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外源NO对NaCl胁迫下燕麦幼苗氧化损伤的保护作用



全 文 :书外源犖犗对犖犪犆犾胁迫下燕麦幼苗氧化损伤的保护作用
苏桐1,龙瑞军2,魏小红1,王俊红3,李源1
(1.甘肃农业大学生命科学技术学院,甘肃 兰州730070;2.兰州大学草地农业科学技术学院 甘肃草原生态研究所,
甘肃 兰州730020;3.甘肃林业职业技术学院信息工程系,甘肃 天水741020)
摘要:用不同浓度的外源一氧化氮(NO)供体SNP处理100mmol/LNaCl胁迫下一年生燕麦草幼苗,研究了外源
NO对NaCl胁迫下燕麦幼苗氧化损伤的影响。结果表明,外源NO可缓解 NaCl胁迫造成的燕麦幼苗膜质过氧化
产物丙二醛(MDA)含量的升高,促进脯氨酸(Pro)积累,提高超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化
物酶(POD)活性,并能缓解叶绿素含量的降解,提高可溶性糖的含量。而且NO的这种作用存在明显的剂量效应,
其中以0.2mmol/LSNP处理效果最为显著。
关键词:一氧化氮;NaCl胁迫;燕麦幼苗;保护酶;氧化损伤
中图分类号:S512.6;Q945.78  文献标识码:A  文章编号:10045759(2008)05004806
  燕麦(犃狏犲狀犪狊狋犪犻狏犪)是禾本科燕麦属一年生草本作物,具有较高的营养价值,是谷类食品中最好的全价营养
食品。燕麦虽具有一定的耐盐碱能力,盐碱胁迫同样会对燕麦叶绿体超微结构、护酶活性的改变以及膜质过氧化
等造成不同程度的伤害。而SOD、CAT和POD是植物细胞内清除活性氧的重要保护酶,在盐碱胁迫强度和胁
迫时间不超过植物活性氧调控限度时,保护酶可诱导植物避免活性氧自由基对植物的伤害[1];脯氨酸为细胞渗透
调节物质,植物体内脯氨酸的含量在一定程度上反映了植物的抗逆性,其含量的多少与植物抗性呈正相关[2];
MDA是膜脂过氧化产物,随着胁迫程度的加剧 MDA含量升高,其含量的高低常作为膜脂过氧化程度的指标。
叶绿素是植物进行光合作用的部位,也是细胞中对盐敏感的细胞器[3]。目前对燕麦的研究主要集中在燕麦的适
应性栽培、育种以及营养特性和产品开发等方面,对于施加外源的信号分子来进一步缓解盐碱的伤害鲜有报道。
NO是广泛分布于生物体的一类气体生物活性分子,属于活性氮(reactivenitrogenspecies,RNS)范畴。其
作为重要的信号分子,在植物生长发育及其对逆境的响应等方面起着重要的调节作用,能够使非生物胁迫条件下
的植物生长发育免受活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)的伤害,且其效应与植物细胞的生理条件及NO处
理浓度有关[4,5]。而在植物中活性氧的主要类型有超氧自由基(O2-)、羟自由基(OH)、过氧化氢(H2O2)、脂质过
氧基(ROO)[6~8]。有研究表明,外源NO预处理对小麦(犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿)渗透胁迫造成的膜脂过氧化有明显
的缓解作用[9],提高小麦叶片中抗氧化酶的活性,清除自由基,从而缓解水分胁迫造成的细胞膜脂过氧化损
伤[10];并且低浓度NO可缓解盐胁迫下水稻(犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪)叶绿素的降解、维持光系统II的高活性[11]。因此,研
究盐胁迫下NO与植物耐盐性的关系具有重要意义。为此,本研究以100mmol/LNaCl作为盐胁迫条件,喷施
不同浓度的外源NO研究了燕麦幼苗主要几种保护酶活性、脯氨酸积累和膜质过氧化的变化,以及盐胁迫对燕麦
叶片叶绿体含量的影响,探讨NO缓解NaCl胁迫的生理机理,以期为改善土壤次生盐渍化及进一步提高燕麦的
耐盐碱性提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为“白燕5号”品种。挑选大小一致、饱满的燕麦籽粒用0.1%的氯化汞消毒3min,再用蒸馏水冲
洗2~3次,将种子均匀播撒于预先灭菌处理的土壤花盆中,置于昼夜温度(25±5)/(12±5)℃下培育生长,自然
48-53
10/2008
   草 业 学 报   
   ACTAPRATACULTURAESINICA   
第17卷 第5期
Vol.17,No.5
 收稿日期:20071018;改回日期:20080201
基金项目:甘肃省教育厅基金(070214)和教育部高校优秀青年教师教学科研奖励基金(031074)资助。
作者简介:苏桐(1980),女,甘肃靖远人,在读硕士。Email:sutony2008@yahoo.com.cn
通讯作者。Email:weixh@gsau.edu.cn
光照。以硝普纳(sodiumnitropresside,SNP)为NO供体,100mmol/LNaCl提供盐害胁迫。待生长至三叶一
心时进行SNP处理。3个SNP处理浓度分别为0.2,0.5和1.0mmol/L,各浓度处理量为50mL,采用喷雾器喷
施于叶面,每隔1d喷施1次,连续喷施3次。3d后用100mmol/LNaCl进行胁迫处理,对照浇蒸馏水,每天处
理1次,共处理3d。
试验设5种处理:A,对照组为蒸馏水;B,100mmol/LNaCl;C,0.1mmol/LSNP+100mmol/LNaCl;D,
0.5mmol/LSNP+100mmol/LNaCl;E,1.0mmol/LSNP+100mmol/LNaCl,每个处理3次重复。于盐胁迫
前(0d),盐胁迫期间(1,2和3d)分别取生长一致的各处理组燕麦幼苗研究相关生理生化指标。
1.2 试验方法
1.2.1 酶液的提取 取0.5g燕麦叶片,加入5mL0.05mol/L(pH值为7)的磷酸缓冲液和少许石英砂在冰浴
下研磨至匀浆,4℃下12000r/min离心20min,上清液为酶液,4℃保存备用[12]。
1.2.2 SOD活性测定 参照Chander[12]的方法进行,取4支管,2支为对照,2支为测定,给其中抑制对照管罩
上黑色纸套,与其他各管同时置于一定光照和温度条件下反应。以不照光的对照作为空白管,分别测定其他各管
对氮蓝四唑的光抑制作用,于560nm处测定光密度,单位为:U/gFW。
1.2.3 POD活性的测定 采用愈创木酚法[13],POD活性以每分钟内A470值减少0.01为1个过氧化物酶活力
单位(U),酶活性以U/gFW表示。
1.2.4 CAT活性的测定 以每分钟内A240减少0.1的酶量为1个酶活性单位(U)计算酶活性。取上述酶液
0.2mL,加入1.5mL磷酸缓冲液和1.0mL蒸馏水,采用Dhindsa等[14]方法稍有改进。
1.2.5 MDA含量的测定 采用硫代巴比妥酸法[15],取材料0.5g加入5mL三氯乙酸(TCA)研磨至匀浆,
4000r/min离心10min,吸取上清液2mL加入2mL0.6%硫待巴比妥酸(TBA),将混合物于沸水浴上反应15
min,迅速冷却后再离心,取上清液测定OD450、OD532、OD600,根据公式计算含量。
1.2.6 脯氨酸含量的测定 采用茚三酮显色法。称取不同处理的样品叶片各0.5g进行测定,以甲苯为空白对
照,在分光光度计上520nm波长处测其吸光度值。
1.2.7 叶绿素含量的测定 参照邹琦的《植物生理学试验指导》[16]。取新鲜燕麦叶片0.2g,加入2~3mL96%
乙醇研磨成匀浆,再加乙醇10mL,继续研磨至组织变白,最后过滤到25mL棕色容量瓶中。以96%乙醇为空
白,分别在665,649,470nm下测定消光度。
1.2.8 可溶性糖的测定 采用蒽酮比色法。取新鲜样品叶片0.2g剪碎混匀后进行测定,计算可溶性糖的含
量[15]。
1.3 统计分析
数据采用SPSS13.0软件中一般线性模型(GLM)进行单因素方差分析,进行Duncan多重比较分析差异显
著。
2 结果与分析
2.1 不同浓度外源NO对NaCl胁迫下燕麦幼苗叶片抗氧化系统的影响
在持续3d的NaCl胁迫过程中,SNP对燕麦幼苗SOD、CAT和POD活性具有显著的影响(图1)。盐胁迫
前(0d)SNP处理组SOD活性高于对照(CK),盐胁迫第1天各处理组SOD活性均有所上升,并达到最大值,其
中100mmol/LNaCl单独处理其SOD活性极显著高于SNP处理组和对照(犘<0.01)。随胁迫时间的延长,
NaCl单独处理SOD活性迅速下降。胁迫第3天SNP处理组燕麦幼苗SOD活性均显著高于NaCl单独处理(犘
<0.05),0.2,0.5和1.0mmol/LSNP与单独盐胁迫相比,SOD活性分别提高了54.93%,34.37%和20.52%,
其中0.2mmol/LSNP处理效果最为显著(图1A)。
POD活性呈先升高后下降的趋势(图1B),NaCl胁迫第2天SNP各处理组POD活性达到最大值,与CK相
比,0.2,0.5和1.0mmol/LSNP喷施燕麦叶片后,其POD活性分别提高了86.42%,71.26%和68.48%,极显
著高于对照(犘<0.01)。单盐胁迫POD活性在盐胁迫第1天达到最大值,随着胁迫时间延长,POD活性下降,盐
胁迫第3天降至最低,极显著低于对照与SNP处理组(犘<0.01)。
94第17卷第5期 草业学报2008年
图1 外源犖犗对盐胁迫下燕麦幼苗犛犗犇、犆犃犜、犘犗犇酶活性影响
犉犻犵.1 犈犳犳犲犮狋狅犳犲狓狅犵犲狀狅狌狊狀犻狋狉犻犮狅狓犻犱犲狅狀犛犗犇,犆犃犜犪狀犱犘犗犇犪犮狋犻狏犻狋狔犻狀狋犺犲狅犪狋狊犲犲犱犾犻狀犵犾犲犪狏犲狊狌狀犱犲狉狊犪犾狋狊狋狉犲狊狊
外源SNP处理可延缓盐胁迫下CAT活性下降程度(图1C)。NaCl胁迫前(0d)SNP处理组CAT活性极显
著高于100mmol/LNaCl单独处理(犘<0.01)。盐胁迫期间,各处理CAT活性下降,单盐处理(100mmol/L
NaCl)在0~1d下降程度较SNP处理组快。盐胁迫第3天各处理CAT活性均降至最低点,0.2,0.5和1.0
mmol/LSNP与CK相比,分别下降了22.89%,29.44%和38.24%,单盐胁迫则下降了65.84%。
2.2 不同浓度外源NO对NaCl胁迫下燕麦幼苗叶片 MDA含量的影响
丙二醛是直接反映膜脂过氧化的指标之一。NaCl胁迫前(0d)SNP处理的燕麦幼苗 MDA活性高于CK,这
可能是植物自身的一种适应性反应。随着胁迫时间的延长,MDA含量开始上升,胁迫第2天各处理 MDA含量
达到最大值,但与单独盐胁迫相比,不同浓度的SNP处理后均能降低盐胁迫下 MDA的含量(图2A),其中0.2
mmol/LSNP处理的效果最好。盐胁迫第3天与第2天相比,各处理 MDA的含量有所下降,但单盐处理的燕麦
幼苗 MDA含量在盐胁迫期间始终高于SNP处理。
2.3 不同浓度外源NO对NaCl胁迫下燕麦幼苗叶片脯氨酸含量的影响
脯氨酸是植物重要的渗透调节和抗氧化物质,盐胁迫使脯氨酸含量积累。NaCl胁迫前(0d)SNP处理组脯
氨酸含量高于CK。随着胁迫时间的延长,土壤中盐分含量的增加,燕麦幼苗叶片内脯氨酸逐渐升高(图2B)。盐
胁迫第3天各处理脯氨酸含量达到最大值,0.2,0.5和1.0mmol/LSNP与对照相比,分别提高了116.69%,
99.4%和78.72%;单盐胁迫脯氨酸含量提高了67.03%,其中以0.2mmol/LSNP处理效果最显著(犘<0.05)。
可见SNP处理可以显著地促进NaCl胁迫下脯氨酸含量的积累。
2.4 不同浓度外源NO对NaCl胁迫下燕麦幼苗叶片叶绿素和可溶性糖含量的影响
随着盐胁迫时间的延长,各处理组叶绿素含量呈下降趋势,SNP处理组叶绿素含量较单盐胁迫下降缓慢(图
3A)。盐胁迫前(0d)SNP处理的燕麦幼苗叶绿素含量较CK升高,其中以0.2mmol/LSNP处理效果最显著(犘
<0.05)。盐胁迫期间,对照幼苗中叶绿素含量逐渐增加,而其他各处理叶绿素含量下降,以单盐胁迫苗下降最显
著,且单盐处理第2天叶绿素含量迅速下降,与第1天相比下降了21.00%。盐胁迫第3天0.2,0.5和1.0
mmol/LSNP与对照相比,分别下降了5.06%,12.68%和16.95%,单盐胁迫苗则下降了36.28%。说明不同浓
度SNP处理均能缓解NaCl胁迫造成的燕麦幼苗叶绿素含量的下降。
05 ACTAPRATACULTURAESINICA(Vol.17,No.5) 10/2008
图2 外源犖犗对盐胁迫下番茄幼苗 犕犇犃和含脯氨酸量的影响
犉犻犵.2 犈犳犳犲犮狋狅犳犲狓狅犵犲狀狅狌狊狀犻狋狉犻犮狅狓犻犱犲狅狀犕犇犃犪狀犱狆狉狅犾犻狀犲犮狅狀狋犲狀狋犻狀狋犺犲狅犪狋狊犲犲犱犾犻狀犵犾犲犪狏犲狊狌狀犱犲狉狊犪犾狋狊狋狉犲狊狊
图3 外源犖犗对盐胁迫下燕麦幼苗叶绿素和可溶性糖含量的影响
犉犻犵.3 犈犳犳犲犮狋狅犳犲狓狅犵犲狀狅狌狊狀犻狋狉犻犮狅狓犻犱犲狅狀犮狅狀狋犲狀狋狅犳犮犺犾狅狉狅狆犺狔犐犐犪狀犱狊狅犾狌犪犫犾犲狊狌犵犪狉犻狀狋犺犲狅犪狋狊犲犲犱犾犻狀犵犾犲犪狏犲狊狌狀犱犲狉狊犪犾狋狊狋狉犲狊狊
可溶性糖也是植物重要的渗透调节物质。盐胁迫前,不同浓度SNP处理组与CK相比,可溶性糖含量增加
(图3B)。盐胁迫第3天,0.2,0.5和1.0mmol/LSNP,与对照相比分别提高了80.2%,72.92%和53.63%,单盐
胁迫与CK相比提高了47.32%。说明外源 NO可以提高NaCl胁迫下燕麦幼苗的渗透保护能力。
3 讨论
当植物受到盐胁迫时,体内会产生大量的活性氧,而超氧阴离子是活性氧中最丰富的一种[17],活性氧若不能
及时被清除,就会导致氧化损伤及其损伤的转移。体内能清除活性氧的酶系和抗氧化物质主要有SOD、POD和
CAT等,它们协同抵抗盐分诱导的氧化损伤。本研究结果表明,外源NO可以提高NaCl胁迫下燕麦幼苗SOD、
CAT和POD的活性,进一步降低因NaCl胁迫而产生的活性氧,从而对燕麦幼苗起到保护作用。然而盐胁迫对
这3种保护酶的诱导效果并不一致,这可能与植物在盐胁迫过程中SOD、POD和CAT在植物膜脂过氧化过程
所起的不同作用有关,也可能与NO在信号传导过程中不同的酶所在的位置有关。而且0.2mmol/LSNP处理
显著高于对照组(图1),说明这种保护作用存在明显的剂量效应[18]。NaCl胁迫后,SOD、POD和CAT等清除和
分解H2O2 的酶活性增加缓慢,增加幅度小,下降迅速(CAT),或增加后又会迅速下降。而NO对SOD、POD和
CAT活性均有明显的促进作用,进而提高了清除自由基防御系统的防御能力,缓解了NaCl胁迫对燕麦幼苗的氧
化损伤作用,使细胞膜受活性氧的伤害减轻,MDA含量下降。NO提高了各种保护酶活性主要在于NO对含铁
的相关酶类有很高的亲和性(如CAT、抗坏血酸过氧化物酶和细胞色素C氧化酶)[19]。保护酶活性提高,降低了
H2O2 等ROS的大量生成,使细胞的渗透能力和耐盐能力的提高成为可能[20]。
15第17卷第5期 草业学报2008年
本研究结果发现,外源NO处理组与单独盐胁迫相比,显著降低了盐胁迫下燕麦幼苗 MDA含量,说明外源
NO对细胞膜具有良好的保护作用,可减轻盐胁迫对其造成的伤害。
逆境条件下,植物体内脯氨酸的积累在一定程度上反应了植物的抗逆性。外源NO能促进低温胁迫下黑麦
草脯氨酸含量的积累,提高抗冷性[21];也可以提高小麦叶片中脯氨酸含量,增强耐盐性[22]。NO还能缓解盐胁迫
对番茄(犔狔犮狅狆犲狉狊犻犮狅狀犲狊犮狌犾犲狀狋狌犿)幼苗POD同功酶造成的损伤,减小盐胁迫对小分子量POD同功酶的伤害[23]。
本研究结果还表明,外源NO能促进盐胁迫下燕麦草脯氨酸含量的积累,维持细胞的结构和调节渗透压。盐胁迫
过程中,与单盐胁迫相比,NO处理使燕麦幼苗的脯氨酸含量处于较高的水平,这也是缓解盐胁迫下燕麦幼苗伤
害的另一重要原因。
在本试验中,外源NO显著提高了盐胁迫下叶绿素含量,降低电解质渗漏,从而缓解了盐胁迫造成的氧化损
伤,一定程度上保护了叶绿体结构的完整,这可能也与除叶绿素之外的其他酶类有关。叶绿素是植物进行光合作
用的主要部位,也是细胞器中对盐敏感的细胞器。叶绿素酶是叶绿素降解代谢中唯一肯定起作用的酶,能增强叶
绿素酶活性,加速叶绿素分解。盐胁迫下,植物细胞叶绿体和线粒体电子传递中泄露的电子增加,活性氧大量产
生。蒋明义等[24]研究表明渗透胁迫下叶绿素的降解主要由活性氧的氧化损伤引起,而质膜电解质外渗的增加与
质脂过氧化速率呈显著正相关。
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犾犲犪狏犲狊狌狀犱犲狉犖犪犆犾狊狋狉犲狊狊
SUTong1,LONGRuijun2,WEIXiaohong1,WANGJunhong3,LIYuan1
(1.SchoolofLifeScience&TechnologyofGansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China;
2.ColegeofPastoralAgricultureScienceandTechnology,LanzhouUniversity;Gansu
GrasslandEcologicalResearchInstitute,Lanzhou730020,China;3.Gansu
ForestryTechnologicalColege,Tianshui741025,China)
犃犫狊狋狉犪犮狋:Theeffectsofanexogenousnitricoxidedonor(sodiumnitroprusside,SNP)atconcentrationsof0.2,
0.5and1.0mmol/Lonoxidativedamageinoatseedlingleavesunder100mmol/LNaClstresswerestudied.
TreatmentofNaClstresswithdifferentconcentrationsofSNPsignificantlyincreasedtheactivitiesofantioxi
dantenzymes(includingSOD,CATandPOD)andthecontentsofprolineandchlorophyIIinleaves,butsig
nificantlydecreasedMDAcontentsofleavescomparedwithsaltstresscontroledseedlingleaves.Moreoverthe
effectsofSNPforaleviationofNaClstressweredosedependant.TheoptimumSNPconcentrationforeleva
tingtheleafantioxidationabilityofoatseedlingswas0.2mmol/Landwasmainlyachievedbyenhancingan
tioxidativecapabilityinleavesofoatseedlings
犓犲狔狑狅狉犱狊:oatseedling;protectiveenzymes;nitricoxide;NaClstress;oxidativedamag
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《中国种业》征订启事
《中国种业》是由农业部主管,中国农业科学院作物科学研究所和中国种子协会共同主办的全国性、专业性、
技术性种业科技期刊。该刊系全国中文核心期刊、全国优秀农业期刊。
刊物目标定位:以行业导刊的面目出现,在新的一年内力争在本行业扩大发行量,并做到权威性、真实性和及
时性。覆盖行业范围:大田作物、蔬菜、花卉、林木、果树、草坪、牧草、特种种植、种子机械等,信息量大,技术实用。
读者对象:各级种子管理、经营企业的领导和技术人员,各级农业科研、推广部门人员,大中专农业院校师生,
农村专业户和广大农业生产经营者。
月刊,大16开本,每期5.80元,全年69.60元。国内统一刊号:CN11-4413/S,国际标准刊号:ISSN1671
-895X,全国各地邮局均可订阅,亦可直接汇款至编辑部订阅,挂号需每期另加3元。邮发代号:82-132
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35第17卷第5期 草业学报2008年