全 文 ：书紫花苜蓿犕狊犣犐犘基因超表达载体的
构建及转基因苜蓿检测
李燕１，孙彦２，杨青川１，康俊梅１，张铁军１，房锋３
（１．中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京１００１９３；２．中国农业大学动物科技学院，北京１００１９１；
３．中国农业科学院植物保护研究所，北京１００１９３）
摘要：根据已经克隆得到的犕狊犣犐犘基因（ＧｅｎＢａｎｋ序列号：ＨＱ９１１７７８），扩增编码区ｃＤＮＡ，构建植物超表达载体
ＰＢＩＭｓＺＩＰ。酶切鉴定表明，目的基因已经正确的插入到载体中，超表达载体构建成功。采用ＣａＣｌ２ 冻融法将其转
入农杆菌菌株中，然后采用农杆菌介导的方法，转化紫花苜蓿，共得到１１株抗性苗，对其中的４株进行卡那霉素基
因ＰＣＲ检测，均得到了目的条带。同时对这４株抗性苗进行目的基因的ＲＴＰＣＲ检测，均得到了目的条带。说明
犕狊犣犐犘基因已经成功在苜蓿中超表达。为了进一步验证该基因的功能，分别用２００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ和２５μｍｏｌ／Ｌ
ＰＥＧ６０００处理转基因苜蓿，３ｄ后进行生理指标的测定。结果表明，犕狊犣犐犘基因在苜蓿中超表达可以提高苜蓿的
耐盐性和耐旱性。
关键词：紫花苜蓿；犕狊犣犐犘基因；超表达载体；苜蓿转化；转基因苜蓿检测
中图分类号：Ｓ８１６；Ｓ５４１＋．１０３；Ｑ９４３．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１２）０６０１８２０８
随着生物技术的发展，对于植物的研究已经深入到分子水平，侧重于从分子角度阐明植物各种生理反应机
理，分子机制，以及基因水平的调控。在培育植物新品种，提高植物抗逆性方面，植物转基因技术已经成为近年来
研究的重点内容之一。转基因育种也成为了苜蓿新品种培育的一项重要手段［１］。在目前的植物转基因育种中，
主要采用的技术有农杆菌介导法，微注射法，电击法和基因枪法。在紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）的育种工作中，
农杆菌介导法成为主要的方法，１９８６年，首例农杆菌介导的苜蓿转化获得成功，之后又建立了紫花苜蓿的遗传转
化体系［２，３］，苜蓿转基因工作获得了很大的进展。在苜蓿中，已经有很多抗逆相关的基因被分离，Ｂｒｏｕｗｅｒ等［４］将
烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿）的 ＭｎＳＯＤｃＤＮＡ导入苜蓿中，发现转基因植物ＳＯＤ活性增强，２轮的田间试验鉴定
表明，转基因苜蓿的抗寒性明显提高。２０００年 Ｗｉｎｉｃｏｖ和Ｂａｓｔｏｌｄ［５］将犃犾犳犻狀犾基因导入苜蓿中，增强了盐诱导的
ＭｓＰＲＰ２基因的表达，在植株的生长过程中其耐盐性得到了提高，并且生长速度加快。Ｍｕｎｎｉｋ等［６］从紫花苜蓿
中分离出了 ＭＡＰＫ（ｍｉｔｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ）路径第一个关键酶基因犛犐犕犓，序列分析结果表明，它与
拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）中的ＭＡＰＫ基因具有极大的相似性，盐胁迫下其体内的表达水平上调。２０１１年，
江藤等［７］对蒺藜苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪）全基因组 ＷＲＫＹ转录因子进行了分析，发现蒺藜苜蓿中含有２８个
犠犚犓犢 基因，同时将这些基因与水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）的犠犚犓犢 基因进行了比较分析，为研究苜蓿的 ＷＲＫＹ转
录因子提供了重要的理论依据。刘晓静等［８］将抗冻基因犆犅犉２构建表达载体并转化和田苜蓿，成功得到和田苜
蓿的愈伤组织。燕丽萍等［９］采用分子生物学检测和不同浓度的ＮａＣｌ对转ＢＡＤＨ基因苜蓿Ｔ１代２个株系进行
遗传稳定性和抗盐性研究，结果表明，转入的犅犃犇犎 基因可以稳定遗传，转基因苜蓿耐盐性明显高于对照。蒋
世翠等［１０］将α犉犌犉基因构建表达载体并转化紫花苜蓿，成功得到了表达α犉犌犉基因的苜蓿，为苜蓿作为植物生
物反应器奠定了理论基础。
紫花苜蓿是分布最广的一种牧草，它的适应性很强，是世界上种植面积最广的一种牧草。但是干旱胁迫和高
盐胁迫却是影响苜蓿生长的主要因素，为了从分子机理上解决这一问题，越来越多的盐诱导基因已经从苜蓿中分
１８２－１８９
２０１２年１２月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第２１卷 第６期
Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．６
收稿日期：２０１１１２０５；改回日期：２０１２０１１１
基金项目：“十二五＂国家科技支撑计划课题（２０１１ＢＡＤ１７Ｂ０１０１３）和中央级公益性科研院所专项资金项目（２０１１ｃｊ１４）资助。
作者简介：李燕（１９８４），女，蒙古族，内蒙古乌兰察布人，博士。Ｅｍａｉｌ：ｃａａｓｌｉｙａｎ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｑｃｈｙａｎｇ６６＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
离出来，在烟草中超表达可以增强烟草的耐盐性［１１，１２］。Ｄｅｕｔｃｈ和 Ｗｉｎｉｃｏｖ［１３］从耐盐苜蓿ｃＤＮＡ文库筛选到一个
新ｃＤＮＡ克隆，称作犕犛犘犚犘２９基因，研究表明该基因与紫花苜蓿富含脯氨酸的细胞壁蛋白转录后盐调节表达
有关，能够通过提高耐盐苜蓿中的脯氨酸含量来提高苜蓿的耐盐性。Ｂｏｒｓｉｃｓ和Ｌａｄｏｓ［１４］用差异显示法从菟丝子
（犆狌狊犮狌狋犪犮犺犻狀犲狀狊犻狊）侵染的紫花苜蓿中克隆出一个与钙调蛋白相关的基因犘犘犚犌犾，在高盐、渗透、低温以及ＡＢＡ
处理下，犘犘犚犌犾转录水平快速上调。Ｇｉｎｚｂｅｒｇ等［１５］从盐胁迫的紫花苜蓿根ｃＤＮＡ文库中成功克隆出２个编码
Ｐｒｏ关键的合成酶基因ｃＤＮＡ克隆，犕狊犘５犆犛１和犕狊犘５犆犛２，两者的转录水平在盐胁迫下显著增加。本实验室
从耐盐苜蓿中克隆得到的锌指蛋白基因犕狊犣犉犖，在盐诱导下，表达量也显著升高［１６］。
本试验构建植物超表达载体ＰＢＩＭｓＺＩＰ，并采用农杆菌介导的方法将目的基因犕狊犣犐犘转入苜蓿中。成功
获得了转基因苜蓿苗，其后的生理指标检测表明，在苜蓿中超表达犕狊犣犐犘基因，可以提高苜蓿的耐盐性，为研究
该基因的功能以及苜蓿新品种的选育提供依据。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
耐盐品种紫花苜蓿中苜１号由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所育成，本实验室保存种子。本试验于
２０１１年进行。选取饱满健康的种子用７５％乙醇灭菌１０ｍｉｎ，０．１％升汞灭菌７ｍｉｎ后，无菌水洗净，放置在１／２
ＭＳ固体培养基上，于２５℃培养箱培养。
克隆载体ＰＭＤ１８Ｔ，实验所需的各种限制性内切酶和Ｔ４ＤＮＡ连接酶购自Ｔａｋａｒａ公司，用于构建超表达载
体的原始质粒ＰＢＩ１２１和农杆菌菌株ＬＢＡ４４０４由本实验室保存。大肠杆菌感受态ＤＨ５α购自北京全式金生物
技术公司。质粒小提试剂盒，胶回收试剂盒，Ｔｒｉｚｏｌ购自北京博迈德生物公司。其他生化试剂均购自北京康博顺
达生物有限公司。
１．２ ＭｓＺＩＰ编码区ｃＤＮＡ的获得
根据已经得到的犕狊犣犐犘基因序列，设计１对带有酶切位点的引物：ＭＦ：５′ＴＣＴＡＧＡＡＴＧＧＧＧＡＣＴＡＡＧ
ＧＡＧ３′；ＭＲ：５′ＧＧＡＴＣＣＴＴＣＡＡＧＧＴＴＡＧＣＡＡＣ３′。酶切位点用下划线表示，分别为犡犫犪Ｉ和犅犪犿ＨＩ。提
取紫花苜蓿总ＲＮＡ，反转录成ｃＤＮＡ作为模板，进行ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ产物在１％琼脂糖凝胶上电泳分析后，切
胶回收，连接到克隆载体ＰＭＤ１８Ｔ上，命名为ＰＭＤＭｓＺＩＰ，转化大肠杆菌，挑取阳性单菌落，菌体ＰＣＲ检测之
后，将含有目的条带的阳性克隆送到北京华大基因生物技术有限公司测序。
１．３ 超表达载体的构建
选取测序完全正确的阳性菌提取质粒，用限制性内切酶 犡犫犪Ｉ和犅犪犿ＨＩ双酶切质粒 ＰＭＤＭｓＺＩＰ和
ＰＢＩ１２１，琼脂糖凝胶检测后各自回收目的片段，用Ｔ４ＤＮＡ连接酶，１６℃连接６ｈ。连接好的载体命名为ＰＢＩ
ＭｓＺＩＰ，转化大肠杆菌，挑取阳性单菌落，ＰＣＲ检测后送阳性克隆测序。将含有阳性克隆的菌落，提取质粒，犡犫犪犐
和犅犪犿犎犐双酶切鉴定。
１．４ 转基因苜蓿的获得
将构建好的超表达载体采用ＣａＣｌ２ 冻融法转入农杆菌中，用于苜蓿的转化。苜蓿种子灭菌后播种在无菌
１／２ＭＳ培养基，２５℃培养箱中培养７ｄ后，切下子叶，转入预培养培养基（２，４Ｄ２．０ｍｇ／Ｌ＋ＫＴ０．２５ｍｇ／Ｌ＋
ＵＭ）中培养２ｄ后，将子叶浸泡在ＯＤ６００＝０．５的农杆菌转化菌液中１０ｍｉｎ。取出后吸干菌液，摆放在共培养培
养基上（２，４Ｄ２．０ｍｇ／Ｌ＋ＫＴ０．２５ｍｇ／Ｌ＋ＵＭ），黑暗培养４８ｈ。之后转入诱芽培养基（５０ｍｇ／ＬＫａｎ＋３００
ｍｇ／ＬＣｅｆ＋２．０ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ＋ＫＴ０．２５ｍｇ／Ｌ＋ＵＭ），直至形成愈伤组织，出现再生芽。当再生芽长至１ｃｍ左
右时，将芽切下，转入１／２ＭＳ培养基中生根培养。当再生苜蓿苗根长至１０ｃｍ，地上部分长至１０ｃｍ左右时，转
入营养土中，温室中继续培养。
１．５ 再生植株的检测
设计１对载体 ＰＢＩＭｓＺＩＰ上的引物 ＮＰＴ１：５′ＡＴＡＣＣＧＴＡＡＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＡＧ３′和 ＮＰＴ２：５′ＣＴ
ＧＡＡＧＣＧＧＧＡＡＧＧＧＡＣＴ３′，用于扩增卡那霉素抗性基因犖犘犜Ⅱ。实验室改进的ＣＴＡＢ法［１７］提取转基因抗
性苜蓿苗的基因组ＤＮＡ作模板，质粒ＰＢＩ１２１和未转基因苜蓿ＤＮＡ分别作为阳性和阴性对照，进行ＰＣＲ扩增。
３８１第２１卷第６期 草业学报２０１２年
ＰＣＲ产物在１％琼脂糖凝胶上电泳分析。
以 ＭＦ和 ＭＲ为引物，用于扩增目的基因。Ｔｒｉｚｏｌ法提取转基因抗性苜蓿苗的总ＲＮＡ（参见说明书），反转
录产物作为模板，质粒ＰＢＩＭｓＺＩＰ和ＰＢＩ１２１分别为阳性对照和阴性对照，进行ＲＴＰＣＲ扩增。ＰＣＲ产物在１％
琼脂糖凝胶上电泳分析。
分别用２００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ和２５μｍｏｌ／ＬＰＥＧ６０００处理转基因苜蓿，３ｄ后测量可溶性蛋白含量，可溶性糖
含量，相对含水量，丙二醛含量以及脯氨酸含量［１８］。每个样品都做３次重复，测量结果用ＳＡＳ９．０数据分析软件
在犘＜０．０５水平进行统计分析。
２ 结果与分析
２．１ 犕狊犣犐犘基因ｃＤＮＡ序列的获得
以紫花苜蓿总ＲＮＡ反转录得到的ｃＤＮＡ为模板，ＭＦ和 ＭＲ为引物，进行ＰＣＲ扩增。得到１条长约１０００
ｂｐ的条带（图１）。将ＰＣＲ产物切胶回收后，连接到载体ＰＭＤ１８Ｔ上，转化大肠杆菌，将ＰＣＲ鉴定的阳性克隆
测序，结果表明序列正确无误，没有碱基突变和移码突变，成功的克隆得到犕狊犣犐犘基因。
２．２ 超表达载体ＰＢＩＭｓＺＩＰ构建
提取构建好的质粒ＰＢＩＭｓＺＩＰ，用限制性内切酶犡犫犪Ｉ和犅犪犿ＨＩ双酶切，１％琼脂糖凝胶电泳得到１条约
１０００ｂｐ的条带（图２），与预期大小相符，表明植物超表达载体ＰＢＩＭｓＺＩＰ构建成功。
图１ 犕狊犣犐犘编码区犮犇犖犃的克隆
犉犻犵．１ 犆犾狅狀犻狀犵狅犳犮狅犱犻狀犵狉犲犵犻狅狀狅犳犕狊犣犐犘
Ｍ：ＤＮＡ标记 ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；Ａ：目的
片段Ｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎ．
图２ 超表达载体的酶切鉴定
犉犻犵．２ 犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狅狏犲狉犲狓狆狉犲狊狊犲犱狏犲犮狋狅狉狊
Ｍ：ＤＮＡ标记 ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；Ｐ：犡犫犪Ｉ和犅犪犿ＨＩ双酶切后
的质粒Ｔｈｅｐｌａｓｍｉｄｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙ犡犫犪Ｉａｎｄ犅犪犿ＨＩ．
２．３ 紫花苜蓿再生植株转化
经过农杆菌转化的苜蓿子叶，在诱芽培养基上生长３０ｄ后，形成愈伤组织（图３Ａ），继续培养６０ｄ之后，可见
在愈伤组织上出现绿色的出芽点，开始形成再生芽（图３Ｂ），当再生芽长到１ｃｍ左右时，将再生芽切下，转入生根
培养基中培养（图３Ｃ），再生植株成苗后，根长１０ｃｍ，地上部分１０ｃｍ左右时（图３Ｄ），即可转入营养土中，在温室
中继续培养（图３Ｅ）。
２．４ 再生植株ＰＣＲ鉴定
从获得的１１株抗性植株中，选取４株进行卡那霉素抗性基因的鉴定。ＰＣＲ产物在１％琼脂糖凝胶电泳上分
析这几株再生苗均得到长为４００ｂｐ左右的条带（图４），与目的大小一致。同时对这４株抗性苗进行目的基因的
ＲＴＰＣＲ检测，１％琼脂糖凝胶电泳结果表明，得到了约为１０００ｂｐ的条带（图５），与目的大小一致。证明这４株
转基因苜蓿转化成功。
４８１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．６
图３ 苜蓿转基因苗的再生
犉犻犵．３ 犃犾犳犪犾犳犪狉犲犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀狆犾犪狀狋狊
Ａ：愈伤组织Ｃａｌｕｓ；Ｂ：开始产生再生芽Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｂｕｄｓ；Ｃ：再生芽Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｂｕｄｓ；
Ｄ：再生根Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｒｏｏｔｓ；Ｅ：抗性苗Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｅｄｌｉｎｇ．
图４ 再生植株卡那霉素抗性基因检测
犉犻犵．４ 犖犘犜Ⅱ犵犲狀犲狋犲狊狋犻狀犵狅犳狉犲犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀狆犾犪狀狋狊
Ｍ：ＤＮＡ标记ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；１～４：再生植株 Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｐｌａｎｔｓ；ＣＫ＋：阳性对照Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；ＣＫ－：阴性对照 Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ．
图５ 再生植株犕狊犣犐犘目的基因检测
犉犻犵．５ 犕狊犣犐犘犵犲狀犲狋犲狊狋犻狀犵狅犳狉犲犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀狆犾犪狀狋狊
Ｍ：ＤＮＡ标记 ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；１～４：再生植株Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｐｌａｎｔｓ；ＣＫ＋：阳性对照Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；ＣＫ－：阴性对照 Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ．
２．５ 再生植株生理指标测定
在干旱和高盐处理之后，可溶性糖含量均增加，转基因苜蓿中高于未转基苜蓿，干旱处理后的增加量高于盐
处理（图６Ａ）；可溶性蛋白的含量也有所增加（图６Ｂ）；相对含水量测定结果显示，高盐处理之后，转基因苜蓿和未
转基因苜蓿的差异不大，干旱处理之后，转基因苜蓿中的相对含水量要高于未转基因苜蓿（图６Ｃ）；丙二醛含量均
有显著的增加，转基因苜蓿的增幅小于未转基因苜蓿，干旱处理之后丙二醛的增加量大于高盐处理（图６Ｄ）；在转
基因和未转基因苜蓿中脯氨酸的含量均大幅增加，转基因苜蓿的增幅大于未转基因苜蓿，高盐处理之后的增幅大
于干旱处理（图６Ｅ）。
３ 讨论
碱性亮氨酸拉链（ｂａｓｉｃｌｅｕｃｉｎｅｚｉｐｐｅｒ，ｂＺＩＰ）蛋白是真核生物的转录因子和阻抑蛋白中最大而且最保守的类
５８１第２１卷第６期 草业学报２０１２年
图６ 再生植株逆境胁迫下生理指标的测定
犉犻犵．６ 犘犺狔狊犻狅犾狅犵犻犮犪犾狆犪狉犪犿犲狋犲狉狋犲狊狋犻狀犵狅犳狉犲犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀狆犾犪狀狋狊
ＷＴ：未转基因苜蓿苗 Ｗｉｌｄａｌｆａｌｆａ；Ｌ１～Ｌ４：４株转基因苜蓿苗 Ｆｏｕｒｔｒａｎｓｇｅｎｉｃａｌｆａｌｆａｓ．不同小写字母表示差异显著（犘＜０．０５）Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｓｍａｌｌｅｔｔｅｒｓｍｅａｎｔｈｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ犘＜０．０５．
６８１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．６
型之一［１８］。ｂＺＩＰ包含２个主要的结构域：一个ＤＮＡ序列特异性结合的结构域和亮氨酸拉链区，该区域每７个
相邻的氨基酸的第７位含有一个亮氨酸［１９］。目前，对于植物中ｂＺＩＰ蛋白已经有了大量的研究，拟南芥［２０］，大麦
（犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲）［２１］，水稻［２２］，烟草［２３］，玉米（犣犲犪犿犪狔狊）［２４］和刀豆（犆犪狀犪狏犪犾犻犪犵犾犪犱犻犪狋犪）［２５］中的犫犣犐犘基因
都已经被克隆并进行了初步分析，犫犣犐犘转录因子主要参与了植物的花发育，ＡＢＡ诱导，耐旱，耐盐等生理过程。
但是在紫花苜蓿中还没有研究，为了解紫花苜蓿中的犕狊犣犐犘基因在苜蓿的生长过程中所发挥的作用，本实验室
首次克隆并初步分析犕狊犣犐犘基因的功能。
在逆境胁迫下，植物体由于大量失水会产生渗透胁迫，使植物的物质代谢发生改变，一些渗透调节物质相继
生成并积累，一些大分子物质（淀粉，蛋白质）分解成小分子物质（糖，氨基酸）。这些小分子物质具有较强的亲水
性，可以稳定胶体性质，在组织代谢中，使植物细胞免受伤害或伤害减轻。因此植物细胞的渗透调节作用是植物
适应环境，提高抗性的基础［２６］。可溶性糖和脯氨酸是植物体内重要的渗透调节物质，在干旱、低温、高温、盐渍等
逆境下都会造成植物体内可溶性糖和脯氨酸含量的增加，这是植物对逆境胁迫的一种生理生化反应。本实验测
定转基因苜蓿中的可溶性糖和脯氨酸含量均显著增加，从而可以起到渗透调节作用，增强植物的耐盐和抗旱
性［２７，２８］。
在植物细胞中，存在许多非生物胁迫可以诱导活性氧大量产生从而导致脂质过氧化［２９］。ＭＤＡ是生物膜上
的游离自由基连锁反应和脂质过氧化作用的终产物，ＭＤＡ的含量能够反应脂质过氧化作用和膜受伤害的程度。
因此，测定逆境胁迫下 ＭＤＡ的含量是评价植物适应逆境条件的一个重要指标。ＭＤＡ增幅越大，受到的伤害越
大，本实验中，相对于未转基因的苜蓿而言，在胁迫处理之后，转基因苜蓿的丙二醛含量增幅要小，这也正说明转
基因苜蓿的抗逆性提高。
蛋白质合成对植物的盐胁迫很敏感［３０，３１］，特别是蛋白质的翻译可以显著的被盐诱导抑制。此外，在盐胁迫
下，可溶性蛋白的含量也会发生变化。在耐盐性品种的大麦，向日葵（犎犲犾犻犪狀狋犺狌狊犪狀狀狌狌狊），水稻［３２］和豇豆（犞犻犵
狀犪狌狀犵狌犻犮狌犾犪狋犪）［３３］中，盐胁迫下可溶性蛋白的含量显著增加。因此，盐胁迫下植物可溶性蛋白含量的测定可以
作为评价植物耐盐性的一个重要指标。本实验中，在盐胁迫和干旱胁迫下，植物的可溶性蛋白质含量显著增加，
说明转基因苜蓿的耐盐和耐旱性都有提高。总之，通过这些生理指标的测定表明犕狊犣犐犘基因在苜蓿中的超表
达可以显著提高苜蓿的耐盐性和耐旱性，为深入研究犕狊犣犐犘基因的功能和苜蓿的遗传育种工作，以及今后将该
基因在其他作物和牧草中表达，开展抗逆基因工程奠定基础。
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犕狊犘犚犘２ｇｅｎｅｉｎａｌｆａｌｆａａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｓｓａｌｉｎｉｔｙｔｏｌｅｒａｎｃｅｏｆｔｈｅｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９９９，１２０（２）：４７３４８０．
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７８１第２１卷第６期 草业学报２０１２年
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犆狅狀狊狋狉狌犮狋犻狅狀犪狀犱狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀狅犳犪狀狅狏犲狉犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狆犾犪狊犿犻犱狅犳狋犺犲犕狊犣犐犘犵犲狀犲犳狉狅犿犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪
ＬＩＹａｎ１，ＳＵＮＹａｎ２，ＹＡＮＧＱｉｎｇｃｈｕａｎ１，ＫＡＮＧＪｕｎｍｅｉ１，ＺＨＡＮＧＴｉｅｊｕｎ１，ＦＡＮＧＦｅｎｇ３
（１．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１９３，Ｃｈｉｎａ；
２．ＣｏｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１９１，
Ｃｈｉｎａ；３．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１９３，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅ犕狊犣犐犘ｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＧｅｎＢａｎｋＮｏ．ＨＱ９１１７７８），ａｃＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｗａｓｃｌｏｎｅｄａｎｄ
ｃｏｎｎｅｃｔｅｄｔｏｔｈｅＰＭＤ１８ＴｖｅｃｔｏｒｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔＰＭＤ犕狊犣犐犘．Ｔｈｅｔａｒｇｅｔｆｒａｇｍｅｎｔａｎｄｌｉｎｅａｒｐｌａｓｍｉｄｗｅｒｅｏｂ
ｔａｉｎｅｄｆｒｏｍｔｈｅｃｌｏｎｉｎｇｖｅｃｔｏｒＰＭＤ犕狊犣犐犘ａｎｄｆｒｏｍｔｈｅｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒＰＢＩ１２１ｕｓｉｎｇｄｕａｌｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
ｗｉｔｈ犡犫犪Ｉａｎｄ犅犪犿ＨＩ．ＴｈｅｐｌａｎｔｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒＰＢＩ犕狊犣犐犘ｗａｓｂｕｉｌｔｔｈｒｏｕｇｈｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ
ｕｓｉｎｇＴ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅ．Ｔｈｅｐｌａｓｍｉｄｗａｓｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄｔｏ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿ＬＢＡ４４０４ｂｙｔｈｅＣａＣｌ２ｆｒｅｅｚｅｔｈａｗｍｅｔｈ
ｏｄａｎｄｗａｓｔｈｅｎｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄｉｎｔｏａｌｆａｌｆａｂｙａｎ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ．Ｅｌｅｖｅｎｋａｎａｍｙ
ｃｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ．ＦｏｕｒｏｆｔｈｅｍｗｅｒｅｓａｍｐｌｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔａｒｇｅｔｆｒａｇｍｅｎｔｓａｎｄＰＣＲｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｈａｄｂｅｅｎｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄｉｎｔｏａｌｆａｌｆａ．Ｔｈｅ犕狊犣犐犘ｇｅｎｅｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙ
ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪ＣＶ．ＺｈｏｎｇｍｕＮｏ．１．Ｔｏｔｅｓｔｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｔｈｉｓｇｅｎｅ，ｔｈｅｔｒａｎｓ
ｇｅｎｉｃａｌｆａｌｆａｗａｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈ２００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌａｎｄ２５μｍｏｌ／ＬＰＥＧ６０００ｆｏｒｔｈｒｅｅｄａｙｓ，ａｎｄｓｏｍｅｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌｐａｒａｍｅｔｅｒｓｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄ．Ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｓｏｌｕｂｌｅｓｕｇａｒ，ｓｏｌｕｂｌｅｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｐｒｏｌｉｎｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎ
ｃｒｅａｓｅｄ，ｗｈｉｌｅｔｈｅＭＤＡｃｏｎｔｅｎｔｄｅｃｌｉｎｅｄ．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ犕狊犣犐犘ｇｅｎｅｅｎｈａｎｃｅｄｔｈｅｓａｌｔａｎｄｄｒｏｕｇｈｔｔｏｌｅｒａｎｃｅ
ｏｆａｌｆａｌｆａ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪；犕狊犣犐犘ｇｅｎｅ；ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ；ａｌｆａｌｆａｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃａｌｆａｌｆａ
ｔｅｓｔ
９８１第２１卷第６期 草业学报２０１２年