全 文 ：马铃薯犛犌犜３基因表达及其启动子功能分析
崔同霞１，白江平１，魏桂民１，赵旭１，２，王蒂１，张金文１
（１．甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室 甘肃省干旱生境作物学重点实验室 甘肃农业大学农学院，
甘肃 兰州７３００７０；２．甘肃省农垦农业研究院，甘肃 武威７３３００６）
摘要：鼠李糖转移酶（ｒｈａｍｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅＳＧＴ３）是植物糖苷生物碱合成的关键酶，它主要调控α茄碱和α查茄碱
从其β形式的转化。本文研究马铃薯栽培种ＳＧＴ３基因的表达特点及其启动子的功能。实时定量ＰＣＲ结果发现
在红光照射２４ｈ后，ＳＧＴ３的表达量是黑暗处理的２６．８倍，说明红光显著诱导了ＳＧＴ３的表达；为进一步分析该基
因的光调控机理，本项研究克隆到ＳＧＴ３上游长度为２４４９ｂｐ的启动子序列，通过分析发现该启动子的转录起始位
点位于翻译起始位点上游－１５２ｂｐ，同时确定了该启动子核心序列及上游增强子、抑制子序列，受病原菌、损伤、干
旱、ＡＢＡ激素及一系列光调控的顺式元件。构建不同长度（３４９，５７２，９７９，１３１２和１８７０ｂｐ）的该启动子驱动报告基
因ＧＵＳ的植物表达载体并转化烟草。结果证明，不同长度的ＳＧＴ３启动子都可以启动ＧＵＳ表达，但没有ＣＭＶ
３５Ｓ启动的ＧＵＳ表达量高；其中在Ｐ５７２和Ｐ９７９的表达强度较高，这可能与该片段含有启动子的正调控元件（ＧＡ
ＴＡＢＯＸ，５′ＵＴＲＰＹＲＩＣＨＳＴＲＥＴＣＨ）有关，ＧＵＳ表达强度在Ｐ１３１２和Ｐ１８７０中明显减弱，预测到该区段存在抑
制基因表达的负调控元件（ＷＲＫＹ７１０Ｓ）；ＳＧＴ３启动子的组织特异性实验表明ＧＵＳ染色主要集中在烟草叶片的叶
脉部分，茎中的表皮、韧皮部及木质部，但髓部几乎不表达，根中主要分布在根冠、分生区以及维管束组织中。上述
结果为将来研究ＳＧＴ３在糖苷生物碱合成过程中的调节功能提供了依据。
关键词：ＳＧＴ３；基因表达；启动子；功能分析
中图分类号：Ｓ５３２．０３；Ｑ９４３．２　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１４）０２０１９６１１
犇犗犐：１０．１１６８６／ｃｙｘｂ２０１４０２２４　　
　　糖苷生物碱（ｓｔｅｒｏｉｄａｌｇｌｙｃｏａｌｋａｌｏｉｄｓ，ＳＧＡｓ）是茄科和百合科等许多植物主要的次生代谢产物。它具有强
大的溶解特性和抑制乙酰胆碱酯酶活力［１２］。它可以麻痹呼吸系统和运动系统中枢神经，并有溶血和刺激、腐蚀
粘膜的作用，甚至有致畸和致死的可能。在马铃薯（犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿）中，当ＳＧＡ含量超过２００ｍｇ／ｋｇＦＷ
时，严重影响食味并且威胁食品安全性［３］。但是，ＳＧＡｓ能阻止动物或昆虫的取食及微生物的攻击［４５］，这为育种
家培育抗病虫害的品种奠定了良好的基础。
糖苷生物碱的含量与外界条件有一定的关系。当温度达到１０℃时，长期贮藏的马铃薯块茎中的ＳＧＡｓ含量
可以增加到５１８ｍｇ／ｋｇＦＷ［６］，而且随着贮藏时间的延长，特别是贮藏期间见光，薯皮变绿，ＳＧＡｓ的含量明显增
加。本课题组在前期的研究中发现红光对块茎ＳＧＡｓ含量有明显的诱导作用，其次为蓝光［７］。在马铃薯栽培种
中α茄碱和α查茄碱是２个天然存在的主要类固醇糖苷生物碱，占总生物碱苷类的９５％，这两种生物碱具有协
同增效作用，被糖苷生物碱合成代谢支路的末端茄啶糖基转移酶 （ｓｏｌａｎｉｄｉｎｅｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ）催化。目前，
已鉴定并克隆出的３个糖基转移酶［８］，分别是茄啶半乳糖基转移酶 （ｓｏｌａｎｉｄｉｎｅｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＳＧＴ１）、
茄啶葡萄糖基转移酶 （ｓｏｌａｎｉｄｉｎｅｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＳＧＴ２）和鼠李糖转移酶 （ｒｈａｍｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＳＧＴ３），
其中ＳＧＴ１和ＳＧＴ２分别催化产生γ茄碱和γ查茄碱，ＳＧＴ３催化β茄碱和β查茄碱转化为其相应的α形
式［９１０］。为了进一步研究此类基因的表达特点以及调控机制，Ｒｏｃｋｈｏｌｄ等［１１］已经克隆到ＳＧＴ２启动子，并将其
构建β葡糖醛酸酶（βｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ，ＧＵＳ）融合表达载体导入到马铃薯中，发现叶片中的ＧＵＳ的表达量明显高
１９６－２０６
２０１４年４月
　　　草　业　学　报　　　
　　　ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　
第２３卷　第２期
Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．２
收稿日期：２０１３０３２０；改回日期：２０１３０４０２
基金项目：９７３计划前期研究专项（２０１０ＣＢ１３４４０４）和国家自然科学基金项目（３１２６０３４３）资助。
作者简介：崔同霞（１９８８），女，甘肃兰州人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｃｔｘｃｕｉ＠１６３．ｃｏｍ。白江平（１９７８），男，甘肃天水人，副教授。Ｅｍａｉｌ：ｂａｉｊｐ＠
ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。 对本论文贡献相同。
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｄ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ，ｊｗｚｈａｎｇ３０５＠１６３．ｃｏｍ
于块茎中的，但均低于阳性对照ＣＭＶ３５Ｓ（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ）启动子驱动的转基因植物。对于马铃薯
ＳＧＴ１和ＳＧＴ３两种糖基转移酶的调控与启动子功能的研究尚未见报道。
本研究拟通过红光诱导处理，研究马铃薯糖苷生物碱合成代谢关键酶ＳＧＴ３的基因光诱导表达特点；确定并
克隆ＳＧＴ３基因启动子序列，通过用ＰＬＡＮＴＣＡＲＥ和ＰＬＡＣＲＥ软件对启动子序列进行分析，构建不同缺失片
段启动子与报告基因ＧＵＳ的融合基因，进行烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿）的瞬时表达和稳定遗传转化，检测不同缺
失片段启动子驱动的转基因植株中报告基因的表达水平，以此分析马铃薯ＳＧＴ３基因启动子的功能。
１　材料与方法
１．１　植物材料
马铃薯栽培种
$
薯３号的无菌组培苗、微型薯以及四倍体烟草品系Ｔ１２均由甘肃省作物遗传改良与种植创
新重点实验室提供。
１．２　菌株和质粒
大肠杆菌（犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻）ＤＨ５α、农杆菌 （犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊）ＬＢＡ４４０４、表达载体ｐＢＩ１２１（图１）
均由本实验室保存。ＳＧＴ３启动子（ＮＣＢＩ注册号：ＫＣ３３１０３７）。中间载体ｐＧＥＭ?－ＴＥａｓｙ载体、限制性内切酶
和Ｔ４ＤＮＡ连接酶购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司（ＳａｎｇｏｎＢｉｏｔｅｃｈＣｏ．，Ｌｔｄ．
Ｓｈａｎｇｈａｉ）合成。ＤＮＡ凝胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司 （ＴｉａｎｇｅｎＢｉｏｔｅｃｈＣｏ．，Ｌｔｄ．Ｂｅｉ
ｊｉｎｇ）。其他生化试剂均为国产分析纯。
图１　表达载体狆犅犐１２１犜犇犖犃结构示意图
犉犻犵．１　犜犇犖犃狊狋狉狌犮狋狌狉犲犱犻犪犵狉犪犿狅犳犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狏犲犮狋狅狉狆犅犐１２１
　ＲＢ，ＬＢ：ＴＤＮＡ的右边界序列和左边界序列ＴｈｅｒｉｇｈｔｂｏｒｄｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｔｈｅｌｅｆｔｂｏｒｄｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＴＤＮＡ；ＮＯＳｐｒｏ，ＮＯＳｔｅｒ：ＮＯＳ基因启动
子和终止子 ＮＯＳｐｒｏｍｏｔｅｒａｎｄｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ；ｎｐｔＩＩ（Ｋａｎ’）：卡那霉素抗性基因 Ｋａｎａｍｙｃｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅ；ＨｉｎｄⅢ，ＢａｍＨⅠ：ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨⅠ限制
性内切酶 ＨｉｎｄⅢａｎｄＢａｍＨⅠｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｓｉｔｅｓ；ＣａＭＶ３５Ｓ：花椰菜花叶病毒基因的启动子Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｇｅｎｅｐｒｏｍｏｔｅｒ；ＧＵＳ：β葡糖醛酸
酶基因βｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅｇｅｎｅ；ＡＴＧ，ＴＧＡ：ＧＵＳ基因的转录起始密码子和终止密码子 ＧＵＳｇｅｎｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．
　
１．３　材料处理
用自来水冲洗试管微型薯，选择平均直径约为８ｍｍ的微型薯分为２组，均保存在１５℃黑暗培养箱。其中
一组用锡箔纸包裹作为黑暗对照，另一组用１５Ｗ 的红灯泡照射（１９．６～１９．７ｍｏｌ／ｍ２·ｓ）。分别在６，１２，２４ｈ
后收集样品并立即液氮处理后放在—８０℃冰箱待用，以新鲜收获的微型薯作为对照。
１．４　总ＲＮＡ提取及其反转录
从冷冻的微型薯中提取总ＲＮＡ，具体操作根据ＳｉｍｐｌｅＴｏｔａｌＲＮＡ 试剂盒的说明 （ＴｉａｎｇｅｎＢｉｏｔｅｃｈＣＯ．，
ＬＴＤＢｅｉｊｉｎｇ）。总ＲＮＡ的浓度测定用 Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ１１００ｐｒｏ分光光度计 （ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ），用２６０／２８０
ｎｍ 的吸光值检测ＲＮＡ的质量，其完整性用１％ 的琼脂糖胶电泳检测［１２］。定量４００ｎｇＲＮＡ 进行反转录，具体
操作根据ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ? ＲＴｒｅａｇｅｎｔＫｉｔ（ＴａＫａＲａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．，ＬｔｄＤａｌｉａｎ），其中包括基因组ＤＮＡ的去
除。
１．５　实时定量ＰＣＲ
实时定量ＰＣＲ以马铃薯延伸因子（ｅｆ１α）作为看家基因，马铃薯ＳＧＴ３基因作为目的基因，其ｃＤＮＡ序列均
从ＧｅｎＢａｎｋ数据库 （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）获得，引物设计用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５．０（ＰＲＥＭＩＥＲＢｉｏ
ｓｏｆｔＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）软件完成（表１）。实时定量ＰＣＲ用ＳＹＢＲＧｒｅｅｎⅠ作染料，Ｍｘ３００５ｐＭｕｌｔｉｐｌｅｘＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ
７９１第２３卷第２期 草业学报２０１４年
ＰＣＲＳｙｓｔｅｍ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）完成整个实验，用２０μＬ反应体系，如下：１０μＬ２×ＳＹＢＲ?ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ
ＴＭ（ＴａＫａ
ＲａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．，ＬｔｄＤａｌｉａｎ），０．４μＬＲＯＸＲｅｖｅｒｅｎｃｅＤｙｅ（５０Ｘ），１μＬｃＤＮＡ，上下游引物的终浓度均为
０．４μｍｏｌ／Ｌ，循环体系为：９５℃３０ｓ，４０个循环（９５℃５ｓ，６０℃３０ｓ），以溶解曲线检查产物扩增的特异性：９５℃
１５ｓ，６０℃１ｍｉｎ，９５℃１５ｓ。所有样品重复３次，取平均值，实时定量ＰＣＲ体系做２～３次重复以保证体系的稳
定性。最终ＰＣＲ产物用２％ 琼脂糖胶电泳分离，证实产物的特异性。ＣＴ值通过 Ｍｘ３００５ｐＭｕｌｔｉｐｌｅｘＱｕａｎｔｉｔａ
ｔｉｖｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍ 得出，用Ｅｘｃｅｌ２００３进行数据分析，ＳＰＳＳ１７．０软件对数据进行邓肯法多重性显著性分析。相
对表达量用ΔΔＣＴ法计算［１３］。即相对表达量＝２－ΔΔＣＴ，其中ΔΔＣＴ＝ＣＴ（未知—看家基因）—ＣＴ（对照—看家
基因）。
表１　实验所需引物序列
犜犪犫犾犲１　犘狉犻犿犲狉狊犲狇狌犲狀犮犲狊狌狊犲犱犳狅狉狋犺犻狊狑狅狉犽
名称
Ｎａｍｅ
上游引物序列（５′－３′）
Ｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ
下游引物序列（５′－３′）
Ｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ
产物长度
Ｐｒｏｄｕｃｔｌｅｎｇｔｈ（ｂｐ）
产物Ｔｍ值
Ｔｍ（℃）
实时定量ＰＣＲ引物ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲｐｒｉｍｅｒ
ｅｆ１α ＡＴＴＧＧＡＡＡＣＧＧＡＴＡＴＧＣＴＣＣＡ ＴＣＣＴＴＡＣＣＴＧＡＡＣＧＣＣＴＧＴＣＡ １０１ ８８．３
ＳＧＴ３ ＡＧＡＧＧＡＧＴＡＡＡＡＧＧＧＴＧＧＣＡＴ ＡＧＣＡＡＡＣＡＡＡＧＡＧＡＡＣＧＧＡＧＴ １８４ ８２．３
克隆引物Ｃｌｏｎｅｐｒｉｍｅｒ
Ｐ１ ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＴＧＣＧＡＡＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧ
ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＡＡＣＡＡＧＴＴＧＴＴＣＣＴＴＣＡＣＴＴ
３４９ ８０．０
Ｐ２ ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＴＴＴＧＴＡＡＣＧＡＣＣＴＧＡＴＴＣＴＧＴＣ ５７２ ８０．９
Ｐ３ ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＴＴＴＴＧＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＣ ９７９ ８０．０
Ｐ４ ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＧＴＴＴＧＧＴＧＧＣＡＧＴＣ １３１２ ８１．２
Ｐ５ ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＧＴＡＡＡＣＡＧＴＡＴＴＴＣＣＣＣＣＧ １８７０ ８０．８
　注：其中ｅｆ１α和ＳＧＴ３分别代表实时定量的内参基因引物和目的基因引物。Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３，Ｐ４和Ｐ５分别代表５个缺失片段的上游引物和１个下游
引物（Ｒ）。下划线代表酶切位点 ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨⅠ，前面为保护碱基。
　Ｎｏｔｅ：ｅｆ１αａｎｄＳＧＴ３ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔｈｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｇｅｎｅｐｒｉｍｅｒａｎｄｔｈｅｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｐｒｉｍｅｒｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３，Ｐ４ａｎｄＰ５ｓｔａｎｄｆｏｒｆｉｖｅｍｉｓｓｉｎｇ
ｆｒａｇｍｅｎｔｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒａｎｄａｃｏｍｍｏｎｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ．ＵｎｄｅｒｌｉｎｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅＨｉｎｄⅢａｎｄＢａｍＨⅠｓｉｔｅｓ。
１．６　马铃薯ＳＧＴ３基因启动子的序列分析
启动子序列分析采用ＰＬＡＮＴＣＡＲＥ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｐｓｂ．ｕｇｅｎｔ．ｂｅ／ｗｅｂｔｏｏｌｓ／ｐｌａｎｔｃａｒｅ／ｈｔｍｌ／）和
ＰＬＡＣＲＥ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ＰＬＡＣＥ／ｓｉｇｎａｌｕｐ．ｈｔｍｌ）软件分析。
１．７　５′端各缺失片段的获得和Ｔ中间载体的构建
利用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５．０（ＰＲＥＭＩＥＲＢｉｏｓｏｆｔＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）软件设计５个缺失片段上游引物（Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３，
Ｐ４和Ｐ５）和１个通用下游引物（Ｒ）（表１），为方便后续表达载体构建，在上游引物和下游引物５′分别插入ＨｉｎｄⅢ
（ＣＣＣＡＡＧＣＴＴ）和ＢａｍＨⅠ （ＣＧＧＧＡＴＣＣ）酶切位点（表１）。以ＳＧＴ３启动子全序列质粒ＤＮＡ为模板，按以
下条件进行ＰＣＲ扩增：反应体积为２０μＬ，包括１μＬＤＮＡ 模板，１０μＬ１０×ＤＮＡ Ｍｉｘ，１μＬ上游引物（１０
ｍｍｏｌ／Ｌ），１μＬ下游引物（１０ｍｍｏｌ／Ｌ），７μＬｄｄＨ２Ｏ；反应条件为：９５℃预变性５ｍｉｎ；９５℃５ｓ，５５℃１ｍｉｎ；７２℃
１ｍｉｎ；３５个循环后于７２℃保温延伸１０ｍｉｎ，得到５个目标片段 （３４９，５７２，９７９，１３１２和１８７０ｂｐ）。经１％琼脂糖
凝胶电泳分离后用ＤＮＡ凝胶回收试剂盒回收纯化，将得到不同长度的ＰＣＲ产物连接到ｐＧＥＭ?－ＴＥａｓｙ载
体，经过蓝白斑筛选，通过ＰＣＲ检测和酶切检测 （ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨⅠ）选择合适的菌体，测序结果用ＤＮＡＭＡＮ
软件进行序列比对，其相似性均达到９９％以上。将测序合适的５个菌体（Ｐ３４９，Ｐ５７２，Ｐ９７９，Ｐ１３１２和Ｐ１８７０）提
取质粒ＤＮＡ，用 ＨｉｎｄⅢ／ＢａｍＨⅠ双酶切，得到５个小片段；同时用这两种酶双酶切ｐＢＩ１２１质粒，得到切去
ＣＭＶ３５Ｓ启动子的ｐＢＩ１２１大片段。将５个小片段分别和ｐＢＩ１２１大片段连接，得到不同长度的ＳＧＴ３ｐ／ＧＵＳ的
５个植物表达载体，分别命名为Ｐ３４９，Ｐ５７２，Ｐ９７９，Ｐ１３１２和Ｐ１８７０（图２）。以ＣＭＶ３５Ｓ驱动的ｐＢＩ１２１作为阳
８９１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．２
性对照。该载体导入感受态大肠杆菌ＤＨ５α细胞，可利用ｐＢＩ１２１上的ｎｐｔＩＩ基因的卡那霉素抗性进行重组体转
化菌的筛选。用 ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨＩ双酶切验证该重组体。
１．８　烟草的稳定遗传转化和瞬时表达
采用农杆菌介导的烟草叶盘法［１４］将构建好的５个缺失片段表达载体（Ｐ３４９，Ｐ５７２，Ｐ９７９，Ｐ１３１２和Ｐ１８７０）进
行遗传转化，通过生根筛选，１个月后取顶部第３个叶片进行ＧＵＳ组织化学染色，以非转基因烟草为阴性对照
（ＣＫ－），ＣＭＶ３５Ｓ启动子驱动的ＧＵＳ基因的ｐＢＩ１２１转化烟草作为阳性对照 （ＣＫ＋）。瞬时表达将共培养完毕
后的烟草叶片在加入２５０ｍｇ／Ｌ的头孢无菌水中脱菌２ｈ，进行ＧＵＳ组织化学染色，照相并观察。以非转基因烟
草叶片为阴性对照（ＣＫ－），ＣＭＶ３５Ｓ启动子驱动的ＧＵＳ基因的ｐＢＩ１２１转化烟草作为阳性对照 （ＣＫ＋）。
图２　犛犌犜３基因启动子驱动报告基因犌犝犛的融合表达载体构建
犉犻犵．２　犆狅狀狊狋狉狌犮狋犻狅狀狅犳犌犝犛犳狌狊犻狅狀犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狏犲犮狋狅狉犱狉犻狏犲狀犫狔犛犌犜３狆狉狅犿狅狋犲狉
　
１．９　ＧＵＳ组织化学染色
参照张宁［１５］的方法进行ＧＵＳ染色，将转基因烟草的顶部第３个叶片、茎和根进行ＧＵＳ染色，至少选取５株
独立植株进行鉴定。３７℃保温过夜，用７０％的乙醇冲洗４～５次，待阴性对照为白色，将植物的茎切取横截面，放
在载玻片上在正置万能显微镜（ＯＬＹＭＰＵＳＢＸ６１）下进行观察并照相，植物的叶片和根可以直接放在载玻片上
观察。以非转基因烟草为阴性对照（ＣＫ－）。本实验于２０１２年４月－２０１３年３月在甘肃农业大学作物遗传改良
与种质创新重点实验室完成。
２　结果与分析
２．１　红光显著诱导ＳＧＴ３基因的表达
图３　犛犌犜３基因表达特点
犉犻犵．３　犜犺犲犛犌犜３犵犲狀犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀
　　　Ｂ表示暗培养；Ｒ表示红光诱导；表示在０．０５水平差异显著。Ｂ
ｄｅｎｏｔｅｓｔｈｅｄａｒｋｔｒｅａｔｍｅｎｔ；Ｒｄｅｎｏｔｅｓｒｅｄｌｉｇｈｔｉｎｄｕｃｅｄ；ｉｎｄｉｃａｔｅｓ
ａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔｔｈｅ０．０５ｌｅｖｅｌ．
将收获的微型薯通过红光诱导，用实时定量ＰＣＲ
方法测定在处理后６，１２和２４ｈ时ＳＧＴ３基因的相对
表达量。结果显示，ＳＧＴ３基因在１５℃黑暗处理１２ｈ，
其微型薯的 ｍＲＮＡ水平有所升高，但随着时间的增
加并无上升趋势，在处理２４ｈ后反而有所降低，说明
在黑暗处理下，随着时间的变化ＳＧＴ３的含量没有明
显改变。在红光诱导６ｈ后，与黑暗对照相比，ＳＧＴ３
的表达量增加，Ｔｔｅｓｔ结果表明在０．０５水平上其差异
不显著；在红光诱导２４ｈ后，ＳＧＴ３的转录水平较黑
暗对照增加了２６．８倍，且在０．０５水平上差异显著，这
说明红光明显诱导ＳＧＴ３基因的表达，尤其在红光诱
导２４ｈ后表达量显著增加（图３）。
９９１第２３卷第２期 草业学报２０１４年
２．２　ＳＧＴ３启动子的序列分析
图４　扩增犛犌犜３基因启动子
犉犻犵．４　犃犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狉犲狊狌犾狋狅犳犛犌犜３犵犲狀犲狆狉狅犿狅狋犲狉
　
为了探索ＳＧＴ３基因的光诱导原理，本实验将克隆
到２４４９ｂｐ的潜在ＳＧＴ３启动子（图４箭头所示），通过
序列分析发现该片段的３′端与已报道的ＳＧＴ３基因ｃＤ
ＮＡ５′端完全相同（５７ｂｐ），将此序列在ＧｅｎＢａｎｋ数据库
中进行Ｂｌａｓｔ对比，发现此启动子序列为首次克隆到，并
且与马铃薯染色体１１上的 ＲＨ１７０Ｄ１０同源性达到
９８％，说明克隆到的是ＳＧＴ３编码起始密码子 ＡＴＧ的
上游序列。通过 Ｃｏｒｅｐｒｏｍｏｔｅｒ软件 （ｈｔｔｐ：／／ｒｕｌａｉ．
ｃｓｈｌ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｇｅｎｅｆｉｎｄｅｒ／ＣＰＲＯＭＯＴＥＲ／ｈｕｍａｎ．ｈｔｍ）
图５　犛犌犜３基因的启动子序列
犉犻犵．５　犛犲狇狌犲狀犮犲狅犳犛犌犜３犵犲狀犲狆狉狅犿狅狋犲狉
　下划线表示构建缺失片段的５个上游引物和１个下游引物；ＡＴＧ的Ａ记为＋１位点，起始密码子ＡＴＧ，ＴＡＴＡＢｏｘ，ＣＡＡＴＢｏｘ均用灰色表示，部
分光调控元件用粗体表示。→代表预测的转录起始位点。Ｔｈｅｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｒｅｆｉｖｅｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒｓａｎｄｏｎｅｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ；ｔｈｅｓｔａｒｔｃｏｄｏｎ，
ＴＡＴＡＢｏｘａｎｄＣＡＡＴＢｏｘａｒｅｈｉｇｈｌｉｇｈｔｅｄｉｎｇｒｅｙ；ｓｏｍｅｅｌｅｍｅｎｔｓｏｆｌｉｇｈｔｒｅｇｕｌａｔｉｏｎａｒｅｓｈｏｗｎｉｎｂｏｌｄ；ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓｔａｒｔｓｉｔｅｉｓｓｈｏｗｎｉｎｂｌａｃｋａｒ
ｒｏｗ→．
００２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．２
表２　马铃薯犛犌犜３基因启动子顺式元件分析
犜犪犫犾犲２　犘狉犲犱犻犮狋犲犱犮犻狊犪犮狋犻狀犵犲犾犲犿犲狀狋狊狅犳狋犺犲犛犌犜３犵犲狀犲狆狉狅犿狅狋犲狉犳狉狅犿狆狅狋犪狋狅
调控序列名称
Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｓｅｑｕｅｎｃｅｎａｍｅ
序列
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
位置
Ｐｏｓｉｔｉｏｎ
功能
Ｆｕｎｃｔｉｏｎ
参考文献
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
ＴＡＴＡＢＯＸ ＴＡＴＡＴＡＡ －９３５（＋），－１９４（＋），－３０１（－），
－２０１（－）
核心启动子元件Ｃｏｒｅｐｒｏｍｏｔｅｒｅｌｅ
ｍｅｎｔ
［１７］
ＣＡＡＴＢＯＸ ＣＡＡＴ －４４２（＋），－４１９（＋），－２１８（＋） 增强子Ｅｎｈａｎｃｅｒｅｌｅｍｅｎｔ ［１８］
ＧＡＴＡＢＯＸ ＧＡＴＡ －２０９（＋），－７９６（＋） 增强子Ｅｎｈａｎｃｅｒｅｌｅｍｅｎｔ ［１９］
ＷＲＫＹ７１０Ｓ ＴＧＡＣ －１７９６（＋），－３２８（＋），－２３５（＋） 抑制子Ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｅｌｅｍｅｎｔ ［２０］
５′ＵＴＲＰＹＲＩＣＨＳＴＲＥＴＣＨ ＴＴＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣ －９７０（＋） 高转录区 Ｈｉｇｈｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｌｅｖｅｌｓ ［２１］
ＡＢＲＥＬＡＴＥＲＤ１ ＡＣＧＴＧ －１６４１（＋） 增强子与组织特异性 Ｅｎｈａｎｃｅｒａｎｄ
ｔｉｓｓｕｅｓｐｅｃｉｆｉｃｅｌｅｍｅｎｔ
［２２］
ＲＯＯＴＭＯＴＩＦＴＡＰＯＸ１ ＡＴＡＴＴ －４１９（＋），－９９８（＋），－１０９５（＋） 根特异性元件Ｒｏｏｔｓｐｅｃｉｆｉｃｅｌｅｍｅｎｔ ［２３］
ＷＢＯＸＡＴＮＰＲ１ ＴＴＧＡＣ －１７９７（＋），－１７０８（－） 病原体响应元件 Ｐａｔｈｏｇｅｎｒｅｓｐｏｎ
ｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ
［２４］
ＢＩＨＤ１０Ｓ ＴＧＴＣＡ －１８４６（＋），－２３５（－） 病原体响应元件 Ｐａｔｈｏｇｅｎｒｅｓｐｏｎ
ｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ
［２５］
ＴＣＲＩＣＨＲＥＰＥＡＴＳ ＡＴＴＴＴＣＴＣＣＡ －１３４７（＋） 抗逆境胁迫元件 Ｄｅｆｅｎｓｅａｎｄｓｔｒｅｓｓ
ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ
［２６］
ＭＹＢ１ＡＴ ＷＡＡＣＣＡ －１８３１（－），－１６３５（－） 受干旱及激素 ＡＢＡ 诱导 Ｄｒｏｕｇｈｔ
ａｎｄＡＢＡｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ
［２７］
ＭＹＣＣＯＮＳＥＮＳＵＳＡＴ ＣＡＮＮＴＧ －２１８（＋），－２７（＋） 受干旱及激素 ＡＢＡ 诱导 Ｄｒｏｕｇｈｔ
ａｎｄＡＢＡｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ
［２８］
ＭＹＢＣＯＲＥ ＣＮＧＴＴＲ －８７９（－），－８４４（－） 受干旱及激素 ＡＢＡ 诱导 Ｄｒｏｕｇｈｔ
ａｎｄＡＢＡｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ
［２９］
ＭＹＢＧＡＨＶ ＴＡＡＣＡＡＡ －６０１（＋），－３０５（－） 糖抑制元件Ｓｕｇａｒｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ［３０］
ＰＹＲＩＭＩＤＩＮＥＢＯＸＯＳＲＡＭＹ１Ａ ＣＣＴＴＴＴ －９７９（＋），－１７１（＋），－６６３（－） 糖抑制元件Ｓｕｇａｒｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ［３１］
ＳＲＥＡＴＭＳＤ ＴＴＡＴＣＣ －１４３７（－） 糖抑制元件Ｓｕｇａｒｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ［３２］
ＡＣＥ ＣＴＡＡＣＧＴＡＴＴ －５８８（＋） 光响应元件Ｌｉｇｈｔｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ
ＡＴＣＴＭＯＴＩＦ ＡＡＴＣＴＡＡＴＣＴ －４６８（＋） 光响应元件Ｌｉｇｈｔｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ
ＩＢＯＸ ＧＡＴＡＴＧＧ －７９６（＋） 光响应元件Ｌｉｇｈｔｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ［３３］
ＳＰ１ ＣＣＡＣＣＣ －１１３９（＋） 光响应元件Ｌｉｇｈｔｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ［３４］
ＰＡＬＢＯＸＡＰＣ ＣＣＧＴＣＣ －１８５１（＋） 光响应元件Ｌｉｇｈｔｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ［３５］
－１０ＰＥＨＶＰＳＢＤ ＴＡＴＴＣＴ －６０８（－） 光调控元件Ｌｉｇｈｔｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ［３６］
ＩＢＯＸＣＯＲＥ ＧＡＴＡＡ －１４３６（＋），－４７３（＋），－２０９（＋），
－１６０２（－），－１５０７（－），－３６９（－）
光调控元件Ｌｉｇｈｔｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ［３３］
ＴＢＯＸＡＴＧＡＰＢ ＡＣＴＴＴＧ －１８００（＋），－１３８４（＋），－１７０６（－） 抑制光激发基因的转录 Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎｓ
ｏｆｌｉｇｈｔａｃｔｉｖａｔｅｄｇｅｎｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
［３７］
在线预测该启动子的起始位点，初步确定转录起始位点为翻译起始密码子上游－１５２ｂｐ处的 “Ａ”碱基。将
ＳＧＴ３基因启动子序列在植物顺式作用元件数据库ＰＬＡＮＴＣＡＲＥ和ＰＬＡＣＥ中进行生物信息学分析，发现在翻
译起始密码子上游－１９４和－９３５处可能存在２个ＴＡＴＡｂｏｘ，同时确定了３个ＣＡＡＴｂｏｘ的位置（图５），在该
启动子序列－９７０处有１个赋予ＳＧＴ３基因高转录水平（ｈｉｇｈｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｌｅｖｅｌｓ）的５′ＵＴＲＰｙｒｉｃｈｓｔｒｅｔｃｈ元
件和３个糖抑制元件（Ｓｕｇａｒｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）（表２）。研究表明ＳＧＴ３基因的合成受到多种环境因素调控［１６］，本实验
通过数据库搜索，预测到ＳＧＴ３基因启动子中含有多个受干旱和受ＡＢＡ诱导 （ｄｒｏｕｇｈｔ和ＡＢＡｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ）、病
菌诱导（ｐａｔｈｏｇｅｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ）等调控元件，同时对启动子的组织特异性元件（ｔｉｓｓｕｅｓｐｅｃｉｆｉｃｅｌｅｍｅｎｔ）、增强子元
件（ｅｎｈａｎｃｅｒｅｌｅｍｅｎｔ）ＧＡＴＡｂｏｘ、抑制子元件（ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｅｌｅｍｅｎｔ）也进行了预测，另外在此ＤＮＡ序列及其互补
１０２第２３卷第２期 草业学报２０１４年
链中分布着许多与光调控相关的顺式作用元件，其中
图６　不同缺失片段表达载体双酶切鉴定图
犉犻犵．６　犇狅狌犫犾犲犱犻犵犲狊狋犻狅狀犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀
狏犲犮狋狅狉犱狉犻狏犲狀犫狔犛犌犜３狆狉狅犿狅狋犲狉　
包括典型的光应答元件：ＡＣＥ，ＡＴＣＴＭＯＴＩＦ，ＩＢＯＸ，
－１０ＰＥＨＶＰＳＢＤ等 （表２），但对于这些调控元件的
功能还有待于进一步的实验证明。
２．３　不同长度的ＳＧＴ３启动子驱动ＧＵＳ基因在烟草
愈伤组织中的瞬时与稳定表达
利用烟草叶片浸染法［３８］分别将构建好的植物表
达载体 Ｐ３４９，Ｐ５７２，Ｐ９７９，Ｐ１３１２、Ｐ１８７０（图６）及
ＣＭＶ３５Ｓ启动子驱动的阳性对照导入烟草愈伤组织。
通过ＧＵＳ组织化学染色发现，５种不同长度的ＳＧＴ３
都能驱动ＧＵＳ基因的表达，但表达水平存在差异，在
Ｐ５７２，Ｐ９７９的表达强度较高，在Ｐ１３１２和Ｐ１８７０明显
减弱。而且不同长度ＳＧＴ３启动子驱动的愈伤组织的ＧＵＳ表达水平没有阳性对照ＣＭＶ３５Ｓ驱动的表达量高，
非转化愈伤组织中无ＧＵＳ表达（图７Ａ）。
为了进一步分析ＳＧＴ３基因在烟草中的稳定遗传表达，采用叶盘法［１４］将５个不同缺失片段的ＧＵＳ融合表
达载体导入烟草叶片，经过愈伤组织分化和生根筛选，得到稳定表达的烟草组培苗。选取顶部第３个叶片进行
ＧＵＳ染色。结果显示，所有转基因烟草叶片均变蓝，未转基因烟草叶片不变色，说明阳性对照及其５种不同长度
ＳＧＴ３驱动的ＧＵＳ基因均成功转入烟草，但其表达水平存在显著差异。其中Ｐ５７２片段驱动的转基因烟草ＧＵＳ
表达量较高，Ｐ１８７０片段驱动的转基因烟草表达量较低。但５种不同长度的ＳＧＴ３驱动ＧＵＳ转基因烟草的表达
均没有阳性对照ｐＢＩ１２１中ＣＭＶ３５Ｓ启动子驱动的表达量高（图７Ｂ），这与瞬时表达结果一致。这证明了ＳＧＴ３
基因启动子和ＣＭＶ３５Ｓ启动子已转化进入到烟草植株基因组中，并能在正常光照条件下诱导驱动ＧＵＳ基因的
表达，说明ＳＧＴ３启动子的活性没有ＣＭＶ３５Ｓ启动子的活性强。
２．４　不同组织中ＳＧＴ３驱动ＧＵＳ基因的特异性表达
通过烟草的瞬时表达和遗传稳定表达，发现Ｐ５７２片段驱动的ＧＵＳ在转基因烟草中的表达量较高，将其顶
部第３个叶片、茎和根进行ＧＵＳ染色，放在正置万能显微镜下观察其组织特异性。在烟草叶片中，ＧＵＳ染色主
要集中在烟草叶片的叶脉部分，而叶肉细胞ＧＵＳ染色不明显（图８Ｃ）。茎中ＧＵＳ染色主要分布在表皮、韧皮部
及木质部，其中ＧＵＳ表达量在木质部最高，在髓部几乎不表达（图８Ｂ）。根中主要分布在根冠、分生区以及维管
束组织中（图８Ａ）。以上结果说明ＳＧＴ３基因启动子驱动的ＧＵＳ基因主要表达在分生组织或维管束组织中。
３　讨论
ＳＧＴ３作为糖苷生物碱末端合成酶，对调控茄碱的表达有至关重要的作用，而启动子是精确调控外源基因在
植物体内表达的重要元件［３９］。本实验首先通过红光诱导，发现当红光和黑暗同时处理马铃薯试管薯６～１２ｈ
后，ＳＧＴ３的表达量没有显著变化。而当红光处理２４ｈ后，ＳＧＴ３的表达量显著增加，而且研究发现红光显著诱
导ＳＧＡ含量的增加［７］，因此红光可能诱导了ＳＧＴ３基因的表达进而导致ＳＧＡ含量增加。
本项研究的结果同时暗示了糖苷生物碱在光下含量高［７］的原因可能与ＳＧＡｓ合成代谢相关基因的调控密切
相关。为进一步探究其调控原理，首次从马铃薯栽培种克隆到ＳＧＴ３启动子，通过信息学分析初步预测该启动子
的起始位点位于翻译起始位点上游－１５２ｂｐ处，其准确性则需要通过进一步试验验证。序列分析发现ＳＧＴ３启
动子序列存在大量光调控元件，如ＡＣＥ，ＡＴＣＴＭＯＴＩＦ，ＩＢＯＸ，－１０ＰＥＨＶＰＳＢＤ。烟草的愈伤组织瞬时表达和
烟草稳定遗传结果表明：不同长度ＳＧＴ３驱动的ＧＵＳ基因均在烟草的愈伤组织和转基因叶片中表达，但其表达
强度没有阳性对照ｐＢＩ１２１的表达量高，说明所研究ＳＧＴ３启动子的驱动活性没有启动子ＣＭＶ３５Ｓ的活性强，
研究表明马铃薯ＳＧＴ２启动子驱动的转基因植株的表达量也没有ＣＭＶ３５Ｓ启动子驱动的转基因植株的表达量
高［１１］。在缺失片段驱动的ＧＵＳ烟草愈伤组织和转基因叶片中发现，Ｐ５７２和Ｐ９７９表达量较高，序列分析结果表
２０２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．２
图７　烟草叶片不同缺失片段犌犝犛染色
犉犻犵．７　犌犝犛犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犻狀狋狅犫犪犮犮狅犱狉犻狏犲狀犫狔狋犺犲狆狉狅犿狅狋犲狉狊狅犳犛犌犜３犪狀犱犆犕犞３５犛
　Ａ．瞬时表达；Ｂ．Ｔ１代。ＣＫ－ 代表未转基因烟草叶片；ＣＫ＋、Ｐ３４９、Ｐ５７２、Ｐ９７９、Ｐ１３１２和Ｐ１８７０分别表示转ｐＢＩ１２１、Ｐ３４９、Ｐ５７２、Ｐ９７９、Ｐ１３１２和
Ｐ１８７０的烟草叶片ＧＵＳ组织化学检测结果。Ａ：Ｔｒａｎｓｉｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｂ：Ｔ１ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．ＣＫ－ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｎｏｔｇｅｎｅｔｉｃａｌｙｍｏｄｉｆｉｅｄ；ＣＫ＋，Ｐ３４９，
Ｐ５７２，Ｐ９７９，Ｐ１３１２ａｎｄＰ１８７０ｓｈｏｗｎＧＵＳｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌａｓｓａｙｏｆｔｏｂａｃｃｏｌｅａｆｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｗｉｔｈＰ３４９，Ｐ５７２，Ｐ９７９，Ｐ１３１２ａｎｄＰ１８７０，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
　
图８　犘５７２驱动的犌犝犛基因在烟草根、茎和叶片中的稳定表达
犉犻犵．８　犛狋犪犫犾犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狅犳犌犝犛犵犲狀犲犻狀狉狅狅狋、狊狋犲犿犪狀犱犾犲犪狏犲狊犱狉犻狏犲狀犫狔犘５７２
Ａ．根 Ｒｏｏｔ；Ｂ．茎Ｓｔｅｍ；Ｃ．叶片Ｌｅａｆ．
　
明在该片段存在加强子（－７９６）和高转录区（－９７０），以及光调控元件ＡＣＥ（－５８８）和ＩＢＯＸ（－７９６）。已知ＡＣＥ
和ＩＢＯＸ是光诱导基因启动子中普遍存在的光应答元件（ＬＲＥｓ），它们对光调控的转录激活是必需的［４０４２］，这可
能是Ｐ５７２和Ｐ９７９驱动的ＧＵＳ基因表达量高的原因，也说明此段区域是启动子调控的关键序列部分，预测结果
与瞬时表达和烟草的稳定表达结果均一致。而Ｐ１３１２和Ｐ１８７０的表达量减弱，序列分析发现，在此片段存在抑
制子（－１７９６）和 ＴＢＯＸＡＴＧＡＰＢ（－１８００和－１３８４），据报道 ＴＢＯＸＡＴＧＡＰＢ是抑制光激活基因转录的元
件［３７］，它能有效地调控光调控元件的表达，同时由于启动子自身序列长度的增加，减弱了启动子的活性。ＳＧＴ３
基因的启动子与ＧＵＳ组成的融合表达基因（ＳＧＴ３ｐ／ＧＵＳ）在烟草的分化部位以及疏导组织中有比较高的表达，
可能与这些部位特殊的疏导作用相关，其疏导作用最终亦要以跨膜运输的方式进行，而通过ＴＭＨＭＭ２．０软件
对ＳＧＴ３蛋白的跨膜区预测发现，该蛋白在５０ＡＡ处存在跨膜结构。这进一步证实了ＳＧＴ３启动子表达的组织
特异性。
瞬时表达不能将转染的核酸整合到染色体上，结果只是短暂的高水平的表达，因此也就无法精确定位转染核
酸表达的位置，同时由于ＤＮＡ的摄入效率和表达水平在不同试验中差异较大，不长久也不稳定，得到的蛋白质
保存时间也比较短。本实验通过比较烟草叶片侵染瞬时表达和稳定遗传表达，发现瞬时表达还是有一定的可靠
性，在烟草叶片中不同长度ＳＧＴ３启动子驱动的ＧＵＳ基因的瞬时表达和叶盘转化法的烟草稳定表达结果基本一
致，但是烟草稳定表达更能确定地从植物遗传学角度去分析问题，它将核酸和染色体整合到一起，但整合并不一
定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因表达的量也是不同
的，所以还需通过生根筛选等新表型筛选稳定转染体，得到稳定表达的植株。
目前，已得到以上５种不同长度ＳＧＴ３基因上游序列驱动的ＧＵＳ基因表达的转基因植株，之后可以对各转
３０２第２３卷第２期 草业学报２０１４年
基因植物进行光诱导和干旱、ＡＢＡ、真菌侵染以及糖抑制等启动子活性检测，以便对该启动子功能做更细致的分
析，从而进行启动子的合理改造，如在保留其核心元件和功能元件的前提下，改变其组织特异性功能元件，提高
其表达活性，更好地应用于生物工程研究中，获得叶片中ＳＧＡｓ含量高而块茎中其含量低的优良马铃薯品种。
参考文献：
［１］　ＢｌａｎｋｅｍｅｙｅｒＪ，ＡｔｈｅｒｔｏｎＲ，ＦｒｉｅｄｍａｎＭ．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｐｏｔａｔｏｇｌｙｃｏａｌｋａｌｏｉｄｓαｃｈａｃｏｎｉｎｅａｎｄαｓｏｌａｎｉｎｅｏｎｓｏｄｉｕｍａｃｔｉｖｅｔｒａｎｓ
ｐｏｒｔｉｎｆｒｏｇｓｋｉｎ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＦｏｏｄＣｈｅｍｉｓｔｙ，１９９５，４３：６３６６３９．
［２］　ＦｒｉｅｄｍａｎＭ，ＲａｙｂｕｒｎＪ，ＢａｎｔｌｅＪ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｔｏｘｉｃｉｔｙｏｆ犛狅犾犪狀狌犿犪犾犽犪犾狅犻犱狊ｉｎｔｈｅｆｒｏｇｅｍ
ｂｒｙｏｔｅｒａｔｏｇｅｎｅｓｉｓａｓｓａｙＸｅｎｏｐｕｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＦｏｏｄＣｈｅｍｉｓｔｙ，１９９２，４０：１６１７１６２４．
［３］　ＶａｌｋｏｎｅｎＪＰＴ，ＫｅｓｋｉｔａｌｏＭ，ＶａｓａｒａＴ，犲狋犪犾．Ｐｏｔａｔｏｇｌｙｃｏａｌｋａｌｏｉｄｓ：Ａｂｕｒｄｅｎｏｒａｂｌｅｓｓｉｎｇ？［Ｊ］．ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＰｌａｎｔ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９６，１５：１２０．
［４］　ＦｒａｇｏｙｉａｎｎｉｓＤＡ，ＭｃＫｉｎｌａｙＲＧ，Ｄ’ＭｅｌｏＪＰ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｏｆａｐｈｉｄｈｅｒｂｉｖｏｒｙａｎｄｎｉｔｒｏｇｅｎａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙｏｎｔｈｅｔｏｔａｌｆｏｌｉａｒｇｌｙ
ｃｏａｌｋａｌｏｉｄｃｏｎｔｅｎｔｏｆｐｏｔａｔｏｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＥｃｏｌｏｇｙ，２００１，２７（９）：１７４９１７６２．
［５］　ＲｏｋｋａＶＭ，ＸｕＹＳ，ＫａｎｋｉｌａＪ，犲狋犪犾．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｏｍａｔｉｃｈｙｂｒｉｄｓｏｆｄｉｈａｐｌｏｉｄ犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿ｌｉｎｅｓａｎｄ犛．犫狉犲狏犻犱犲狀狊
ｂｙｓｐｅｃｉｅｓｓｐｅｃｉｆｉｃＲＡＰＤｐａｔｔｅｒｎｓａｎｄａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆｄｉｓｅａｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｔｈｅｈｙｂｒｉｄｓ［Ｊ］．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，１９９４，８０（３）：２０７２１７．
［６］　ＨａａｓｅＮＵ．Ｇｌｙｃｏａｌｋａｌｏｉｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｐｏｔａｔｏｔｕｂｅｒｓｒｅｌａｔｅｄｔｏｓｔｏｒａｇｅａｎｄｃｏｎｓｕｍｅｒｏｆｆｅｒｉｎｇ［Ｊ］．ＰｏｔａｔｏＲｅｓｅａｒｃｈ，２０１０，
５３（４）：２９７３０７．
［７］　季彦林，王旺田，王蒂．不同光质对马铃薯块茎糖苷生物碱积累的诱导效应［Ｊ］．江苏农业学报，２０１０，２６（１）：４０４５．
［８］　牛继平，张金文，王旺田，等．马铃ＳＧＡｓ合成代谢途径末端ＳＧＴ酶基因克隆及序列分析［Ｊ］．草业学报，２０１２，２１（３）：１０６
１１６．
［９］　ＭｃＣｕｅＫ，ＡｌｅｎＰＶ，ＳｈｅｐｈｅｒｄＬＶＴ，犲狋犪犾．Ｐｏｔａｔｏｇｌｙｃｏｓｔｅｒｏｌｒｈａｍｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ｔｈｅｔｅｒｍｉｎａｌｓｔｅｐｉｎｔｒｉｏｓｅｓｉｄｅｃｈａｉｎ
ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７，６８：３２７３３４．
［１０］　ＭｃＣｕｅＫ，ＡｌｅｎＰ，ＳｈｅｐｈｅｒｓＬ．Ｔｈｅｐｒｉｍａｒｙｉｎｖｉｖｏｓｔｅｒｏｉｄａｌａｌｋａｌｏｉｄｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｆｒｏｍｐｏｔａｔｏ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
２００６，６７：１５９０１５９７．
［１１］　ＲｏｃｋｈｏｌｄＤＲ，ＣｈａｎｇＳ，ＴａｙｌｏｒＮ，犲狋犪犾．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｗｏ犛狅犾犪狀狌犿犫狌犾犫狅犮犪狊狋犪狀狌犿ｐｏｌｙｕｂｉｑｕｉｔｉｎｇｅｎｅｓａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ
ｔｈｅｉｒｐｒｏｍｏｔｅｒｓｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｏｔａｔｏｅｓ［Ｊ］．ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｏｔａｔｏＲｅｓｅａｒｃｈ，２００８，８５：２１９２２６．
［１２］　安惠惠，马晖玲，李坚，等．农杆菌介导的ＬｙｚＧＦＰ基因对匍匐翦股颖ＰｅｎｎＡ１转化和表达的研究［Ｊ］．草业学报，２０１２，
２１（３）：１４１１４８．
［１３］　ＤａｖｉｄＧＧ，ＴｏｎｙＥＧ，ＪａｎｉｃｅＮ，犲狋犪犾．ＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆＤＮＡｃｏｐｙｎｕｍｂｅｒａｔｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅｌｏｃｉｕｓｉｎｇｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲａｎａｌ
ｙｓｉｓ［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，２０００，６０：５４０５５４０９．
［１４］　张宁，王蒂．农杆菌介导的烟草高效遗传转化体系研究［Ｊ］．甘肃农业科技，２００４，９：１１１３．
［１５］　张宁．应用甜菜碱醛脱氢酶基因工程提高马铃薯抗逆性的研究［Ｄ］．兰州：甘肃农业大学，２００４．
［１６］　段光明，刘加，李霞．马铃薯糖苷生物碱的生物学作用及开发利用［Ｊ］．资源开发与市场，１９９５，１１（２）：６１６５．
［１７］　ＫｅｄｄｉｅＪＳ，ＨｕｂｎｅｒＧ，ＳｌｏｃｏｍｂｅＳＰ，犲狋犪犾．Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎｏｆａｎｏｌｅｏｓｉｎｇｅｎｅｆｒｏｍ犅狉犪狊狊犻犮犪狀犪狆狌狊［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１９９２，１９：４４３４５３．
［１８］　ＳｈｉｒｓａｔＡ，ＷｉｌｆｏｒｄＮ，ＣｒｏｙＲ，犲狋犪犾．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅｆｏｒｔｈｅｔｉｓｓｕｅｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｏｍｏｔｅｒａｃｔｉｖｉｔｙｏｆａｐｅａｌｅｇｕｍｉｎｇｅｎｅｉｎ
ｔｏｂａｃｃｏ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆ＧｅｎｅｒａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，１９８９，２１５：３２６３３１．
［１９］　ＲｅｙｅｓＪＣ，ＭｕｒｏＰａｓｔｏｒＭＩ，ＦｌｏｒｅｎｃｉｏＦＪ．ＴｈｅＧＡＴＡｆａｍｉｌｙｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｉｎ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊ａｎｄｒｉｃｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００４，１３４（４）：１７１８１７３２．
［２０］　ＸｉｅＺ，ＡｌｅｎＥ，ＷｉｌｋｅｎＡ．ＤＩＣＥＲＬＩＫＥ４ｆｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎｔｒａｎｓａｃｔｉｎｇｓｍａｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｖｅｇｅｔａｔｉｖｅｐｈａｓｅ
ｃｈａｎｇｅｉｎ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵＳＡ，２００５，１０２（３６）：１２９８４
１２９８９．
［２１］　ＤａｒａｓｅｌｉａＮＤ，ＴａｒｃｈｅｖｓｋａｙａＳ，ＮａｒｉｔａＪＯ．Ｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｆｏｒｔｏｍａｔｏ３ｈｙｄｒｏｘｙ３ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔａｒｙｌｃｏｅｎｚｙｍｅＡｒｅｄｕｃｔａｓｅ
ｇｅｎｅ２ｈａｓｕｎｕｓｕａｌｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｌｅｍｅｎｔｓｔｈａｔｄｉｒｅｃｔｈｉｇｈｌｅｖｅｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９９６，１１２：７２７７３３．
［２２］　ＮａｋａｓｈｉｍａＫ，ＦｕｊｉｔａＹ，ＫａｔｓｕｒａＫ，犲狋犪犾．ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＡＢＩ３ａｎｄＡＢＡｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｇｅｎｅｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇＲＤ２９Ｂ
４０２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．２
ａｎｄＲＤ２９Ａｉｎｓｅｅｄｓ，ｇｅｒｍｉｎａｔｉｎｇｅｍｂｒｙｏｓ，ａｎｄｓｅｅｄｌｉｎｇｓｏｆ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊［Ｊ］．ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２００６，６０：５１６８．
［２３］　ＥｌｍａｙａｎＴ，ＴｅｐｆｅｒＭ．ＥｖａｌｕａｔｉｏｎｉｎｔｏｂａｃｃｏｏｆｔｈｅｏｒｇａｎｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄｓｔｒｅｎｇｔｈｏｆｔｈｅｒｏｌＤｐｒｏｍｏｔｅｒ，ｄｏｍａｉｎＡｏｆｔｈｅ３５Ｓ
ｐｒｏｍｏｔｅｒａｎｄｔｈｅ３５Ｓ２ｐｒｏｍｏｔｅｒ［Ｊ］．ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９５，４：３８８３９６．
［２４］　ＸｕＸ，ＣｈｅｎＣ，ＦａｎＢ，犲狋犪犾．Ｐｈｙｓｉｃａｌａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｂｅｔｗｅｅｎｐａｔｈｏｇｅｎｉｎｄｕｃｅｄ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊 ＷＲＫＹ１８，
ＷＲＫＹ４０，ａｎｄＷＲＫＹ６０ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌ，２００６，１８：１３１０１３２６．
［２５］　ＬｕｏＨ，ＳｏｎｇＦ，ＧｏｏｄｍａｎＲＭ，犲狋犪犾．ＵｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＯｓＢＩＨＤＩ，ａｒｉｃｅｇｅｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇＢＥＬＬｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ
ｆａｃｔｏｒ，ｉｎｄｉｓｅａｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙ，２００５，７（５）：４５９４６８．
［２６］　ＤｉａｚＤｅＬｅｏｎＦ，ＫｌｏｔｚＫＬ，ＬａｇｒｉｍｉｎｉＭ．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｔｏｂａｃｃｏ（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿）ａｎｉｏｎｉｃｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｇｅｎｅ［Ｊ］．
ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９９３，１０１：１１１７１１１８．
［２７］　ＡｂｅＨ，ＴａｔｓｕｎｏＩ，ＴｏｂｅＴ，犲狋犪犾．Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅｉｏｎｓｔｉｍｕｌａｔｅｓｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｌｏｃｕｓｏｆｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅｅｆｆａｃｅｍｅｎｔｅｎｃｏｄｅｄｇｅｎｅｓ
ｉｎｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７［Ｊ］．ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ，２００２，７０（７）：３５００３５０９．
［２８］　ＡｂｅＨ，ＵｒａｏＴ，ＩｔｏＴ，犲狋犪犾．犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊ＡｔＭＹＣ２（ｂＨＬＨ）ａｎｄＡｔＭＹＢ２（ＭＹＢ）ｆｕｎｃｔｉｏｎａｓｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖａｔｏｒｓｉｎ
ａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄｓｉｇｎａｌｉｎｇ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌ，２００３，１５：６３７８．
［２９］　ＵｒａｏＴ，ＹａｍａｇｕｃｈｉＳｈｉｎｏｚａｋｉＫ，ＵｒａｏＳ，犲狋犪犾．Ａｎ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊ｍｙｂｈｏｍｏｌｏｇｉｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎｓｔｒｅｓｓａｎｄｉｔｓｇｅｎｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｂｉｎｄｓｔｏｔｈｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄＭＹＢｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌ，１９９３，５：１５２９１５３９．
［３０］　ＧｕｂｌｅｒＦ，ＪａｃｏｂｓｅｎＪＶ．ＧｉｂｂｅｒｅｌｉｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔｓｉｎｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｏｆａｂａｒｌｅｙｈｉｇｈｐＩａｌｐｈａａｍｙｌａｓｅｇｅｎｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌ，１９９２，４（１１）：１４３５１４４１．
［３１］　ＭｏｒｉｔａＡ，ＵｍｅｍｕｒａＴ，ＫｕｒｏｙａｎａｇｉＭ，犲狋犪犾．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎｏｆａｓｕｇａｒｒｅｐｒｅｓｓｅｄαａｍｙｌａｓｅｇｅｎｅ（Ｒａｍｙ１Ａ）ｐｒｏｍｏｔ
ｅｒｉｎｒｉｃｅｅｍｂｒｙｏｓ［Ｊ］．ＦｅｂｓＬｅｔｔ，１９９８，４２３：８１８５．
［３２］　ＴａｔｅｍａｔｓｕＫ，ＷａｒｄＳ，ＬｅｙｓｅｒＯ，犲狋犪犾．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｉｓｅｌｅｍｅｎｔｓｔｈａｔｒｅｇｕｌａｔｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄｕｒｉｎｇｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｏｆａｘｉｌａ
ｒｙｂｕｄｏｕｔｇｒｏｗｔｈｉｎ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００５，１３８（２）：７５７７６６．
［３３］　ＴｅｒｚａｇｈｉＷＢ，ＣａｓｈｍｏｒｅＡＲ．Ｌｉｇｈｔｒｅｇｕｌａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ［Ｊ］．ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉ
ｏｌｏｇｙ，１９９５，４６：４４５４７４．
［３４］　ＴｈｉｅｓｅｎＨＪ，ＢａｃｈＣ．ＴａｒｇｅｔＤｅｔｅｃｔｉｏｎＡｓｓａｙ（ＴＤＡ）：ａｖｅｒｓａｔｉｌｅｐｒｏｃｅｄｕｒｅｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｓａｓｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ
ｏｎＳＰ１ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９０，１８（１１）：３２０３３２０９．
［３５］　ＬｏｇｅｍａｎｎＥ，ＰａｒｎｉｓｋｅＭ，ＨａｈｌｂｒｏｃｋＫ．Ｍｏｄｅｓｏｆｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｃｏｍｍｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｆｅａｔｕｒｅｓｏｆｔｈｅｃｏｍｐｌｅｔｅｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ
ａｍｍｏｎｉａｌｙａｓｅｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎｐａｒｓｌｅｙ［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵＳＡ，１９９５，９２（１３）：５９０５
５９０９．
［３６］　ＴｈｕｍＫＥ，Ｋｉｍ Ｍ，ＣｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒＤＡ，犲狋犪犾．Ｃｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅ１，ｃｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅ２，ａｎｄｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅａｃｏａｃｔｉｖａｔｅｔｈｅｃｈｌｏｒｏ
ｐｌａｓｔｐｓｂＤｂｌｕｅｌｉｇｈｔｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｐｒｏｍｏｔｅｒ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌ，２００１，１３（１２）：２７４７２７６０．
［３７］　ＣｈａｎＣＳ，ＧｕｏＬ，ＳｈｉｈＭＣ．Ｐｒｏｍｏｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｎｕｃｌｅａｒｇｅｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇｔｈｅｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ３ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅ
ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅＢｓｕｂｕｎｉｔｏｆ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪［Ｊ］．ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２００１，４６（２），１３１１４１．
［３８］　邢智峰，张安世，徐存栓，等．毛白杨４ＣＬ基因启动子的克隆及初步功能分析［Ｊ］．河南师范大学学报，２００７，３５：１４２１４５．
［３９］　陈婷婷，杨青川，丁旺，等．紫花苜蓿 ＷＲＫＹ转录因子基因的克隆与亚细胞定位［Ｊ］．草业学报，２０１２，２１（４）：１５９１６７．
［４０］　ＭｉｌａｒＡ，ＫａｙＳ．ＩｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｏｆｃｉｒｃａｄｉａｎａｎｄｐｈｏｔｏｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｐａｔｈｗａｙｓｉｎｔｈｅｎｅｔｗｏｒｋｃｏｎｔｒｏｌｉｎｇＣＡＢｇｅｎｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
ｉｎ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵＳＡ，１９９６，９３：１５４９１１５４９６．
［４１］　ＴｅｒｚａｇｈｉＷ，ＣａｓｈｍｏｒｅＡ．Ｌｉｇｈｔｒｅｇｕｌａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ［Ｊ］．ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏ
ｇｙ，１９９５，４６：４４５４７４．
［４２］　ＤｅｇｅｎｈａｒｄｔＪ，ＴｏｂｉｎＥ．ＡＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙｆｏｒｏｎｅｏｆｔｗｏｃｌｏｓｅｌｙｄｅｆｉｎｅｄｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｌｅｍｅｎｔｓｉｎａｎＬｈｃｂ
ｐｒｏｍｏｔｅｒｉｓｍｏｒｅａｂｕｎｄａｎｔｉｎｅｔｉｏｌａｔｅｄｔｈａｎｉｎｇｒｅｅｎｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌ，１９９６，８：３１４１．
５０２第２３卷第２期 草业学报２０１４年
犚犲犱犾犻犵犺狋犻狀犱狌犮犲犱犛犌犜３犵犲狀犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犪狀犱犳狌狀犮狋犻狅狀犪犾犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狋犺犲犛犌犜３狆狉狅犿狅狋犲狉犻狀狆狅狋犪狋狅
ＣＵＩＴｏｎｇｘｉａ１，ＢＡＩＪｉａｎｇｐｉｎｇ１，ＷＥＩＧｕｉｍｉｎｇ１，ＺＨＡＯＸｕ１，２，ＷＡＮＧＤｉ１，ＺＨＡＮＧＪｉｎｗｅｎ１
（１．ＧａｎｓｕＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｒｏｐＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ＆ＧｅｒｍｐｌａｓｍＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ，ＧａｎｓｕＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂ
ｏｆＡｒｉｄｌａｎｄＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅ，ＡｇｒｏｎｏｍｙＦａｃｕｌｔｙ，ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，
Ｃｈｉｎａ；２．ＧａｎｓｕＳｔａｔｅＦａｒｍｓＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈｅｓ，Ｗｕｗｅｉ７３３００６，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｒｈａｍｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＳＧＴ３）ｉｓａｋｅｙｅｎｚｙｍｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｐｌａｎｔｇｌｙｃｏａｌｋａｌｏｉｄｓ，ａｎｄ
ｍａｉｎｌｙｃａｔａｌｙｚｅｓｔｈｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆαｓｏｌａｎｉｎｅａｎｄαｃｈａｃｏｎｉｎｅｆｒｏｍｔｈｅｉｒβｆｏｒｍ．ＷｅｓｔｕｄｉｅｄｔｈｅＳＧＴ３ｇｅｎｅ
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ｒｅｄｌｉｇｈｔｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳＧＴ３ｗａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄ２６．８ｆｏｌｄｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｃｏｎｔｒｏｌ（ｕｎ
ｄｅｒｄａｒｋ）．ＴｈｅｄａｔａｔｈｕｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｒｅｄｌｉｇｈｔｉｎｄｕｃｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳＧＴ３．Ｔｏｆｕｒｔｈｅｒｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｔｈｅ
ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＳＧＴ３，ｔｈｅｐｕｔａｔｉｖｅＳＧＴ３ｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎ（２４４９ｂｐｕｐｓｔｒｅａｍｏｆｔｈｅｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇ
ｆｒａｍｅ）ｗａｓｃｌｏｎｅｄａｎｄｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｔｏｐｒｅｄｉｃｔｔｈｅｃｉｓｅｌｅｍｅｎｔｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｐｒｏｍｏｔｅｒｃｏｒｅｓｅ
ｑｕｅｎｃｅｓ，ｅｎｈａｎｃｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ｐａｔｈｏｇｅｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ，ｄｒｏｕｇｈｔａｎｄＡＢＡｒｅｓｐｏｎ
ｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ，ａｎｄａｆｅｗｌｉｇｈｔｒｅｇｕｌａｔｅｄｅｌｅｍｅｎｔｓ．Ｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓｔａｒｔｓｉｔｅｏｆｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｉｓｌｏｃａｔｅｄ１５２ｂｐ
ｕｐｓｔｒｅａｍｏｆｔｈｅｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓｔａｒｔｓｉｔｅ．ＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅＳＧＴ３ｐｒｏｍｏｔｅｒ，ｔｈｅＧＵＳｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ
ｄｒｉｖｅｎｂｙＳＧＴ３ｏｒＣＭＶ３５Ｓｐｒｏｍｏｔｅｒｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄａｎｄｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｔｏｔｏｂａｃｃｏｌｅａｖｅｓｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｔｒａｎ
ｓｉｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｓｔａｂｌｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅＳＧＴ３ｐｒｏｍｏｔｅｒｃａｎｄｒｉｖｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎｏｆＧＵＳ，ｂｕｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｗａｓｌｅｓｓｔｈａｎｔｈａｔｄｒｉｖｅｎｂｙｔｈｅＣＭＶ３５Ｓｐｒｏｍｏｔｅｒ．ＴｈｅｈｉｇｈｅｓｔＧＵＳ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｔｏｂａｃｃｏｌｅａｖｅｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｂｙＰ５７２ａｎｄＰ９７９ｂｕｔｔｈｅＧＵＳｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｄｅｃｒｅａｓｅｄ
ｗｉｔｈＰ１３１２ａｎｄＰ１８７０．Ｍｏｒｅｐｏｓｉｔｉｖｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｌｅｍｅｎｔｓｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｗｉｔｈｉｎ１０００ｂｐｕｐｓｔｒｅａｍｏｆｔｈｅｓｔａｒｔ
ｃｏｄｅ．ＴｈｅｔｉｓｓｕｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎａｌｙｓｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅＳＧＴ３ｄｒｉｖｅｎＧＵＳｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｍａｉｎｌｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄｉｎ
ｔｈｅｖｅｉｎｓｏｆｔｈｅｔｏｂａｃｃｏｌｅａｖｅｓ，ｂｕｔｗａｓｎｏｔｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｍｅｓｏｐｈｙｌｃｅｌｓ．Ｉｎｔｈｅｒｏｏｔ，ＧＵＳｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｍｅｒｉ
ｓｔｅｍａｎｄｖａｓｃｕｌａｒｔｉｓｓｕｅｓ．Ｉｎｔｈｅｓｔｅｍ，ＧＵＳｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｅｐｉｄｅｒｍｉｓ，ｘｙｌｅｍａｎｄｐｈｌｏｅｍｏｆｔｏｂａｃｃｏｓｔｅｍｓ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ＳＧＴ３；ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｐｒｏｍｏｔｅｒ；ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓ
６０２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．２