全 文 ：书紫花苜蓿二氢黄酮醇还原酶基因
（犕狊犇犉犚）的克隆与分析
董洁，王学敏，王赞，高洪文，孙桂枝
（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京１００１９３）
摘要：二氢黄酮醇还原酶（ｄｉｈｙｄｒｏｆｌａｖｏｎｏｌｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＤＦＲ）是缩合单宁生物合成途径中的关键酶，在单宁的合成中
起着重要的作用。根据同源克隆的原理，利用ＲＡＣＥ技术，从“中苜一号”苜蓿中克隆得到ＤＦＲ基因（犕狊犇犉犚），并
对其进行了序列分析及不同胁迫条件下的表达模式分析。结果表明，犕狊犇犉犚基因ｃＤＮＡ全长１４０２ｂｐ，包括开放
阅读框１０２３ｂｐ，编码３４０个氨基酸，在Ｎ端存在１个 ＮＡＤＰ结合位点“ＶＴＧＡＳＧＦＩＧＳＷＬＶＭＲＬＭＥＲＧＹ”，中部
存在１个底物特异性结合的氨基酸基序“ＴＬＮＶＴＥＤＱＫＰＬＷＤＥＳＣＷＳＤＶＥＦＣＲＲＶ”。实时荧光定量ＰＣＲ结果表
明，该基因在荚果中表达量较高，根中较弱；在ＮａＣｌ和ＧＡ３ 诱导下，犕狊犇犉犚基因表达受到抑制；在黑暗条件下，该
基因被诱导表达。由此推测“中苜一号”苜蓿中可能存在不依赖于ＧＡ３ 信号的单宁合成途径。
关键词：紫花苜蓿；二氢黄酮醇还原酶基因；实时荧光定量ＰＣＲ
中图分类号：Ｓ８１６；Ｓ５４１＋．１０３；Ｑ９４３．２　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１２）０２０１２３１０
　 紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）是世界上广泛栽培的一种多年生豆科牧草，它不仅产量高而且营养丰富，被誉
为“牧草之王”［１，２］。然而反刍动物大量采食后易发生臌胀病，严重限制了这种优良牧草在畜牧业中的应用。浓
缩单宁（ｃｏｎｄｅｎｓｅｄｔａｎｎｉｎｓ，ＣＴ）长期以来一直被认为是一种抗臌胀病因子，可抑制瘤胃微生物对牧草中蛋白质
的脱氨基作用，形成大量过瘤胃蛋白，使得其在家畜小肠中得到更好的吸收利用［３］。目前在许多豆科植物中均发
现浓缩单宁，但其含量差异较大，如百脉根（犔狅狋狌狊犮狅狉狀犻犮狌犾犪狋狌狊）、红豆草（犗狀狅犫狉狔犮犺犻狊狏犻犮犻犪犲犳狅犾犻犪）、小冠花（犆狅狉狅
狀犻犾犾犪狏犪狉犻犪）等豆科牧草浓缩单宁含量相当高，因此不会引起家畜臌胀病的发生，而紫花苜蓿、白三叶（犜狉犻犳狅犾犻狌犿
狉犲狆犲狀狊）、红三叶（犜狉犻犳狅犾犻狌犿狆狉犪狋犲狀狊犲）等豆科牧草其含量非常低，极易引起家畜臌胀病［４］。二氢黄酮醇还原酶
（ｄｉｈｙｄｒｏｆｌａｖｏｎｏｌｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＤＦＲ）是花青素和单宁合成途径中的关键酶，是一个重要的分支点［５］。因此，克隆紫
花苜蓿中的ＤＦＲ基因对于研究调控单宁合成途径的分子机制有重要的意义。
浓缩单宁也被称为原花青素（ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ），是黄酮类化合物的聚合物，是黄酮类化合物生物合成中的
一个重要的分支产物，该途径位于苯丙烷途径下游，主要以花青素作为前体物质，通过一步或多步酶促反应而形
成。二氢黄酮醇还原酶是类黄酮途径中合成花青素和原花青素的关键酶，该酶可将二氢黄酮醇还原为相应的黄
烷３，４二元醇［６］。目前已从多种植物中分离克隆出ＤＦＲ基因，发现ＤＦＲ酶为单基因或多基因编码。ＤＦＲ蛋白
可以与带有不同羟基形式的二氢黄酮醇结合，比如二氢三羟黄酮醇（ＤＨＫ）、二氢榭皮素（ＤＨＱ）、二氢杨梅素
（ＤＨＭ）等均可作为底物。在辅助因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（ＮＡＤＰ）作用下，发生还原反应，生成无色花
青素（ｌｅｕｅｏｎａｔｈｏｅｙｎａｉｄｉｎ，即黄烷３，４二元醇ｆｌａｖａｎ３，４ｄｉｏｌｓ），无色花青素又在无色花青素还原酶（ｌｅｕｅｏｎａｈｔｏ
ｅｙｎａｉｄｉｎｅｒｄｕｅｔａｓｅ，ＬＡＲ）催化下进一步缩合而成［５］。
目前，单宁合成途径已经大致清楚，培育单宁含量相对较高的苜蓿是一个亟待解决的难题。本研究从中苜一
号紫花苜蓿中克隆了１个ＤＦＲ基因，并进一步分析其核苷酸序列和编码的蛋白序列，以及在不同逆境胁迫下，
ＤＦＲ基因的表达情况，为阐明ＤＦＲ基因在浓缩单宁合成途径中的重要作用，培育抗臌胀病苜蓿新品种提供理论
依据。
第２１卷　第２期
Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．２
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
１２３－１３２
２０１２年４月
 收稿日期：２０１１１１２５；改回日期：２０１１１２３０
基金项目：十二五科技支撑项目（２０１１ＢＡＤ１７Ｂ０１），中国农业科学院基本科研业务费（２０１１ｃｊ１６）和农业部物种资源保护项目资助。
作者简介：董洁（１９８２），女，山西太原人，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｄｏｎｇｊｉｅ１９８０＠１２６．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｘｍ＠ｉａｓｃａａｓ．ｎｅｔ．ｃｎ
１　材料与方法
１．１　材料
中苜一号紫花苜蓿 （犕．狊犪狋犻狏犪ｃｖ．ＺｈｏｎｇｍｕＮｏ．１）由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所草业资源实验
室提供。２００９年６月种植于农业科学院试验田。
１．２　试剂
ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ购自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司；ｐＭＤ１８Ｔｖｅｃｔｏｒ，Ｔ４ＤＮＡ连接酶购自ＴａＫａＲａ公司产品；ＤＮＡ
ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔＫｉｔ购自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司；Ｔｒｉｚｏｌ总 ＲＮＡ 提取试剂盒为Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品；ＳＭＡＲＴＴＭ ＲＡＣＥ
ｃＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ购自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司。
１．３　方法
１．３．１　中苜一号苜蓿ＤＦＲ基因ｃＤＮＡ序列的克隆　按照ＲＮＡ提取试剂盒提取中苜一号苜蓿幼果总ＲＮＡ，以
其为模版，用ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）试剂盒反转录合成ｃＤＮＡ第１链。根据ＧｅｎＢａｎｋ已登录的近缘
植物ＤＦＲ基因序列，应用Ｐｒｉｍｅｒ５．０软件设计特异性引物：正向引物Ｐ１：ＧＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＡＴＧＧＡＴＴＴＴ
ＧＡＧ；反向引物Ｐ２：ＡＡＴＣＡＣＴＧＣＣＣＴＴＴＣＴＣＣＴＡＴＣＡＣ。
以ｃＤＮＡ第１链为模板，用引物Ｐ１、Ｐ２进行ＰＣＲ扩增，获得中苜一号苜蓿ＤＦＲ基因片段。５′和３′ＲＡＣＥ
ＲｅａｄｙｃＤＮＡ的合成参照ＳＭＡＲＴＴＭＲＡＣＥｃＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ试剂盒。根据所获得的片段设计基因特
异引物：
ＧＰＳ１：ＣＣＧＴＡＧＡＴＴＧＡＴＴＴＡＣＡＣＡＴＣＧＴＣＣＧＣＣ；ＧＰＳ２：ＧＧＧＣＡＧＴＧＡＴＴＡＧＧＣＴＡＧＧＴＧＧＣＡＴ
ＡＧＴ。
用特异性引物ＧＰＳ１、ＧＰＳ２和试剂盒自带引物ＵＰＭ（ｕｎｉｖｅｒｓａｌｐｒｉｍｅｒｍｉｘ）分别扩增中苜一号苜蓿ＤＦＲ基
因的３′端和５′端。ＰＣＲ反应总体系为５０μＬ，５′和３′ＲＡＣＥｒｅａｄｙｃＤＮＡ各２．５μＬ；ＵＰＭ５μＬ，ＧＰＳ１或ＧＰＳ２
各１μＬ；ＰＣＲｇｒａｄｅｗａｔｅｒ３４．５μＬ；１０×ａｄｖａｎｔａｇｅ２ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ５μＬ；ｄＮＴＰＭｉｘ（１０μｍｏｌ／Ｌ）１μＬ；５０×ａｄｖａｎ
ｔａｇｅ２ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｍｉｘ１μＬ。反应条件：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，５个循环；９４℃３０ｓ，７０℃
３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，５个循环；９４℃３０ｓ，６８℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，２５个循环；最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。测序后，利用
ＤＮＡＭＡＮ５．０软件拼接出全长ｃＤＮＡ 序列，利用 ＤＮＡｓｔａｒ软件寻找最大开放阅读框 ＯＲＦ（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇ
ｆｒａｍｅ，ＯＲＦ），在ＯＲＦ两端分别设计全长引物：
正向引物Ｐ３：ＴＣＡＣＡＣＡＴＴＧＴＣＴＣＣＡＴＴＣＣＡＴＣＴ；反向引物Ｐ４：ＡＡＧＡＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＴＣＡＣＡＧＡ
ＣＡ。
ＰＣＲ扩增得到ＤＦＲ基因的ｃＤＮＡ全长序列。
１．３．２　ＤＦＲ基因生物信息学分析　对中苜一号苜蓿ＤＦＲ基因序列及其编码蛋白的结构功能进行生物信息学
分析。利用ＤＮＡＭＡＮ软件对ＤＦＲ基因全长ｃＤＮＡ序列进行分析，获得该序列的氨基酸序列、分子量和等电点
等，并根据其氨基酸序列进行同源性分析。利用ＳＭＡＲＴ工具对推测的氨基酸序列进行功能预测，分析其结构
域，验证是否为ＤＦＲ基因家族中的新成员。
１．３．３　ＤＦＲ基因结构分析　利用十六烷基三甲基溴化铵法（ＣＴＡＢ法）［７］提取中苜一号苜蓿基因组ＤＮＡ，分别
以ＤＮＡ和ｃＤＮＡ为模板，利用引物Ｐ３和Ｐ４进行ＰＣＲ扩增，琼脂糖凝胶电泳检测目的基因是否含有内含子。
之后进一步测序分析基因序列信息。
１．３．４　ＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲ分析ＤＦＲ基因的组织特异性表达模式　在紫花苜蓿的开花后期进行取样，从同一株上
分别提取根、茎、叶、花、荚果的总ＲＮＡ，之后利用ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）试剂盒反转录合成ｃＤＮＡ。
根据犕狊犇犉犚基因的ｃＤＮＡ序列设计引物：
ＭｓＤＦＲＲＴＦ：ＣＣＡＡＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＡＴＧＡＡ；ＭｓＤＦＲＲＴＲ：ＡＣＡＧＣＴＣＴＣＡＴＣＣＣＡＣＡＡＧＧ。
根据紫花苜蓿的Ａｃｔｉｎ基因序列设计引物：
ＭｓＡｃｔｉｎＲＴＦ：ＧＡＧＣＧＴＴＴＣＣＧＴＴＧＴＣＣＴＧＡ；ＭｓＡｃｔｉｎＲＴＲ：ＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＧＧＡＡＧＣＣＡＡＡ。
ＭｓＡｃｔｉｎ基因作为内标对所有的ｃＤＮＡ模板进行荧光定量分析。参考ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＴＭ（ＴａＫａＲａ，
４２１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．２
Ｊａｐａｎ）说明书，用ＡＢＩＰＲＩＳＭ７５００进行ＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲ扩增，反应程序：第１步：９５℃ 预变性３０ｓ；第２步：
９５℃５ｓ，６０℃３４ｓ，４０个循环，每个ｃＤＮＡ样品做３次重复。根据得到的Ｃｔ值，利用Ｋｅｎｎｅｔｈ和Ｔｈｏｍａｓ［８］报道
的方法即２△△Ｃｔ方法，分别计算犕狊犇犉犚基因在根、茎、叶、花、荚果中的表达量。把根中表达量设为对照，利用公
式△△Ｃｔ＝（ＣｔＴａｒｇｅｔ－ＣｔＡｃｔｉｎ）处理－（ＣｔＴａｒｇｅｔ－ＣｔＡｃｔｉｎ）对照，ＣｔＴａｒｇｅｔ为目标基因的拷贝数；ＣｔＡｃｔｉｎ为对照基因的拷贝数，
分别计算出根、茎、叶、花和荚果的２△△Ｃｔ值和标准误Ｓ．Ｅ．，绘出柱形图。以上数据均采用ＡＢＩｐｒｉｓｍ７５００ＳＤＳ
１．１软件分析。
１．３．５　ＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲ检测犕狊犇犉犚基因在不同逆境胁迫下的表达量　将中苜一号苜蓿的种子用 ＨｇＣｌ２ 消毒
以后，播种于铺有２层滤纸的培养皿中，在光照培养箱（２４℃，１６ｈ／光照，８ｈ／黑暗）中培养至种子发芽，将发芽后
的幼苗移至蛭石与珍珠岩比例为３∶１的花盆中继续培养３０ｄ。幼苗分别用２５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液和５０
μｍｏｌ／ＬＧＡ３ 溶液处理０，２，４，８，１２，２４ｈ；黑暗处理０，１２，２４，４８，７２ｈ。分别提取叶中总ＲＮＡ，利用ｃＤＮＡＳｙｎ
ｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）试剂盒反转录合成ｃＤＮＡ第１链用于ＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲ分析不同胁迫、同种胁迫不同时间
犕狊犇犉犚基因的表达量，每个样品３次重复。
２　结果与分析
２．１　犕狊犇犉犚基因全长ｃＤＮＡ的克隆与分析
以中苜一号苜蓿荚果ｃＤＮＡ为模版，利用特异性引物Ｐ１和Ｐ２扩增得到ＤＦＲ基因的中间片段３９３ｂｐ，
ＢＬＡＳＴｘ分析确认得到的片段是苜蓿ＤＦＲ基因的一个片段。利用ｃＤＮＡ末端快速克隆技术（ＲＡＣＥ法），分别
用特异性引物扩增出３′末端和５′末端片段，经测序３′末端片段长度为１０１６ｂｐ（图１左），５′末端片段长度为７７８
ｂｐ（图１中），ＢＬＡＳＴｘ比对结果表明为ＤＦＲ的３′末端和５′末端片段。利用ＤＮＡＭＡＮ５．０软件拼接，全长ｃＤ
ＮＡ为１４０２ｂｐ。利用全长引物Ｐ３和Ｐ４，扩增出全长ｃＤＮＡ的ＯＲＦ经测序为１０２３ｂｐ（图１右），对测序结果进
行ＢＬＡＳＴｘ比对分析，所获得序列与蒺藜苜蓿（犕．狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪）、百脉根、大豆（犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓）等ＤＦＲ基因序列有
较高的相似性，与蒺藜苜蓿最高，达到９６％。由此证实获得的序列是源于苜蓿ＤＦＲ基因的全长ｃＤＮＡ序列。将
该基因命名为犕狊犇犉犚。
图１　犇犉犚基因的３′末端片段、５′末端片段和全长犗犚犉
犉犻犵．１　３′犚犃犆犈，５′犚犃犆犈狉犲狊狌犾狋狊犪狀犱犳狌犾犾犲狀犵狋犺犗犚犉狅犳犇犉犚犵犲狀犲
　Ｍ：ＤＮＡＤＬ２０００；１：３′末端片段；２：５′末端片段；３：全长ＯＲＦ。Ｍ：ＤＮＡＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；１：３′ＲＡＣＥｒｅｓｕｌｔｏｆＤＦＲｇｅｎｅ；２：５′ＲＡＣＥｒｅｓｕｌｔｏｆ
ＤＦＲｇｅｎｅ；３：ＴｈｅｆｕｌｌｅｎｇｔｈＯＲＦｏｆＤＦＲｇｅｎｅ．
２．２　ＤＦＲ基因的生物信息学分析
利用ＤＮＡＳｔａｒ６．１３软件对犕狊犇犉犚全长ｃＤＮＡ序列进行分析（图２）。结果表明，该基因序列编码３４０个氨
基酸。推测其分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔ）为３８．４７ｋｄａ，碱性氨基酸（Ｋ、Ｒ）４１个；酸性氨基酸（Ｄ、Ｅ）４６个；疏水氨
基酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｗ、Ｖ）１１９个；极性氨基酸（Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ）７３个。
５２１第２１卷第２期 草业学报２０１２年
用ＮＣＢＩ数据库中的Ｂｌａｓｔ软件将犕狊犇犉犚基因编码的氨基酸序列与数据库中的其他ＤＦＲｓ蛋白序列进行
比较，发现该蛋白与３Ｂｅｔａ羟基类固醇脱氢酶和异构酶家族都有一段保守的氨基酸序列，它们是短链脱氢／还原
酶（ｓｈｏｒｔｃｈａｉｎｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ／ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＳＤＲ）超基因家族中的成员。目前，ＳＤＲ家族的部分成员的结构已经得
到阐明［１０］。ＳＤＲ家族包含了木质素合成途径中的２个关键性酶：桂醇辅酶Ａ和肉桂醇脱氢酶，它们的保守区域
含有１个典型的ｈｅｌｉｘｌｏｏｐｈｅｌｉｘ结构和１个由２６个氨基酸组成的特异性底物结合区。分析表明，犕狊犇犉犚基因
在Ｎ端存在１个与ＮＡＤＰ结合的氨基酸序列“ＶＴＧＡＳＧＦＩＧＳＷＬＶＭＲＬＭＥＲＧＹ”，中部存在１个与底物结合的
功能区域“ＴＬＮＶＴＥＤＱＫＰＬＷＤＥＳＣＷＳＤＶＥＦＣＲＲＶ”（图２）［９１２］。有研究显示，底物结合区域单个氨基酸的改
变将可能导致其结合底物的能力发生改变［１３］。
图２　犇犉犚基因的核苷酸序列和氨基酸序列
犉犻犵．２　犜犺犲狀狌犮犾犲狅狋犻犱犲犪狀犱犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳犇犉犚犵犲狀犲
　下划线部分为ＮＡＰＤ（Ｈ）结合区，阴影部分为底物结合区。ＮＡＰＤ（Ｈ）ｂｉｎｇｉｎｇｓｉｔｅｉｓｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ，ｔｈｅｓｕｂｓｔｒａｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｓｉｔｅｉｓｓｈａｄｅｄ．
使用ＢｌａｓｔＰ２．２．３（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）以及ＤＮＡＭＡＮ软件分析表明犕狊犇犉犚与其他植物的犇犉犚狊
有很高的序列相似性（图３）。其中与蒺藜苜蓿、大豆、蝴蝶豌豆（犆犾犻狋狅狉犻犪狋犲狉狀犪狋犲犪）和百脉根相似性分别为９７％，
９７％，９８％和９８％。此外它与葡萄（犞犻狋犻狊狏犻狀犻犳犲狉犪）、山楂（犆狉犪狋犪犲犵狌狊犿狅狀狅犵狔狀犪）、樱桃（犘狉狌狀狌狊犪狏犻狌犿）和毛果杨
（犘狅狆狌犾狌狊狋狉犻犮犺狅犮犪狉狆犪）的ＤＦＲ氨基酸的相似性也超过了９０％。说明犕狊犇犉犚基因在进化上是高度保守的。
６２１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．２
图３　犕狊犇犉犚蛋白的氨基酸序列与其他植物犇犉犚蛋白氨基酸的多重比对
犉犻犵．３　犛犲狇狌犲狀犮犲犪犾犻犵狀犿犲狀狋狅犳狋犺犲狆狌狋犪狋犻狏犲犕狊犇犉犚狆狉狅狋犲犻狀狑犻狋犺狅狋犺犲狉犱犻犺狔犱狉狅犳犾犪狏狅狀狅犾狉犲犱狌犮狋犪狊犲狊犻狀狆犾犪狀狋狊
　蒺藜苜蓿犕犲犱犻犮犪犵狅狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪ＡＡＲ２７０１４．１；蝴蝶豌豆犆犾犻狋狅狉犻犪狋犲狉狀犪狋犲犪ＢＡＦ４９２９４．１；大豆犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓ＡＡＤ５４２７３．；百脉根犔狅狋狌狊犮狅狉狀犻犮狌犾犪狋狌狊
ＡＡＶ７１１７１．１；莲花犔狅狋狌狊犼犪狆狅狀犻犮狌狊ＢＡＥ１９９５０．１．
７２１第２１卷第２期 草业学报２０１２年
２．３　犕狊犇犉犚基因的结构分析
分别以中苜一号的基因组ＤＮＡ和ｃＤＮＡ为模板，利用全长引物Ｐ３和Ｐ４进行ＰＣＲ扩增。结果表明，来自２
种不同模板的ＰＣＲ扩增产物的大小不同，进一步对２个片段进行克隆和测序，并通过ＳＰＩＤＥＹ软件（ｈｔｔｐ：／／
ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｐｉｄｅｙ／）对比犕狊犇犉犚基因组ＤＮＡ序列与ｃＤＮＡ序列，发现犕狊犇犉犚基因由６个外显
子和５个内含子组成（图４）：第１个内含子长度为１９１ｂｐ，第２个内含子长度为１８４６ｂｐ，第３个内含子为１４４
ｂｐ，第４个为２０１ｂｐ，第５个为１００ｂｐ，并且这些内含子严格遵守真核生物典型的内含子ＧＴ…ＡＴ法则。
图４　犕狊犇犉犚基因的外显子和内含子示意图
犉犻犵．４　犛犮犺犲犿犲狊狅犳犲狓狅狀／犻狀狋狉狅狀狅狉犵犪狀犻狕犪狋犻狅狀狅犳犕狊犇犉犚犵犲狀犲
　外显子（Ｅｘ）为阴影部分箭头，内含子（Ｉｎｔ）为透明部分箭头，两端横线为非编码区（ＵＴＲ）。Ｔｈｅｅｘｏｎ（Ｅｘ）ｉｓｍａｒｋｅｄｗｉｔｈｓｈａｄｅｄａｒｒｏｗ，ｔｈｅｉｎｔｒｏｎｓ
（Ｉｎｔ）ａｒｅｍａｒｋｅｄｗｉｔｈｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔａｒｒｏｗ，ｂｏｔｈｅｎｄｏｆｔｈｅｌｉｎｅａｒｅｕｎｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎ（ＵＴＲ）．
２．４　犕狊犇犉犚基因的组织特异性表达模式分析
图５　犕狊犇犉犚基因在紫花苜蓿不同组织中的相对表达量
　犉犻犵．５　犜犺犲狉犲犾犪狋犻狏犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狅犳犕狊犇犉犚犵犲狀犲犻狀
犱犻犳犳犲狉犲狀狋狋犻狊狊狌犲狊狅犳犕．狊犪狋犻狏犪
在紫花苜蓿开花后期进行取样，从同一株植株的
根、茎、叶、花和荚果中分别提取总 ＲＮＡ，反转录为
ｃＤＮＡ后进行 犕狊犇犉犚 基因的 ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ 分析
（图５）。结果表明，该基因在根、茎、叶、花和荚果中均
有表达。该基因在根中表达量最低，其次为盛花、初
花、茎和叶。在荚果中的表达量最高，为根中的６３．７
倍，叶中的１．２倍。
２．５　不同逆境胁迫下犕狊犇犉犚基因表达量的研究
利用ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ检测了多种胁迫下 犕狊犇犉犚
基因在叶中的表达情况（图６）。结果显示，盐胁迫对
基因表达有一定影响，特别是在处理前期对 犕狊犇犉犚
基因的表达量有明显的抑制作用，随着处理时间的延
长对犕狊犇犉犚基因表达量的影响不显著。但是，犕狊犇
犉犚基因受到光照条件的调节，在黑暗条件下，４８ｈ后表达量逐渐上升，３ｄ后表达仍处于上升期，为对照的４．２
倍。由于赤霉素（ＧＡ３）是协调花色素苷合成基因表达的信号，因此检测了外源激素ＧＡ３ 对犕狊犇犉犚基因表达的
调控。外源激素ＧＡ３ 对犕狊犇犉犚基因的表达有一定的抑制作用（图６）。
３　讨论
单宁类化合物是黄酮类化合物生物合成（ｆｌａｖｏｎｏｉｄｐａｔｈｗａｙ）中的一个重要分支产物，该途径位于苯丙烷途
径（ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄｐａｔｈｗａｙ）下游，主要以花青素作为前体物质，通过一步或多步酶促反应而形成［１４］。Ｆｏｒｋ
ｍａｎｎ和Ｓｔｅｆａｎ［１６］研究表明，ＤＦＲ是缩合单宁生物合成中重要的关键酶［１７］。目前已从多种植物中分离克隆出
ＤＦＲ基因，这些植物的ＤＦＲ酶为单基因或多基因编码。一些观赏植物的花朵颜色可通过ＤＦＲ基因表达水平的
控制而被改变，也有研究表明将ＤＦＲ基因导入百脉根中可以改变其中原花青素的含量水平［１５，１６］。
８２１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．２
犕狊犇犉犚编码的蛋白具有典型的ＤＦＲ蛋白功能结
图６　犕狊犇犉犚基因在受到犖犪犆犾、犌犃３ 诱导和
黑暗处理后的相对表达量
犉犻犵．６　犜犺犲狉犲犾犪狋犻狏犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狅犳犕狊犇犉犚犵犲狀犲
犻狀犱狌犮犲犱犫狔犖犪犆犾，犌犃３犪狀犱犱犪狉犽狋狉犲犪狋犿犲狀狋狊
构域：它们大都是短链脱氢／还原酶（ＳＤＲ）家族，是
ＮＡＤＰ依赖的还原酶，通常具有２个结构域，第１个
结构域是ＮＡＤＰ结合区，第２个结构域是决定底物的
特异性氨基酸结合区。不同植物的ＤＦＲ氨基酸序列
在多个区域有较高的同源性，ＤＦＲ氨基酸序列中的
ＮＡＤＰＨ结合位点是高度保守的，由２６个氨基酸序列
组成的底物特异性结合区也是高度保守的［１１，１２］。本
实验发现，紫花苜蓿ＤＦＲ氨基酸序列的 Ｎ端存在１
个ＮＡＤＰ结合位点“ＶＴＧＡＳＧＦＩＧＳＷＬＶＭＲＬＭＥＲ
ＧＹ”，中部也存在一个底物特异性结合的氨基酸基序
“ＴＬＮＶＴＥＤＱＫＰＬＷＤＥＳＣＷＳＤＶＥＦＣＲＲＶ”。Ｊｏｈｎ
ｓｏｎ等［１８］发现，第１３４和１４５位氨基酸可直接影响酶
的底物结合的特异性，大多数植物在１３４位是Ｄ（天冬
氨酸）或Ｎ（天冬酰胺），紫花苜蓿中的ＤＦＲ在１３４位
是Ｄ（天冬酰胺），因此，其ＤＦＲ酶作用的底物为二氢
山柰素（ＤＨＫ）和二氢榭皮素（ＤＨＱ）［１７］。在这个区域
的下游还含有１个β垂直环α螺旋的次级结构，如果
环的长度不同，它们所结合的底物也将不同［１９２１］。
通过与已知植物ＤＦＲ氨基酸序列比对，紫花苜蓿
的ＤＦＲ与已克隆的蒺藜苜蓿ＤＦＲ基因编码的氨基酸
序列相似度非常高，仅在Ｃ末端存在一些氨基酸残基
的差异。大多数植物ＤＦＲ基因都由６个外显子和５
个内含子组成，如拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）、矮
牵牛（犘犲狋狌狀犻犪犺狔犫狉犻犱犪）和金鱼草（犃狀狋犻狉狉犺犻狀狌犿犿犪
犼狌狊）等的ＤＦＲ基因，它们的内含子剪切位点都大致相
同［２２］。本实验从紫花苜蓿中得到的犕狊犇犉犚的ＤＮＡ
序列也是由６个外显子和５个内含子组成，说明该基
因在进化上是比较保守的，这类基因可能具有较为重
要的功能。
单宁合成途径中，各功能基因在同一植物不同器
官，以及同一器官不同部位的表达量均有差异。Ｔｕｎｅｎ等［２３］研究发现矮牵牛（犘犲狋狌狀犻犪犺狔犫狉犻犱犪）中２种花色素苷
合成酶基因（查尔酮合成酶犆犎犛基因和查耳酮异构酶犆犎犐基因）的表达存在组织特异性，同时受到光照以及花
自身发育的调控。Ｈｅｌａｒｉｕｔｔａ等［２４２６］研究发现非洲菊（犌犲狉犫犲狉犪犼犪犿犲狊狅狀犻犻）中犌犆犎犛１和犌犆犎犛３基因的表达主
要位于冠毛和舌状花瓣中，而犌犆犎犛２则在植物营养器官和生殖器官中均有表达。犌犇犉犚１的表达在非洲菊的不
同部位也是不同的。本实验的组织特异性结果表明，犕狊犇犉犚基因在荚果中的表达量最大。Ｘｉｅ等［２８］从蒺藜苜
蓿中克隆了犕狋犇犉犚１和犕狋犇犉犚２两个基因，这２个基因也是在荚果和花中表达最丰富。
Ｓｉｎｇｈ等［２９］研究发现在茶树（犆犪犿犲犾犾犻犪狊犻狀犲狀狊犻狊）中，犇犉犚 基因在受到干旱和盐胁迫时，表达量有所上升。
Ｊｅｙａｒａｍｒａｊａ等［３０］研究发现在茶树中，水分胁迫条件下，花色素合成途径中的苯丙氨酸解氨酶ＰＡＬ基因表达量
下调。本实验中，犕狊犇犉犚基因在盐胁迫处理前期，其表达量受到明显的抑制，但随着处理时间的延长，盐胁迫对
该基因的表达量影响不显著。结果表明，当植株受到非生物环境胁迫时，对犇犉犚基因的表达产生一定影响。是
否该基因在逆境胁迫中发挥作用，有待进一步的研究证明。
９２１第２１卷第２期 草业学报２０１２年
光照是花色素苷合成的重要调节因子之一［３１］，不同的光质、光强以及光周期差异均能影响花色素苷的产生
和组成［３２３６］。Ｄｏｎｇ等［３７］研究发现阻断光照后苹果（犕犪犾狌狊狆狌犿犻犾犪）的花不能正常着色，这主要是因为在黑暗条
件下花色素苷合成途径中ＤＦＲ和花青素合成酶ＡＮＳ基因的表达受到抑制［３８，３９］。同时，还发现紫外光促进苹果
花色素苷的积累，而在金鱼草（犃狀狋犻狉狉犺犻狀狌犿犿犪犼狌狊）、老鹤草（犌犲狉犪狀犻狌犿）、绣球（犘犺犾狅狓）和凤仙（犐犿狆犪狋犻犲狀狊）等植
物中，紫外光对花青素苷的合成没有影响。Ｓｈｉｒｌｅｙ等［４０］研究发现在白苏（犘犲狉犻犾犾犪犳狉狌狋犲狊犮犲狀狊）中ＤＦＲ基因的表
达受到顺式作用元件 ＭＹＢＰ１的调节，而编码该蛋白基因的表达受到光照的诱导。Ｋａｔｚ和 Ｗｅｉｓｓ［４１］研究表明光
周期对花色素苷合成酶基因的表达也有影响，在植物花冠中ＣＨＳ基因的表达量在昼夜间存在差异，一般在光周
期末端达到最高［４２］。本实验中，在黑暗条件下紫花苜蓿犕狊犇犉犚基因的表达量随时间的延长快速积累。可见，
犕狊犇犉犚基因可被黑暗条件诱导表达。
ＧＡｓ是一种重要的植物激素，在高等植物生长过程中起到重要的调节作用。植物体内花色素苷的生物合成
需要许多基因在不同时空条件下的顺序表达和协调作用。ＧＡｓ是协调这些基因表达的共同信号，可诱导几乎所
有与花色素苷生物合成相关结构基因的表达，但是目前关于 ＧＡｓ对植物花瓣着色的影响还存在争议［４３，４４］。
Ｓｔｏｄｄａｒｔ等［４５］研究发现在矮化大豆品种中ＧＡ合成的功能丧失，但对于花色素苷的积累没有影响，这可能是因
为大豆花药中ＧＡ的合成受另外基因的调控［４６，４７］。而在绣球中则发现ＧＡ３ 可抑制花色素苷的合成，这种ＧＡ３
非依赖性的合成途径也存在于其他多种植物［４８］。本研究中，在外源激素ＧＡ３ 诱导下，紫花苜蓿ＤＦＲ基因的表
达被抑制，表明它可能属于非ＧＡ３ 依赖型的花色素合成基因。
４　结论
中苜一号苜蓿犕狊犇犉犚基因全长ｃＤＮＡ为１４０２ｂｐ，与蒺藜苜蓿相似性达９６％。通过ＳＰＩＤＥＹ软件对比
犕狊犇犉犚基因组ＤＮＡ序列与ｃＤＮＡ序列，发现犕狊犇犉犚基因由６个外显子和５个内含子组成。该基因在根、茎、
叶、花和荚果中均有表达，在根中表达量最低，在荚果中表达量最高。利用ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ检测了不同逆境胁迫
下犕狊犇犉犚基因的表达，结果表明犕狊犇犉犚基因的表达不受盐胁迫的影响，但受到光照条件的调节，在黑暗条件
下诱导表达量升高，为非ＧＡ３ 依赖型的花色素合成基因。
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［２１］　ＴｈｏｄｅｎＪＢ，ＨｅｇｅｍａｎＡＤ，ＷｅｓｅｎｂｅｒｇＧ，犲狋犪犾．ＳｔｒｕｃｔｕｒｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆＵＤＰｓｕｇａｒｂｉｎｄｉｎｇｔｏＵＤＰｇａｌａｃｔｏｓｅ４ｅｐｉｍｅｒａｓｅ
ｆｒｏｍ犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７，３６（２１）：６２９４６３０４．
［２２］　ＩｎａｇａｋｉＹ，ＪｏｈｚｕｋａＨＹ，ＭｏｒｉＴ，犲狋犪犾．Ｇｅｎｏｍｉｃｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｇｅｎｅｓｅｎｃｏｄｉｎｇｄｉｈｙｄｒｏｆｌａｖｏｎｏｌ４ｒｅｄｕｃｔａｓｅｆｏｒｆｌｏｗｅｒ
ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｎｔｈｅＪａｐａｎｅｓｅａｎｄｃｏｍｍｏｎｍｏｒｎｉｎｇｇｌｏｒｉｅｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｅ，１９９９，２２６（２）：１８１１８８．
［２３］　ＴｕｎｅｎＡＪ，ＫｏｅｓＲＥ，ＳｐｅｌｔＣＥ，犲狋犪犾．Ｃｌｏｎｉｎｇｏｆｔｈｅｔｗｏｃｈａｌｃｏｎｅｆｌａｖａｎｏｎｅｉｓｏｍｅｒａｓｅｇｅｎｅｓｆｒｏｍ犘犲狋狌狀犻犪犺狔犫狉犻犱犪：ｃｏｏｒ
ｄｉｎａｔｅ，ｌｉｇｈｔｒｅｇｕｌａｔｅｄａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｆｌａｖｏｎｏｉｄｇｅｎｅｓ［Ｊ］．ＴｈｅＥｕｒｏｐｅａｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎＪｏｕｒ
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ｉｚａｔｉｏｎｏｆｄｆｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｔｈｅｃｏｒｏｌａｓｏｆ犌犲狉犫犲狉犪犺狔犫狉犻犱犪ｖａｒ．Ｒｅｇｉｎａ（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）［Ｊ］．ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１９９３，
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［２５］　ＨｅｌａｒｉｕｔｔａＹ，ＫｏｔｉｌａｉｎｅｎＭ，ＥｌｏｍａａＰ，犲狋犪犾．Ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅｉｎｔｈｅｃｈａｌｃｏｎｅｓｙｎｔｈａｓｅｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｏｆ
Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ：ｅｖｏｌｕｔｉｏｎｗｉｔｈｓｕｂｓｔｒａｔｅｃｈａｎｇｅａｎｄｃａｔａｌｙｔｉｃｓｉｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ
ｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ，１９９６，９３（１７）：９０３３９０３８．
［２６］　ＨｅｌａｒｉｕｔｔａＹ，ＫｏｔｉｌａｉｎｅｎＭ，ＥｌｏｍａａＰ，犲狋犪犾．犌犲狉犫犲狉犪犺狔犫狉犻犱犪（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）ｉｍｐｏｓｅｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎａｔｓｅｖｅｒａｌａｎａｔｏｍｉｃａｌｌｅｖｅｌｓ
ｄｕｒｉｎｇｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｎｔｈｅｇｅｎｅｆｏｒｄｉｈｙｄｒｏｆｌａｖｏｎｏｌ４ｒｅｄｕｃｔａｓｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１９９５，２８（５）：
９３５９４１．
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ｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｎｄｅｎｃｏｄｅｅｎｚｙｍｅｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃａｔａｌｙｔｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｉｎ犌犲狉犫犲狉犪犺狔犫狉犻犱犪（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）［Ｊ］．ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉ
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ＤＯＮＧＪｉｅ，ＷＡＮＧＸｕｅｍｉｎ，ＷＡＮＧＺａｎ，ＧＡＯＨｏｎｇｗｅｎ，ＳＵＮＧｕｉｚｈｉ
（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１９３，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｄｉｈｙｄｒｏｆｌａｖｏｎｏｌｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＤＦＲ）ｉｓａｋｅｙｅｎｚｙｍｅｉｎｃｏｎｄｅｎｓｅｄｔａｎｎｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｐａｔｈｗａｙ．ＡｃＤＮＡ
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犓犲狔狑狅狉犱狊：犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪；ｄｉｈｙｄｒｏｆｌａｖｏｎｏｌｒｅｄｕｃｔａｓｅ；ｄａｒｋｓｅｎｓｉｔｉｖｅ
２３１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．２