全 文 ：林业科学研究!"#$%!"&"$#$," ,-
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!!文章编号!$##$($)*&""#$%##$(##,"(#%
小叶杨 ==>基因的克隆及其在重金属
胁迫下的表达模式
刁!姝! 苏晓华! 丁昌俊! 张冰玉!
"林木遗传育种国家重点实验室!中国林业科学研究院林业研究所!国家林业局林木培育重点实验室! 北京!$###*$#
收稿日期$ "#$,(#"("-
基金项目$ 国家高新技术研究发展计划"&-, 计划#课题""#$$..$##"#$#
作者简介$ 刁!姝"$*&(#!女!硕士生!研究方向为林木基因工程+/(0123$E21:K;6#&#"8$-,+9:0
!
通讯作者$研究员!研究方向为林木基因工程+J<3$#$#(-"&&*--$%/(0123$@5S;17M891>+19+97
摘要!利用生物信息学与分子生物学相结合的策略克隆了小叶杨 DD9基因!基因编码区全长 "%& @W!编码由 &% 个
氨基酸残基构成的蛋白质!蛋白]端具有与铜离子结合的保守功能域Z_P__P!且具有铜伴侣蛋白典型的
#$##$#
二级结构!命名为H%DD9) 系统进化分析表明$ K`PPQ蛋白与橡胶,麻疯树,葡萄的PPQ蛋白的亲缘关系最近"相似
性 *#d *,d#) 通过实时定量 P`N方法对其在不同浓度铜离子,其它重金属离子及植物生长激素处理下的表达
模式进行了分析) 结果表明$小叶杨H%DD9的表达受多种重金属及植物激素的调控!在低浓度铜离子,铝离子,锌
离子,水杨酸处理下!其0N].表达先上升而后下降%而在高浓度铜离子,钴离子,汞离子,茉莉酸处理下则是持
续下降)
关键词!小叶杨%铜伴侣蛋白%基因表达%重金属胁迫
中图分类号!D$&+- 文献标识码!.
N/)*-*H .*8$J,1#((-)*+*./7(-()%?/==>%1)2?-.616//+:-2+
O*8#1C1#((#()%S#.P7 0#./
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JI<+5(1.&$ J;I:0H"G?1?%%2@"623<1>V1K93:7:I01F29K17E
0:3<9631I@2:3:M29131WWI:19;F&% 1027:192EK! 710X6<79<:>H%DD9W:KK27 2FK](F#$##$#
(>:3E KFI69F6I<+` ;53:M<7517135K2KK;:VI:09$_$( 7#(0
%212$6%2%!5(&#"G*( )?#)(%17E L2&2%_262T$#( "V2F; *#d [*,d 27 1027:192EKK20231I2F5#+J;X P`N
K;:VH%DD9V1KIFI17K9I2WFK279I<1KF3:V9:WWK69; 1K27 ;2M; 9:WW6#7 4)18($H"G?1?%%2@"62% 9:WW铜作为植物必需的微量元素之一!以铜离子形 式参与植物体内一些重要代谢过程%然而!高浓度的
第 $ 期 刁!姝等$小叶杨DD9基因的克隆及其在重金属胁迫下的表达模式
铜离子会引起自由基的形成!造成氧化破坏!从而对
植物产生毒性*$+ ) 铜伴侣蛋白是生物体内广泛存在
的,参与调控细胞内铜离子水平的重要蛋白!它能与
铜离子结合并转运铜离子!保护机体免受游离铜离
子的毒性作用!是生物体铜稳态调节的重要蛋
白*" [,+ ) 植物体的铜伴侣蛋白由铜伴侣蛋白基因编
码!拟南芥 ",#(72F"G%2%&*(12(6( "H277+# Q<57;+#
,&DD9是植物中第一个克隆的类 ,&Y+ 铜伴侣蛋白
基因) ,&DD9具有植物所特有的P末端延伸区域以
及保守的铜离子结合位点 Z_P__P!并能使酵母突
变体 (&Y+ 恢复铜离子转运功能*)+ ) ,&DD9在衰老
叶片中以及氧化胁迫后大量表达!当外施过量铜离
子"$ 00:3-H[$#!则抑制,&DD9的表达!说明,&DD9
在叶片衰老和铜离子转运中具有重要作用 *% [-+ )
目前!已经在银白杨和欧洲山杨的杂种"H"G?1?%(10
7(qH[&#$@?1( T1I+A1(6F?1"%(#,黄瓜"D?)?@2%%(&2_?%
H277+#,西伯利亚蓼"H"1^A"6?@%272#2)?@H1A0+#等
植物中克隆了DD9铜伴侣蛋白基因!该基因在植物
根,茎,叶中均有表达!并受到铜离子等多种重金属
离子, 高盐胁迫, 植物生长素等多种因素的
调控* [*+ )
小叶杨"H[%2@"62P1I+#是我国特有乡土树种
之一!具有较强的抗重金属污染能力*$#+ ) 为了阐明
小叶杨DD9基因的功能!本文作者克隆了小叶杨
DD9基因"H%DD9#!并以水培苗为材料!采用实时定
量 P`N的方法对其在不同浓度铜离子,重金属胁迫
以及生长因子胁迫下的表达量进行了比较分析!以
探讨小叶杨H%DD9基因抗重金属胁迫的作用机制!
为培育抗重金属污染的杨树新品种奠定基础)
$!材料与方法
9>9:小叶杨 ?/==>的克隆$序列及系统进化树的
构建
!!以小叶杨叶片为材料!采用 rO.B/]N]<1K5
3`17FZ272试剂盒提取总 N].) 取 "
!
M总 N].!以
I`20司!大连#进行反转录!并以此为模板进行 P`N扩
增) 根据H"DD9基因*+以及毛果杨"H[)*")( #G(
J:I+R.+BI15#同源序列"_Zw##",$#**+$#设计
引物!用正向引物 P6(?$"%.(.JBJPJP.B.PJBJJ(
BJPPJ(,.#和反向引 P6(N"%.(JJ.JBP.BP.BP(
P.PBBJJJ(,.#进行H%DD9基因编码区"P:E27MK<(
X6<79缓冲液!-#
!
M-H
[$
9^].! "##
!
0:3-H
[$
E]J`K!
#+"
!
0:3-H
[$
P`N引物!$ C72FJ1X(酶) 扩增程序
为先 *) f预变性 $ 027%*) f ,# K!%* f ,# K! "
f $ 027!共 ,% 个循环%" f延伸 $# 027) 扩增产
物纯化后!连接到 J(<1K5载体 " I`:0国#!转化大肠杆菌kZ$#*!通过蓝白斑筛选!挑取阳
性克隆进行序列测定)
采用rO.B/] ]^<1K5` 317FZ272试剂盒提取小
叶杨叶片基因组 ]^.!并用上述引物进行基因组
]^.扩增!获得 H%DD9基因组序列) 应用 ]^.(
Z.]软件"\二级结构";FWK$bbVVV+WI"]1F2:713P<7F:IL2:F<9;7:3:M5O7>:I01F2:7#网站
上!下载拟南芥及其它物种 PPQ蛋白序列!利用
Z/B.%+#% 软件建立基于氨基酸序列的邻位连接法
"]k!7<2M;@:I(=:2727M#系统发育树!遗传距离采用 W(
距离!@::FKFI1W $ ### 次检验系统发育树各分支的支
持值)
9+;:小叶杨的胁迫处理
以Q:1M317E.KD:36F2:7 培养的小叶杨苗"苗高
,# 90#为材料!通过向培养液中添加 P6DY
)
"%#
!
0:3-H
[$
!%##
!
0:3-H
[$
#! j7DY
)
""%#
!
0:3-
H
[$
#! .3P3
,
",##
!
0:3-H
[$
#! P:P3
"
", ###
!
0:3-
H
[$
#! QMP3
"
",##
!
0:3-H
[$
#!水杨酸"D.!"#
!
0:3
-H
[$
#和茉莉酸"k.!$#
!
0:3-H
[$
#等进行重金属
及植物生长调节剂处理!分别在处理后 $,, ; 取功
能叶!并迅速在液氮中冷冻!之后保存于 [&# f冰
箱中备用)
9><:小叶杨 ?/==>胁迫处理后表达量的 M!L
TINM检测
!!采用 rO.B/]N]<1K5` 317FZ272试剂盒提取各
种处理后的叶片总 N].) 总 N].用无 N]1K<的
]^1K<在 , f下处理 $% 027!琼脂糖凝胶"#+&d#
电泳检测总N].质量之后!用核酸蛋白定量仪测定
总N].的浓度) 取 %
!
M经过处理的总 N].进行
反转录合成第一链 9^].!用无N]1K<的去离子水以
$g$# 进行稀释作为实时 P`N模板! ["# f冰箱保
存备用)
对各种处理后的小叶杨 H%DD9基因表达量进
行NJ(X P`N检测) "#
!
H实时定量 P`N反应体系
中含有 $
!
H第 $ 链 9^].!"## 70:3-H[$的引物和
$ qDaLN P`N混合物 "大连宝生物公司#) 使用
.LO`I2K0%## 荧光定量 P`N仪!反应条件为 *) f
,,
林!业!科!学!研!究 第 "& 卷
变性 % 027!然后在 *) f变性 $# K,%% f退火 $# K,
" f延伸 ,% K条件下进行 )# 个循环!并在 " f时
收集荧光信号) 每个反应进行 ) 次重复) 以CLr为
内参!H%DD9实时定量 P`N引物序列为$%.(BJP.J(
BPB..BBPJBJBJJ(,. 和 %.(BJJJPJBP.BBPJJJ(
BPJB(,.)
"!结果与分析
;>9:小叶杨?/==>的克隆及序列分析
以小叶杨 9^].为模板!用 DD9全长引物 P6(
?$,P6(N$ 进行扩增!扩增产物为 "%& @W 长的片
段) 双向测序结果表明$该序列包含完整的 P^ D
序列!编码由 &% 个氨基酸残基构成的蛋白质) 预
测编码蛋白质的分子量为 &+*#& 4 !^等电点"H4#
为 -+%&) 蛋白 ]端具有铜伴侣蛋白典型的与铜离
子结合的保守功能域Z_P__P!P端具有富含赖氨
酸区域"图 $#!蛋白质二级结构为铜伴侣蛋白典型
的
#$##$#
结构) 用推导的 K`PPQ蛋白序列进行
B<7@174 LH.DJ` 搜索!其氨基酸序列与从银白杨
和欧洲山杨的杂种"M@x..J$")&&+$ x#悬浮细胞
中克隆的 H"DD9基因编码的蛋白一致性达
$##d!与其他多种植物的 DD9基因编码的蛋白也
有较高的一致性"&,d *,d#!其中!与橡胶"9$0
_$( 7#(%212$6%2%"U23E+疯树 "5(&#"G*( )?#)(%H277+#,葡萄 "L2&2%_262T$#(
H277+#一致性达 *#d *,d) 进一步的系统进化
分析也证实!小叶杨 H%DD9与橡胶,麻疯树 PPQ
蛋白的亲缘关系最近"图 "#%因此!推断该基因为
小叶杨铜伴侣蛋白基因!命名为 H%DD9)
图 $!小叶杨H%DD9基因 P^ D序列及对应的氨基酸序列"双线处为铜离子结合位点!单线处为富含赖氨酸区域#
图 "!通过Z/B.%+# 获得的小叶杨H%DD9推导蛋白与其他植物
PPQ蛋白系统进化树"树上的数字表示 @::FKFI1W支持率#
采用DD9全长引物扩增出了该基因基因组序
列!扩增片段 ]^.全长为 &- @W!序列分析表明!该
片段含有 " 个外显子和 $ 个内含子!长度分别为 &,
%"&,$$ @W)
;>;:不同浓度铜离子处理下小叶杨?/==>的表达
实时定量 P`N结果"图 ,#表明$小叶杨 H%DD9
基因对不同浓度铜离子处理的反应不同!当用 %#
!
0:3-H
[$低浓度P6DY
)
处理时!$ ;后小叶杨
H%DD9的表达量约提高了 %+%d! , ; 后是处理前
的 $&+#d左右%当用 %##
!
0:3-H
[$高浓度 P6DY
)
处理时!小叶杨H%DD9表达量持续下降!$ ; 是处理
前的 -)+)d!, ;是处理前 ,"+"d)
;><:其它重金属处理下小叶杨?/==>的表达
在 j7DY
)
等其它重金属处理下!H%DD9基因
的表达也发生了很大变化) "%#
!
0:3-H
[$
j7(
DY
)
处理 $ ;!其表达量是处理前的 "+"% 倍!, ;
后 K`PPQ的表达量又降至处理前的 d%,##
!
0:3-H
[$
.3P3
,
处理后 $ ;!H%DD9的表达量是
处理前的 $+- 倍!, ; 后其表达量降至处理前的
%%d% ,##
!
0:3-H
[$
QMP3
"
处理!H%DD9表达量
持续下降!$ ; 后其表达量降至处理前的 -#d!,
; 后表达量降至处理前的 $d%, ###
!
0:3-H
[$
P:P3
"
处理!H%DD9表达量持续下降!$ ; 时其表
达量降至处理前的 -"+%d!, ; 后表达量降至原
来的 ,#e-d"图 )# )
),
第 $ 期 刁!姝等$小叶杨DD9基因的克隆及其在重金属胁迫下的表达模式
图 ,!小叶杨H%DD9基因在不同浓度P6DY
)
溶液处理下的表达情况
图 )!小叶杨H%DD9基因在j7DY
)
等其它溶液处理下的表达情况
;>=:植物生长激素"U+$C+#处理下小叶杨 ?/==>
的表达
!!为了检测小叶杨 H%DD9基因是否受到外源植
物生长激素的调控!本文作者检测了小叶杨 H%DD9
基因对k.,D.的反应) 实时定量 P`N结果显示$当
用 $#
!
0:3-H
[$
k.处理时!H%DD9的表达量持续降
低!$ ; 后 H%DD9的表达量降至处理前的 )%d!, ;
后降至处理前的 ,#d%用 "#
!
0:3-H
[$
D.处理 $ ;
时! H%DD9的表达量增加了 ,#d!, ;后又降至很低
的水平!约为处理前的 $-d"图 %#)
图 %!小叶杨H%DD9基因在植物生长调节剂茉莉酸 "k.#和水杨酸"D.#处理下的表达情况
%,
林!业!科!学!研!究 第 "& 卷
,!结论与讨论
本研究获得了完整的小叶杨 H%DD9基因编码
序列及基因组序列!由基因编码序列推断其编码 &%
个氨基酸!分子质量为 &+*#& 4 !^该蛋白能够形成
#$##$#
的二级结构!其 ]端具有保守的铜离子结
合位点Z_P__P!且与其它植物PPQ蛋白具有较高
的同源性!因此!获得的铜伴侣蛋白属于 PPQ类铜
伴侣蛋白)
植物DD9基因的表达受到铜离子浓度的调控$
高浓度铜离子会抑制其 0N].的表达!铜离子缺失
的条件下!DD9表达会提高*%!!$$+ ) 除此之外!植物
DD9基因的表达还与各种非生物胁迫甚至于生物
胁迫相关*%!+ ) 尽管小叶杨H%DD9基因与杂种杨悬
浮细胞中克隆的 H"DD9基因*+编码蛋白的一致性
达到 $##d!但二者在相同处理条件下的表达模式
却存在很大的不同) 杂种杨悬浮细胞在 %#
!
0:3-
H
[$铜离子处理下!#+% ;就能够检测到DD9基因表
达水平降低!- ; 后才恢复到处理前的水平%而 %#
!
0:3-H
[$铜离子处理促进了小叶杨 H%DD9基因的
表达"处理 $ ;#!之后逐渐降低!在 , ; 后其表达水
平甚至比处理前更低) 同样!在锌离子和铝离子处
理下!杂种杨悬浮细胞 H"DD9基因表达逐渐增加!
而在同等条件下小叶杨H%DD9基因是先升高"处理
$ ;#后下降至比处理前更低的水平"处理 , ;#) 在
植物生长激素处理下!小叶杨 H%DD9基因的表达也
与杂种杨悬浮细胞 H"DD9表达完全不同$$#
!
0:3
-H
[$
Zk.处理 , ; 过程中!H%DD9的表达量持续
降低%在 "#
!
0:3-H
[$
D.处理下!其表达量先增
加!而 , ;后又降至比处理前更低的水平%而H"DD9
基因在同等浓度的k.和 D.处理下! #+% ; 后 " 种
处理的DD9基因转录本没有变化!- ; 后用k.处理
的DD9基因转录本明显增加!用 D.处理后的 DD9
基因的转录本增加不明显) 导致这种表达差异的可
能原因主要有以下 " 个方面!一是杨树树种对重金
属离子抗性的差异!二是所用实验材料的差异) H<<
等*+所用的材料为银白杨和欧洲山杨的杂种!其抗
重金属的能力较差!且其所用的材料为杨树的悬浮
细胞!是未分化细胞团!而本文所用的材料是对重金
属具有较强抗性,整株小叶杨苗!与悬浮细胞相比!
整株植物已经分化出了各种器官和组织!具有更强
的抵抗力和自我保护调控机制) 如 %#
!
0:3-H
[$铜
离子已经对该杂种杨造成了毒害!所以其 DD9基因
表达下降!而同等浓度的铜离子并未对小叶杨造成
伤害!反而促进了 DD9基因表达!只有当植株吸收
了足够多的铜离子后!DD9基因表达下调!来避免过
多吸收铜离子)
植物激素在植物应对各种生物胁迫及非生物胁
迫过程中起重要的信号调控作用*$"+ ) 小叶杨
H%DD9基因在各种重金属处理下有 " 种表达模式!
一种是先上升而后下降!与 D.处理下 DD9基因的
表达模式类似%另一种是持续下降!与k.处理类似)
据此推测!不同重金属处理可能启动了杨树不同的
信号通路!从而导致了小叶杨 H%DD9基因不同的表
达模式)
参考文献!
*$+ G1I3KFI:0.N! HI:0;6(
017 20067:E<>292<795T2I6K$ @5@:F; 95KF<27<(E27<(27E&&"$,#$ %%%" [%%%-+
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*-+ 6`2MD! Z2I1Q! :^I9<5/!$&(1+Q2M;F5W.J_$(324<9:WWP:0067! "##! ,%)""#$,&% [,*#+
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*&+ 井!鑫! 张兴国+黄瓜DD9基因的生物信息学及表达分析* +^+
重庆$西南大学!"##-$," [,*+
**+ 刘关君!曲春浦! 刘明坤! 等+西伯利亚蓼铜伴侣蛋白基因在盐
胁迫条件下的表达分析*k++中国生物化学与分子生物学报!
"##&!")"$$#$ $#,) [$#,*+
*$#+ 智颖飙!王再岚!王中生!等+公路绿化植物油松"H26?%&(7?1($0
T"#@2%#和小叶杨"H"G?1?%%2@"62#对重金属元素的吸收与积累
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*$"+ N:@W317FE2K<1K<17E E<><7K<$ 0:IF1M:72K0*k++.776 N-,