全 文 ：书象草４犆犔基因片段的克隆及犚犖犃犻表达载体构建
霍松，陈慧，朱琼华，解新明
（华南农业大学农学院，广东 广州５１０６４２）
摘要：象草是热带和亚热带地区广泛栽培的多年生资源植物。为探讨华南象草４香豆酸：ＣｏＡ 连接酶（４犆犔）基因
下调表达对木质素合成的影响，本研究设计１对特异引物，ＰＣＲ扩增获得一段长为３７４ｂｐ的干扰片段。通过ＴＯ
ＰＯ克隆，将该片段克隆到载体ｐＣＲ?／ＧＷ／ＴＯＰＯ?，构建了入门克隆载体ｐＥＮＴＲ４犆犔；再经过ＬＲ反应使ｐＥ
ＮＴＲ４犆犔上的干扰片段进入目的载体ｐＣＢ２００４Ｂ上，形成表达载体ｐＣＢ２００４Ｂ４犆犔，最后通过冻融法将其转入到
根癌农杆菌ＥＨＡ１０５中。菌液ＰＣＲ结果表明ＲＮＡｉ质粒已成功转入农杆菌，为进一步利用ＲＮＡｉ技术研究４犆犔
基因的功能奠定了基础。
关键词：象草；Ｇａｔｅｗａｙ技术；４犆犔基因；ＲＮＡｉ；载体构建
中图分类号：Ｓ８１６；Ｓ５４３．９ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１２）０１０２９６０６
象草（犘犲狀狀犻狊犲狋狌犿狆狌狉狆狌狉犲狌犿）系禾本科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）狼尾草属多年生Ｃ４ 草本植物。由于它具有产量高、再
生能力强、营养丰富、适口性良好、抗逆性强等优点，使之成为了热带、亚热带地区重要的资源植物。象草无论是
作为能源植物，还是饲用植物及造纸原料，其品质与低木质素含量密切相关［１４］。
ＲＮＡｉ（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）是指一些与靶基因序列同源的小片段干扰ＲＮＡ，可高效和特异性地使ｍＲＮＡ降
解，从而导致内源靶基因的沉默，最终产生相应功能的表型缺失现象［５，６］。４香豆酸：ＣｏＡ 连接酶（４ｃｏｕｍａｒａｔｅ：
ＣｏＡｌｉｇａｓｅ，４犆犔）是木质素合成中的一个关键酶，其位于苯丙烷类衍生物生物合成的关键点上，以肉桂酸及其羟
基或甲氧基衍生物，如４香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、５羟基阿魏酸、芥子酸等为底物，生成相应的辅酶Ａ 酯。这些
中间产物随后进入苯丙烷类衍生物支路合成途径。其中生成的香豆酰ＣｏＡ、阿魏酰ＣｏＡ及芥子酰ＣｏＡ转化为
肉桂醇衍生物，后通过还原反应生成３种木质素单体［７，８］。目前已从多种植物中分离了编码４犆犔的ｃＤＮＡ序
列［９］。然而，针对禾本科植物的研究，仅有水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）、玉米（犣犲犪犿犪狔狊）和黑麦草（犔狅犾犻狌犿狆犲狉犲狀狀犲）这３
种植物［１０１２］，同时在对４犆犔进行功能分析中，也未曾有人利用到ＲＮＡｉ技术。因此，利用ＲＮＡｉ技术开展对象草
这种热带亚热带地区重要资源植物的４犆犔基因的研究，既具有重要的理论意义，又具有深远的实践意义。
目前有关植物ＲＮＡｉ载体的构建有多种方法［１３］。常规方法构建ＲＮＡｉ载体需要使用限制性内切酶和连接
酶，操作起来程序繁琐，且连接效率较低。本实验采用Ｇａｔｅｗａｙ技术构建入门克隆，利用ＴＯＰＯ异构酶（ｔｏｐｏｉ
ｓｏｍｅｒａｓｅ）特性，能在５ｍｉｎ内快速高效地将ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）产物整合到Ｇａｔｅｗａｙ入门载体上，
彻底简化了ＰＣＲ产物进入Ｇａｔｅｗａｙ入门载体的步骤。表达克隆的构建是利用ＬＲ反应将目的基因从入门载体
重组转入目的载体［１４］。本试验设计１对特异性引物，ＰＣＲ扩增目的片段，利用Ｇａｔｅｗａｙ技术，将目的片段导入
目的载体，形成具有ｉｈｐＲＮＡ结构的高效表达载体，并将其转入农杆菌ＥＨＡ１０５中。为下一阶段通过转基因技
术开展象草遗传改良，培育新型象草种质资源奠定重要的基础。
１ 材料与方法
１．１ 材料
本研究在２０１０年进行。实验所用材料为华南象草（犘．狆狌狉狆狌狉犲狌犿ｃｖ．Ｈｕａｎａｎ），种植于华南农业大学宁西
实验基地和校内跃进南牧草引种园。入门载体ｐＣＲ?／ＧＷ／ＴＯＰＯ? ｖｅｃｔｏｒ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；目的载体
ｐＣＢ２００４Ｂ由中国科技大学向成斌教授实验室惠赠。大肠杆菌（犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻）ＤＨ５α和根癌农杆菌（犃犵狉狅犫犪犮
２９６－３０１
２０１２年２月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第２１卷 第１期
Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．１
收稿日期：２０１０１１１０；改回日期：２０１０１１２９
基金项目：国家自然科学基金项目（３０９７２１３８和３０６７１４８９）资助。
作者简介：霍松（１９８４），男，山东菏泽人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｈｕｏｓｏｎｇ２０１＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｘｉｅｘｍｂｓ＠ｓｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊）ＥＨＡ１０５为华南农业大学农学院草生物技术实验室保存菌种。ＴＲＩｚｏｌＫｉｔ、ｐＣＲ?／ＧＷ／
ＴＯＰＯ? ＴＡＣｌｏｎｉｎｇ? Ｋｉｔ、ＧａｔｅｗａｙＬＲｒｅａｃｔｉｏｎＫｉｔ，ＰｕｒｅｌｉｎｋＴＭ ＱｕｉｃｋＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｉＫｉｔ均购自于Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ公司；ＴａＫａＲａＥｘＴａｑ聚合酶、ＤＮＡ回收试剂盒，购自于ＴａＫａＲａ公司。其他试剂均为国产或进口分析纯试剂。
１．２ 方法
１．２．１ 目的片段的选择及引物设计 根据本课题组从摩特矮象草中分离的４犆犔基因序列（登录号：ＧＵ９９７５９７．１），
与其他４种４犆犔基因［玉米、柳枝稷（犘犪狀犻犮狌犿狏犻狉犵犪狋狌犿）、多年生黑麦草、水稻］做同源性比较，选择同源性较高
的部分，利用Ｐｒｉｍｅｒ３（ｖｅｒｓｉｏｎ０．４．０）设计ＰＣＲ引物４犆犔Ｌ（５′ＡＧＣＣＧＴＴＣＣＡＧＧＴＧＡＡＧＴＣ３′）和４犆犔Ｒ
（５′ＧＧＣＧＡＧＡＴＣＡＴＣＣＴＴＣＴＣＴＧ３′）；同时在ｐＣＢ２００４Ｂ插入目的片段的两端设计２对引物，０４ＢＬ１（５′ＡＴ
ＣＡＣＡＡＡＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＣＡ３′）和 ０４ＢＲ１（５′ＣＴＧＧＣＧＴＡＡＴＡＧＣＧＡＡＧＡＧＧ３′）、０４ＢＬ２（５′ＧＣＧＣＧＣ
ＴＡＴＡＴＴＴＴＧＴＴＴ３′）和０４ＢＲ２（５′ＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣ３′），用于检测目的片段是否正确插入。所
有引物均由Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ有限公司合成。
１．２．２ 目的片段的扩增 采用Ｔｒｉｚｏｌ提取法从象草的幼嫩茎中提取总ＲＮＡ，各步骤均按试剂说明书进行。用
琼脂糖电泳和紫外分光光度计检测其质量，用高质量的ＲＮＡ做下一步实验。按照反转录试剂盒提供的程序合
成ｃＤＮＡ第一链。以该ｃＤＮＡ２０倍稀释液为模板，采用５０μＬ扩增体系：１μＬ反转录ｃＤＮＡ、５μＬ１０×ＰＣＲ
Ｂｕｆｆｅｒ、４μＬ２．５μｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ、０．５μＬ５Ｕ／μＬＴａＫａＲａＥｘＴａｑ?、１０μｍｏｌ／Ｌ４犆犔Ｌ和４犆犔Ｒ各２μＬ，加入经
焦炭酸二乙酯处理过的超纯水至总体积５０μＬ。ＰＣＲ反应条件：９５℃预变性５ｍｉｎ、９５℃变性３０ｓ、５５℃退火３０
ｓ、７２℃延伸９０ｓ，３５个循环后，于７２℃延伸７ｍｉｎ。ＰＣＲ产物用１．０％琼脂糖凝胶进行电泳检测，并用试剂盒回
收目标条带。
１．２．３ Ｇａｔｅｗａｙ入门克隆的构建 在０．５ｍＬｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，加入回收的目的片段２μＬ（约６０ｎｇ），ＳａｌｔＳｏｌｕ
ｔｉｏｎ１μＬ，ＴＯＰＯｖｅｃｔｏｒ１μＬ，用灭菌超纯水补至６μＬ体系，２３℃连接５ｍｉｎ，将目的片段定向克隆到ｐＣＲ?／
ＧＷ／ＴＯＰＯ?载体中，形成入门克隆载体ｐＥＮＴＲ４犆犔。具体操作方法依据ｐＣＲ?／ＧＷ／ＴＯＰＯ?试剂盒说明书进
行。入门载体ｐＥＮＴＲ４犆犔用热激法转化至大肠杆菌 Ｍａｃｈ１ＴＭＴ１?感受态细胞中。将转化细胞均匀涂在含壮
观霉素（１００ｍｇ／Ｌ）ＬＢ（ＬｕｒｉａＢｅｒｔａｎｉ）固体培养基上，３７℃培养５ｈ，挑取单克隆到含有相同壮观霉素的ＬＢ液体
培养基，再振荡培养５ｈ。之后以４犆犔Ｌ和４犆犔Ｒ为引物，菌液为模板，ＰＣＲ验证阳性克隆。最后选取阳性克隆
的菌液，送华大基因公司测序。测序引物为 Ｍ１３通用引物（Ｍ１３Ｌ：５′ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ３′，Ｍ１３Ｒ：
５′ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ３′）。用试剂盒提取入门载体质粒，方法参照试剂盒说明书进行，为表达克隆的
构建做准备。
１．２．４ Ｇａｔｅｗａｙ表达克隆的构建 ＬＲ反应采用１０μＬ体系：在０．５ｍＬ的ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ中加入ｐＥＮＴＲ４犆犔３μＬ
（约１５０ｎｇ），ｐＣＢ２００４Ｂ５μＬ（约２５０ｎｇ），ＬＲＣｌｏｎａｓｅⅡ２μＬ，２５℃反应１５ｈ。加１μＬ蛋白酶Ｋ，３７℃反应１０
ｍｉｎ，以终止反应。片段克隆到ｐＣＢ２００４Ｂ载体中，形成表达克隆载体ｐＣＢ２００４Ｂ４犆犔。取５μＬ反应液热激法转
入大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞，将转化细胞均匀涂在含卡那霉素（５０ｍｇ／Ｌ）ＬＢ琼脂培养基上，３７℃培养１４ｈ，挑
取单克隆到含有相同卡那霉素的ＬＢ液体培养基再振荡培养１４ｈ。以４犆犔Ｌ和４犆犔Ｒ，０４ＢＬ１和０４ＢＲ１，０４Ｂ
Ｌ２和０４ＢＲ２等３对引物作菌液ＰＣＲ，鉴定阳性克隆。最后把阳性克隆菌液，送华大基因公司测序。测序引物
为０４ＢＬ１和０４ＢＲ１，０４ＢＬ２和０４ＢＲ２。
１．２．５ 农杆菌表达克隆的构建 将测序验证正确的阳性克隆载体ｐＣＢ２００４Ｂ４犆犔，用冻融法转至农杆菌
ＥＨＡ１０５，以特异性引物４犆犔Ｌ和４犆犔Ｒ，０４ＢＬ１和０４ＢＲ１，０４ＢＬ２和０４ＢＲ２进行ＰＣＲ扩增验证阳性菌落，
同时以未转化的农杆菌ＥＨＡ１０５做阴性对照。用１．０％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
２ 结果与分析
２．１ 目的片段的获得与验证
用引物４犆犔Ｌ和４犆犔Ｒ，以经反转录所得ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，扩增产物用１．０％的琼脂糖电泳检
测，和预期结果一致，长度大约为３７４ｂｐ（图１）。经进一步测序，得到如下序列：５′ＡＧＣＣＧＴＴＣＣＡＧＧＴＧＡＡＧ
ＴＣＣＧＧＧＴＣＧＴＧＣＧＧＣＡＣＧＧＴＧＧＴＧＣＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＧＣＴＣＡＡＧＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＣＣＧＡＣＡＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣ
７９２第２１卷第１期 草业学报２０１２年
ＣＣＴＣＧＧＣＣＧＧＡＡＣＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＡＧＡＴＣＴＧＣＡＴＣＣＧＣＧＧＧＧＡＧＣＡＧＡＴＣＧＴＧＡＡＡＧＧＧＴＡＣＣＴＧＡＡＣ
ＧＡＣＣＣＣＧＡＧＴＣＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＡＴＣＧＡＣＡＡＧＧＡＣＧＧＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＡＣＣＧＧＧＧＡＣＡＴＴＧＧＴＴＡＣＧ
ＴＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＧＡＴＣＴＴＣＡＴＣＧＴＣＧＡＣＡＧＧＣＴＣＡＡＧＧＡＧＡＴＣＡＴＣＡＡＧＴＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＣＣＡ
ＧＧＴＧＣＣＧＣＣＧＧＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＧＧＣＧＣＴＣＣＴＣＡＴＣＡＣＧＣＡＣＣＣＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＧＡＣＧＣＣＧＣＣＧＴＣＧＴＣＴ
ＣＡＧＡＧＡＡＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＧＣＣ３′。该片段和摩特矮象草４犆犔基因的同源性为９８％，证明为华南象草的４犆犔
基因片段。
２．２ 入门载体的阳性克隆检测
将目的片段经ＴＯＰＯ克隆后，可形成ｐＥＮＴＲ４犆犔入门载体。ｐＥＮＴＲ４犆犔载体转入大肠杆菌后，经摇菌培
养获得菌液，以４犆犔Ｌ和４犆犔Ｒ为引物，对其进行ＰＣＲ扩增，所得片段大小接近３７４ｂｐ（图２），证明目的片段已
成功连入载体。为了更进一步验证克隆的准确性，笔者还以 Ｍ１３通用引物进行测序，测序结果和目的片段比对，
同源性为１００％，证明入门克隆构建成功。
图１ 电泳检测犘犆犚扩增片段
犉犻犵．１ 犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀犳狉犪犵犿犲狀狋狊
Ｍ：ＤＬ２０００ＤＮＡ标记；１，２：长为３７４ｂｐ４犆犔基因片段。
Ｍ：ＤＬ２０００ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１，２：３７４ｂｐｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆ４犆犔ｇｅｎｅ．
图２ 电泳检测犜犗犘犗反应阳性克隆
犉犻犵．２ 犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳狆狅狊犻狋犻狏犲犮犾狅狀犲狊犳狉狅犿犜犗犘犗狉犲犪犮狋犻狅狀犫狔
犪犵犪狉狅狊犲犵犲犾犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊
Ｍ：ＤＬ２０００ＤＮＡ标记；１～６：６个入门克隆的ＰＣＲ产物。
Ｍ：ＤＬ２０００ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１－６：ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆ６ｅｎｔｒｙｃｌｏｎｅｓ．
２．３ 表达载体的阳性克隆检测
经ＬＲ反应，将 ｐＥＮＴＲ４犆犔 入门载体上的４犆犔 目的片段转移到目的载体 ｐＣＢ２００４Ｂ 上，进而形成
ｐＣＢ２００４Ｂ４犆犔表达载体。
为了验证目的片段（ＲＮＡ干涉片段）是否同时正确插入到表达载体的２个位点上，分别以０４ＢＬ１和０４Ｂ
Ｒ１，０４ＢＬ２和０４ＢＲ２这２对引物对表达载体ｐＣＢ２００４Ｂ４犆犔 的克隆产物进行了 ＰＣＲ验证。由表达载体
ｐＣＢ２００４Ｂ４犆犔上引物的位置可知，这２对引物扩增的目的片段长度应分别为５４８和７７２ｂｐ。使用这２对引物
及目的片段上的４犆犔Ｌ和４犆犔Ｒ引物对３个克隆进行了ＰＣＲ验证。电泳结果表明，挑取的３个克隆均为阳性
（图３）。进一步测序，与目的片段比对，同源性为１００％，证明表达克隆构建成功。
２．４ 转化农杆菌及其验证
农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系，被誉为“自然界最小的遗传工程师”，农杆菌介导法具有简便、高效、
低拷贝数等特点［１５］。借助农杆菌的感染可实现外源基因向植物细胞的转移和整合，然后通过细胞和组织培养技
术，得到转基因植物。本研究也试图通过农杆菌将ＲＮＡ干涉片段导入象草中。因此，将ｐＣＢ２００４Ｂ４犆犔表达载
体转入农杆菌是构建ＲＮＡｉ表达载体的关键一步。本实验通过冻融法将ｐＣＢ２００４Ｂ４犆犔转入农杆菌，并以４犆犔
Ｌ和４犆犔Ｒ，０４ＢＬ１和０４ＢＲ１，０４ＢＬ２和０４ＢＲ２等３对引物对已转化的ＥＨＡ１０５菌液进行ＰＣＲ扩增，检测其
是否含有表达载体。电泳结果表明，所挑取的２个克隆，均为阳性克隆（图４，泳道１～６），同时以未转化ＥＨＡ１０５
菌液做阴性对照，无条带出现（图４，泳道７～９）。
８９２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．１
图３ 电泳检测犔犚反应阳性克隆
犉犻犵．３ 犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳狆狅狊犻狋犻狏犲犮犾狅狀犲狊犳狉狅犿犔犚狉犲犪犮狋犻狅狀
犫狔犪犵犪狉狅狊犲犵犲犾犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊
图４ 电泳检测犈犎犃１０５阳性菌液
犉犻犵．４ 犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳狆狅狊犻狋犻狏犲犫犪犮狋犲狉犻犪犾犻狇狌犻犱狅犳犈犎犃１０５
犫狔犪犵犪狉狅狊犲犵犲犾犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊
挑取了３个ＬＲ反应克隆进行验证。１，４，７为４犆犔Ｌ和４犆犔Ｒ的扩
增产物，２，５，８为０４ＢＬ１和０４ＢＲ１的扩增产物，３，６，９为０４ＢＬ２和
０４ＢＲ２的扩增产物；１～３，４～６及７～９分别为３个不同的克隆。
ＴｈｒｅｅｃｌｏｎｅｓｆｒｏｍＬＲｒｅａｃｔｉｏｎｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄｆｏｒＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．１，４
ａｎｄ７ｗｅｒｅｔｈｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｐｒｉｍｅｒｐａｉｒ４犆犔Ｌａｎｄ４犆犔Ｒ；２，５ａｎｄ
８ｗｅｒｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｐｒｉｍｅｒｐａｉｒ０４ＢＬ１ａｎｄ０４ＢＲ１；ａｎｄ３，６，９
ｆｏｒｐｒｉｍｅｒｐａｉｒｏｆ０４ＢＬ２ａｎｄ０４ＢＲ２．Ｎｕｍｂｅｒ１ｔｏ３，４ｔｏ６，ａｎｄ７ｔｏ
９ｗｅｒｅｔｈｒｅｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｌｏｎｅｓ．
挑取了２个转化克隆和１个阴性对照进行验证。１，４，７为４犆犔Ｌ和
４犆犔Ｒ的扩增产物，２，５，８为０４ＢＬ１和０４ＢＲ１的扩增产物，３，６，９为
０４ＢＬ２和０４ＢＲ２的扩增产物；１～３和４～６为转化克隆，７～９为阴性
对照。Ｔｗｏｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｃｌｏｎｅｓａｎｄｏｎｅｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｗｅｒｅｅｘａｍｉｎｅｄ
ｂｙａｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．１，４ａｎｄ７ｗｅｒｅｔｈｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆ
ｐｒｉｍｅｒｐａｉｒ４犆犔Ｌａｎｄ４犆犔Ｒ；２，５ａｎｄ８ｗｅｒｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｐｒｉｍｅｒ
ｐａｉｒ０４ＢＬ１ａｎｄ０４ＢＲ１；ａｎｄ３，６，９ｆｏｒｐｒｉｍｅｒｐａｉｒｏｆ０４ＢＬ２ａｎｄ
０４ＢＲ２．Ｎｕｍｂｅｒ１ｔｏ３，ａｎｄ４ｔｏ６ｗｅｒｅｔｗｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ
ｃｌｏｎｅｓ；７ｔｏ９ｗｅｒｅｔｈｅｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ．
３ 讨论
３．１ ＲＮＡ干涉片段的大小选择
根据ｓｉＲＮＡ作用机制［１６，１７］，ｓｉＲＮＡ途径是由双链ＲＮＡ （ｄｓＲＮＡ）引起的序列特异性基因沉默，ｄｓＲＮＡ被
内切核酸酶（Ｄｉｃｅｒ）切割成２１～２３ｎｔ长的ｓｉＲＮＡ，此ｓｉＲＮＡ指导形成ＲＩＳＣ蛋白复合物降解与之序列互补的
ｍＲＮＡ，从而引发ＲＮＡ沉默。目前，在植物中根据不同的实验情况及不同的ｄｓＲＮＡ来源，主要有２种介导方法
引发ＲＮＡｉ机制：其一是发夹式ＲＮＡ（ｈａｉｒｐｉｎＲＮＡ，ｈｐＲＮＡ）介导的基因沉默，其二是病毒介导的基因沉默（ｖｉ
ｒｕｓｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，ＶＩＧＳ）。由于ＶＩＧＳ不能稳定遗传，在植物基因功能鉴定中的应用有所局限。因此构
建ｈｐＲＮＡ高效克隆和表达载体，并用于植物特定基因功能鉴定及表达调控是ＲＮＡｉ技术的研究热点。ＲＮＡ干
涉载体以含有２个反向重复序列，中间夹１个内含子所形成ｉｈｐＲＮＡ（ｉｎｔｒｏｎｈａｉｒｐｉｎＲＮＡ）结构的沉默效果最
好，平均比例高达９０％以上［１６］。关于发夹结构ＲＮＡｉ高效表达载体发夹结构臂序列的选择，以往研究认为序列
长度具有一定的可塑性，在１００～１２００ｂｐ均能取得良好的效果［１８，１９］。根据以往的经验，片段太短不利于实现高
效率的ＲＮＡ干涉；而太长的片段在构建中容易引起与宿主菌重组，且太长的ｄｓＲＮＡ结构上不太稳定，一般认为
所选片段的大小在３００～６００ｂｐ最佳［１６，１８］。因此，本研究中选用了３７４ｂｐ的长度。选择片段时，尽量选择在本
基因中保守，且与其他基因无同源性的区域作为ＲＮＡｉ片段，和其他基因序列连续相同的碱基数不超过２０，以避
免把其他非目标基因沉默［２０］。笔者认为，如果所研究物种的公开基因序列很少，可以将所用目的片段的序列与
其他亲缘关系较近物种的全基因组进行比较，例如本研究就是通过与水稻的基因组进行比较，从而做出预判的。
华南象草的目的片段和摩特矮象草的同源性为９８％，说明二者在４犆犔基因序列上是存在差异的。从木质素
含量上来看［２１］，拔节后，华南象草无论是茎秆还是叶片的木质素含量均高于摩特矮象草；从４犆犔酶活性来看，在
不同发育阶段，在这２个品种间也存在某种差异［３］。因此，在４犆犔基因片段上存在一定差异也就可以理解了，或
许这正是上述差异的分子基础。
３．２ Ｇａｔｅｗａｙ系统的优势
本研究利用Ｇａｔｅｗａｙ系统将目标基因的ＰＣＲ产物直接插入到载体中，形成高效沉默系统。传统的以酶切
９９２第２１卷第１期 草业学报２０１２年
连接为基础的植物ＲＮＡｉ表达载体构建方法耗时费力、实验周期长；以重组ＰＣＲ技术为基础结合酶切连接的植
物ＲＮＡｉ表达载体构建方法，也由于目的片段的选择和内引物的设计受到的限制因素较多，使其应用受到了一定
影响［１３］。笔者采用的方法省去了酶切和连接的繁琐步骤，并将目的片段的ＰＣＲ产物直接进行ＴＯＰＯ克隆，在完
成目的片段克隆的同时也完成了入门克隆的构建，省去ＢＰ反应过程，而且可以快速的应用到其他带有ａｔｔＲ接头
位点的表达载体。
３．３ 测序的重要性
在入门克隆的构建过程中，有可能连接上和目的片段大小大约一致的ＰＣＲ产物，仅以目的片段的引物做菌
液ＰＣＲ，或者以载体引物做菌液ＰＣＲ验证，均不能保证其ＰＣＲ产物一定为目的片段，可能出现假阳性克隆，在实
验中会偶然出现类似情况，因此有必要进行测序验证。构建表达克隆所用的入门克隆载体，一定要用测序正确的
菌液进行提取，不能随便更换为其他ＰＣＲ验证正确的菌液。在载体上目的片段的两端设计引物，既方便菌液
ＰＣＲ验证，也可以用于测序。植物基因工程中，外源基因表达量不足是得不到理想的转基因植物的主要原因之
一［２２］，ＲＮＡｉ具有高度的特异性，如果有１个碱基与靶序列错配，其干扰效应可能将大大减弱［１８］，因此任何一步
的转接都有必要做测序验证。
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１０３第２１卷第１期 草业学报２０１２年