全 文 ：书利用犃犆犌犕和犈犛犜犛犛犚标记对云贵高原野生
山蚂蝗属种质的遗传多样性分析
贺欣１，４，刘国道２，刘迪秋３，罗富成４，黄必志１
（１．云南省肉牛与牧草研究中心，云南 昆明６５０２１２；２．中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南 儋州５７１７３７；３．昆明理工
大学生命科学与技术学院，云南 昆明６５０２２４；４．云南农业大学动物科学技术学院，云南 昆明６５０２０１）
摘要：山蚂蝗属野生种质是一个具有巨大经济价值的资源。本研究利用基于基因表达序列数据库开发的２种分子
标记ＡＣＧＭ和ＥＳＴＳＳＲ共８５对引物对山蚂蝗属９个种４６个野生种质资源进行多样性分析。结果显示，ＡＣＧＭ
引物中有扩增产物的引物比例为８６．４９％，远高于ＥＳＴＳＳＲ引物的５４．１７％。同时，ＡＣＧＭ 的多态性比率也大于
ＥＳＴＳＳＲ，可见ＡＣＧＭ在山蚂蝗属野生种质中的转移性优于ＥＳＴＳＳＲ。通过 ＡＣＧＭ 和ＥＳＴＳＳＲ分析得到的遗
传相似性系数为０．５２３～０．９６７，平均相似系数为０．７０３，这表明山蚂蝗属野生种质资源间存在较高的遗传多样性。
此外，ＡＣＧＭ分析能有效区分４６个山蚂蝗属种质基因型，而ＥＳＴＳＳＲ只能区分绝大多数山蚂蝗属基因型。在
ＵＰＧＭＡ聚类图上４６个供试材料被分成９组，与传统分类结果不完全一致。说明基于禾本科和豆科基因表达序
列开发的分子标记能用于山蚂蝗属植物的遗传分析，同时这也为其他野生种质资源的遗传多样性研究提供了有益
的借鉴。
关键词：山蚂蝗属；遗传多样性；ＡＣＧＭ；ＥＳＴＳＳＲ
中图分类号：Ｑ９４８．１２＋２．１；Ｑ９４３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２００８）０６０１０２１０
山蚂蝗属（犇犲狊犿狅犱犻狌犿）植物是蝶形花科（Ｐａｐｉｌｉｏｎａｃｅａｅ）山蚂蝗族植物（Ｄｅｓｍｏｄｉｅａｅ）中开发和利用潜力较大
的一类资源，全世界大约有３５０个种，主要分布于亚热带和热带地区。在中国山蚂蝗植物一共有２７个种５个变
种，绝大多数分布于亚热带和热带地区。山蚂蝗属植物可以作为纤维作物、牧草［１］、优良固氮绿肥作物［２，３］；同时
这个属的很多种也是优良的中药材［４，５］和杀虫剂［６］；在对热带、亚热带地区水土保持方面，这个属的植物也展现出
了巨大潜力［７］。目前，世界上对山蚂蝗属植物的研究仅局限于生理生化指标分析、形态学分类和同功酶分析，利
用基于ＰＣＲ的分子标记对山蚂蝗属植物开展大规模的多态性分析刚刚起步。ＢｅｄｏｌａＧａｒｃｉａ和ＬａｒａＣａｂｒｅｒａ［８］
用随机扩增多态性ＤＮＡ（ｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ，ＲＡＰＤ）对从墨西哥采集到的１２８份犇犲狊犿狅犱犻狌犿
狊狌犿犻犮犺狉狊犪狋犻犻种质的遗传多样性进行了研究，发现自然居群间存在较高的遗传差异，并且遗传距离与地理距离呈
显著正相关。
随着生命科学的快速发展，分子标记技术不断进步，并广泛运用于牧草的遗传多样性研究中［９～１１］。但传统
分子标记多数是在基因组基础上开发的，因此这些标记对编码区基因序列多态性的描述能力有限［１２］。而利用
ｃＤＮＡ序列开发分子标记成为一大趋势，基于表达序列开发的标记主要有表达序列标签微卫星标记（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ，ＥＳＴＳＳＲ）［１３，１４］，ＥＳＴ扩增片段长度多态性（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇａｍ
ｐｌｉｆｉｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｓｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＥＳＴＡＦＬＰ）［１５］，单核苷酸多态性（ｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ，
ＳＮＰ）［１６］。基于ＥＳＴ和其他基因编码序列的分子标记在种质资源多样性分析、系谱以及亲缘关系分析、遗传图
谱构建等方面的大量运用是由其自身的优点决定的。其优势表现在，１）序列的信息量大。ＥＳＴ或其他编码序列
代表着某一基因，如果发现其与某一性状连锁时，那它很可能与控制这个性状的基因相关［１７，１８］。２）通用性好。
很多序列来自保守性较高的基因表达区，故可以用于对近缘种进行比较作图，并且连锁图的利用价值较大［１９，２０］。
１０２－１１１
１２／２００８
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第１７卷 第６期
Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．６
收稿日期：２００７１２１８；改回日期：２００８０２０１
基金项目：农业部草地农业生态系统学重点开放实验室开放基金（２００６２）资助。
作者简介：贺欣（１９８０），男，云南昆明人，硕士。Ｅｍａｉｌ：ｐｐｂｉｇｃａｔ＠１２６．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｙｂｐｃｈｂｚ＠ｐｕｂｌｉｃ．ｋｍ．ｙｎ．ｃｎ
３）开发这类标记简单、快捷、费用低。基因表达序列是数量巨大的公共资源，可以通过互联网免费下载。例如在
美国国立生物技术信息中心数据库（ＮＣＢＩ）上可以检索到拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）ＥＳＴ序列１０５３４２１条，
小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏犻狌犿）ＥＳＴ序列６４８１５２条，玉米（犣犲犪犿犪狔）ＥＳＴ序列１２９３０２５条（８／１１／２００７，ｈｔｔｐ：／／
ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｎｕｃｅｓｔ）。
本研究采用扩增共有序列遗传标记（ａｍｐｌｉｆｉｅｄｃｏｎｓｅｎｓｕｓｇｅｎｅｔｉｃｍａｒｋｅｒｓ，ＡＣＧＭ）和ＥＳＴＳＳＲ标记对山蚂
蝗属植物的多态性进行研究。这２种标记都是利用基因表达序列设计引物，并结合ＰＣＲ技术研究不同物种中扩
增片段有无以及长度多态性的方法。ＡＣＧＭ引物锚定在内含子（ｉｎｔｒｏｎ）两翼的外显子（ｅｘｏｎ）序列上［２１］，因此这
类分子标记具有广泛的通用性［２２］和较大的信息量，能有效揭示研究对象的遗传多样性。这个技术由Ｂｒｕｎｅｌ
等［２３］提出，他们发现拟南芥和甘蓝型油菜（犅狉犪狊狊犻犮犪狀犪狆狌狊）中有很多编码序列相同；Ｌａｎ和Ｐａｔｅｒｓｏｎ［２４］也发现它
们之间存在着广泛的共线性。如果利用保守性区段设计引物就能探知拟南芥和芸薹属（犅狉犪狊狊犻犮犪）植物之间的共
有遗传信息。目前，ＡＣＧＭ标记已经广泛用于物种遗传距离的估计［２５，２６］、比较图谱构建［２１，２４］和植物物种进化关
系的研究［１７，１８］。ＥＳＴＳＳＲ是基于ＥＳＴ上的ＳＳＲ位点设计的一种分子标记，它比ＡＣＧＭ 发展更快一些，目前已
成为一项比较成熟的技术。本研究利用３７对ＡＣＧＭ引物和４８对ＥＳＴＳＳＲ引物对采自云贵高原９个种４６份
野生山蚂蝗属植物的多态性进行评价。
１ 材料与方法
１．１ 植物材料
供试材料采自中国云贵高原（云南、广西和贵州三省）的山蚂蝗属植物种质，共４６份（表１，图１）。其中包括
９个种：长波叶山蚂蝗（犇．狊犲狇狌犪狓）１０份、大叶拿身草（犇．犾犪狓犻犳犾狅狉狌犿）１份、葫芦茶（犜犪犱犲犺犪犵犻狋狉犻狇狌犲狋狉狌犿）８份、
异果山绿豆（犇．犺犲狋犲狉狅犮犪狉狆狅狀）４份、绒毛山蚂蝗（犇．狏犲犾狌狋犻狀狌犿）７份、肾叶山蚂蝗（犇．狉犲狀犻犳狅犾犻狌犿）４份、舞草
（犆狅犱犪狉犻狅犮犪犾狔狓犿狅狋狅狉犻狌狊）６份、小叶三点金（犇．犿犻犮狉狅狆犺狔犾犾狌犿）２份、大叶山蚂蝗（犇．犵犪狀犵犲狋犻犮狌犿）４份。种质保
存在中国热带作物品种资源研究所种质库内，并在中国热带作物品种资源研究所资源圃内少量种植以采集植物
叶片和进行形态学观察。
１．２ 试验方法
采用改良的ＣＴＡＢ（ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）法［２７］提取植物幼叶总ＤＮＡ。ＰＣＲ反应体系为２０
μＬ，其中包含６０ｎｇ模板ＤＮＡ、上下游引物各０．２μｍｏｌ／Ｌ、２００μｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ、１×Ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ）、０．５ＵＴａｑ
酶（ＴａＫａＲａ）。ＰＣＲ反应程序如下：预变性９４℃２ｍｉｎ，３８个循环（９４℃３０ｓ→５５℃３０ｓ→７２℃１ｍｉｎ），７２℃３
ｍｉｎ。ＰＣＲ产物在ＤＹＣＺ３０型垂直槽（北京六一）上经６％聚丙烯酰胺凝胶分离后银染。
ＡＣＧＭ引物共３７对，来自卢泳全等［２８］基于水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）基因编码序列和内含子开发的引物，其中去
除引物ＧＡ２３。ＥＳＴＳＳＲ引物共４８对，来自 Ｗａｎｇ等［２９］基于苜蓿属（犕犲犱犻犮犪犵狅）ＥＳＴ序列开发的引物，其中去
除了１０对引物，它们分别是 ＡＷ６８８８６１、ＢＩ２６３３９３、ＭｔＳＳＲＮＦＡＷ１６、ＭｔＳＳＲＮＦＡＷ５０、ＡＧ８１、ＭＳＡ１３２９３、
ＡＷ５０８２４７、ＡＷ１８６４９３、ＢＥ８０１１２８和 ＭｔＳＳＲＮＦＡＷ５５。
１．３ 数据统计
经过银染后，所有ＤＮＡ扩增片段的大小都参考１００ｂｐ的ｍａｒｋｅｒ记录下来。扩增片段的“有”和“无”分别用
“１”和“０”代表，每个扩增片段和基因组上的一个位点相对应，最后形成一个０，１矩阵。多态性信息含量ＰＩＣ
（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｃｏｎｔｅｎｔ）计算式为犘犐犆＝１－∑
犽
犻＝１
犘犻２，式中，犽是一对引物所检测到等位基因数量，犘犻是
第犻个等位基因的频率。用ＮＴＳＹＳｐｃｖ２．１（ｎｕｍｅｒｉｃａｌｔａｘｏｎｏｍｙｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅａｎａｌｙｓｉｓｓｙｓｔｅｍｖｅｒｓｉｏｎ２．１０）软
件包［３０］中的Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｄａｔａ对原始０，１矩阵进行计算，获得相似性系数矩阵，根据相似性系数矩阵用不加权组
平均法（ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄｐａｉｒｇｒｏｕｐｍｅｔｈｏｄｏｆａｒｉｔｈｍｅｔｉｃｍｅａｎｓ，ＵＰＧＭＡ）绘制树形图。对上面求得的相似性系数
矩阵用Ｄｃｅｎｔｅｒ程序进行系数转换，再用Ｅｉｇｅｎ求出特征值和特征向量，并绘制出主坐标之间的二维和三维图。
２ 结果与分析
２．１ ＡＣＧＭｓ和ＥＳＴＳＳＲ引物有用性分析
本研究利用３７对ＡＣＧＭｓ引物和４８对ＥＳＴＳＳＲ引物对４６个不同的山蚂蝗属基因型进行多态性分析。
ＡＣＧＭ和ＥＳＴＳＳＲ的转移性比较结果见表２和３。不难发现ＡＣＧＭ引物的转移性远高于ＥＳＴＳＳＲ引物。能
３０１第１７卷第６期 草业学报２００８年
表１ 供试４６份山蚂蝗属植物种质的编号及详情
犜犪犫犾犲１ 犇犲狊犮狉犻狆狋犻狅狀狅犳４６犇犲狊犿狅犱犻狌犿犪犮犮犲狊狊犻狅狀狊狌狊犲犱犻狀狋犺犻狊狊狋狌犱狔
编号Ｎｏ． 种名Ｎａｍｅ 采集地点Ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃｏｒｉｇｉｎ 纬度Ｌａｔｉｔｕｄｅ（Ｎ）经度Ｌｏｎｇｉｔｕｄｅ（Ｅ）海拔Ｅｌｅｖａｔｉｏｎ（ｍ）
Ｃ０
长波叶山蚂蝗
犇．狊犲狇狌犪狓
云南镇康Ｚｈｅｎｋａｎｇ，Ｙｕｎｎａｎ ２４°１４′ ９９°０８′ １００４．０
Ｃ１ 云南卡房 Ｋａｆａｎｇ，Ｙｕｎｎａｎ ２３°１５′ １０３°０２′ １４１４．０
Ｃ２ 贵州坡妹Ｐｏｍｅｉ，Ｇｕｉｚｈｏｕ ２５°０８′ １０５°４１′ ９８９．７
Ｃ３ 云南梁河Ｌｉａｎｇｈｅ，Ｙｕｎｎａｎ ２４°４７′ ９８°１３′ １０３７．０
Ｃ４ 云南腾冲 Ｔｅｎｇｃｈｏｎｇ，Ｙｕｎｎａｎ ２４°５６′ ９８°２６′ １４１０．０
Ｃ５ 云南新平 Ｘｉｎｐｉｎｇ，Ｙｕｎｎａｎ ２３°４９′ １０２°０４′ １２２２．０
Ｃ６ 云南磨黑 Ｍｏｈｅｉ，Ｙｕｎｎａｎ ２３°０９′ １０１°０８′ １４５２．０
Ｃ７ 云南元江 Ｙｕａｎｊｉａｎｇ，Ｙｕｎｎａｎ ２３°２６′ １０１°４７′ １５８７．０
Ｃ８ 云南勐省 Ｍｅｎｇｓｈｅｎｇ，Ｙｕｎｎａｎ ２３°２４′ ９９°２３′ ９７４．８
Ｃ９ 云南普洱Ｐｕｅｒ，Ｙｕｎｎａｎ ２２°５４′ １００°５９′ １６２２．０
Ｄ 大叶拿身草犇．犾犪狓犻犳犾狅狉狌犿 云南勐仑 Ｍｅｎｇｌｕｎ，Ｙｕｎｎａｎ ２１°５５′ １０１°１１′ ５９０．８
Ｆ１
葫芦茶
犜．狋狉犻狇狌犲狋狉狌犿
云南勐腊 Ｍｅｎｇｌａ，Ｙｕｎｎａｎ ２１°５８′ １０１°０９′ １０２２．０
Ｆ２ 广西湖润 Ｈｕｒｕｎ，Ｇｕａｎｇｘｉ ２２°５７′ １０６°４２′ ２６３．８
Ｆ３ 云南勐海 Ｍｅｎｇｈａｉ，Ｙｕｎｎａｎ ２１°５８′ １００°３１′ １１６８．０
Ｆ４ 云南梁河Ｌｉａｎｇｈｅ，Ｙｕｎｎａｎ ２４°４７′ ９８°１３′ １０３７．０
Ｆ５ 云南腾冲 Ｔｅｎｇｃｈｏｎｇ，Ｙｕｎｎａｎ ２４°５６′ ９８°２６′ １４４０．０
Ｆ６ 云南龙陵Ｌｏｎｇｌｉｎｇ，Ｙｕｎｎａｎ ２４°３９′ ９８°３９′ １２５８．０
Ｆ７ 云南江城Ｊｉａｎｇｃｈｅｎｇ，Ｙｕｎｎａｎ ２２°３３′ １０１°３７′ ９７７．５
Ｆ８ 云南普洱Ｐｕｅｒ，Ｙｕｎｎａｎ ２２°４３′ １００°５８′ １４５２．０
Ｌ１
异果山绿豆
犇．犺犲狋犲狉狅犮犪狉狆狅狀
云南江城Ｊｉａｎｇｃｈｅｎｇ，Ｙｕｎｎａｎ ２２°３２′ １０１°４７′ ８５３．３
Ｌ２ 云南勐腊 Ｍｅｎｇｌａ，Ｙｕｎｎａｎ ２２°０９′ １０１°２８′ ８１７．９
Ｌ３ 云南普洱Ｐｕｅｒ，Ｙｕｎｎａｎ ２２°４３′ １０１°０８′ １３４６．０
Ｌ４ 云南沧源Ｃａｎｇｙｕａｎ，Ｙｕｎｎａｎ ２３°１７′ ９９°４１′ ８５３．０
Ｌ５ 贵州坡妹Ｐｏｍｅｉ，Ｇｕｉｚｈｏｕ ２５°０８′ １０５°４１′ ９８９．７
Ｒ１
绒毛山蚂蝗
犇．狏犲犾狌狋犻狀狌犿
云南江城Ｊｉａｎｇｃｈｅｎｇ，Ｙｕｎｎａｎ ２２°３５′ １０１°４６′ ９６６．２
Ｒ２ 广西旧州Ｊｉｕｚｈｏｕ，Ｇｕａｎｇｘｉ ２４°４１′ １０５°４２′ ５３９．１
Ｒ３ 云南新城 Ｘｉｎｃｈｅｎｇ，Ｙｕｎｎａｎ ２４°４８′ ９８°０４′ ９００．６
Ｒ４ 云南潞西Ｌｕｘｉ，Ｙｕｎｎａｎ ２４°２５′ ９８°３２′ ８６２．９
Ｒ５ 云南沧源Ｃａｎｇｙｕａｎ，Ｙｕｎｎａｎ ２３°１７′ ９９°４１′ ８５３．０
Ｒ６ 云南江城Ｊｉａｎｇｃｈｅｎｇ，Ｙｕｎｎａｎ ２２°３４′ １０１°４６′ ８５３．３
Ｒ７ 云南勐腊 Ｍｅｎｇｌａ，Ｙｕｎｎａｎ ２２°０９′ １０１°２８′ ８１７．９
Ｓ１
肾叶山蚂蝗
犇．狉犲狀犻犳狅犾犻狌犿
中国科学院西双版纳热带植物园 Ｘｉｓｈｕａｎｇ
ｂａｎｎａＴｒｏｐｉｃａｌＢｏｔａｎｉｃａｌＧａｒｄｅｎ，ＣＡＳ
２１°５５′ １０１°１５′ ５４５．３
Ｓ２ 云南普洱Ｐｕｅｒ，Ｙｕｎｎａｎ ２２°３６′ １００°５９′ １００３．０
Ｓ３ 云南普洱Ｐｕｅｒ，Ｙｕｎｎａｎ ２２°５４′ １０１°０１′ １４８３．０
Ｓ４ 云南磨黑 Ｍｏｈｅｉ，Ｙｕｎｎａｎ ２３°１５′ １０１°０９′ １０５４．０
Ｗ１
舞草
犆．犿狅狋狅狉犻狌狊
云南勐糯 Ｍｅｎｇｎｕｏ，Ｙｕｎｎａｎ ２４°１５′ ９９°０４′ ６０４．８
Ｗ２ 贵州巧马Ｑｉａｏｍａ，Ｇｕｉｚｈｏｕ ２４°５４′ １０５°２６′ ４５９．８
Ｗ３ 云南清水 Ｑｉｎｇｓｈｕｉ，Ｙｕｎｎａｎ ２４°５６′ ９８°２６′ １４１０．０
Ｗ４ 云南清水Ｑｉｎｇｓｈｕｉ，Ｙｕｎｎａｎ ２４°５６′ ９８°２６′ １４１０．０
Ｗ５ 中国科学院西双版纳热带植物园 Ｘｉｓｈｕａｎｇ
ｂａｎｎａＴｒｏｐｉｃａｌＢｏｔａｎｉｃａｌＧａｒｄｅｎ，ＣＡＳ
２１°５５′ １０１°１５′ ５４５．３
Ｘ１ 小叶三点金
犇．犿犻犮狉狅狆犺狔犾犾狌犿
云南普洱Ｐｕｅｒ，Ｙｕｎｎａｎ ２２°４３′ １０１°０８′ １３４６．０
Ｘ２ 云南江城Ｊｉａｎｇｃｈｅｎｇ，Ｙｕｎｎａｎ ２２°２８′ １０２°１６′ １２３２．０
Ｙ１
大叶山蚂蝗
犇．犵犪狀犵犲狋犻犮狌犿
广西靖西Ｊｉｎｇｘｉ，Ｇｕａｎｇｘｉ ２３°１７′ １０６°２４′ ７８５．４
Ｙ２ 广西旧州Ｊｉｕｚｈｏｕ，Ｇｕａｎｇｘｉ ２４°４１′ １０５°４２′ ５３９．１
Ｙ３ 云南江城Ｊｉａｎｇｃｈｅｎｇ，Ｙｕｎｎａｎ ２２°３３′ １０１°３７′ ９７７．５
Ｙ４ 云南元江Ｙｕａｎｊｉａｎｇ，Ｙｕｎｎａｎ ２３°３１′ １０１°５４′ ８９８．０
４０１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．６） １２／２００８
对所有山蚂蝗属种质进行有效扩增的ＡＣＧＭ 引物共有１８对，占有扩增片段引物（３２对）的５６．２５％。ＥＳＴＳＳＲ
引物中至少能在１个山蚂蝗属基因型中有效扩增的引物为２６对，而能对所有４６个山蚂蝗属基因型进行有效扩
增的引物只有５对，仅占有扩增片段引物的１９．２３％。ＡＣＧＭ 引物中，ＧＡ３和ＧＡ８的扩增产物最多，都达到了
１２条，而ＧＡ６、ＧＡ２０、ＧＡ２１和ＧＡ２４仅有１个扩增片段。ＥＳＴＳＳＲ引物中，ＡＩ７３７６０８和ＡＱ８４２１２８分别扩增
出了８个片段，ＡＩ９７４３５７、ＡＬ３６９９９４、ＡＷ１２７６２６、ＡＷ６８４３４１、ＭｔＳＳＲＮＦＡＬ２１、ＭｔＳＳＲＮＦＡＷ８１和 ＭｔＳＳＲＮＦ
ＢＧ４６均只扩增出１条ＤＮＡ片段。
２．２ 基因多态性分析
分析ＡＣＧＭ、ＥＳＴＳＳＲ的０，１矩阵得到各供试材料的相似性系数，２种标记的遗传相似性系数变幅、平均相
似性系数见表３。同时对２种标记总合的０，１矩阵进行分析，得到的相似性系数分布于０．５２３～０．９６７，平均值
为０．７０３。相似性系数最大值０．９６７出现在绒毛山蚂蝗Ｒ２和Ｒ３之间，说明这２份绒毛山蚂蝗资源的遗传差异
图１ 供试材料的地理分布
犉犻犵．１ 犌犲狅犵狉犪狆犺犻犮狅狉犻犵犻狀狅犳４６犇犲狊犿狅犱犻狌犿犪犮犮犲狊狊犻狅狀狊犮狅犾犲犮狋犲犱犳狉狅犿犢狌狀狀犪狀－犌狌犻狕犺狅狌犘犾犪狋犲犪狌狅犳犆犺犻狀犪
各种质名称见表１，下同Ｔｈｅｇｅｒｍｐｌａｓｍｎａｍｅｓｗｅｒｅｌｉｓｔｅｄｉｎｔａｂｌｅ１，ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ
表２ 犃犆犌犕和犈犛犜犛犛犚引物的扩增能力［２８，２９］
犜犪犫犾犲２ 犔犻狊狋狅犳狋犺犲犃犆犌犕犪狀犱犈犛犜犛犛犚狆狉犻犿犲狉狊狑犺犻犮犺狑犲狉犲狌狋犻犾犻狕犲犱犻狀狋犺犲４６犇犲狊犿狅犱犻狌犿犪犮犮犲狊狊犻狅狀狊
项目Ｉｔｅｍ 引物名Ｐｒｉｍｅｒｎａｍｅ
ＡＣＧＭ
ＧＡ１ ＧＡ２ ＧＡ３ ＧＡ４￥ ＧＡ５￥ Ｇ６Ａ Ｇ７Ａ ＧＡ８￥ ＧＡ９￥ ＧＡ１０￥ ＧＡ１２ ＧＡ１３￥ ＧＡ１４￥ ＧＡ１６ ＧＡ１７ ＧＡ１８￥
ＧＡ１９ ＧＡ２０￥ ＧＡ２１￥ ＧＡ２２ ＧＡ２４ ＧＡ２５￥ ＧＡ２６￥ ＧＡ２７ ＧＡ２８￥ ＧＡ３０￥ ＧＡ３１￥ ＧＡ３３￥ ＧＡ３５￥ ＧＡ３６￥
ＧＡ３７ ＧＡ３８
ＥＳＴＳＳＲ
ＡＩ７３７６０８ ＡＩ９７４３５７ＡＩ９７４８４１￥ ＡＬ３６５８９２￥ ＡＬ３６９９９４ ＡＬ３７０５４９ ＡＱ５７９６４１ ＡＱ８４２１２８ ＡＷ１２７６２６￥ ＡＷ５８４５３９
ＡＷ６８４３４１ ＡＷ６８５６７９ ＡＷ６８８２１６ ＢＦ６４９２０９ ＭｔＳＳＲＮＦＡＬ１８ ＭｔＳＳＲＮＦＡＬ２９ ＭｔＳＳＲＮＦＡＷ１０ ＭｔＳＳＲＮＦＡＷ１５４
ＭｔＳＳＲＮＦＡＷ３８ ＭｔＳＳＲＮＦＡＷ８１ ＭｔＳＳＲＮＦＢＥ１５ ＭｔＳＳＲＮＦＢＦ１０３ ＭｔＳＳＲＮＦＢＦ２０ ＭｔＳＳＲＮＦＢＧ２８￥ ＭｔＳＳＲＮＦＢＧ４６
ＭｔＳＳＲＮＦＢＩ１５￥
：能对至少１个山蚂蝗属种质进行有效扩增的引物 Ｔｈｅｐｒｉｍｅｒｓｗｈｉｃｈｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙａｍｐｌｉｆｉｅｄｉｎａｔｌｅａｓｔｏｎｅ犇犲狊犿狅犱犻狌犿ａｃｃｅｓｓｉｏｎ；￥：能对所有
４６个山蚂蝗属种质进行有效扩增的引物 Ｔｈｅｐｒｉｍｅｒｓｗｈｉｃｈｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙａｍｐｌｉｆｉｅｄｉｎａｌｏｆｔｈｅ４６犇犲狊犿狅犱犻狌犿ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ．
５０１第１７卷第６期 草业学报２００８年
很小。相似性系数最小值０．５２３出现在绒毛山蚂蝗
Ｒ４和长波叶山蚂蝗Ｃ５间。绒毛山蚂蝗与长波叶山
蚂蝗所有基因型间的平均相似性系数为０．５５８，远低
于４６份供试山蚂蝗属植物材料的平均相似系数
０．７０３，可见绒毛山蚂蝗与长波叶山蚂蝗种间存在较大
遗传多样性。经相关性测验，ＡＣＧＭ、ＥＳＴＳＳＲ以及
两者总合的遗传相似性系数间的相关性都达到了极显
著水平。
对ＡＣＧＭ、ＥＳＴＳＳＲ以及两者总合的遗传相似
性系数进行聚类分析后得到ＵＰＧＭＡ树形图，从树形
图上可以清楚的看出所有材料被分成了９个组，即组
Ｃ、Ｄ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｌ、Ｆ、Ｓ和组Ｒ（图２和３）。其中组Ｃ、
Ｘ、Ｙ、Ｆ、Ｌ、Ｓ和Ｒ分别包括长波叶山蚂蝗、小叶三点
金、大叶山蚂蝗、葫芦茶、异果山绿豆、肾叶山蚂蝗和绒
毛山蚂蝗种的全部基因型。而５个舞草基因型被分成
两部分，Ｗ１和 Ｗ２与大叶拿身草聚在一起形成组Ｄ，
而剩下的３个舞草基因型构成 Ｗ 组。从 ＵＰＧＭＡ树
形图３Ａ中可以看出，ＡＣＧＭ标记能有效地区分４６份
山蚂蝗属种质资源，而ＥＳＴＳＳＲ标记只能区别遗传
表３ 犃犆犌犕和犈犛犜犛犛犚标记的转移性和对４６个
山蚂蝗属基因型多态性的比较
犜犪犫犾犲３ 犜狉犪狀狊犳犲狉犪犫犻犾犻狋狔犪狀犱狆狅犾狔犿狅狉狆犺犻狊犿狅犳犃犆犌犕犪狀犱
犈犛犜犛犛犚犪犿狅狀犵狋犺犲４６犇犲狊犿狅犱犻狌犿犪犮犮犲狊狊犻狅狀狊
项目Ｉｔｅｍ ＡＣＧＭ ＥＳＴＳＳＲ
引物数Ｎｏ．ｏｆｐｒｉｍｅｒｓ ３７ ４８
能扩增出片段的引物数 ３２ ２６
Ｎｏ．ｏｆｔｒａｎｓｆｅｒａｂｌｅｐｒｉｍｅｒｓ
能扩增出片段的引物比例 ８６．４９ ５４．１７
Ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｌｅｐｒｉｍｅｒｓｒａｔｉｏ（％）
扩增出的片段数 １５２ １０７
Ｎｏ．ｏｆａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｓ
扩增片段分布范围 ７０～８００ ７０～１５００
Ｒａｎｇｅｏｆａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｓｉｚｅｓ（ｂｐ）
平均每对引物扩增出的片段数 ４．１ ２．２
Ｎｏ．ｏｆｆｒａｇｍｅｎｔｓ／ｐｒｉｍｅｒ
多态性片段数Ｎｏ．ｏｆｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｌｏｃｉ １３５ ７９
多态性比率Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｒａｔｉｏ（％） ８８．８１ ７３．８３
多态性信息含量ＰＩＣ ０．４２１ ０．７９６
相似性系数变幅 ０．５２６～０．９５６０．４３０～１．０００
Ｒａｎｇｅｏｆｇｅｎｅｔｉｃｄｉｓｔａｎｃｅ
平均相似性系数 ０．６８２ ０．７４０
Ｍｅａｎｇｅｎｅｔｉｃｄｉｓｔａｎｃｅ
图２ 基于犃犆犌犕和犈犛犜犛犛犚分析的犝犘犌犕犃树形图
犉犻犵．２ 犇犲狀犱狉狅犵狉犪犿狅犳４６犇犲狊犿狅犱犻狌犿犪犮犮犲狊狊犻狅狀狊犫犪狊犲犱狅狀犃犆犌犕犪狀犱犈犛犜犛犛犚犱犪狋犪
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图３ 基于犃犆犌犕标记分析的犝犘犌犕犃树形图（犃）和基于犈犛犜犛犛犚标记分析的犝犘犌犕犃树形图（犅）
犉犻犵．３ 犇犲狀犱狉狅犵狉犪犿狊狅犳４６犇犲狊犿狅犱犻狌犿犪犮犮犲狊狊犻狅狀狊犫犪狊犲犱狅狀犃犆犌犕 （犃）犪狀犱犈犛犜犛犛犚（犅）犱犪狋犪，狉犲狊狆犲犮狋犻狏犲犾狔
背景差异相对较大的山蚂蝗属植物资源，对于遗传背景相似性很高的葫芦茶Ｆ１与Ｆ７、异果山绿豆Ｌ１与Ｌ３、绒
毛山蚂蝗Ｒ２与Ｒ４、Ｒ３与Ｒ５则不能将它们区分开来。
在聚类图中舞草被分成了２个部分，第１部分即 Ｗ１和 Ｗ２与大叶拿身草聚到了一起，而第２部分 Ｗ３、Ｗ４
和 Ｗ５自成一组。从表面上看这是个明显的错误，但是从形态学上分析，Ｗ１、Ｗ２与 Ｗ３、Ｗ４和 Ｗ５的形态差异
很大。首先，Ｗ１、Ｗ２嫩叶被金黄色柔毛，叶脉明显；其次，三出复叶中的侧生小叶与顶生小叶的长度差异比舞草
Ｗ３、Ｗ４和 Ｗ５小得多；第三，小叶先端急尖至钝圆，具小细尖，基部楔形。与此相反，舞草 Ｗ３、Ｗ４和 Ｗ５表皮毛
短而少，侧生小叶很小，小叶先端不具小细尖。形态学和分子标记鉴定结果暗示 Ｗ１、Ｗ２与 Ｗ３、Ｗ４、Ｗ５的遗传
距离较远，山蚂蝗属舞草种内可能存在较大的遗传多样性。
２．３ 主坐标分析
基于ＡＣＧＭ和ＥＳＴＳＳＲ分析的遗传相似性系数，对４６个供试山蚂蝗属种质进行了主坐标分析，并建立了
二维和三维图（图４）。从主坐标聚类图４Ａ中可以看出４６份山蚂蝗属种质被分成了５个大组，组Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ和ＩＶ
分别囊括了长波叶山蚂蝗、绒毛山蚂蝗、葫芦茶和肾叶山蚂蝗的所有基因型；剩下的基因型都进入组Ｖ。而从三
维图４Ｂ中可以发现５份舞草和大叶拿身草并没有被紧紧的束缚在组Ｖ中，其中大叶拿身草和舞草中的 Ｗ１和
Ｗ２与其他基因型的遗传距离相对较大。
３ 讨论
世界各国都非常重视植物种质资源的收集、保存、评价及利用研究［３１，３２］。而系统地估计种质资源的遗传多
样性有助于阐明种质资源间的相互关系，还能促进研究者对种质资源有用性状的开发和利用。对山蚂蝗属野生
种质资源的遗传多样性分析长期受到引物开发成本过高的限制，直到２００６年ＢｅｄｏｌａＧａｒｃｉａ和ＬａｒａＣａｂｒｅｒａ［８］
发表了首篇利用ＲＡＰＤ标记对从美洲采集的山蚂蝗属野生种质进行多样性分析的报告。本研究利用ＡＣＧＭ和
７０１第１７卷第６期 草业学报２００８年
图４ ４６份山蚂蝗属种质资源的主坐标分析二维图（犃）和三维图（犅）
犉犻犵．４ 犜犺犲２犱犻犿犲狀狊犻狅狀（犃）犪狀犱３犱犻犿犲狀狊犻狅狀（犅）狊犮犪狋狋犲狉狆犾狅狋狊犳狅狉４６犪犮犮犲狊狊犻狅狀狊狅犫狋犪犻狀犲犱犫狔狆狉犻狀犮犻狆犪犾
犮狅犿狆狅狀犲狀狋犪狀犪犾狔狊犻狊（犘犆犃）犫犪狊犲犱狅狀狋犺犲犃犆犌犕犪狀犱犈犛犜犛犛犚犱犪狋犪
ＥＳＴＳＳＲ两种基于基因表达序列开发的分子标记对中国云贵高原热带、亚热带地区部分野生山蚂蝗属种质的遗
传多样性进行评估。试验结果表明，这２种标记都能有效地对野生山蚂蝗属种质进行分类，用这２种标记对４６
份山蚂蝗属种质分析后得出的遗传相似性系数显著正相关。较来自苜蓿属的ＥＳＴＳＳＲ标记而言，基于水稻表
达序列的ＡＣＧＭ标记更能揭示供试山蚂蝗属植物的遗传多样性，并且其转移性也明显高于ＥＳＴＳＳＲ标记。
ＡＣＧＭ引物中，８６．４９％可以产生扩增条带，虽然略低于利用这批引物分析竹亚科（犅犪犿犫狌狊狅犻犱犲犪犲）种质所得到结
论（８７．１８％）［３３］，但这已经远高于本研究中所用的ＥＳＴＳＳＲ标记（５４．１７％）。同时 Ｗａｎｇ等［２９］利用与本研究相
同的ＥＳＴＳＳＲ对猪屎豆属（犆狉狅狋犪犾犪狉犻犪）种质进行多态性研究时发现仅有４８％的引物能产生有效扩增片段。
Ｇｕｐｔａ等［３４］发现ＥＳＴＳＳＲ引物在大麦（犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲）和小麦间的转移性为５５．１２％。Ｓａｈａ等［３５］分析从高
羊茅（犉犲狊狋狌犮犪犪狉狌狀犱犻狀犪犮犲犪）表达序列中开发的ＥＳＴＳＳＲ标记，发现这些标记在水稻和小麦中的转移性分别为
４３％和３８％，而在黑麦草（犔狅犾犻狌犿狆犲狉犲狀狀犲）中的转移性为６６％。ＡＣＧＭ标记在山蚂蝗属植物中的高转移性可能
缘于研究人员在开发水稻ＡＣＧＭ引物时对小麦、大麦和玉米的ＥＳＴ数据库进行了ＢＬＡＳＴＮ检索，选择错配碱
基率低于４％的保守引物［２８］，从而提高了标记的可转移性。值得注意的是，能对山蚂蝗属植物有效扩增的２６对
ＥＳＴＳＳＲ引物中，有１８对（５６．２５％）能同时在猪屎豆属植物中进行有效扩增［２９］，这可能与属间基因组的共线性
有关。本研究中，ＡＣＧＭ的多态性比率为８８．８１％，略高于ＥＳＴＳＳＲ的７３．８３％，同时也明显高于ＡＣＧＭ 引物
在小麦中的多态性比率７０％［３６］。ＡＣＧＭ的高多态性比率可能与本研究所用材料来自山蚂蝗属的９个野生种，
整体遗传背景差异较大有关。
基于ＡＣＧＭ和ＥＳＴＳＳＲ标记的聚类分析结果表明，这２类标记都能有效地对山蚂蝗属野生种质资源分类，
而且划分结果与形态学划分的结果基本一致，证明这２种标记对山蚂蝗属内遗传距离的界定是有效的。但是在
一些种的次序上有所不同，可能与２种标记所检测的位点不同有关［３７］。ＡＣＧＭ具有很强的基因型鉴别能力，每
对ＡＣＧＭ引物的平均扩增片段数为４．１条，远大于ＥＳＴＳＳＲ的２．２条。在舞草和葫芦茶的分类方面，本研究聚
类分析结果与传统的分类结果存在一些分歧。舞草的５个基因型 Ｗ１～Ｗ５与其他山蚂蝗属种质的平均遗传相
似性系数为０．７３６，葫芦茶与其他山蚂蝗属种质的平均遗传相似性系数为０．７１４，均高于４６份供试种质的总平均
值０．７０３。因而认为舞草和葫芦茶是山蚂蝗属内的２个种，与《海南植物志》［３８］的分类结果一致，而在《中国植物
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志》［３９］中葫芦茶和舞草被划分成２个独立的属。
本研究利用ＡＣＧＭ 和ＥＳＴＳＳＲ标记对山蚂蝗属野生种质资源间遗传多样性进行分析，并取得了一定的成
果，同时对亲缘关系较远物种间分子标记的通用性研究做出了初步探索，证明了高等植物间基于保守序列设计的
分子标记有一定的通用性。在对山蚂蝗属的９个种进行多态性研究时发现分类结果与传统分类出现了一些矛盾
的地方，但就山蚂蝗属这样一个研究还不深入的物种来说，出现分歧也是可以接受的。再次说明结合分子标记对
那些仅依据形态特征分类的物种进行研究是必需的。
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犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｋｎｏｗｎｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｅ，１９９９，４２：３８７４０２．
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０１１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．６） １２／２００８
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（１．ＹｕｎｎａｎＢｅｅｆＣａｔｔｌｅ＆ＰａｓｔｕｒｅＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｒｅ，Ｋｕｎｍｉｎｇ６５０２１２，Ｃｈｉｎａ；２．ＴｒｏｐｉｃａｌＰａｓｔｕｒｅ
ＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ，ＴｒｏｐｉｃａｌＣｒｏｐｓＧｅｎｅｔｉｃＲｅｓｏｕｒｃｅｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣＡＴＡＳ，Ｄａｎｚｈｏｕ５７１７３７，Ｃｈｉｎａ；
３．ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＫｕｎｍｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
Ｋｕｎｍｉｎｇ６５０２２４，Ｃｈｉｎａ；４．ＣｏｌｅｇｅＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｙｕｎｎａｎ
ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ６５０２０１，Ｃｈｉｎａ）
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ＡＣＧＭ ｍａｒｋｅｒｓａｎｄ４８ｐｒｉｍｅｒｐａｉｒｓｏｆＥＳＴＳＳＲ，ｄｅｖｅｌｏｐｅｄｆｒｏｍｔｈｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏ
ａｓｓｅｓｓｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ４６犇犲狊犿狅犱犻狌犿ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓｆｒｏｍ９ｓｐｅｃｉｅｓ．ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍ
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ＥＳＴＳＳＲ．ＢａｓｅｄｏｎｔｈｅＡＣＧＭａｎｄＥＳＴＳＳＲｄａｔａ，ｇｅｎｅｔｉｃｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓａｍｏｎｇａｌｔｈｅ犇犲狊犿狅犱犻狌犿ａｃ
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ｍｏｎｇ犇犲狊犿狅犱犻狌犿ｇｅｒｍｐｌａｓｍｓ．Ａｌ４６犇犲狊犿狅犱犻狌犿ｇｅｎｏｔｙｐｅｓｗｅｒｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙｂｙｔｈｅＡＣＧＭ
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犓犲狔狑狅狉犱狊：犇犲狊犿狅犱犻狌犿；ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙ；ａｍｐｌｉｆｉｅｄｃｏｎｓｅｎｓｕｓｇｅｎｅｔｉｃｍａｒｋｅｒｓ；ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇｓｉｍｐｌｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ
１１１第１７卷第６期 草业学报２００８年