全 文 ：书一种有效检测水稻叶鞘低丰度蛋白的方法
王莹１，２，崔为同１，２，杨明峰１，２，沈世华１，２
（１．中国科学院北京植物所，北京１０００９３；２．中国科学院研究生院，北京１０００４９）
摘要：蛋白质组学研究中，低丰度蛋白的富集、检测和鉴定是主要的技术难题。植物组织中核酮糖１，５二磷酸羧
化／加氧酶（ｒｕｂｉｓｃｏ）等高丰度蛋白占细胞全蛋白很大比例，严重影响双向凝胶电泳（２ＤＥ）对低丰度蛋白的检测。
为探索一种适用于叶鞘低丰度蛋白的有效检测方法，本研究采用聚乙二醇（ＰＥＧ）沉淀法以减少ｒｕｂｉｓｃｏ等高丰度
蛋白，富集低丰度蛋白。以 Ｍｇ／ＮＰ４０法为对照，分别使用１５％和２０％ＰＥＧ分离水稻叶鞘可溶性全蛋白，并将对
照和各ＰＥＧ分离组分进行２ＤＥ。２ＤＥ图谱经软件分析结果表明，２０％ＰＥＧ沉淀法适用于灌浆期叶鞘低丰度蛋
白检测。
关键词：叶鞘；低丰度蛋白；ＰＥＧ；双向凝胶电泳
中图分类号：Ｑ９４６３；Ｓ５１１．０１　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１１）０３０１９２０６
　 蛋白质组学研究已成为２１世纪生命科学的重要战略前沿，《科学》杂志将其列为六大研究热点之一［１］。在后
基因组时代蛋白质组学发展迅速，对于探索基因功能日趋重要［２］。作为有力的分子生物学手段，蛋白质组学已被
用来研究水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）等作物生长发育和环境胁迫下蛋白质的表达［３５］。
蛋白质组学研究中的关键步骤之一是样品的制备和分离。尽管色谱、同位素亲和标签（ＩＣＡＴ）和蛋白微列阵
等技术已成功应用于蛋白质组学分析［６，７］，双向凝胶电泳技术（２ＤＥ）仍然是目前分析大量复杂蛋白样品的常用
工具［８］。样品的制备是影响２ＤＥ有效分辨率的关键因素，而蛋白分辨率可影响凝胶图像质量和蛋白分布［９］。
蛋白样品的电泳分离常被一种或几种含量极度丰富的蛋白干扰，这些“超高丰度蛋白”限制低丰度蛋白的分辨
率［１０］，而且数量庞大，可遮盖邻近蛋白点或影响其他蛋白点的电泳迁移［１１，１２］。例如，核酮糖１，５二磷酸羧化／加
氧酶（ｒｕｂｉｃｓｏ）是光合作用中ＣＯ２ 固定的关键酶，也是植物中含量最丰富的蛋白［１３］。叶片中ｒｕｂｉｓｃｏ含量非常丰
富，在电泳共迁移过程中影响或遮盖邻近蛋白点［１４］，进而降低２ＤＥ对低丰度蛋白的检测率。
降低样品体系复杂性，分离富集低丰度蛋白质的各种预分离技术近年来发展较快，并与现有的分离技术相结
合，大幅度提高了低丰度蛋白的检测率［９，１１，１５２１］。但是，多数预分离技术比较昂贵或是耗时较长。ＰＥＧ沉淀法是
其中一种能够简单、快速地富集低丰度蛋白质的预分离方法。Ｓｕｎ等［２２］采用２０％ＰＥＧ预处理水稻蛋白样品，
ｒｕｂｉｓｃｏ大亚基为主的高丰度蛋白被分离到沉淀部分，取得很好的分离效果；Ｘｉ等［２３］采用ＰＥＧ分离法检测拟南
芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）中低丰度蛋白，报道ｒｕｂｉｓｃｏ大亚基可被１６％ＰＥＧ沉淀；Ｌｅｅ等［２４］采用１５％ＰＥＧ分离
法检测了水稻幼苗叶片中响应低温胁迫的低丰度蛋白，取得了良好分离效果。
水稻、玉米（犣犲犪犿犪狔狊）和小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）等禾谷类植物被广泛研究［２５２８］。叶鞘常被作为研究禾谷
类作物库源转化的特殊器官［２９］，已有关于水稻灌浆期叶鞘蛋白质组学分析的报道［３０］。叶鞘也进行一部分光合作
用，因此该器官内也含有大量光合作用相关酶类，尤其是ｒｕｂｉｓｃｏ的存在严重干扰叶鞘低丰度蛋白的检测和分
析，目前尚无提高叶鞘低丰度蛋白鉴定率的报道。本研究分别采用１５％和２０％ＰＥＧ预分离法富集低丰度蛋白，
旨在探索一种叶鞘低丰度蛋白的鉴定方法，为单子叶植物叶鞘蛋白质组学研究提供参考。
１　材料与方法
１．１　材料
将水稻９３１１（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪ｓｓｐ．ｉｎｄｉｃａｃｕｌｔｉｖａｒ９３１１）于正常水稻生长季节种植于北京中国科学院植物研究
１９２－１９７
２０１１年６月
　　　草　业　学　报　　　
　　　ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　
第２０卷　第３期
Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．３
 收稿日期：２０１００４１１；改回日期：２０１００６２１
基金项目：国家高技术研究发展计划项目（Ｎｏ．２００７ＡＡ１０Ｚ１０９）资助。
作者简介：王莹（１９８５），女，山东菏泽人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｙｉｎｇ８５５８＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｓｈｓｈｅｎ＠ｉｂｃａｓ．ａｃ．ｃｎ
所实验温室内，常规水肥管理。自然光照下，生长７０ｄ左右，待水稻生长至灌浆期，剪取水稻剑叶的叶鞘作为实
验材料，液氮速冻后储藏于－８０℃冰箱里。
１．２　蛋白质提取
１．２．１　Ｍｇ／ＮＰ４０法　蛋白质提取方法参照Ｋｉｍ等［３１］的方法，略作修改。将０．５ｇ材料在液氮中研磨成精细
的粉末，然后加入３ｍＬ预冷的 Ｍｇ／ＮＰ４０提取液［０．５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．３），２％（ｖ／ｖ）乙基苯基聚乙二醇
（ＮＰ４０），２０ｍｍｏｌ／Ｌ氯化镁，１ｍｍｏｌ／Ｌ苯甲基磺酰氟（ＰＭＳＦ），２％（ｖ／ｖ）β巯基乙醇］，在冰上充分研磨。４℃
下１２７９１ｒ／ｍｉｎ离心匀浆液１０ｍｉｎ，弃沉淀。上清液中加入４倍体积丙酮，－２０℃沉淀３０ｍｉｎ。相同条件下再
次离心后，弃上清。沉淀用丙酮清洗，４℃下１２７９１ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，清洗３次。将沉淀真空干燥即得到可溶
性全蛋白干粉（ＮＦ）。
１．２．２　Ｍｇ／ＮＰ４０法（ＰＥＧ预分离）　ＰＥＧ沉淀方法参照Ｋｉｍ等［３１］和Ｙａｎｇ等［３２］的方法，并作修改。将０．５ｇ
材料在液氮中研磨成精细的粉末，然后加入３ｍＬ预冷的 Ｍｇ／ＮＰ４０提取液，在冰上研磨充分。４℃下１２７９１
ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃沉淀。上清中加入５０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００至终浓度为１５％或２０％（ｗ／ｖ）。混匀，冰上沉淀
３０ｍｉｎ。４℃下１２７９１ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。离心后上清加入４倍体积丙酮，置于－２０℃沉淀３０ｍｉｎ。４℃下
１２７９１ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取沉淀用丙酮清洗４次后真空干燥得到１５％或２０％ＰＥＧ预分离上清组分（ＡＦ１或
ＢＦ１）。离心后沉淀用丙酮清洗４次，真空干燥得到１５％或２０％ＰＥＧ预分离沉淀组分（ＡＦ２或ＢＦ２）。
１．３　双向凝胶电泳
双向凝胶电泳方法参照Ｙａｎｇ等［３２］的方法，略作修改。将蛋白干粉溶于裂解液：７ｍｏｌ／Ｌ尿素，２ｍｏｌ／Ｌ硫
脲，４％ （ｗ／ｖ）３［３（胆酰氨丙基）二甲氨基］丙磺酸内盐，２％ （ｖ／ｖ）两性电解质（ｐＨ３．５～１０），５％（ｖ／ｖ）β巯基
乙醇，１％ （ｗ／ｖ）二硫苏糖醇。ＮＦ、ＡＦ１、ＡＦ２、ＢＦ１和ＢＦ２蛋白上样量均为６００μｇ。第一向等电聚焦（ＩＥＦ）在长
１３ｃｍ、直径３ｍｍ的玻璃管内进行。注射器灌胶［２％（ｖ／ｖ）ＮＰ４０，３．６％（ｗ／ｖ）丙烯酰胺，８ｍｏｌ／Ｌ尿素，２．５％
（ｖ／ｖ）两性电解质（ｐＨ３．５～１０），２．５％（ｖ／ｖ）两性电解质（ｐＨ５～８）］。胶条聚合完全后，加入溶有蛋白样品的裂
解液，其上覆盖３０μＬ的５０％裂解液。最后加入上槽电极缓冲液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠）及下槽电极缓冲液
（６．６７ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸），等点聚焦２００，４００和８００Ｖ分别进行０．５，１５和１ｈ。聚焦完毕后，从凝胶管中取出胶条，
放入平衡缓冲液［６２．５ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣＬ（ｐＨ６．８），２．５％ （ｗ／ｖ）十二烷基磺酸钠，１０％（ｖ／ｖ）甘油，５％ （ｖ／ｖ）β
巯基乙醇］中。振荡平衡２次，每次１５ｍｉｎ。然后转移胶条至分离胶浓度为１５％，浓缩胶浓度为５％的聚丙烯酰
胺凝胶（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）上端进行第二向垂直电泳。双向电泳后，使用０．１％的考马斯亮蓝Ｒ２５０（ＣＢＢＲ２５０）染
色。
１．４　蛋白质凝胶扫描及图像分析
脱色后的凝胶用ＵＭＡＸ扫描仪扫描。使用ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ凝胶分析软件对凝胶进行分析。
１．５　统计分析
所得数据经ＳＰＳＳ１４．０软件统计分析。
２　结果与分析
２．１　２ＤＥ图谱
为测试ＰＥＧ分离法是否适用于灌浆期水稻叶鞘低丰度蛋白的鉴定，分别将可溶性全蛋白（ＮＦ）、１５％ＰＥＧ
预分离的上清蛋白（ＡＦ１）、１５％ＰＥＧ预分离的沉淀蛋白（ＡＦ２）、２０％ＰＥＧ预分离的上清蛋白（ＢＦ１）和２０％ＰＥＧ
预分离的沉淀蛋白（ＢＦ２）进行２ＤＥ（图１）。
经ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ２ＤＰｌａｔｉｎｕｍ软件分析，并计算各提取方法所检测到的总蛋白种类（表１）。１５％和２０％
ＰＥＧ沉淀法预分离上清分别检测到６４２和８０６个蛋白点，而沉淀分别检测到８８２和６９５个蛋白点。ＴＣＡ／丙酮
法检测到７３３个蛋白点，除去上清与沉淀中重叠的蛋白点，１５％和２０％ＰＥＧ沉淀法检测到的蛋白点分别为１０４２
和１０２３个。１５％和２０％ＰＥＧ沉淀法所得的蛋白点大概相同，均显著（犘＜０．０５）高于ＴＣＡ／丙酮法检测到的蛋
白点数。
３９１第２０卷第３期 草业学报２０１１年
图１　犘犈犌预分离各组分与对照凝胶电泳图谱
犉犻犵．１　犆狅犿狆犪狉犻狊狅狀狅犳２犇犈犵犲犾犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊狆狉狅狋犲犻狀狆犪狋狋犲狉狀狊狅犳犕犵／犖犘４０犿犲狋犺狅犱
狑犻狋犺犘犈犌犳狉犪犮狋犻狅狀犪狋犻狅狀（犃犉１，犃犉２，犅犉１，犅犉２）犪狀犱狀狅犘犈犌犳狉犪犮狋犻狅狀犪狋犻狅狀（犖犉）
表１　不同分离方法的２犇犈图谱上蛋白点数
犜犪犫犾犲１　犖狌犿犫犲狉狅犳狊狆狅狋狊狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋犿犲狋犺狅犱狊
方法 Ｍｅｔｈｏｄｓ 上清Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ 沉淀Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ 重叠Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ 总量Ｔｏｔａｌ
ＴＣＡ／丙酮 ＴＣＡ／Ａｃｅｔｏｎｅ － － － ７３３±２３
１５％ＰＥＧ预分离１５％ＰＥＧｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ６４２±５４ ８８２±２７ ４８２ １０４２±２７
２０％ＰＥＧ预分离２０％ＰＥＧｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ８０６±１３ ６９５±４９ ４７８ １０２３±４１
２．２　ｒｕｂｉｓｃｏ大亚基
ＮＦ的２ＤＥ图谱上ｒｕｂｉｓｃｏ大亚基蛋白点影响或遮盖其周围的蛋白点（图２）。经ＰＥＧ沉淀后ＡＦ１和ＢＦ１
图谱上的ｒｕｂｉｓｃｏ大亚基显著减小（犘＜０．０５）。采用ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ２Ｄ软件分析，以计算ｒｕｂｉｓｃｏ大亚基相对蛋白
点体积在经ＰＥＧ沉淀后的变化（图３）。未经ＰＥＧ预分离的全蛋白图谱上，ｒｕｂｉｓｃｏ大亚基占全部蛋白的１６．９％。
经１５％ＰＥＧ沉淀后，ｒｕｂｉｓｃｏ大亚基下降５５．９％，２０％ＰＥＧ沉淀后下降９２．７％。可见，２０％ＰＥＧ沉淀ｒｕｂｉｓｃｏ的
效果较好。
２．３　低丰度蛋白
与未经ＰＥＧ分离提取的蛋白２ＤＥ图谱相比较，ＰＥＧ预分离后上清蛋白２ＤＥ图谱上检测到的蛋白点的数
目增多。如图４所示，仅在２ＤＥ图谱的Ｂ和Ｃ两个小区域上，ＰＥＧ预分离法的采用使得可检测蛋白点的数目显
著增多。
参照Ｋｒｉｓｈｎａｎ和Ｎａｔａｒａｊａｎ［３３］的方法，将ＰＥＧ预分离上清蛋白２ＤＥ胶上表达上调３倍以上，且在可溶性全
蛋白图谱上很微弱或检测不到的蛋白点，认为是ＰＥＧ预分离法检测到的低丰度蛋白点。使用ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ２Ｄ
４９１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．３
图２　犘犈犌预分离法沉淀狉狌犫犻狊犮狅大亚基效果
犉犻犵．２　犘犈犌犳狉犪犮狋犻狅狀犪狋犻狅狀犱犲犮狉犲犪狊犲犱狉狌犫犻狊犮狅犾犪狉犵犲狊狌犫狌狀犻狋犻狀２犇犈犪狀犪犾狔狊犻狊
Ａ为图１中被标记方框ＡｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈｅｂｏｘｍａｒｋｅｄｉｎＦｉｇ．１
软件，将ＡＦ１和ＢＦ１的２ＤＥ图谱分别与ＮＦ进行比
图３　不同分离方法２犇犈图谱狉狌犫犻狊犮狅大亚基相对丰度百分比
犉犻犵．３　犚犲犾犪狋犻狏犲狊狆狅狋狏狅犾狌犿犲狅犳狉狌犫犻狊犮狅犾犪狉犵犲
狊狌犫狌狀犻狋狌狊犻狀犵犱犻犳犳犲狉犲狀狋犿犲狋犺狅犱狊
较分析。结果显示，ＡＦ１的２ＤＥ胶上可检测到低丰
度蛋白点共有６２个，而ＢＦ１可检测到１１９个。显然，
２０％ＰＥＧ沉淀法可检测到灌浆期水稻叶鞘中更多种
类的低丰度蛋白。
３　讨论
在现今的蛋白质组学研究中，低丰度蛋白备受关
注。细胞或组织中受体分子、信号分子等参与基因表
达调控的蛋白均是低丰度蛋白，而在细胞中拷贝数众
多的高丰度蛋白，如ｒｕｂｉｓｃｏ等一般不参与基因调
控［８］。结合双向凝胶电泳的预分离技术已成为蛋白质
组学中分析低丰度蛋白的有力工具。
图４　犘犈犌分离法增加２犇犈图谱上可检测低丰度蛋白点数目
犉犻犵．４　１５％犪狀犱２０％犘犈犌犳狉犪犮狋犻狅狀犪狋犻狅狀犻狀犮狉犲犪狊犲犱犱犲狋犲犮狋犪犫犾犲狆狉狅狋犲犻狀狊犻狀２犇犈犪狀犪犾狔狊犻狊
Ｂ和Ｃ在图１中分别用方框标出ＢａｎｄＣｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈｅｂｏｘｍａｒｋｅｄｉｎＦｉｇ．１
以ｒｕｂｉｓｃｏ为主的高丰度蛋白的存在严重影响叶片低丰度蛋白的检测和分析，文献报道ＰＥＧ分离法主要是
分离沉淀ｒｕｂｉｓｃｏ大亚基［２２２４］。本研究采用简便ＰＥＧ预分离方法去除水稻叶鞘中的ｒｕｂｉｓｃｏ，探索适用于水稻叶
鞘低丰度蛋白的检测方法。前人报道证明ＰＥＧ可有效分离沉淀ｒｕｂｉｓｃｏ，而不同样品蛋白的预分离所需ＰＥＧ浓
度不同。本研究分别采用１５％和２０％ＰＥＧ，以测定适用于叶鞘低丰度蛋白检测的ＰＥＧ浓度。
５９１第２０卷第３期 草业学报２０１１年
与未经ＰＥＧ预分离的方法相比较，１５％ＰＥＧ沉淀可使ｒｕｂｉｓｃｏ大亚基相对蛋白点体积下降５５．９％，而２０％
ＰＥＧ沉淀法可降低９２．７％。采用２０％ＰＥＧ预分离水稻叶鞘蛋白，可有效去除ｒｕｂｉｓｃｏ大亚基。ＰＥＧ预分离的
目的是富集低丰度蛋白，１５％ＰＥＧ沉淀法可检测到６２个低丰度蛋白，而２０％ＰＥＧ可检测到１１９个。证明２０％
ＰＥＧ对于灌浆期水稻叶鞘高丰度蛋白的减少和低丰度蛋白的富集效果显著。与传统的未经ＰＥＧ预分离的
ＴＣＡ／丙酮法相比，采用１５％和２０％ＰＥＧ分别预分离后经２ＤＥ检测到的全蛋白种类均显著升高（犘＜０．０５），而
２种浓度ＰＥＧ沉淀方法所检测到全蛋白种类差异并不显著。由此看来，２０％ＰＥＧ预分离方法不仅适于低丰度蛋
白的鉴定，也适用于全蛋白表达的鉴定。
４　结论
ＰＥＧ沉淀法是富集低丰度蛋白的方法之一。本研究采用水稻叶鞘为材料，分析了不同浓度ＰＥＧ对ｒｕｂｉｓｃｏ
的分离效果。研究发现，２０％ＰＥＧ分离法非常适合于鉴定水稻叶鞘中的低丰度蛋白，这些工作可为进一步研究
水稻叶鞘差异蛋白质组学提供参考。
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［１３］　ＧｕｔｔｅｒｉｄｇｅＳ，ＧａｔｅｎｂｙＡＡ．Ｒｕｂｉｓｃｏｓｙｓｔｈｅｓｉｓ，ａｓｓｅｍｂｌｙ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌ，１９９５，７：８０９８１９．
［１４］　ＣｏｒｔｈａｌｓＧＬ，ＷａｓｉｎｇｅｒＶＣ，ＨｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒＤＦ，犲狋犪犾．Ｔｈｅｄｙｎａｍｉｃｒａｎｇｅｏｆｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ａｃｈａｌｅｎｇｅｆｏｒｐｒｏｔｅｏｍｉｃ
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ｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｏｆｐｌａｎｔｓ，ｔｈｅｉｒｐｒｅｄｉｃｔｅｄｔｈｒｅｅｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，ａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍ
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６９１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．３
ｔｉｄｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｅｎｈａｎｃｅｓｐｒｏｔｅｉｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｒｏｍｃｏｍｐｌｅｘｍｉｘｔｕｒｅｓｅｖｅｎｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆａｂｕｎ
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ｏｆｒｉｃｅ（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪Ｌ．）ｄｕｒｉｎｇｔｈｅｈｅａｄｉｎｇｐｅｒｉｏｄｉｎｒｅｌａｔｉｏｎｔｏｔｈｅｓｉｎｋｔｏｓｏｕｒｃｅｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＳｃｉｅｎｃｅ，
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犃狀犪狆狆狉狅犪犮犺狋狅犱犲狋犲犮狋狋犺犲犾狅狑犪犫狌狀犱犪狀狋狆狉狅狋犲犻狀狊犻狀狉犻犮犲犾犲犪犳狊犺犲犪狋犺
ＷＡＮＧＹｉｎｇ１，２，ＣＵＩＷｅｉｔｏｎｇ１，２，ＹＡＮＧＭｉｎｇｆｅｎｇ１，２，ＳＨＥＮＳｈｉｈｕａ１，２
（１．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｏｔａｎｙ，ｔｈｅＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００９３，Ｃｈｉｎａ；
２．ＧｒａｄｕａｔｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００４９，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｏｆｌｏｗａｂｕｎｄａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｔｈｅｉｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｔｉｌｒｅｍａｉｎｇｒｅａｔｃｈａｌｅｎｇｅｓｉｎｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ
ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｔｈｅｅｘｉｓｔｅｎｃｅｏｆｈｉｇｈａｂｕｎｄａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｅ．ｇ．ｒｉｂｕｌｏｓｅ１，５ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ／ｏｘｙｇｅｎａｓｅ
（ｒｕｂｉｓｃｏ）ｉｎｐｌａｎｔｓ，ｌｅａｄｓｔｏｔｈｉｓｄｉｌｅｍｍａ．Ｔｈｅｈｉｇｈａｂｕｎｄａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｅｎｇａｇｅａｌａｒｇｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆｔｈｅｗｈｏｌｅ
ｃｅｌｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｔｈｕｓｍａｋｅｔｈｅｌｏｗａｂｕｎｄａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｐｏｏｒｌｙｄｅｔｅｃｔａｂｌｅｂｙ２ＤＥ．Ｉｎｔｈｉｓｒｅｐｏｒｔ，ｗｅｕｓｅｄａｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｆｏｒｔｈｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｗｈｏｌｅｃｅｌｐｒｏｔｅｉｎｓｔｈｒｏｕｇｈｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ（ＰＥＧ）ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，ｔｏｄｅｖｅｌｏｐａｎ
ａｐｐｒｏａｃｈｏｆｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｌｏｗａｂｕｎｄａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｒｉｃｅｌｅａｆｓｈｅａｔｈｅｓ．Ｉｎａｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｅ２ＤＥａｎａｌｙｓｅｓｏｆ
ｐｒｏｔｅｉｎｓａｍｐｌｅｓｐｒｅｐａｒｅｄｕｓｉｎｇｔｈｅＭｇ／ＮＰ４０ｍｅｔｈｏｄｗｉｔｈｏｕｔＰＥＧｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ，ｗｉｔｈｔｈｅ１５％ａｎｄ２０％ＰＥＧ
ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎｐｒｏｔｏｃｏｌ，ａｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｈｉｇｈｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙｗａｓａｃｈｉｅｖｅｄｕｓｉｎｇｔｈｅ２０％ＰＥＧｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｉｎｔｅｒｍｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｐｅｃｉｅｓａｎｄｌｏｗａｂｕｎｄａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｒｉｃｅｌｅａｆｓｈｅａｔｈ；ｌｏｗａｂｕｎｄａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓ；ＰＥＧ；２ＤＥ
７９１第２０卷第３期 草业学报２０１１年