全 文 ：林业科学研究　２０１４，２７（３）：３３５ ３４０
ＦｏｒｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ
　　文章编号：１００１１４９８（２０１４）０３０３３５０６
毛竹小 ＲＮＡ高通量测序及病毒分析
范春节１，２，王　晖１，３，卢孟柱１
（１．中国林业科学研究院林业研究所，林木遗传育种国家重点实验室，北京　１０００９１；２．中国林业科学研究院热带林业研究所，
广东 广州　５１０５２０；３．ＮＥＲＣ／ＣｅｎｔｒｅｆｏｒＥｃｏｌｏｇｙａｎｄＨｙｄｒｏｌｏｇｙ（ＣＥＨ）Ｏｘｆｏｒｄ，ＭａｎｓｆｉｅｌｄＲｏａｄ，ＯｘｆｏｒｄＯＸ１３ＳＲ，ＵＫ）
收稿日期：２０１２０７０８
基金项目：国家自然科学基金海外及港澳台基金“利用小ＲＮＡ组研究竹子中的抗病毒免疫及其与竹子开花的关系”（２０１１３１０２８００４）
作者简介：范春节（１９８３—），男，河南驻马店人，博士，主要研究方向为植物分子生物学．
 通讯作者：研究员，博士，主要研究方向：木材形成的分子基础与分子育种．
摘要：以毛竹叶片为材料，采用小ＲＮＡ高通量测序结合生物信息学对小 ＲＮＡ数据库进行组装，进一步分析了毛竹
中存在的病毒和类病毒，并采用ＲＴＰＣＲ和 ＲＡＣＥ进行验证。结果表明：在竹子样品中存在水稻东格鲁病毒（ＲＴ
ＢＶ），覆盖率达到９１．０％。在毛竹样品中扩增得到１９９２ｂｐＲＴＢＶ病毒类似序列，占其基因组的２４．９％。ＲＴＢＶ病
毒在多个毛竹样品中存在且不存在多态性。ＲＴＢＶ病毒可能是一个古老的植物病毒，在进化过程中禾本科植物将
其序列整合到基因组中来防御ＲＴＢＶ病毒的浸染。
关键词：毛竹；高通量测序；小ＲＮＡ；ＲＴＢＶ病毒
中图分类号：Ｓ７９５．７ 文献标识码：Ａ
ＳｍａｌＲＮＡＡｎａｌｙｓｉｓＵｓｉｎｇＨｉｇｈＴｈｒｏｕｇｈｐｕｔＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄＶｉｒｕｓ
ＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｉｎＢａｍｂｏｏ（Ｐｈｙｌｏｓｔａｃｈｙｓｅｄｕｌｉｓ）
ＦＡＮＣｈｕｎｊｉｅ１，２，ＷＡＮＧＨｕｉ１，３，ＬＵＭｅｎｇｚｈｕ１
（１．ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＴｒｅｅＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＢｒｅｅｄｉｎｇ，ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００９１，Ｃｈｉｎａ；
２．ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＦｏｒｅｓｔｒｙ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１０５２０，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ；
３．ＮＥＲＣ／ＣｅｎｔｒｅｆｏｒＥｃｏｌｏｇｙａｎｄＨｙｄｒｏｌｏｇｙ（ＣＥＨ），ＭａｎｓｆｉｅｌｄＲｏａｄ，ＯｘｆｏｒｄＯＸ１３ＳＲ，ＵＫ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｌｅａｖｅｓｏｆＰｈｙｌｏｓｔａｃｈｙｓｅｄｕｌｉｓｗｅｒｅｈａｒｖｅｓｔｅｄｆｏｒＲＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ａｓＲＮＡｌｉｂｒａｒｙｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ
ａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅｄｂｙｕｓｉｎｇｔｈｅＳｏｌｅｘａｈｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙ
ｔｈｅｓＲＮＡｓａｎｄｖｉｒｕｓｅｓ．ＲＴＰＣＲａｎｄＲＡＣＥｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｗｅｒｅｅｘｐｌｏｒｅｄｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙａｎｄｃｏｎｆｉｒｍｔｈｅｖｉｒｕｓｅｓｏｒｖｉｒｏｉｄｉｎ
ｂａｍｂｏｏ．ＴｈｅａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｓＲＮＡｉｎａｌｓａｍｐｌｅｓｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔａｓｅｑｕｅｎｃｅｗｈｉｃｈｃｏｖｅｒｅｄ９１０％ ｏｆｒｉｃｅｔｕｎｇｒｏｂａｃｉｌｉ
ｆｏｒｍｖｉｒｕｓ（ＲＴＢＶ）ｇｅｎｏｍｅｅｘｉｓｔｅｄｗｉｄｅｌｙｉｎｂａｍｂｏｏｓａｍｐｌｅｓ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，１９９２ｂｐＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｗｈｉｃｈｃｏｖｅｒｅｄ
２４．９％ ｏｆＲＴＢＶｃｏｍｐｌｅｔｅｄｇｅｎｏｍｅｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄａｎｄｎｏｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｉｎｔｈｉｓｓａｍｐｌｅｓ．Ｉｔｃｏｎｃｌｕｄｅｄ
ｔｈａｔＲＴＢＶｖｉｒｕｓｍａｙｅｘｉｓｔｉｎｐｌａｎｔａｉｎａｎｃｉｅｎｔｔｉｍｅａｎｄｗａｓｌａｔｅｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｐｌａｎｔｇｅｎｏｍｅｓａｇａｉｎｓｔｔｈｅＲＴＢＶ
ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐｈｙｌｏｓｔａｃｈｙｓｅｄｕｌｉｓ；ｈｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；ｓｍａｌＲＮＡ；ＲＴＢＶ
野生植物被认为是病毒的天然储存库，其爆发
可能会导致农业和种植业的减产。近年来已经从农
作物中发现了大量的植物病毒并且进行了基因组测
序，但目前大部分的植物病毒仍然是未知的［１］。植
物在受到病毒浸染时会形成干扰小 ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ），
以ＲＮＡ干扰（ＲＮＡｉ）方式对靶向病毒核酸多个位点
进行降解，来沉默病毒 ＲＮＡ，使植物可以获得系统
性的病毒免疫［２］。在这个过程中植物中存在着大量
的起源于病毒的 ｓｉＲＮＡ，通过 Ｓｏｌｅｘａ深度测序和组
装可以得到病毒的序列信息，如果测序深度足够可
林　业　科　学　研　究 第２７卷
以得到完整的病毒序列。利用这种方法检测到温室
中培育的甜土豆中感染２个已知病毒，证实了这种
方法的有效性［３］；同时还检测到２个未知病毒，这也
说明植物中可能存在着大量未知病毒，也表明了这
种方法的高灵敏度。目前，高通量的小ＲＮＡ测序技
术用于植物病毒和调控生物学过程的ｍｉＲＮＡ发现。
如果植物样品中有病毒感染，在获得的 ｓｉＲＮＡ序列
库中就会含有来源于病毒的序列，并且可以发现植
物病毒以及植物抗病毒基因沉默的特点特征，如基
因沉默的热点区域等，对抗病性的研究有指导意义。
目前，在竹子中发现存在着竹花叶病毒（ｂａｍｂｏｏｍｏ
ｓａｉｃｖｉｒｕｓ，ＢａＭＶ），竹花叶病的病征主要为叶片呈现
黄绿相嵌的斑纹，尤其心叶更是明显。罹病竹株的
产笋量减少，品质亦受到很大影响［４］。除此之外，在
竹子中的相关病毒研究未见报道。本研究以桂林地
区野生毛竹为研究对象，从中提取低分子量 ＲＮＡ，
应用Ｓｏｌｅｘａ高通量测序技术获得大量的小 ＲＮＡ序
列，通过生物信息学组装小 ＲＮＡ，预测和发现竹子
中存在的病毒或者植物抗病毒序列特征。通过进一
步分析竹子抗病毒基因沉默的热点区域，为进一步
的抗病性研究提供支持。
１　材料和方法
１．１　材料
野生型毛竹（Ｐｈｙｌｏｓｔａｃｈｙｓｅｄｕｌｉｓ（Ｃａｒ．）Ｈ．ｄｅ
Ｌｅｈａｉｅ）材料取自广西壮族自治区桂林市，样品 ｍｉｘ１
和 ｍｉｘ３取自桂林市灌阳县洞井瑶族乡野猪殿村
（２５°１３′２４．３８″Ｎ，１１０°４３′１３．８４″Ｅ），样品 ｍｉｘ２、
ｍｉｘ４和ｍｉｘ５取自灵川县松江村（２５°１２′２３．３３″Ｎ，
１１０°４３′１３．８４″Ｅ），样品 ｍｉｘ６取自桂林市兴安县猫
儿山自然保护区（２５°８０′１３．２７″Ｎ，１１０°４５′３１．５２″
Ｅ），选取２ ３年生毛竹幼嫩叶片３ ５片，每个样
品至少有３株以上，２０１０年５—６月采样。ｍｉｘ７为
毛竹种子实生苗温室材料，种子取自广西桂林市，
２０１０年９月收获当年种子，将种子种植在中国林业
科学研究院温室生长３个月，取叶片。所有样品的
材料至少取３株以上。
１．２　方法
将采取的毛竹叶片放在冻存管中，快速放入到
液氮中直接保存。按照 ＡｍｂｉｏｎＲＮＡ提取试剂盒步
骤分离小分子量和大分子量ＲＮＡ，采用Ａｇｉｌｅｎｔ２１００
ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ检测提取小分子量 ＲＮＡ的质量和浓度，
将检测合格的２μｇ小分子量ＲＮＡ样品送到华大基
因进行建库测序分析。其中ｃＤＮＡ合成采用ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ公司的ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ反转录试剂盒。
采用ＲＮＡ组装软件ＳＯＡＰｄｅｎｏｖｏ（ｈｔｐ：／／ｓｏａｐ．
ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎ／ｓｏａｐｄｅｎｏｖｏ．ｈｔｍｌ）进行序列的组装
分析。采用病毒库（ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／
ｇｅｎｏｍｅｓ／ＧｅｎｏｍｅｓＨｏｍｅ．ｃｇｉ？ｔａｘｉｄ＝１０２３９）数据与
组装结果进行 ｂｌａｓｔ比对分析。根据比对分析结果
以及测序组装序列所在的 ＲＴＢＶ或 ＥＲＴＢＶ序列的
ＯＲＦ区域设计引物。以混合样品为模板利用上述引
物，利用ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＴＭＨＳＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）
进行序列扩增。采用 ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ的 ＳＭＡＲＴｅｒＴＭＲＡＣＥ
ｃＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ和 Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ＰＣＲＫｉｔ，得
到的片段采用ＮｕｃｌｅｏＴｒａｐ ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ试剂盒
进行扩增片段的回收。根据扩增序列设计引物，以
ｍｉｘ１ ｍｉｘ７多个样地的单株毛竹叶片的 ｃＤＮＡ为
模板分别ＰＣＲ扩增。
２　结果与分析
２．１　小ＲＮＡ群体的基本分析
２．１．１　小ＲＮＡ在各类中的分类　将得到的原始数
据进行去接头序列以及去除低质量读序和污染序列
等，最终得到确定读序。表１所示：７个样品小 ＲＮＡ
库都得到超过２０００００００的小 ＲＮＡ片段，其中，最
多的是样品 ｍｉｘ６得到３２６６５６７６个小 ＲＮＡ片段，
最少的为样品ｍｉｘ７，为２０３４７８９３个。通过与 Ｇｅｎ
ｂａｎｋ和Ｒｆａｍ比对，进行小 ＲＮＡ分类。在所有的样
品中ｒＲＮＡ占的比例较小，其中，最高的为 ｍｉｘ４，为
１１．２８％，说明样品ＲＮＡ不存在降解，构建的小ＲＮＡ
文库是合格的。在所测样品中大部分是未知序列，
几乎所有的样品中都超过了６０．０％，原因可能是缺
少毛竹的全基因组序列。另外，样品中 ｍｉＲＮＡ所占
比例较高，除 ｍｉｘ４外，都超过１０．０％，其中，ｍｉｘ５样
品中的ｍｉＲＮＡ所占比例为２０．９１％。除此之外还存
在着其他类型的小 ＲＮＡ种类，如重复序列、ｓｎＲＮＡ
和ｓｎｏＲＮＡ等，但所占比例较少，都低于０．５％。
２．１．２　小 ＲＮＡ的长度分布　在７个小 ＲＮＡ文库
中里面，１８ ３５ｎｔ的小 ＲＮＡ具体分布比例见图
１。在所有样品中２４ｎｔ长度的小ＲＮＡ所占比例最
高，在 ｍｉｘ７样品中２４ｎｔ长度的小 ＲＮＡ占到所有
小ＲＮＡ的６３．９１％，其次为２１ｎｔ长度的小ＲＮＡ，所
占比例为 １４％ ２４％。大多数小 ＲＮＡ分布在
２０ ２５ｎｔ区间，占所有小 ＲＮＡ的９０％左右；而在
ｍｉｘ７样品中 ２０ ２５ｎｔ所占比例最高，达到
６３３
第３期 范春节等：毛竹小ＲＮＡ高通量测序及病毒分析
９７８２％。在样品 ｍｉｘ６中表现与其他样品有些差
异，除了在２１ ２４ｎｔ一个主分布区域外，在３０
３５ｎｔ片段长度序列分布较多，占３６．４８％，这与其
它样品明显不同。
表１　所有毛竹样品小ＲＮＡ种类的分布
分类
小ＲＮＡ种类
ｍｉｘ１ ｍｉｘ２ ｍｉｘ３ ｍｉｘ４ ｍｉｘ５ ｍｉｘ６ ｍｉｘ７
总数 ２５３７５７２０ ２２５６６９６６ ２３７０３４８５ ２１８４５５２８ ２６５９２７２８ ３２６６５６７６ ２０３４７８９３
反义外显子
１２２４８
（０．０５％）
６７８６
（０．０３％）
１０８７０
（０．０５％）
８１７２
（０．０４％）
９４５２
（０．０４％）
７９４５
（０．０２％）
１０１３１
（０．０５％）
正义外显子
５５７０９
（０．２２％）
２８８４７
（０．１３％）
５２６７７
（０．２２％）
４６２１２
（０．２１％）
１２７７２７
（０．４８％）
３１１９５６
（０．９５％）
２３２６１
（０．１１％）
反义内含子
５０００
（０．０２％）
３３０７
（０．０１％）
３６９４
（０．０２％）
４９６５
（０．０２％）
９０９９
（０．０３％）
９９３９
（０．０３％）
３９０６
（０．０２％）
正义内含子
５９７１５
（０．２４％）
１０８９５
（０．０５％）
１６８５１
（０．０７％）
１４３２５
（０．０７％）
２７９９７
（０．１１％）
４３６４０
（０．１３％）
９５７９
（０．０５％）
ｍｉＲＮＡ
３６７５７７９
（１４．４９％）
２８７５４１９
（１２．７４％）
３５３０４２１
（１４．８９％）
２０９７７９３
（９．６％）
５５５９４６７
（２０．９１％）
３８９９０４３
（１１．９４％）
３２５７５５２
（１６．０１％）
核糖体ＲＮＡ
２６５２６０６
（１０．４５％）
１３５０５３８
（５．９８％）
２０７７６６６
（８．７７％）
２４６４４８８
（１１．２８％）
２１８４１５０
（８．２１％）
３５８０６１１
（１０．９６％）
５０８８５０
（２．５％）
重复序列
３１７４９
（０．１３％）
３２４９６
（０．１４％）
３６３０７
（０．１５％）
４８９８３
（０．２２％）
５１２２７
（０．１９％）
３１６２５
（０．１０％）
３８０００
（０．１９％）
核小ＲＮＡ
１１４１９
（０．０４％）
６５４０
（０．０３％）
９９８２
（０．０４％）
６９０４２
（０．３２％）
６７６７３
（０．２５％）
１３１０６５
（０．４％）
５６６７
（０．０３％）
核仁小ＲＮＡ
９７１３
（０．０４％）
４９６８
（０．０２％）
６６６０
（０．０３％）
７７１９２
（０．３５％）
７０５０６
（０．２７％）
９７７２８
（０．３％）
３２３２
（０．０２％）
转运ＲＮＡ
９７０５６６
（３．８２％）
４０６６６３
（１．８％）
６１２０５１
（２．５８％）
１４７４８９８
（６．７５％）
１９３７５５０
（７．２９％）
１３１０７８６５
（４０．１３％）
１７７３８９
（０．８７％）
未知
１７８９１２１６
（７０．５１％）
１７８４０５０７
（７９．０６％）
１７３４６３０６
（７３．１８％）
１５５３９４５８
（７１．１３％）
１６５４７８８０
（６２．２３％）
１１４４４２５９
（３５．０３％）
１６３１０３２６
（８０．１６％）
　　注：括号内数据为占总数的百分比。
图１　不同的库中ｓＲＮＡ长度的分布
２．２　小ＲＮＡ组装结果与分析
采用 ＳＯＡＰｄｅｎｏｖｏ软件以 １７ｍｅｒ进行小 ＲＮＡ
序列组装，将组装后的序列与病毒库序列进行比对，
在不考虑比对长度的条件下，能够比对上的病毒种
类共有２９４种（图２ａ）。有２４６种病毒对应的比对
序列数量小于４个，其中，大多数只有一条比对序
列，另外能够比对上５ １０条序列的病毒有３３个。
由于比对序列数量较少，推测毛竹的小 ＲＮＡ中存在
着少量与病毒类似的序列。超过１０条以上的有１５
种病毒（图 ２ｂ），值得关注的是水稻东格鲁病毒
（Ｒｉｃｅｔｕｎｇｒｏｂａｃｉｌｉｆｏｒｍｖｉｒｕｓ，ＲＴＢＶ）和柑橘裂皮病
类病毒（Ｃｉｔｒｕｓｅｘｏｃｏｒｔｉｓｖｉｒｏｉｄ，ＣＥＶｄ），他们的序列
比对条数分别达到了５９、４８条（图２ｂ）。
７３３
林　业　科　学　研　究 第２７卷
图２　毛竹数据库中存在的病毒分析
２．３　ＲＴＢＶ病毒的组装与分析
根据在 ＮＣＢＩ（ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／
ｇｅｎｏｍｅ／？ｔｅｒｍ＝ＲＴＢＶ）搜索到的信息，ＲＴＢＶ病毒
基因组长度为８００２ｂｐ，ＧＣ含量为３３．７％，由４个
开放可读框组成，分别定位在基因组６９ ６６８ｂｐ、
６６５ ９９７ｂｐ、９９４ ６０２１ｂｐ和６０４２ ７２１１ｂｐ。
第１个开放可读框编码１个２４ｋＤ的蛋白，但没有
起始密码子 ＡＴＧ。另外，在 ７３７３ ７３７９有一个
ＴＡＴＡ盒子，在７６１０ ７６１６处有 ｐｏｌｙＡ尾巴。设
定如下参数：比对长度大于 １５ｎｔ，３个错配碱基以
内，ｅ＝０．０１，进一步与小 ＲＮＡ数据库 ｂｌａｓｔ比对计
算样品和 ＲＴＢＶ的覆盖度（表 ２）。所有的样品中
ＲＴＢＶ覆盖度均大于 ８０．０％，覆盖长度最多的是
ｍｉｘ７，覆盖度达到９０２％。将７个小ＲＮＡ数据库混
合在一起比对 ＲＴＢＶ病毒时，其覆盖率达到１００％，
初步说明在毛竹样品中存在着 ＲＴＢＶ病毒。在
ｍｅｒ１７的条件下进行组装后，除了 ｍｉｘ６覆盖度为
３５．３％外，其他样品的覆盖度都大于４０．０％，混合
总样品分析ＲＴＢＶ病毒覆盖度达到８８．２％，说明样
品中存在着 ＲＴＢＶ病毒。在样品 ｍｉｘ５中组装出最
长的序列，长度为 ３５３ｎｔ，占 ＲＴＢＶ病毒总长的
４４％；混合样品组装出来的 ＲＴＢＶ序列最长为４５３
ｎｔ，占总长的５．７％。
表２　水稻东格鲁病毒（ＲＴＢＶ）在样品中的覆盖度分析
样品名 覆盖长度／ｎｔ 覆盖度／％ 组装后覆盖长度／ｎｔ 组装后覆盖度／％ 组装最长长度／ｎｔ 覆盖度／％
ｍｉｘ１ ７０５７ ８８．２ ３６７１ ４５．９ ２３６ ２．９
ｍｉｘ２ ７０４０ ８８．０ ３５３９ ４４．２ ２８８ ３．６
ｍｉｘ３ ７１６０ ８９．５ ３８２２ ４７．８ ２２７ ２．８
ｍｉｘ４ ７１１７ ８９．０ ３７８８ ４７．３ ２２８ ２．８
ｍｉｘ５ ７０３８ ８８．０ ３５６８ ４４．６ ３５３ ４．４
ｍｉｘ６ ６７１０ ８３．９ ２８２４ ３５．３ １５４ １．９
ｍｉｘ７ ７２１８ ９０．２ ３５６１ ４４．５ １９１ ２．４
混合 ８００２ １００．０ ７０６０ ８８．２ ４５３ ５．７
进一步将所有样品组装出来的序列进行拼接，
结果如图３所示：覆盖率达到７９．０％，存在几个较小
的缺口，在第４个 ＯＲＦ中序列覆盖度较高，几乎不
存在缺口。在第１个ＯＲＦ区存在着大于４０倍的重
叠率，而在其他 ＯＲＦ区重叠率相对较低，可能由于
样品是幼嫩的叶片。
２．４　ＲＴＢＶ病毒的验证和分析
２．４．１　ＰＣＲ和 ＲＡＣＥ扩增病毒序列　将提取的各
样品的总 ＲＮＡ分别进行反转录得到的 ｃＤＮＡ，等量
混合后作为模板引物 ＥＲＡ１（ＦＰ：ＧＡＴＧＣＴＴＡ
８３３
第３期 范春节等：毛竹小ＲＮＡ高通量测序及病毒分析
图３　毛竹小ＲＮＡ库中的水稻东格鲁病毒（ＲＴＢＶ）病毒覆盖分析（空白处表示序列缺失）
ＣＡＡＴＡＴＴＣＣＡＡＡＴＡ， ＲＰ： ＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＴＧＴ
ＴＣＡＡＡＴ）和ＥＲＡ２（ＦＰ：ＴＧＡＣＡＡＴＡＣＣＡＴＡＧＡＴＧＡＴ
ＧＣＴＴ，ＲＰ：ＡＣＴＴＴＡＴＧＡＣＣＡＴＴＴＣＣＴＧＴＡＡ）进 行
ＲＴＰＣＲ扩增，扩增产物长度分别为１０３４、１００９ｂｐ
的序列。比对结果为水稻东格鲁病毒类似序列 Ａ
（ＥＲＴＢＶＡ），定位在第 ２个 ＯＲＦ区域的 ５６２０
６６５４ｂｐ，同源性达到８１％，氨基酸序列同源性达到
９１％。为了得到更长的 ＲＴＢＶ病毒序列，采用通过
５’ＲＡＣＥ和 ３’ＲＡＣＥ扩增出长度为 １９９２ｂｐ的
ＥＲＴＢＶＡ病毒类似序列。将扩增结果与测序组装
结果进一步组装，最终达到覆盖率为９１％的 ＲＴＢＶ，
初步证明了在毛竹序列中存在的ＲＴＢＶ病毒。
２．４．２　ＲＴＢＶ病毒的分布及多样性分析　以 ＥＲＡ１
为引物对 ｍｉｘ１ ｍｉｘ６不同样地的３２个样品进行
ＲＴＰＣＲ扩增，结果表明：其中有 １８个样品存在着
ＲＴＢＶ病毒序列，且这 １８个样品均匀的分布于
ｍｉｘ１ ｍｉｘ６样地。在温室取样的材料中也能够扩
增出目的片段，说明在毛竹中广泛存在着 ＲＴＢＶ病
毒，这是一个内在的古老的植物病毒，可能在进化过
程中整合到毛竹基因组序列中，而且其序列可以表
达。为了确认病毒序列是否存在多态性，对 ＰＣＲ产
物测序并进行分析，结果表明：在毛竹样品中 ＲＴＢＶ
病毒只存在着一种序列，不存在多态性。
３　结论与讨论
通过高通量测序和生物信息学组装分析，发现
在野外的竹子样品中存在着 ＲＴＢＶ病毒序列和
ＣＥＶｄ类病毒序列，一次组装的结果中ＲＴＢＶ病毒的
覆盖率达到７９．０％。通过进一步 ＰＣＲ和 ＲＡＣＥ扩
增，最终得到１９９２ｂｐＲＴＢＶ病毒类似序列，将实验
扩增结果与小ＲＮＡ拼接组装最终得到覆盖９１０％
ＲＴＢＶ病毒的序列。初步认为竹子中存在着 ＲＴＢＶ
病毒类似序列，且不同样品的病毒序列没有多态性。
通过小ＲＮＡ高通量测序的方法从甜土豆中发
现植物病毒后，通过高通量测序在模式生物线虫以
及果蝇中也发现已知的病毒和新的病毒［３，５］。除此
之外，通过这种方式在家蚊的研究中也发现了病毒
的存在，在竹子感染了 ＢａＴＶ病毒后的小 ＲＮＡ测序
的结果也验证了这种方法的可行性［６－７］。在本研究
中同样发现高达９０％以上的 ＲＴＢＶ病毒覆盖序列，
ＲＴＢＶ病毒是环状双链 ＤＮＡ中的花椰菜病毒科
（Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｉｄａｅ）水稻衰退（东格鲁）杆状样病毒属
（ＴｕｎｇｒｏｖｉｒｕｓＲｉｃｅｔｕｎｇｒｏｂａｃｉｌｉｆｏｒｍｌｉｋｅｖｉｒｕｓｅｓ）的
代表种，存在着４个开放可读框（ＯＲＦ），分别编码
２４、１２、１９４、４６ｋＤ的蛋白［８］，主要在水稻中存在，感
染后叶片变黄或变橙色，植株矮化，导致水稻减产，
是东南亚水稻限产的主要原因。在水稻中存在着
ＲＴＢＶ病毒类似的序列，这些序列都是以分散的形
式整合在水稻基因组中，通过组装发现在水稻中存
在ＥＲＴＢＶＡ、ＥＲＴＢＶＢ和ＥＲＴＢＶＣ３类类似序列，
长度分别为７５２６、７４９６、７４９９ｂｐ，这些序列除了缺
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林　业　科　学　研　究 第２７卷
乏ＲＴＢＶ病毒的 ＯＲＦ２区域外，具备其他所有的编
码区，而且类似序列 ＯＲＦｚ区域（ＲＴＢＶ中是 ＯＲＦ３）
中具有完整的编码ＭＰ、ＣＰ、ＰＲ、ＲＮａｓｅＨ（ＲＴ／ＲＨ）
区域［９］。在水稻中发现 ＥＲＴＢＶ的拷贝数在不同种
之间差异较大，在不易感染 ＲＴＢＶ亚洲种源的品种
中拷贝数较高，而在非洲和拉丁美洲中拷贝数较低，
值得注意的是非洲种源的光稃稻（Ｏｒｙｚａｇｌａｂｅｒｉｍａ）
和短舌野生稻（Ｏ．ｂａｒｔｈｉ）是水稻东格鲁病毒的易感
品种，因此，可能是在水稻长期的进化过程中通过整
合病毒进一步通过形成内源的ｓｉＲＮＡ起到防御病毒
的作用。
越来越多的证据也表明，植物中内源的 ｓｉＲＮＡ
而不是病毒的ｓｉＲＮＡ在植物防御病毒中起着更加重
要的作用［１０－１２］，也说明植物中存在病毒类似序列对
于植株防御病毒的重要性。在毛竹中也有可能是这
些序列嵌合在基因组中，在 ＲＴＢＶ病毒浸染的时候
起作为内源的ｓｉＲＮＡ的起源来抵御ＲＴＢＶ病毒对毛
竹的侵染。如果这种假设属实，ＲＴＢＶ病毒可能是
一个古老的植物病毒，在进化过程中禾本科植物将
其序列整合到基因组中来防御 ＲＴＢＶ病毒的浸染。
在本研究中发现毛竹中存在的 ＲＴＢＶ病毒类似序
列，其覆盖深度较低，可能是由于采取的样品是幼嫩
的叶片本身带有的病毒较少的原因，也可能与 ＲＴ
ＢＶ病毒主要在韧皮部特异作用有关［１３］。
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