔｈｅｓｅｃＳＳＲｓ，１３３４４ｐａｉｒｓｏｆｃＳＳＲｐｒｉｍｅｒｓ
ｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄ．４５ｐａｉｒｓｏｆｔｈｅｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｂａｓｅｄｏｎｍａｌｅｓｔｅｒｉｌｅｒｅｌａｔｅｄｃＳＳＲｓ，ａｎｄ３２（７１．１％）
ｏｆｔｈｅｐａｉｒｓｌｅｄｔｏａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｒｏｄｕｃｔｓ．ＵｓｉｎｇｔｈｅＦ２ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ，ｔｈｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｏｆ１１ｐａｉｒｓｂｅｔｗｅｅｎｐａｒｅｎｔｓ
ａｎｄｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｏｆ７ｐａｉｒｓｂｅｔｗｅｅｎｆｅｒｔｉｌｅａｎｄｓｔｅｒｉｌｅｔｒａｉｔｐｏｏｌｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｉｎｔｏｔａｌ，１３３４４ｐａｉｒｓｏｆｃＳＳＲ
ｐｒｉｍｅｒｓｈａｖｅｂｅｅｎｄｅｖｅｌｏｐｅｄｆｒｏｍｔｈｅＲＮＡＳｅｑｄａｔａｂａｓｅ．３２ｐａｉｒｓｗｅｒｅｒｅｌａｔｅｄｔｏｆｅｒｔｉｌｉｔｙａｎｄ７ｃａｎｂｅｕｓｅｄ
ｆｏｒｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｏａｔｍａｌｅｓｔｅｒｉｌｉｔｙ．ＴｈｅｓｅｎｅｗｃＳＳＲｍａｒｋｅｒｓａｒｅｂｅｎｅｆｉｃｉａｌｆｏｒｔｈｅｆｕｒｔｈｅｒｕｓｅｏｆｏａｔ
ｇｅｒｍｐｌａｓｍａｎｄｆｏｒｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆｍａｌｅｓｔｅｒｉｌｉｔｙ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｏａｔ（犃狏犲狀犪狊犪狋犻狏犪）；ｃＳＳＲ；ＳＳＲ
燕麦（犃狏犲狀犪狊犪狋犻狏犪）为禾本科燕麦属（犃狏犲狀犪）单子叶植物，具有降低血清胆固醇、甘油三脂和血糖的功效，是
国际适销的营养和医用保健食品［１３］。雄性不育既是研究植物生殖生物学重要的植物学性状，也是研究作物杂种
优势利用的重要农艺性状，因此在遗传和分子生物学中具有重要地位。目前我国发现了两种燕麦不育类型：皮燕
麦隐性核不育［４］和裸燕麦显性核不育［５］。
燕麦雄性不育材料不仅是宝贵的种质资源，而且对改进育种方法、提高育种效率具有非常重要的作用。但目
前燕麦雄性不育植株的鉴别只能在抽穗后进行。通过对燕麦雄性不育相关分子标记的研究，促使不育植株的鉴
别工作在苗期提前进行，有利于杂交种子的大量获得，对于更为有效地实现燕麦轮回选择育种具有重要的应用前
景。
目前ＳＳＲ（ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔｓ，ＳＳＲ）、ＡＦＬＰ（ａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｓｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＡＦＬＰ）、
ＲＦＬＰ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＲＦＬＰ）、ＲＡＰＤ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＲＡＰＤ）和ＤａｒＴ
（ｄｙｎａｍｉｃａｄｖｅｒｔｉｓｉｎｇｒｅｐｏｒｔｉｎｇｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ＤａｒＴ）等分子标记广泛应用于基因组分析［６］、遗传多样性分析［７］、分子
育种［８］等方面，其中ＳＳＲ分子标记因具有共显性遗传、多态性高、多等位性以及技术简单等优点［９］而应用最广。
随着测序技术的发展，ｃＳＳＲ标记除保留了ＳＳＲ标记的优势外，还具有其他的应用特点：针对性强，若发现某个
ｃＳＳＲ在某一性状连锁的基因或ＥＳＴ序列上，则该ｃＳＳＲ就可能与此性状相关；通用性好，由于ＥＳＴ来自转录区，
其保守性较高，具有较好的通用性，因而在亲缘物种之间校正基因组连锁图谱方面及在比较作图方面均有很高的
利用价值［１０］。现在ｃＳＳＲ标记已在小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）［１１］、大麦（犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲）［１２］、水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻
狏犪）［１３］、高粱（犛狅狉犵犺狌犿狏狌犾犵犪狉犲）［１４］等物种中应用于遗传图谱构建、遗传多样性分析、品种鉴定、基因诊断等多种
方面。
本研究利用ＩｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑＴＭ２０００二代测序技术对皮燕麦隐性核不育植株的近等基因系进行转录组测序，
分析了燕麦基因组中基因转录本所含微卫星重复序列的组成和特征，后基于ＥＳＴ开发ｃＳＳＲ引物，并对其中的
隐性核不育ｃＳＳＲ标记进行验证，发掘可用于苗期鉴别燕麦雄性不育株与可育株的分子标记，为燕麦育性研究以
及育种方法的改进奠定基础。
１　材料与方法
１．１　试验材料
燕麦雄性不育近等基因系ＣＡＭＳ１用于转录组测序；亲本ＣＡＭＳ１和品燕２号，及其Ｆ２、Ｆ２：３群体用于对隐性
核不育ＳＳＲ标记的验证。上述材料均由山西省农业科学院农作物品种资源研究所提供。
１．２　转录组测序文库构建及测序
２０１１年冬天将燕麦雄性不育近等基因系ＣＡＭＳ１在温室种植，室温２０℃左右，相对湿度（６５±２０）％，光照１２
７４１第７期 张丽君　等：燕麦隐性核不育ｃＳＳＲ标记的开发及其验证
ｈ／ｄ，光强４０００ｌｘ。当可育和不育植株在抽穗０～５ｃｍ时，选择不同发育阶段雄蕊混合提取总ＲＮＡ。用带有Ｏｌ
ｉｇｏ（ｄＴ）的磁珠富集ｍＲＮＡ。加入ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ将ｍＲＮＡ打断成短片段，以ｍＲＮＡ为模板，用ｒａｎｄｏｍ
ｈｅｘａｍｅｒｓ合成第１条ｃＤＮＡ链，然后加入缓冲液、ｄＮＴＰｓ、ＲＮａｓｅＨ 和ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＩ合成第２条ｃＤＮＡ
链，在经过ＱｉａＱｕｉｃｋＰＣＲ试剂盒纯化并加ＥＢ缓冲液洗脱之后做末端修复、加Ａ并连接测序接头，然后用琼脂
糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行ＰＣＲ扩增，建好的测序文库用ＩｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑＴＭ２０００进行测序。
１．３　ＳＳＲ的开发
利用ＩｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑＴＭ２０００对供试材料进行转录组测序，将获得的序列应用 ＭＩＳＡ（ＭｉｃｒｏＳＡｔｅｌｉｔｅ）和ＳＳ
Ｒｆｉｎｄｅｒ软件开发ＳＳＲ。将可循环的序列及其互补序列进行分类：如 ＡＡＣ基序代表所有ＡＡＣ、ＡＣＡ、ＣＡＡ、
ＧＴＴ、ＴＧＴ和 ＴＴＧ的ＳＳＲ［１５］。据此，将单核苷酸重复序列归为 Ａ／Ｔ，Ｃ／Ｇ 两类，二核苷酸重复序列归为ＡＣ／
ＧＴ、ＡＧ／ＣＴ、ＡＴ／ＡＴ、ＣＧ／ＣＧ４类，三核苷酸重复序列归为１０类，四核苷酸重复序列归为３３类，五核苷酸重复
序列归为１０２类，六核苷酸重复序列归为３５０类。
１．４　ＳＳＲ－ＥＳＴ的功能分析
从ＮＣＢＩ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）数据库中下载７５９９条雄性不育相关序列（截止
２０１３年６月），与燕麦转录组ＥＳＴ序列进行比对预测其功能。通过Ｂｌａｓｔｘ程序对包含ＳＳＲ位点的ＥＳＴ序列进
行同源性比较，筛选同源蛋白质的标准为：最大评分（ｍａｘｓｃｏｒｅ）≥８０，最大一致性（ｍａｘｉｄｅｎｔｉｔｙ）≥３５％，Ｅｖａｌｕｅ＜
１０－５；通过ＧＯ（ＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙ）注释系统将获得的ＳＳＲ的ＥＳＴ序列进行功能注释和分类。
１．５　ｃＳＳＲ引物设计
基于燕麦ＥＳＴ－ＳＳＲ重复单元前后的序列，应用软件Ｐｒｉｍｅｒ３设计ｃＳＳＲ引物，每条ＳＳＲ产生５对引物。
引物筛选条件：引物不能存在ＳＳＲ；将获得的引物比对到ＥＳＴ序列，引物的５′端允许有３个碱基的错配，３′端允
许有１个碱基的错配；去掉比对到不同ＥＳＴ上的引物，筛选得到唯一匹配的引物；使用ＳＳＲｆｉｎｄｅｒ软件和产物序
列分析来校验ＳＳＲ检验结果是否与ＭＩＳＡ软件分析结果相同。通过评估的ｃＳＳＲ引物由北京六合华大科技有限
公司进行引物合成。
１．６　ｃＳＳＲ引物的筛选
２０１２年夏天取ＣＡＭＳ１×品燕２号Ｆ２ 群体五叶期的嫩绿叶片，以ＣＴＡＢ（ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙａｍｍｏｎｉｕｍ
ｂｒｏｍｉｄｅ，ＣＴＡＢ）法提取基因组ＤＮＡ。结合ＣＡＭＳ１×品燕２号Ｆ２：３群体的表现型，从Ｆ２ 群体中分别选取１０份
纯合可育单株和１０株纯合不可育单株的ＤＮＡ进行混合，建立可育池和不育池。利用亲本和育性池验证和筛选
引物。引物筛选分２个环节进行：前期筛选以获得初步认为与育性相关基因的引物对育性池进行扩增。在前期
引物筛选（即初筛）环节，每次扩增电泳同时检测若干对引物，扩增反应体系为１３μＬ１０×ＰｒｅｍｉｘＴａｑ（ＴａＫａ
Ｒａ），上游和下游引物各１μＬ（１０μｍｏｌ／Ｌ），１μＬＤＮＡ（５０ｎｇ／μＬ）和４μＬ超纯水。扩增程序为：９４℃５ｍｉｎ（１
个循环）；９４℃３０ｓ，５５～６５℃４０ｓ，７２℃３０ｓ（３５个循环），７２℃１０ｍｉｎ（１个循环）。根据扩增结果和已有经验，
在可育池和不育池完全无带的引物都舍弃，认为该引物无效。２０１２年１１－１２月完成４５对ｃＳＳＲ引物的前期筛
选，筛选时使用的退火温度通常为５６℃，少量引物使用６０℃。然后，进一步应用初步认为有效的引物对可育池和
不育池进行扩增，扩增反应体系和程序同前期筛选所应用的，但已根据初筛的扩增情况来适当调整了退火温度。
进一步挑选在可育池和不育池之间存在差异的引物，然后利用亲本和育性池进一步验证和筛选引物。试验重复
３次，扩增产物分别用１．０％的琼脂糖电泳和６％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，每样品点样２μＬ，电泳时间９０
ｍｉｎ。胶板在０．１５％ ＡｇＮＯ３ 溶液中银染１５ｍｉｎ，取出后蒸馏水速漂５ｓ，放入含有３％ＮａＯＨ和０．５％甲醛的溶
液中显色１０ｍｉｎ，视条带清晰后转入固定液终止反应，蒸馏水清洗２ｍｉｎ后晾干、扫描。
２　结果与分析
２．１　转录组得到的ＥＳＴ序列长度分布
采用ＩｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑＴＭ２０００转录组测序组装获得１００１６９条ｃＤＮＡ序列、总长为６６５８０８３２ｎｔ，其中３００ｎｔ
的ＥＳＴ序列共３０９７０条（３０．９２％），４００ｎｔ的ＥＳＴ序列共１８４８０条（１８．４５％），５００ｎｔ的ＥＳＴ序列共１０２６７条
８４１ 草　业　学　报 第２４卷
（１０．２５％）（图１）。
图１　犈犛犜序列长度分布
犉犻犵．１　犈犛犜狊犲狇狌犲狀犮犲犾犲狀犵狋犺犱犻狊狋狉犻犫狌狋犻狅狀
　
图２　犮犛犛犚中不同犛犛犚重复基元分布频率
犉犻犵．２　犉狉犲狇狌犲狀犮狔犱犻狊狋狉犻犫狌狋犻狅狀狅犳犮犛犛犚犿狅狋犻犳狊狅犳犃．狊犪狋犻狏犪
　
图３　犛犛犚基元重复次数在燕麦犈犛犜序列中的分布频率
犉犻犵．３　犉狉犲狇狌犲狀犮狔犱犻狊狋狉犻犫狌狋犻狅狀狅犳狋犺犲狀狌犿犫犲狉狅犳
犮犛犛犚狉犲狆犲犪狋狊狅犳犃．狊犪狋犻狏犪
　
２．２　燕麦ＥＳＴ序列中不同类型ＳＳＲ的频率
燕麦ＥＳＴ序列中有６４０９条ＥＳＴ序列包含１～６
核苷酸重复的ＳＳＲ位点，７２７５个ＳＳＲ位点被找到，平
均每９１５２．００４ｎｔ的ＥＳＴ序列（６６５８０８３２／７２７５）出现
一个 ＳＳＲ，且每 １００ 条 ＥＳＴ 中出现 ７．２６（７２７５／
１００１６９）个ＳＳＲ，说明燕麦ＥＳＴ中ＳＳＲ数量较为丰
富。７３６个序列含２个及２个以上ＳＳＲ位点，５６７３个
（８８．５２％）ＥＳＴ只含有１个ＳＳＲ位点。ｃＳＳＲ位点的
总长度变化在１２～１９７ｎｔ之间，其中１５ｎｔ的最多，占
３５．７４％；１８，１２和２０ｎｔ的分别占１４．２８％，１３．１３％
和７．１６％。单、二、三、四、五、六核苷酸重复基序最
小，长度分别达到１２，１２，１５，２０，２０，２４ｂｐ。在这些
ＳＳＲ位点中，三核苷酸重复的数量最多，共４３４０个
（５６．６６％），其次是二核苷酸（２４．３０％）、单核苷酸
（６．１０％）、四核苷酸（３．９５％）、五核苷酸（３．５３％）及六
核苷酸（２．４６％）（图２）。其中约３４７个（４．７７％）ＳＳＲ
为复合ＳＳＲ。对于重复次数而言，六核苷酸和五核苷
酸重复４次出现频率最高，分别达到８７．７１％ 和
８９．８８％；四核苷酸和三核苷酸基序的ＳＳＲ中，５次重
复频率最高，分别为８５．０２％和４７．０９％（图３）。
２．３　燕麦ＥＳＴ－ＳＳＲ中不同类型基序的分布频率
在单碱基（４４４）重复的ＳＳＲ中，Ａ／Ｔ出现频率最
高（８７．８４％），其次是Ｃ／Ｇ（１２．１６％）；二碱基（１７６８）
重复的ＳＳＲ序列中共搜索到 ＡＣ／ＧＴ、ＡＧ／ＣＴ、ＡＴ／
ＡＴ、ＣＧ／ＣＧ四类ＳＳＲ基序，其中 ＡＧ／ＣＴ出现频率
最高（６０．６３％），其次是ＡＣ／ＧＴ（２６．２４％）和ＡＴ／ＡＴ
（８．２０％）；在三碱基（４３４０）重复的ＳＳＲ序列中出现频
率最 高 的 是 ＣＣＧ／ＣＧＧ（２６．６８％），而 ＡＧＧ／ＣＴＴ
（２１．２９％）、ＡＧＣ／ＣＴＧ（１８．４８％）、ＡＡＧ／ＣＴＴ（８．１８％）
及ＡＣＣ／ＧＧＴ（８．１１％）次之，这５类基序所组成的
ＳＳＲ占三碱基ＳＳＲ总数的８２．７４％，数量最少的三碱
基基数为ＡＡＴ／ＡＴＴ，仅有２９个（图４）。同时在燕麦
的ＥＳＴ中搜索四、五和六碱基重复的ＳＳＲ分别有２７，
６９，１０１种，其中 ＡＡＡＧ／ＣＴＴＴ（１０．４５％）和 ＡＡＧＧ／
ＣＣＴＴ（９．４１％）在四碱基重复ＳＳＲ中（２８７）出现的频率
较高；ＡＧＡＧＧ／ＣＣＴＣＴ（１１．２８％）和 ＡＡＡＡＧ／ＣＴＴＴＴ
（５．４５％）在五碱基重复ＳＳＲ中（２５７）出现频率较高；ＡＣＧＡＧＧ／ＣＣＴＣＧＴ（２．７９％）在六碱基重复ＳＳＲ中（１７９）出
现频率较高。
分析燕麦ＥＳＴ数据库中的ＳＳＲ得出，在燕麦ＥＳＴ中最丰富的微卫星类型是三碱基重复，其次为二碱基重
复，主要的优势重复序列分别是ＧＧＣ、ＧＣＧ以及ＧＡ、ＣＴ类。
９４１第７期 张丽君　等：燕麦隐性核不育ｃＳＳＲ标记的开发及其验证
２．４　ｃＳＳＲ引物筛选和功能推测
图４　二核苷酸和三核苷酸重复中不同重复基序的比例
犉犻犵．４　犘犲狉犮犲狀狋犪犵犲狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋犿狅狋犻犳狊犻狀犱犻狀狌犮犾犲狅狋犻犱犲
（犃）犪狀犱狋狉犻狀狌犮犾犲狅狋犻犱犲（犅）狉犲狆犲犪狋狊
按照引物设计要求设置基本检索条件，共得到燕
麦ｃＳＳＲ引物１３３４４对。以“雄性不育”为检索词在
ＮＣＢＩ数据库中进行搜索，再将结果与转录组基因集
进行同源性比对，最终得到４２４条相关序列。用
ＴＢＬＡＳＴＸ将设计引物的７２７５条燕麦ＥＳＴ序列与上
述４２４条序列进行同源性比对，筛选出９６条燕麦
ＥＳＴ序列，去除含有ＳＳＲ位点但是长度不支持设计
ＳＳＲ引物的ＥＳＴ序列，得到２１条与雄性不育相关的
候选基因序列。
ＢＬＡＳＴ比对发现，２１条燕麦育性候选基因中与
短柄草（犅狉犪犮犺狔狆狅犱犻狌犿犱犻狊狋犪犮犺狔狅狀）同源的有９条，与
大麦同源的有８条。这些基因涉及的通路主要为次生
代谢产物合成（ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏ
ｌｉｔｅｓ）、代谢通路（ｍｅｔａｂｏｌｉｃｐａｔｈｗａｙｓ）、淀粉和蔗糖合
成（ｓｔａｒｃｈａｎｄｓｕｃｒｏｓｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）。
２．５　燕麦中与雄性不育相关基因的ＧＯ注释分析
ＧＯ功能注释分析结果表明，２１条燕麦育性候选
基因分布在分子功能、细胞组分和生物学过程３大类，
以及更详细的２７个子类（图５）。其中生物学过程功
能类型中的细胞过程（ｃｅｌｕｌａｒｐｒｏｃｅｓｓＧＯ：０００９９８７）
和代谢过程（ｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｃｅｓｓＧＯ：０００８１５２）所占比
例最高，分别为６８．２％和６３．６％；细胞组分功能类型中，细胞（ｃｅｌ ＧＯ：０００５６２３）、细胞部分（ｃｅｌｐａｒｔＧＯ：
００４４４６４）涉及的基因最多（ｃｅｌＧＯ：０００５６２３为１５条，ｃｅｌｐａｒｔＧＯ：００４４４６４为１５条）；分子功能类型中的催化活
性（ｃａｔａｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙＧＯ：０００３８２４）和蛋白结合（ｂｉｎｄｉｎｇＧＯ：０００５４８８）所含比例最高，为７７．３％和６３．６％。
图５　２１条候选基因 犌犗功能分类
犉犻犵．５　犌犲狀犲狅狀狋狅犾狅犵狔犳狌狀犮狋犻狅狀犪犾犮犾犪狊狊犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳２１犮犪狀犱犻犱犪狋犲犵犲狀犲狊
　Ⅰ：细胞组分Ｃｅｌｕｌａｒｃｏｍｐｏｎｅｎｔ；Ⅱ：分子功能Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｕｎｃｔｉｏｎ；Ⅲ：生物过程Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｃｅｓｓ．１：细胞Ｃｅｌ；２：细胞部分Ｃｅｌｐａｒｔ；３：外
膜Ｅｎｖｅｌｏｐｅ；４：胞外区Ｅｘｔｒａｃｅｌｕｌａｒｒｅｇｉｏｎ；５：细胞器Ｏｒｇａｎｅｌｅ；６：细胞器部分Ｏｒｇａｎｅｌｅｐａｒｔ；７：合胞体Ｓｙｍｐｌａｓｔ；８：结合Ｂｉｎｄｉｎｇ；９：催化
Ｃａｔａｌｙｔｉｃ；１０：电子载体Ｅｌｅｃｔｒｏｎｃａｒｒｉｅｒ；１１：酶的调节器Ｅｎｚｙｍｅｒｅｇｕｌａｔｏｒ；１２：分子转导 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ；１３：转运Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ；１４：组织
结构的形成Ａｎａｔｏｍｉｃａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ；１５：生物调节Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ；１６：细胞成分的生物合成Ｃｅｌｕｌａｒｃｏｍｐｏｎｅｎｔｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ；１７：细胞
成分的组织Ｃｅｌｕｌａｒｃｏｍｐｏｎｅｎｔｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ；１８：细胞过程Ｃｅｌｕｌａｒｐｒｏｃｅｓｓ；１９：发育过程Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｐｒｏｃｅｓｓ；２０：生长Ｇｒｏｗｔｈ；２１：代谢过程
Ｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｃｅｓｓ；２２：多生物体过程 Ｍｕｌｔｉｏｒｇａｎｉｓｍｐｒｏｃｅｓｓ；２３：多细胞生物过程 Ｍｕｌｔｉｃｅｌｕｌａｒｏｒｇａｎｉｓｍａｌｐｒｏｃｅｓｓ；２４：着色Ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ；２５：
生殖Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ；２６：生殖过程Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｐｒｏｃｅｓｓ；２７：响应刺激Ｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｓｔｉｍｕｌｕｓ．
０５１ 草　业　学　报 第２４卷
２．６　ｃＳＳＲ引物的验证
利用建立的可育池和不育池ＤＮＡ为模板，对２１个雄性不育候选基因对应的４５对ｃＳＳＲ引物进行验证和筛
选。对４５对引物进行初步筛选发现有３２对引物（表１）能在燕麦中成功扩增出条带，初步认为这些引物是有效
引物。利用这些引物对亲本和育性池进行进一步筛选发现其中１１对引物在亲本间具有多态性（表１中编号２～
１２），７对引物在可育和不育性状池间存在差异（表１中编号１～７），引物ＣＬ１１６３＿１３４＿１、ＣＬ２３８３＿２４８＿２和ｎｉ
ｇｅｎｅ２２２０６＿２２６０＿１（表中编号１～３）只在不育池中有条带，可育池中没有条带（图６），可用于苗期鉴别燕麦雄性
不育株与可育株。
表１　３２对犮犛犛犚引物
犜犪犫犾犲１　３２狆犪犻狉狊狅犳犮犛犛犚狆狉犻犿犲狉狊
编号Ｎｕｍｂｅｒ 序列名称Ｓｅｑｕｅｎｃｅｎａｍｅ 上游引物Ｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒ 下游引物Ｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ
１ ＣＬ１１６３＿１３４＿１ ＧＣＴＴＣＣＴＴＧＡＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＴＣ ＣＴＡＴＣＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＣＴＴＡＧＣＡＧ
２ ＣＬ２３８３＿２４８＿２ ＧＴＣＧＡＧＴＣＣＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＣ ＡＧＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＣＡＡＧＴＡＴＧ
３ Ｕｎｉｇｅｎｅ２２２０６＿２２６０＿１ ＡＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡＧ ＧＴＡＧＴＴＧＡＴＧＣＣＧＡＡＣＴＴＴＴＧＣＴ
４ ＣＬ２２８８１＿１７９１＿３ ＧＧＴＣＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＴＣＡＧＡＴＧＣ ＴＡＡＧＧＧＴＡＣＡＧＡＧＧＧＧＡＡＧＡＡＣＴ
５ ＣＬ２３８３＿２４８＿４ ＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＧＡＡＴＣＡＣＡＣＣ ＡＧＴＡＣＡＣＣＧＴＣＧＡＧＡＧＧＴＴＣＡＴ
６ ＣＬ１０８１５＿１００７＿２ ＡＴＣＣＣＧＡＴＧＡＣＧＡＡＴＣＴＧＡＣＴ ＴＡＧＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＡＡＣＡＡＴＧＧＡＴ
７ ＣＬ１９５４＿２０５＿５ ＡＴＧＧＧＧＡＴＡＡＴＡＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴ ＣＣＧＴＧＡＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＧＡＧＡＡＧ
８ ＣＬ１２９１８＿１１７５＿１ ＴＴＧＡＡＣＴＴＧＡＴＧＡＧＣＴＣＣＴＴＧＡＣ ＣＡＴＧＡＡＡＧＧＡＴＡＣＴＴＧＡＡＣＧＡＣＣ
９ ＣＬ１０４２１＿９７６＿３ ＡＡＡＡＧＧＡＣＡＡＡＡＡＣＴＴＧＧＧＡＧＡＣ ＡＴＧＡＣＣＡＣＣＣＣＣＴＧＴＡＡＴＧＴＡＣＴ
１０ ＣＬ２３８３＿２４８＿１ ＧＧＡＡＴＧＣＣＡＴＡＡＣＡＴＧＴＡＣＡＣＡＡ ＣＣＧＡＣＡＧＧＡＴＡＣＡＣＴＧＡＧＣＧ
１１ ＣＬ４２８８＿４１１＿１ ＣＧＣＡＧＴＴＴＡＴＧＴＡＧＡＡＣＣＣＴＣＴＧ ＴＡＴＧＡＴＡＴＴＡＣＧＡＴＧＣＣＡＡＴＣＣＣ
１２ ＣＬ１０４２１＿９７６＿１ ＣＡＧＣＴＣＡＡＧＣＣＴＴＣＴＡＣＡＣＴＧＴＴ ＣＧＣＴＡＣＣＡＣＣＡＡＧＡＧＡＡＴＧＡＧＴＡ
１３ ＣＬ１０８１５＿１００６＿５ ＡＴＣＧＴＣＡＴＣＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＧ ＣＣＴＴＡＣＴＡＣＡＣＣＧＡＣＣＡＧＣＡＣ
１４ ＣＬ１０８１５＿１００７＿１ ＡＴＣＣＣＧＡＴＧＡＣＧＡＡＴＣＴＧＡＣＴ ＧＧＡＡＣＧＣＴＡＡＧＴＡＧＧＡＡＡＣＣＴＧＴ
１５ ＣＬ１２２２７＿１１２２＿１ ＴＧＧＧＡＴＧＧＧＡＴＡＧＡＡＡＣＡＡＧＡＡＴ ＣＴＧＧＡＴＴＧＴＴＣＴＡＧＴＴＴＧＧＧＡＴＧ
１６ ＣＬ１２２２７＿１１２２＿４ ＡＴＡＧＡＡＡＣＡＡＧＡＡＴＴＴＧＣＣＣＡＡＧ ＣＴＧＧＡＴＴＧＴＴＣＴＡＧＴＴＴＧＧＧＡＴＧ
１７ ＣＬ１３６８＿１５６＿１ ＧＣＣＴＴＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣ ＧＧＣＡＧＧＡＣＡＡＣＧＧＣＡＡＴＡＡＴ
１８ ＣＬ１５７９＿１８２＿１ ＣＣＴＧＴＣＣＴＴＣＡＴＧＡＧＧＴＧＧＴ ＡＣＣＧＡＣＴＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＣＧＴＧ
１９ ＣＬ１９５４＿２０５＿１ ＡＴＡＡＴＡＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＡＧＣＧＴＣ ＣＣＧＴＧＡＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＧＡＧＡＡＧ
２０ ＣＬ２２８８１＿１７９１＿１ ＡＴＡＴＣＴＣＡＡＡＡＴＣＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣ ＧＡＴＴＴＴＧＧＴＴＧＣＴＣＴＣＧＴＧＴＡＡＧ
２１ ＣＬ９０４＿１０６＿２ ＡＧＡＡＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＡＴＣＴＧＴ ＣＧＧＡＣＣＴＣＡＴＣＡＧＡＡＧＣＡＴＡＴＴ
２２ Ｕｎｉｇｅｎｅ＿２１４８＿３ ＣＣＣＴＴＧＡＧＧＡＴＧＴＧＣＴＴＧＴＡＧ ＴＧＧＣＣＣＴＣＴＴＣＣＴＡＴＡＴＴＣＣＴＴＡ
２３ Ｕｎｉｇｅｎｅ＿２１４８＿４ ＣＣＣＴＴＧＡＧＧＡＴＧＴＧＣＴＴＧＴＡＧ ＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＡＧＴＧ
２４ Ｕｎｉｇｅｎｅ＿２１６９＿１ ＡＣＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＡＣＡＴＧＧＡＣＣＡＧ ＧＡＴＣＣＣＧＴＣＡＡＣＴＴＣＡＧＧＡＣ
２５ Ｕｎｉｇｅｎｅ＿２１６９＿３ ＴＡＡＴＴＴＴＴＣＴＴＡＣＧＣＧＴＣＧＧＣＴＡ ＡＡＣＴＴＣＡＧＧＡＣＧＣＴＧＧＴＣＡＣ
２６ Ｕｎｉｇｅｎｅ＿２５０６＿１ ＧＣＣＣＡＴＡＴＴＡＡＣＡＣＣＡＣＡＣＴＡＣＣ ＡＴＣＴＣＴＧＣＡＣＴＴＣＴＣＴＣＴＡＴＧＣＧ
２７ Ｕｎｉｇｅｎｅ＿１８９２＿１ ＧＧＣＣＡＡＧＣＴＡＧＴＣＡＧＴＧＡＴＴＧ ＣＡＡＴＧＣＴＡＡＴＴＴＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＡ
２８ Ｕｎｉｇｅｎｅ＿１８９２＿３ ＡＧＣＴＡＧＴＣＡＧＴＧＡＴＴＧＣＧＴＧＧ ＣＡＡＴＧＣＴＡＡＴＴＴＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＡ
２９ Ｕｎｉｇｅｎｅ＿１８９２＿４ ＧＧＣＣＡＡＧＣＴＡＧＴＣＡＧＴＧＡＴＴＧ ＧＧＣＧＴＡＧＴＴＣＣＴＡＧＴＡＧＴＡＣＣＣＧ
３０ Ｕｎｉｇｅｎｅ＿１８９２＿５ ＧＧＣＣＡＡＧＣＴＡＧＴＣＡＧＴＧＡＴＴＧ ＴＡＴＴＣＧＴＧＴＧＴＴＧＣＡＡＴＧＣＴＡＡＴ
３１ Ｕｎｉｇｅｎｅ＿２６１５＿１ ＣＴＣＣＧＡＴＡＡＡＴＣＡＧＣＴＧＡＧＡＡＧＡ ＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＡＡＡＡＧＡＧＣＣＴＡＣＴ
３２ Ｕｎｉｇｅｎｅ＿２６１５＿３ ＣＴＣＣＧＡＴＡＡＡＴＣＡＧＣＴＧＡＧＡＡＧＡ ＧＴＡＧＣＡＧＡＴＴＡＴＴＣＡＡＡＴＣＧＣＧＴ
１５１第７期 张丽君　等：燕麦隐性核不育ｃＳＳＲ标记的开发及其验证
３　讨论
　图６　部分引物在两个性状池间的多态性
　　犉犻犵．６　犘狅犾狔犿狅狉狆犺犻狊犿狊狅犳狊狅犿犲狆狉犻犿犲狉狊犻狀狅犪狋狋狑狅狋狉犪犻狋狊狆狅狅犾狊
　　 　Ｆ：可育材料 Ｆｅｒｔｉｌｅｍａｔｅｒｉａｌｓ；Ｓ：不育材料 Ｓｔｅｒｉｌｅｍａｔｅｒｉａｌｓ；１：
ＣＬ１０４２１＿９７６＿３；２：ＣＬ１１６３＿１３４＿１；３：ＣＬ２２８８１＿１７９１＿３；４：ＣＬ２３８３＿
２４８＿１；５：ＣＬ２３８３＿２４８＿２；６：ＣＬ２３８３＿２４８＿４；７：ＣＬ４２８８＿４１１＿１；８：Ｕｎｉ
ｇｅｎｅ２２２０６＿２２６０＿１；Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ５００．
３．１　皮燕麦隐性核不育相关ＳＳＲ标记的开发
ＥＳＴ序列来源于保守型较高的编码ＤＮＡ，可直
接反映相关基因的功能，在分子生物学研究领域中已
被作为一个重要的使用工具。截止２０１４年４月ＮＣＢＩ
数据库中公布的燕麦ＥＳＴ序列为７９６５７条，与小麦
（１３５８１４０条）、大麦（５３７５４６条）、水稻（１３６９５０６条）等
禾本科作物相比燕麦ＥＳＴ序列数据明显不足。在利
用ＥＳＴ进行燕麦的ｃＳＳＲ标记开发方面，Ｂｒｕｔｉｇａｍ
等［１６］利用测序技术对不同温度条件下生长的燕麦进
行转录组分析，发现９７９２条ＥＳＴ序列，确定了２８００
个与冷诱导相关的基因，其中５１条基因是以前报道过
与冷诱导相关的基因，并证明ＣＢＦ转录因子在调节冷
驯化中有重要作用，并开发４００对与冷诱导相关ｃＳＳＲ
标记。本研究在国内首次利用皮燕麦隐性核不育材料进行ＳＳＲ开发，根据获得的燕麦隐形核不育ＥＳＴ序列，开
发了１３３４４对引物。经过生物信息学同源比对分析和实验验证发现，７对ＳＳＲ引物可作为燕麦可育和不育性状
的评价引物，为燕麦的育性分子标记研究以及育种方法的改进奠定基础。
３．２　ＥＳＴ中简单重复序列（ｃＳＳＲ）的分布特点
ＳＳＲｓ分布于基因间隔区和基因编码区。对大麦、小麦、燕麦和玉米（犣犲犪犿犪狔狊）等禾谷类作物ＥＳＴ中ｃＳＳＲ
的含量、出现频率、重复类型等的研究表明，７％～１０％的ＥＳＴ序列含有ｃＳＳＲ，其中３％可用于ｃＳＳＲ引物设计。
ｃＳＳＲ在大麦、小麦、燕麦、黑麦（犛犲犮犪犾犲犮犲狉犲犪犾犲）、玉米、高粱和水稻中出现的频率分别为７．５，６．２，５．５，７．５，５．５和
３．９ｋｂ，平均６．０ｋｂ就出现一个ｃＳＳＲ。其中三核苷酸重复出现次数最多（５４％～７８％），其次为二核苷酸重复类
型（１７％～４０％），而四核苷酸以上重复类型较少［１７］。
Ｇａｏ等［１８］发现，许多三核苷酸与具有重要功能的基因相关，如ＣＣＧ重复涉及许多基因的功能，如胁迫抗性、
转录调控、信号传导等许多基因的功能。二核苷酸重复单元ＡＧ／ＣＴ在ｍＲＮＡ中根据不同的阅读起始位点可以
分别读为：ＧＡＧ、ＡＧＡ、ＵＣＵ和ＣＵＣ，从而分别翻译为Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｌａ和Ｌｅｕ，而Ａｌａ和Ｌｅｕ在蛋白质中出现的频
率高达８％和１０％［１９］。在本研究中，三核苷酸重复基元的ＳＳＲ类型最多（４３４０个，５６．６６％），其中ＣＣＧ／ＣＧＧ
（２６．６８％）和ＡＧＧ／ＣＴＴ（２１．２９％）出现频率最高，这两类重复类型占了三核苷酸重复类型总量的５０％以上，而
其他重复类型则相对较少。二核苷酸重复中（１７６８个，２４．３０％），含ＡＧ／ＣＴ重复单元的最多，而含ＣＧ／ＣＧ重复
单元的数量最少。这些和大麦［２０］、小麦［２１］、水稻［２２］以及玉米［２３］４种禾本科作物ＥＳＴ序列ＳＳＲ的分布规律相
似［２４］。
Ｔｅｍｎｙｋｈ等［２５］按照ＳＳＲ长度将微卫星分为两大类：长度≥２０ｂｐ的ＳＳＲ和长度＞１２ｂｐ但＜２０ｂｐ的ＳＳＲ。
与第２类ＳＳＲ相比，第１类ＳＳＲ序列长度更长，具有更高的突变率，因而更不稳定。ＳＳＲ一般被认为是由于
ＤＮＡ复制过程中聚合酶瞬时脱离、碱基错配引起的，ｃＳＳＲ的多态性主要是由于重复长度和重复次数造成的［２６］，
菊花（犆犺狉狔狊犪狀狋犺犲犿狌犿）ＥＳＴ序列中ＳＳＲ重复基元的重复次数为１～１３次，最大的重复次数出现在三核苷酸中，
詹少华等［２７］统计了ＳＳＲ基元重复次数变异范围，推测ＳＳＲ基元重复次数变异范围越大，分子标记的多态性就越
高，认为ＳＳＲ重复基元重复次数变异的发生与ＳＳＲ形成有关。本试验对７２７５个微卫星长度进行分析发现，燕麦
ＥＳＴ序列所含的微卫星在长度上存在显著变异，微卫星长度为１２～１９７ｂｐ，平均１９ｂｐ。长度大于２０ｂｐ的有
１０６６条，这些较长的序列变异较大，其多态性较丰富，有利于ｃＳＳＲ标记的开发［２８］。在燕麦ｃＳＳＲ位点中重复最
长的出现在二核苷酸中，为１９７ｂｐ。７对在可育和不育性状池间存在差异的引物涉及６条序列，分布在二核苷酸
ＧＣ、ＴＧ和三核苷酸ＧＣＴ、ＣＡＧ和ＴＣＧ，大小为１２～１８ｂｐ，重复次数为５～８次。在可育和不育性状间存在差
２５１ 草　业　学　报 第２４卷
异分子标记的开发，有利于不育植株的鉴别工作提前开展，获得大量的杂交种子。
４　结论
本研究利用生物信息学软件对燕麦雄蕊发育ＥＳＴ库中的ｃＳＳＲ位点分布特征进行了分析，了解了燕麦育性
材料转录组中基因转录序列所含微卫星重复序列的特征和组成情况，后根据发现的微卫星位点设计了ｃＳＳＲ引
物，在此基础上开发了燕麦育性相关的ＳＳＲ标记，并对这些标记在燕麦育性鉴别上进行了初步验证。通过燕麦
ＳＳＲ标记开发，将其用于燕麦遗传多样性检测，有助于燕麦属植物分子水平的研究，对中国燕麦种质资源多样性
的分析、连锁图谱构建、比较基因组学等研究也具有重要的现实意义。
犚犲犳犲狉犲狀犮犲狊：
［１］　ＷｕＮ，ＨｕＹＧ，ＲｅｎＣＺ，犲狋犪犾．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｓｕｐｅｒａｂｓｏｒｂｅｎｔｐｏｌｙｍｅｒａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｒａｔｅｏｎｓｏｉｌｎｉｔｒｏｇｅｎｏｆｓｐｒｉｎｇｓｏｗｎｎａｋｅｄｏａｔ
ｉｎｔｗｏｉｒｒｉｇａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｓ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１４，２３（２）：３４６３５１．
［２］　ＸｉｅＺＬ，ＺｈａｎｇＴＦ，ＣｈｅｎＸＺ，犲狋犪犾．Ａｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅｎｕｔｒｉｅｎｔｖａｌｕｅｏｆｏａｔａｎｄｉｔｓｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｎｓｏｉｌｆｅｒｔｉｌｉｔｙｏｆｗｉｎｔｅｒｆａｌｏｗ
ｆｉｅｌｄｓ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１３，２２（２）：４７５３．
［３］　ＧｕｏＸ，ＪｉｅＸＬ，ＨｕＨＦ，犲狋犪犾．ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｂａｓａｌＳｅｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒｓｏｎｎｕｔｒｉｔｉｏｎｖａｌｕｅｓｏｆｎａｋｅｄｏａｔｓ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，
２０１３，２２（１）：５３５９．
［４］　ＣｕｉＬ，ＦａｎＹＹ，ＸｕＨＹ，犲狋犪犾．ＤｉｓｃｏｖｅｒｙａｎｄｇｅｎｅｔｉｃｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｍａｌｅｓｔｅｒｉｌｅｏａｔｉｎＣｈｉｎａ．ＡｃｔａＡｇｒｏｎｏｍｉｃａＳｉｎｉｃａ，
１９９９，２５（３）：２９６３０１．
［５］　ＹａｎｇＣ，ＺｈｏｕＨＴ，ＺｈａｎｇＸＪ，犲狋犪犾．Ｎｅｗｈｉｇｈｐｒｏｔｅｉｎｏａｔｖａｒｉｅｔｙ“ＪｉＺｈａｎｇＹａｎＮｏ．１”ｂｒｅｅｄｅｄｗｉｔｈｎａｋｅｄｏａｔｇｅｎｅｔｉｃｍａｌｅ
ｓｔｅｒｉｌｅｇｅｎｅＺＹ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｅｂｅｉＮｏｒｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＥｄｉｔｉｏｎ，２００９，２５（１）：３９４１．
［６］　ＷｕＬ，ＷａｎｇＤ，ＳｕＷＹ，犲狋犪犾．ＤｅｖｅｌｏｐｉｎｇＩｎＤｅｌｍａｒｋｅｒｓｆｒｏｍ犃犲犵犻犾狅狆狊犵犲狀狌狊ｂａｓｅｄｏｎｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｇｅｎｏｍｉｃｓ．ＡｃｔａＡｇｒｏ
ｎｏｍｉｃａＳｉｎｉｃａ，２０１２，３８（７）：１３３４１３３８．
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