全 文 ：书犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１５０４２０ 犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀
唐晓梅，王艳，马东伟，程海洋，杨宏，代娅，陶向，马欣荣．干旱胁迫下高羊茅基因组甲基化分析．草业学报，２０１５，２４（４）：１６４１７３．
ＴａｎｇＸＭ，ＷａｎｇＹ，ＭａＤＷ，ＣｈｅｎｇＨＹ，ＹａｎｇＨ，ＤａｉＹ，ＴａｏＸ，ＭａＸＲ．ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｏｆｔａｌｆｅｓｃｕｅｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｄｒｏｕｇｈｔ
ｂａｓｅｄｏｎｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＭＳＡＰ）．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１５，２４（４）：１６４１７３．
干旱胁迫下高羊茅基因组甲基化分析
唐晓梅１，２，王艳１，马东伟３，程海洋１，２，杨宏１，代娅１，２，陶向１，马欣荣１
（１．中国科学院成都生物研究所，四川 成都６１００４１；２．中国科学院大学，北京１０００４９；３．吉林工商学院信息工程分院，吉林 长春１３００６２）
摘要：ＤＮＡ甲基化是真核细胞基因组重要的一种表观遗传调控。ＤＮＡ甲基化影响基因表达，在植物逆境胁迫适
应中起着重要作用。高羊茅是禾本科单子叶羊茅属植物，具有良好的耐寒、耐热性，大量用作运动场草坪和防护草
坪，也可用做牧草。干旱是限制高羊茅分布和产量的主要因素之一。本研究利用甲基化敏感扩增多态性技术
（ＭＳＡＰ），比较了高羊茅在干旱胁迫１５ｄ后基因组胞嘧啶甲基化的变化。在干旱胁迫下，植株生长受到严重抑制。
ＭＳＡＰ分析显示，１０对选择性扩增引物，共扩增出４７５个ＣＣＧＧ位点，其中１３１个位点发生了甲基化或去甲基化变
化，占２７．５８％。对照组和干旱处理组，总甲基化水平分别是４３．１６％和４２．１１％，显示干旱胁迫诱导高羊茅总的甲
基化率下降了１．０５％。对差异条带进行归类分析，并克隆、测序，获得１３条不同变化类型的序列。序列同源分析
显示，大多数序列是参与胁迫应答的基因片段。其中２个片段，Ｆａ６和Ｆａ７为干旱诱导下发生甲基化的位点，分别
与小麦和大麦的一个逆转录转座子具有较高的同源性，在干旱胁迫下它们的甲基化程度增加，表明干旱诱导二者
进一步甲基化。甲基化的转座子在维持基因组稳定性具有重要作用。综上，干旱胁迫诱导的甲基化的变化，可能
参与高羊茅对环境的适应性调节。
关键词：高羊茅；干旱胁迫；ＤＮＡ甲基化；ＭＳＡＰ；转座子　　
犃狀犪犾狔狊犻狊狅犳犇犖犃犿犲狋犺狔犾犪狋犻狅狀狅犳狋犪犾犳犲狊犮狌犲犻狀狉犲狊狆狅狀狊犲狋狅犱狉狅狌犵犺狋犫犪狊犲犱狅狀犿犲狋犺狔犾犪
狋犻狅狀狊犲狀狊犻狋犻狏犲犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狆狅犾狔犿狅狉狆犺犻狊犿（犕犛犃犘）
ＴＡＮＧＸｉａｏＭｅｉ１，２，ＷＡＮＧＹａｎ１，ＭＡＤｏｎｇＷｅｉ３，ＣＨＥＮＧＨａｉＹａｎｇ１，２，ＹＡＮＧＨｏｎｇ１，ＤＡＩＹａ１，２，ＴＡＯ
Ｘｉａｎｇ１，ＭＡＸｉｎＲｏｎｇ１
１．犆犺犲狀犵犱狌犐狀狊狋犻狋狌狋犲狅犳犅犻狅犾狅犵狔，犆犺犻狀犲狊犲犃犮犪犱犲犿狔狅犳犛犮犻犲狀犮犲狊，犆犺犲狀犵犱狌６１００４１，犆犺犻狀犪；２．犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔狅犳犆犺犻狀犲狊犲犃犮犪犱犲犿狔狅犳
犛犮犻犲狀犮犲狊，犅犲犻犼犻狀犵１０００４９，犆犺犻狀犪；３．犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犐狀犳狅狉犿犪狋犻狅狀犈狀犵犻狀犲犲狉犻狀犵，犑犻犾犻狀犅狌狊犻狀犲狊狊犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔犆狅犾犾犲犵犲，犆犺犪狀犵犮犺狌狀
１３００６２，犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋：ＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｍｏｓｔｉｍｐｏｒｔａｎｔｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｉｎｔｈｅｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｉｎｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ
ｃｅｌｓ．ＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎａｆｆｅｃｔｓｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｐｌａｙｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｐｌａｎｔｓａｄａｐｔｉｎｇｔｏａｄｖｅｒｓｅｅｎｖｉ
ｒｏｎｍｅｎｔｓ．Ｔａｌｆｅｓｃｕｅ（犉犲狊狋狌犮犪犪狉狌狀犱犻狀犪犮犲犪），ａｇｒａｍｉｎｅｏｕｓｍｏｎｏｃｏｔ，ｈａｓｓｕｐｅｒｉｏｒｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｃｏｌｄａｎｄｈｅａｔ．
Ｉｔｉｓｗｉｄｅｌｙｕｓｅｄｆｏｒｓｐｏｒｔｓｔｕｒｆ，ｅｒｏｓｉｏｎｃｏｎｔｒｏｌ，ａｎｄａｓａｆｏｒａｇｅｇｒａｓｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎａｎｄｙｉｅｌｄｏｆ
ｔａｌｆｅｓｃｕｅｉｓｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄｂｙｄｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓ．Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ｔｈｅｇｒｏｗｔｈｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄａｎｄｔｈｅＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ
ｐｒｏｆｉｌｅｏｆｔａｌｆｅｓｃｕｅ（ｃｖ．Ｂａｒｌｅｘａｓ）ｅｖａｌｕａｔｅｄｕｓｉｎｇｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＭＳＡＰ）
ａｆｔｅｒ１５ｄｄｒｏｕｇｈｔｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｔｈｅｐｌａｎｔｓｗａｓｓｅｒｉｏｕｓｌｙｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄｕｎｄｅｒｗａｔｅｒｄｅｆｉｃｉｔｃｈａｌｅｎｇｅ．
Ｇｅｎｏｍｅｗｉｄｅ，ａｔｏｔａｌｏｆ４７５ＣＣＧＧｓｉｔｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＭＳＡＰｕｓｉｎｇ１０ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｐｒｉｍｅｒｐａｉｒｓｉｎｔａｌｆｅｓｃｕｅ
第２４卷　第４期
Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．４
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
２０１５年４月
Ａｐｒｉｌ，２０１５
收稿日期：２０１４０４０３；改回日期：２０１４０５１５
基金项目：国家支撑项目（２０１４ＢＡＣ０５Ｂ０４３）和中国科学院西部之光项目（Ｙ３Ｃ４０１１１００）资助。
作者简介：唐晓梅（１９８９），女，四川乐至人，硕士。Ｅｍａｉｌ：ｔｘｍｄｙｘ＿ｏｋ＠１２６．ｃｏｍ
通讯作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅｍａｉｌ：ｍａｘｒ＠ｃｉｂ．ａｃ．ｃｎ
ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ．Ａｍｏｎｇｔｈｅｓｅｓｉｔｅｓ，１３１ｓｉｔｅｓ（２７．５８％）ｓｈｏｗｅｄｄｒｏｕｇｈｔｉｎｄｕｃｅｄｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎａｎｄｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ．
Ｔｈｅｔｏｔａｌｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌｗａｓ４３．１６％ｉｎｃｏｎｔｒｏｌａｎｄ４２．１１％ｉｎｄｒｏｕｇｈｔｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｗｈｉｃｈｉｎｄｉｃａｔｅｓａ１．０５％
ｄｅｃｒｅａｓｅｗｈｅｎｅｘｐｏｓｅｄｔｏｄｒｏｕｇｈｔ．Ｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆ１３ａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｓｗｅｒｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙｏｂｔａｉｎｅｄ，ｒｅｐｒｅ
ｓｅｎｔｉｎｇｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｔｙｐｅｓｏｆｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｃｈａｎｇｅｓ．Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｍｏｓｔｏｆｔｈｅｆｒａｇｍｅｎｔｓ
ｗｅｒｅｒｅｌｅｖａｎｔｔｏｓｔｒｅｓｓ．Ｔｗｏｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（Ｆａ６ａｎｄＦａ７）ｗｉｔｈｅｎｈａｎｃｅｄｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｉｎｄｕｃｅｄｂｙｄｒｏｕｇｈｔｗｅｒｅｈｏ
ｍｏｌｏｇｏｕｓｔｏａｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｏｆ犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿ａｎｄ犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｓｈｏｗｉｎｇｄｒｏｕｇｈｔｉｎ
ｄｕｃｅｄｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓ．ＴｈｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓｉｓｖｉｔａｌｉｎｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇＤＮＡｓｔａｂｉｌｉ
ｔｙ．Ｉｎｓｕｍｍａｒｙ，ｄｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓｄｅｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｔｏｔａｌＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌｉｎｔｈｅｔａｌｆｅｓｃｕｅｇｅｎｏｍｅ，ａｎｄｔｈｅ
ａｌｔｅｒｅｄｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｓｔｒｅｓｓｗａｓｐｒｏｂａｂｌｙｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｓｔｒｅｓｓａｃｃｌｉｍａｔｉｏｎ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｔａｌｆｅｓｃｕｅ；ｄｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓ；ＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ；ＭＳＡＰ；ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ
面对千变万化的环境，植物进化出许多不同的生存机制，最常见的策略是基因的适应性调控。调节基因表达
的方式不仅限于特异的ＤＮＡ序列，转录因子，蛋白质ＤＮＡ相互作用，而且涉及表观遗传调控。表观遗传调控是
指在不改变ＤＮＡ序列的条件下，基因表达发生了可遗传的变化［１］。
ＤＮＡ甲基化是表观遗传学研究的主要内容之一，包括胞嘧啶和腺嘌呤的甲基化，由特异的甲基化转移酶介
导，是真核细胞基因组重要的表观遗传学调控方式。ＤＮＡ甲基化主要影响ＤＮＡ转录和复制［２］。由于植物基因
组的复杂性，植物甲基化率一般比动物高，甲基化位点主要位于对称序列如ＣｐＧ和ＣｐＮｐＧ中［３］。在植物发育过
程中，ＤＮＡ甲基化状态与基因表达密切相关，并在调节转座子的活性中起到重要作用［４］。植物基因组中异染色
质通常是高度甲基化的，常染色质基因沉默通常与高甲基化有关，而低甲基化通常可激活基因的表达［５］。
在植物逆境胁迫中，干旱是最频繁的环境胁迫之一，能诱导ＤＮＡ甲基化在基因组范围内发生变化［６］。ＤＮＡ
甲基化作为一种控制效应基因表达活动的重要开关，调节基因表达，引起不同水平的生理反应，以适应干旱胁
迫［７８］。例如，可降低水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）叶和根的ＤＮＡ甲基化程度以激活更多的基因表达，以调节水稻对干旱
的适应性［９］。在霍山石斛（犇犲狀犱狉狅犫犻狌犿犺狌狅狊犺犪狀犲狀狊犲）中，干旱胁迫亦诱导ＤＮＡ甲基化水平的降低［１０］。而在豌
豆（犘犻狊狌犿狊犪狋犻狏狌犿）中，干旱诱导基因组胞嘧啶超甲基化产生［１１］。
目前，常用重亚硫酸盐（ｓｏｄｉｕｍｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）处理法，免疫共沉淀法（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ），限制性内切酶（ｒｅ
ｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅ）法来检测基因组范围内或者特定基因的甲基化状态［１２］。ＭＳＡＰ（ＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＳｅｎｓｉｔｉｖｅＡｍｐｌｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，甲基化敏感扩增多态性）是检测基因组胞嘧啶甲基化的一种最常用的方法，属于限制性
内切酶法。ＭＳＡＰ利用同裂酶犎狆犪Ⅱ和犕狊狆Ⅰ识别相同的四核苷酸序列ＣＣＧＧ，但是对于胞嘧啶甲基化敏感性
不同，可产生不同的ＤＮＡ切割片段来揭示不同的甲基化位点。犎狆犪Ⅱ可酶切一条链被甲基化的位点（ｈｅｍｉ
ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ，半甲基化），但不能切割两条链都被甲基化的位点（ｆｕｌｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ，全甲基化）；而犕狊狆Ⅰ只对双链
内侧全甲基化位点（ＣｍＣＧＧ）进行切割，不切割外侧（ｍＣＣＧＧ）或者内外均甲基化的（ｍＣｍＣＧＧ）位点［１３１５］。除
此之外，犎狆犪Ⅱ和 犕狊狆Ⅰ 均可切割无甲基化ＣＣＧＧ位点。因此，对于一个给定的ＤＮＡ样品，利用 犎狆犪Ⅱ和
犕狊狆Ⅰ 可以分析ＣＣＧＧ位点的甲基化状态［１６］。由于 ＭＳＡＰ独特的优势，如操作简单，多态性高，引物设计简便
等。最重要的是不需要知道ＤＮＡ样品的序列信息，就可以在全基因组范围内分析特定位点的ＤＮＡ甲基化状
态。因此，ＭＳＡＰ被广泛用于各种植物中检测胞嘧啶甲基化，如玉米（犣犲犪犿犪狔狊）［１７］，小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻
狏狌犿）［１８］，香蕉（犕狌狊犪狀犪狀犪）［１９］，棉花（犌狅狊狊狔狆犻狌犿ｓｐｐ．）［２０］等。
高羊茅（犉犲狊狋狌犮犪犪狉狌狀犱犻狀犪犮犲犪），禾本科羊茅属（犉犲狊狋狌犮犪）草本植物，属于多年生疏丛、冷季型禾草，具有生长
迅速、再生性强等特点，自然分布于中国东北、新疆地区和欧亚大陆，已是世界温带和亚热带地区建立人工草地和
补播天然草场的重要草种。在我国具有广泛的气候和土壤环境适宜性，大部分地区均可种植［２１］。然而，频繁发
生的干旱，严重影响了高羊茅的分布和生长［２２２５］。在一定程度胁迫下，植物可通过调节基因表达来适应干旱胁
迫［２６］。ＤＮＡ甲基化是调节基因表达的方式之一，研究高羊茅在胁迫下的甲基化，对于研究高羊茅对胁迫的适应
５６１第４期 唐晓梅　等：干旱胁迫下高羊茅基因组甲基化分析
性，具有重要意义。到目前为止，高羊茅在适应包括干旱在内的非生物胁迫中的ＤＮＡ甲基化状况还未见报道。
本文应用 ＭＳＡＰ技术研究高羊茅在干旱条件下的基因组ＤＮＡ甲基化状态的变化，检测了胞嘧啶甲基化的
模式和水平，分析比较了干旱胁迫和对照叶片的甲基化差异，克隆并测序了由 ＭＳＡＰ方法得到的１３条甲基化差
异条带，讨论了这些条带在干旱胁迫应答过程中可能起到的作用。
１　材料与方法
１．１　材料和干旱试验
高羊茅品种凌志（犉．犪狉狌狀犱犻狀犪犮犲犪ｃｖ．Ｂａｒｌｅｘａｓ）种子购自百绿（天津）国际草业有限公司。成熟种子于２０１２
年１０月，在四川省成都市（３０．６７°Ｎ，１０４．０６°Ｅ）温室（自然光照周期和光照强度，光照强度１５０μｍｏｌ／ｍ
２·ｓ，温
度１８～２５℃）中播种６０盆。每两天浇水１次。３周以后，将所有植株叶片修剪１次，保留５ｃｍ，进行下一步的试
验。将６０盆高羊茅分为两组，每组３０盆，一组干旱处理１５ｄ作为处理组，另外３０盆仍每两天浇１次水作为对
照组。１５ｄ后，随机剪取对照组１０盆中叶片（约１０００株）混在一起并立即液氮速冻，储存在液氮中，处理组用相
同的方法取样并保存，用于提取ＤＮＡ，分别构建两个群体样本的ＤＮＡ池。
限制性内切酶犈犮狅ＲⅠ，犎狆犪Ⅱ，犕狊狆Ⅰ 和Ｔ４ＤＮＡ连接酶，均购自ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ生物技术有限公
司。ＰＣＲ扩增相关试剂（ＴａｑＤＮＡ聚合酶，ｄＮＴＰ等）购自宝生物工程（大连）有限公司。
１．２　基因组ＤＮＡ池构建
对照组和处理组群体样本的基因组ＤＮＡ，用改良的ＣＴＡＢ方法进行提取［２７］，分别获得ＤＮＡ池。１％琼脂
糖凝胶电泳和吸光度值测定检测ＤＮＡ质量和浓度。总ＤＮＡ样品在－２０℃条件下储存。
１．３　甲基化敏感扩增多态性分析
ＭＳＡＰ方法改良自ＲｅｙｎａＬｏｐｅｚ等［２８］。首先对基因组ＤＮＡ进行双酶切。简言之，对基因组ＤＮＡ分别同
时进行犎狆犪Ⅱ／犈犮狅ＲⅠ 或犕狊狆Ⅰ／犈犮狅ＲⅠ双酶切，２０μＬ酶切体系中包含４００ｎｇＤＮＡ，２０Ｕ犎狆犪Ⅱ和１０Ｕ
犈犮狅ＲⅠ，或者２０Ｕ犕狊狆Ⅰ和１０Ｕ犈犮狅ＲⅠ，３７℃酶切５ｈ，６５℃下２０ｍｉｎ终止反应。
酶切后进行连接反应。在酶切片段的两端加上人工设计的与犈犮狅ＲⅠ和犎狆犪Ⅱ／犕狊狆Ⅰ酶切位点互补的接
头。接头连接反应体系为２０μＬ，１０×Ｔ４Ｂｕｆｆｅｒ２μＬ，４００Ｕ／μＬＴ４ 连接酶１μＬ，２０μｍｏｌ／Ｌ的犈犮狅ＲⅠ和犎狆犪
Ⅱ／犕狊狆Ⅰ接头０．４μＬ，无菌去离子水补齐，１６℃过夜。连接反应于６５℃温育１０ｍｉｎ终止。连接产物用作预扩
增产物的模板。
接头连接后，进行预扩增。预扩增反应体系为２０μＬ，１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ０．４μＬ，１０×Ｂｕｆｆｅｒ２μＬ，５Ｕ／μＬ
Ｔａｑ酶０．２μＬ，１０μｍｏｌ／ＬＥ００ｐｒｉｍｅｒ０．５μＬ，１０μｍｏｌ／ＬＨＭ００ｐｒｉｍｅｒ０．５μＬ，其余用水补齐。ＰＣＲ反应条
件，９４℃３０ｓ，５６℃６０ｓ，７２℃６０ｓ，２６个循环，７２℃延伸１０ｍｉｎ。预扩增产物稀释２０倍，作为选择扩增模板。
选择性扩增。选择扩增体系与预扩增相同，引物为选择性扩增引物，ＰＣＲ反应条件，９４℃３０ｓ，６５℃至５６℃
３０ｓ，７２℃６０ｓ，１３个循环，每循环降０．７℃，进行降落式ＰＣＲ扩增；９４℃３０ｓ，５６℃３０ｓ，７２℃６０ｓ，２３个循环，
７２℃延伸１０ｍｉｎ。扩增产物用于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）分析扩增条带。
选择扩增ＰＣＲ产物加入上样缓冲液，９４℃变性１０ｍｉｎ，于６％变性ＰＡＧＥ胶垂直电泳，银染［２９］后，进行条带
分析。接头、预扩增引物、选择性引物序列，见表１。
ＭＳＡＰ试验进行了３个生物学重复和技术重复。
１．４　片段克隆及测序
在 ＭＳＡＰ试验完成后，用手术刀切取１３条差异 ＭＳＡＰ片段，编号为Ｆａ１～Ｆａ１３，分别放入１．５ｍＬ的离心
管内，加１００μＬ去离子水洗涤，立即离心并吸去水，再加３０μＬＴＥｂｕｆｆｅｒ并用吸头尖将胶带捣碎，浸泡过夜。短
暂离心后取上清液１μＬ，作为特异片段扩增模板。用对应的 ＭＳＡＰ选择性引物，采用 ＭＳＡＰ选择扩增的体系和
条件，进行扩增。取１μＬ扩增产物，直接克隆到ｐＭＤ１８Ｔ载体中 （ｐＭＤ?１８ＴＶｅｃｔｏｒｋｉｔ，Ｔａｋａｒａ，大连），连
６６１ 草　业　学　报 第２４卷
接反应按照说明书进行，１６℃连接过夜。取５μＬ连接
产物转化１００μＬ大肠杆菌感受态细胞 ＤＨ５α，加入
９００μＬＬＢ培养基，１５０ｒ／ｍｉｎ、３７℃振荡培养１ｈ，菌
体复苏后，短暂离心，弃去大部分上清，取１００μＬ菌液
涂布于含Ｘｇａｌ（２０μｇ／ｍＬ）的氨苄青霉素抗性ＬＢ
平板上，３７℃培养过夜。次日观察菌落，以氨苄青霉素
抗性标记和蓝白斑筛选阳性转化子。获得的重组子送
上海生工生物工程公司测序，测序结果在 ＮＣＢＩ上进
行ＢＬＡＳＴ序列比对分析（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）。
２　结果与分析
２．１　干旱对高羊茅生长的影响
播种３周之后高羊茅植株长到１０～１５ｃｍ高，修
剪后进行干旱胁迫试验。
１５ｄ之后，与对照组相比，干旱处理组植株生长
受到极大影响，植株高度仅为５～９ｃｍ，而对照组植物
高度为１５～１６ｃｍ。除此之外，在干旱条件下，植株叶
片变窄、开始发黄（图１）。
２．２　总甲基化状态
进一步运用 ＭＳＡＰ探究干旱组和对照组高羊茅
的基因组甲基化差异。结果显示，在对照组和干旱处
理组中，１０对选择性扩增引物共扩增出４７５个ＣＣＧＧ
位点，其中１３１个位点发生了甲基化或去甲基化变化，
占２７．５８％。总甲基化水平，对照和干旱处理组分别为
４３．１６％和４２．１１％，干旱胁迫后下降了１．０５％（图
２）。
表１　犕犛犃犘分析的接头和引物序列
犜犪犫犾犲１　犛犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳犪犱犪狆狋犲狉狊犪狀犱狆狉犻犿犲狉狊
狌狊犲犱犳狅狉犕犛犃犘犪狀犪犾狔狊犻狊
引物和接头
Ｐｒｉｍｅｒｓａｎｄａｄａｐｔｅｒｓ
核苷酸序列
Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（５′３′）
犈犮狅ＲⅠ 接头
犈犮狅ＲⅠａｄａｐｔｅｒ
ＣＴＣＧＴＡＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣ
ＡＡＴＴＧＧＴＡＣＧＣＡＧＴＣＴＡＣ
犎狆犪Ⅱ／犕狊狆Ⅰ 接头
犎狆犪Ⅱ／犕狊狆Ⅰａｄａｐｔｅｒ
ＧＡＣＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧ
ＣＧＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＡＴ
预扩增引物Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｉｍｅｒ
Ｅ００ ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣ
ＨＭ００ ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＣＧＧ
犈犮狅ＲⅠ选扩增引物犈犮狅ＲⅠｓｅｌｅｃｔｉｖｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｉｍｅｒｓ
Ｅ００＋ＡＴＣ（Ｅ４４） ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＴＣ
Ｅ００＋ＣＡＴ（Ｅ５０） ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＣＡＴ
Ｅ００＋ＧＴＣ（Ｅ７６） ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＧＴＣ
犎狆犪Ⅱ／犕狊狆Ⅰ选扩增引物犎狆犪Ⅱ／犕狊狆Ⅰｓｅｌｅｃｔｉｖｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｉｍｅｒｓ
ＨＭ００＋ＡＧＣ（Ｍ４０） ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＣＧＧＡＧＣ
ＨＭ００＋ＡＧＧ（Ｍ４１） ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＣＧＧＡＧＧ
ＨＭ００＋ＡＧＴ（Ｍ４２） ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＣＧＧＡＧＴ
ＨＭ００＋ＡＧＡ（Ｍ３９） ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＣＧＧＡＧＡ
图１　干旱影响高羊茅的生长
犉犻犵．１　犇狉狅狌犵犺狋犲犳犳犲犮狋狅狀狋犺犲狆犾犪狀狋犵狉狅狑狋犺狅犳狋犪犾犳犲狊犮狌犲
　　　 对照组（左），干旱处理组 （右）。Ｌｅｆｔ：ｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌ；Ｒｉｇｈｔ：ｔｈｅ
ｄｒｏｕｇｈｔｔｒｅａｔｅｄｐｌａｎｔｓ．
　　ＭＳＡＰ片段分为４种类型［３０］。Ⅰ型是无甲基化
位点，代表犈犮狅ＲⅠ／犎狆犪Ⅱ 和犈犮狅ＲⅠ／犕狊狆Ⅰ双酶切
组合中都有的条带。Ⅱ型是半甲基化（ｈｅｍｉｍｅｔｈｙｌａ
ｔｉｏｎ，仅有一条链甲基化）位点，代表犈犮狅ＲⅠ／犎狆犪Ⅱ
酶切组合中有条带，而犈犮狅ＲⅠ／犕狊狆Ⅰ酶切组合中没
有条带。Ⅲ型是内侧胞嘧啶全甲基化位点（ｆｕｌｍｅｔｈ
ｙｌａｔｉｏｎ，两条链均甲基化），代表犈犮狅ＲⅠ／犕狊狆Ⅰ酶切
组合中有条带，而犈犮狅ＲⅠ／犎狆犪Ⅱ组合中无条带。Ⅳ
型代表犈犮狅ＲⅠ／犎狆犪Ⅱ和犈犮狅ＲⅠ／犕狊狆Ⅰ酶切组合中
都没有条带，代表超甲基化位点。根据许多研究的共
识，将Ⅱ型条带视为半甲基化，Ⅲ型和Ⅳ型在统计中，通常视为全甲基化，Ⅳ型也视为超甲基化 （表２）。
在对照和干旱处理组中，半甲基化位点（Ⅱ型）分别有１０９和９１个，分别占２２．９５％和１９．１６％，显示干旱诱
导高羊茅基因组半甲基化率下降了３．７９％；全甲基化位点（Ⅲ型和Ⅳ型）分别有９６和１０９个，占２０．２１％和
２２．９５％。显示干旱诱导高羊茅基因组全甲基化率上升了２．７４％。统计分析采用卡方检验并用 Ｙａｔｅ’ｓ校正
（表２）。
７６１第４期 唐晓梅　等：干旱胁迫下高羊茅基因组甲基化分析
图２　犕犛犃犘扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
犉犻犵．２　犇犖犃犿犲狋犺狔犾犪狋犻狅狀狆犪狋狋犲狉狀狊犱犲狋犲犮狋犲犱犫狔
犕犛犃犘犪狊狊犪狔狑犻狋犺犘犃犌犈犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊
　Ｈ：犈犮狅ＲⅠ和犎狆犪Ⅱ双酶切产生的条带；Ｍ：犈犮狅ＲⅠ和犕狊狆Ⅰ
双酶切产生的条带；ＣＫ：对照组；ＤＲ：干旱组；引物：Ｅ４４Ｍ３９，
Ｅ４４Ｍ４０，Ｅ４４Ｍ４１，Ｅ４４Ｍｓｐ４２，Ｅ５０Ｍ３９，Ｅ５０Ｍ４０，Ｅ５０Ｍ４１，
Ｅ５０Ｍ４２，Ｅ７６Ｍ３９，Ｅ７６Ｍ４０；Ｆａ１～Ｆａ１３代表不同类型的条带，并
克隆测序。Ｈ：ＴｈｅＤＮＡｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙ犈犮狅ＲⅠａｎｄ犎狆犪Ⅱ；Ｍ：
ＴｈｅＤＮＡｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙ犈犮狅ＲⅠａｎｄ犕狊狆Ⅰ；ＣＫ：Ｃｏｎｔｒｏｌ；ＤＲ：
Ｔｈｅｄｒｏｕｇｈｔｔｒｅａｔｍｅｎｔ；Ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒｓ：Ｅ４４Ｍ３９，Ｅ４４Ｍ４０，
Ｅ４４Ｍ４１，Ｅ４４Ｍ４２，Ｅ５０Ｍ３９，Ｅ５０Ｍ４０，Ｅ５０Ｍ４１，Ｅ５０Ｍ４２，
Ｅ７６Ｍ３９，Ｅ７６Ｍ４０；Ｆａ１－Ｆａ１３：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｓ．
表２　高羊茅干旱处理组和对照组的 犕犛犃犘条带类型
犜犪犫犾犲２　犇犻犳犳犲狉犲狀狋狋狔狆犲狅犳犕犛犃犘犿犲狋犺狔犾犪狋犻狅狀犾犲狏犲犾狊狌狀犱犲狉犮狅狀狋狉狅犾犪狀犱犱狉狅狌犵犺狋狊狋狉犲狊狊犻狀狋犪犾犳犲狊犮狌犲
模式
Ｐａｔｔｅｒｎｓ
犎狆犪Ⅱ 犕狊狆Ⅰ
ＭＳＡＰ带型
ＭＳＡＰｂａｎｄｔｙｐｅｓ
条带数及比例Ｎｕｍｂｅｒ
ｏｆｂａｎｄｓａｎｄｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ
对照组Ｃｏｎｔｒｏｌ 干旱组Ｄｒｏｕｇｈｔ
比率 （干旱处理组／对照组）
Ｒａｔｉｏ（Ｄｒｏｕｇｈｔ／ｃｏｎｔｒｏｌ）
观测值Ｏｂｓｅｒｖｅｄｖａｌｕｅ 期望值Ｅｘｐｅｃｔｅｄｖａｌｕｅ
１ １ Ⅰ（非甲基化Ｕｎｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ） ２７０ ２７５ １．０２ａ １
１ ０ Ⅱ（半甲基化 Ｈｅｍｉｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ） １０９ ９１ ０．８３ａ １
０ １ Ⅲ（全甲基化Ｆｕｌｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ） ６７ ８１ １．２１ｂ １
０ ０ Ⅳ（超甲基化Ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ） ２９ ２８ ０．９７ａ １
总扩增位点Ｔｏｔａｌａｍｐｌｉｆｉｅｄｓｉｔｅｓ ４７５ ４７５
总甲基化位点Ｔｏｔａｌｍｅｔｈｙｌａｔｅｄｓｉｔｅｓ ２０５ ２００
全甲基化位点（Ⅲ＋Ⅳ）Ｆｕｌｍｅｔｈｙｌａｔｅｄｓｉｔｅｓ ９６ １０９
总甲基化率Ｔｏｔａｌｍｅｔｈｙｌａｔｅｄｒａｔｉｏ（％） ４３．１６ ４２．１１
全甲基化率Ｆｕｌｍｅｔｈｙｌａｔｅｄｒａｔｉｏ（％） ２０．２１ ２２．９５
半甲基化率Ｈｅｍｉｍｅｔｈｙｌａｔｅｄｒａｔｉｏ（％） ２２．９５ １９．１６
　总甲基化率＝［（Ⅱ＋Ⅲ＋Ⅳ）／（Ⅰ＋Ⅱ＋Ⅲ＋Ⅳ）］×１００％。Ｔｏｔａｌｍｅｔｈｙｌａｔｅｄｒａｔｉｏ＝［（Ⅱ＋Ⅲ＋Ⅳ）／（Ⅰ＋Ⅱ＋Ⅲ＋Ⅳ）］×１００％．全甲基化率
＝［（Ⅲ＋Ⅳ）／（Ⅰ＋Ⅱ＋Ⅲ＋Ⅳ）］×１００％。Ｆｕｌｍｅｔｈｙｌａｔｅｄｒａｔｉｏ＝［（Ⅲ＋Ⅳ）／（Ⅰ＋Ⅱ＋Ⅲ＋Ⅳ）］×１００％．半甲基化率＝［（Ⅱ）／（Ⅰ＋Ⅱ＋Ⅲ＋
Ⅳ）］×１００％。Ｈｅｍｉｍｅｔｈｙｌａｔｅｄｒａｔｉｏ＝［（Ⅱ）／（Ⅰ＋Ⅱ＋Ⅲ＋Ⅳ）］×１００％．ａ，观测值与期望值相比，差异不显著。ａ，Ｔｈｅｏｂｓｅｒｖｅｄｒａｔｉｏｗａｓｎｏｔｓｉｇ
ｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔ（犘＞０．０５）ｆｒｏｍｔｈｅｅｘｐｅｃｔｅｄｒａｔｉｏ．ｂ，观测值与期望值相比，差异显著。ｂ，Ｔｈｅｏｂｓｅｒｖｅｄｒａｔｉｏｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔ（犘＜
０．０５）ｆｒｏｍｔｈｅｅｘｐｅｃｔｅｄｒａｔｉｏ．
２．３　干旱诱导的甲基化和去甲基化的变化
基于以上结果，干旱诱导的胞嘧啶甲基化和去甲基化变化包括３种模式，共１４种条带类型（表３）。
第一种模式，甲基化位点无变化，包含３种条带类型，Ａ１，Ａ２，Ａ３，显示在对照组和干旱处理组有相同甲基化
类型ＣＣＧＧ位点，占７２．４２％。第二种模式，去甲基化，包含５种条带类型，Ｂ１～Ｂ５。Ｂ１～Ｂ３ 代表与对照组中的
甲基化位点变成非甲基化位点，占８．４２％；Ｂ４ 代表超甲基化位点变成半甲基化位点，占２．５３％；Ｂ５ 代表超甲基化
位点变成全甲基化位点，约占１．６８％。第三种模式，甲基化，包含６种条带类型，Ｃ１～Ｃ６。Ｃ１～Ｃ３ 代表对照组中
８６１ 草　业　学　报 第２４卷
的非甲基化位点变成甲基化位点，占７．３７％；Ｃ４ 代表半甲基化位点变成全甲基化位点，占２．３２％；Ｃ５ 代表半甲基
化位点变成超甲基化位点，占２．３２％；Ｃ６ 代表全甲基化位点变成超甲基化位点，占２．９４％ （表３）。
表３　干旱诱导的甲基化状态变化
犜犪犫犾犲３　犜犺犲犱犻犳犳犲狉犲狀狋狆犪狋狋犲狉狀狊狅犳犿犲狋犺狔犾犪狋犻狅狀犮犺犪狀犵犲狊犻狀犱狌犮犲犱犫狔犱狉狅狌犵犺狋
模式
Ｐａｔｔｅｒｎｓ
类型
Ｔｙｐｅｓ
带型Ｂａｎｄｉｎｇｐａｔｔｅｒｎ
对照组
Ｃｏｎｔｒｏｌ
犎狆犪Ⅱ 犕狊狆Ⅰ
干旱处理组
Ｄｒｏｕｇｈｔ
犎狆犪Ⅱ 犕狊狆Ⅰ
位点数
Ｓｉｔｅ
ｎｕｍｂｅｒｓ
甲基化变化情况
Ｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ
测序片段编号
Ｎｕｍｂｅｒｓｏｆ
ｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｄ
ｆｒａｇｍｅｎｔｓ
百分比
Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ
（％）
无变化
Ｎｏ
ｃｈａｎｇｅ
Ａ１ １ １ １ １ ２３５ 非甲基化→非甲基化Ｕｎｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ→ｕｎｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｆａ１２
Ａ２ １ ０ １ ０ ６２ 半甲基化→半甲基化 Ｈｅｍｉｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ→ｈｅｍｉｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｆａ１３ ７２．４２
Ａ３ ０ １ ０ １ ４７ 全甲基化→全甲基化Ｆｕｌｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ→ｆｕｌｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ 无Ｎｏ
去甲基化
Ｄｅｍｅｔｈ
ｙｌａｔｉｏｎ
Ｂ１ １ ０ １ １ ２５ 半甲基化→非甲基化 Ｈｅｍｉｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ→ｕｎｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｆａ５
Ｂ２ ０ １ １ １ ６ 全甲基化→非甲基化Ｆｕｌｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ→ｕｎｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｆａ４ ８．４２
Ｂ３ ０ ０ １ １ ９ 超甲基化→非甲基化 Ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ→ｕｎｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｆａ３
Ｂ４ ０ ０ １ ０ １２ 超甲基化→半甲基化 Ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ→ｈｅｍｉｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｆａ２ ２．５３
Ｂ５ ０ ０ ０ １ ８ 超甲基化→全甲基化 Ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ→ｆｕｌｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｆａ１ １．６８
甲基化
Ｍｅｔｈｙｌ
ａｔｉｏｎ
Ｃ１ １ １ １ ０ １７ 非甲基化→半甲基化Ｕｎｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ→ｈｅｍｉｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｆａ１０
Ｃ２ １ １ ０ １ １５ 非甲基化→全甲基化Ｕｎｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ→ｆｕｌｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｆａ９ ７．３７
Ｃ３ １ １ ０ ０ ３ 非甲基化→超甲基化Ｕｎｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ→ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｆａ１１
Ｃ４ １ ０ ０ １ １１ 半甲基化→全甲基化 Ｈｅｍｉｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ→ｆｕｌｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｆａ６ ２．３２
Ｃ５ １ ０ ０ ０ １１ 半甲基化→超甲基化 Ｈｅｍｉｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ→ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｆａ８ ２．３２
Ｃ６ ０ １ ０ ０ １４ 全甲基化→超甲基化Ｆｕｌｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ→ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｆａ７ ２．９４
２．４　ＭＳＡＰ差异性片段序列分析
选取片段长度超过１００ｂｐ的１４条差异条带，分别代表１４种甲基化差异模式，进行纯化克隆并测序，其中１
条未获得克隆，获得１３条差异条带，命名为Ｆａ１～Ｆａ１３。这些片段的长度从１０４ｂｐ到４３５ｂｐ不等。迄今，高羊
茅基因组测序还未完成，因此这些片段序列只能在ＮＣＢＩ上通过ＢＬＡＳＴＮ与其他植物做同源序列比对。根据分
析结果，这些序列与禾本科植物亲缘关系更近。同源功能分析，推测这些片段参与代谢、信号转导和转录调节，其
中３个片段推测是转座子序列（表４）。
３　讨论
本研究结果显示，干旱严重影响高羊茅的生长，植株矮小，叶片细窄，颜色较深，边缘逐渐变黄。新的表型能
更好地适应干旱环境。
ＭＳＡＰ结果显示，高羊茅的甲基化水平较高，在对照和干旱胁迫组中分别是４３．１６％和４２．１１％。据报道，植
物基因组胞嘧啶甲基化率通常超过３０％，不同的植物中甲基化水平存在差异，并且不同的组织或不同的环境下
亦存在差异［３１３２］。拟南芥甲基化率约为２０％［３３］。水稻叶和根中ＤＮＡ甲基化率约占１６．４３％～２２．１３％［９］。在
番茄（犛狅犾犪狀狌犿犾狔犮狅狆犲狉狊犻犮狌犿）中，未成熟组织和原生质体的甲基化率平均约２０％，比成熟组织（平均约２５％）
低［３４］。本研究显示高羊茅甲基化水平相对较高。目前发现一些物种基因组甲基化水平很高，如在多年生黑麦草
（犔狅犾犻狌犿狆犲狉犲狀狀犲）中甲基化率达到５７．６７％［３０］，在一种绿藻网石莼（犝犾狏犪狉犲狋犻犮狌犾犪狋犲）中检测到的甲基化率在丝状
菌体和盘状菌体中分别高达６７．５６％和７２．９７％［３５］。绝大多数植物基因组含有大量重复序列，甲基化水平与其
基因组复杂性密切相关，甲基化的ＤＮＡ绝大部分由转座子和其他重复序列构成，重复序列多的基因组，甲基化
程度亦较高［３３，３６］。高羊茅有一个庞大而复杂的基因组，基因组大小约为５２７０～５８３０Ｍｂ［３７３８］，推测存在大量重
复序列，多拷贝的重复序列可能发生胞嘧啶甲基化而失去活性，因此高羊茅甲基化率相对较高。
９６１第４期 唐晓梅　等：干旱胁迫下高羊茅基因组甲基化分析
表４　甲基化差异片段序列功能分析
犜犪犫犾犲４　犛犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳犿犲狋犺狔犾犪狋犲犱犳狉犪犵犿犲狀狋狊犪狀犱犅犔犃犛犜犖狊犲犪狉犮犺狉犲狊狌犾狋狊
名称
Ｎａｍｅ
片段长度
Ｓｉｚｅ
（ｂｐ）
甲基化变化
类型 Ｍｅｔｈｙ
ｌａｔｉｏｎｔｙｐｅ
同源参考基因登录号
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅａｃｃｅｓｓｉｏｎ
Ｎｏ．
参考基因注释及功能
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｈｏｍｏｌｏｇｙ
Ｆａ１ ２０４ 去甲基化
Ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ
ＡＦ４７４０７１．１ 部分同源：大麦ＢＡＣ克隆７４５ｃ１３。犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲ｓｕｂｓｐ．ｖｕｌｇａｒｅｃｕｌｔｉｖａｒＭｏｒｅｘＢＡＣ
ｃｌｏｎｅ７４５ｃ１３．
Ｆａ２ １８５ 去甲基化
Ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ
ＥＦ５６７０６２．１ 部分同源：小麦ＢＡＣ克隆１６４８＿４６４抗病蛋白基因，Ｐ４５０基因。犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿ｃｕｌｔｉｖａｒ
ＧｌｅｎｌｅａｃｌｏｎｅＢＡＣ１６４８＿４６４ｄｉｓｅａｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎ（Ｌｒ１）ｇｅｎｏｍｉｃｒｅｇｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔ＝Ｐ４５０．
Ｆａ３ ４３５ 去甲基化
Ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ
ＡＣ０９１７７５．１０ 部分同源：水稻３号染色体ＢＡＣＯＳＪＮＢａ０００４Ｇ１７基因组序列。犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ３
ＢＡＣＯＳＪＮＢａ０００４Ｇ１７ｇｅｎｏｍｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅ．
Ｆａ４ ４２１ 去甲基化
Ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ
ＦＮ５６４４３２．１ 部分同源：小麦染色体３Ｂ特异 ＢＡＣ 文库，重叠群ｃｔｇ０６１６ｂ。犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿ｃｈｒｏｍｏ
ｓｏｍｅ３ＢｓｐｅｃｉｆｉｃＢＡＣｌｉｂｒａｒｙ，ｃｏｎｔｉｇｃｔｇ０６１６ｂ．
Ｆａ５ １０４ 去甲基化
Ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ
ＡＫ３７４２５８．１ 部分同源：大麦 ｍＲＮＡ，克隆：ＮＩＡＳＨｖ３０５８Ｎ０６。犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲ｓｕｂｓｐ．ｖｕｌｇａｒｅｍＲＮＡ
ｆｏｒｐｒｅｄｉｃｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ，ｃｌｏｎｅ：ＮＩＡＳＨｖ３０５８Ｎ０６．
Ｆａ６ ３１４ 甲基化
Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ
ＦＮ６４５４５０．１ 部分同源：小麦３Ｂ特异染色体ＢＡＣ文库，重叠群ｃｔｇ００１１ｂ逆转录了转座子：Ｃｏｐｉａ。犜狉犻狋犻犮
狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ３ＢｓｐｅｃｉｆｉｃＢＡＣｌｉｂｒａｒｙ，ｃｏｎｔｉｇｃｔｇ００１１ｂｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ：Ｃｏｐｉａ．
Ｆａ７ １９７ 甲基化
Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ
ＡＹ８５３２５２．１ 部分同源：大麦７Ｂ端粒染色体逆转录转座子，Ｃｏｐｉａ，ＴＡＲ１。犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲狋犲犾狅犿犲狉犻犮
ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ７Ｂｒｅｇｉｏｎ，ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ：ＬＴＲｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ，Ｃｏｐｉａ，ＴＡＲ１．
Ｆａ８ ２２７ 甲基化
Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ
ＡＰ００６０６２．２ 部分同源：粳稻基因组序列９号染色体ＰＡＣ克隆：Ｐ０４１５Ｄ０４基因间隔区。犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪Ｊａ
ｐｏｎｉｃａＧｒｏｕｐｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ，ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ９，ＰＡＣｃｌｏｎｅ：Ｐ０４１５Ｄ０４．
Ｆａ９ ２５９ 甲基化
Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ
ＡＬ７３１８８０．３ 部分同源：日本晴１２号染色体ＢＡＣＯＳＪＮＢａ００３５Ｅ０２文库ＯＳＪＮＢａ基因组序列。犗狉狔狕犪狊犪狋犻
狏犪ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ１２．ＢＡＣＯＳＪＮＢａ００３５Ｅ０２ｏｆｌｉｂｒａｒｙＯＳＪＮＢａｆｒｏｍｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ１２ｏｆｃｕｌｔｉｖａｒ
Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅｏｆｓｓｐ．ｊａｐｏｎｉｃａｏｆ犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪（ｒｉｃｅ）．
Ｆａ１０ １７７ 甲基化
Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ
ＥＵ５３４４０９．１ 部分同源：中国小麦品种豫麦线粒体基因组序列。犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿ｃｕｌｔｉｖａｒＣｈｉｎｅｓｅＹｕｍａｉ
ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ．
Ｆａ１１ １５３ 甲基化
Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ
ＮＭ＿００１０７１０
５９．１
部分同源：粳稻（Ｏｓ１０ｇ０３９４４００）ｍＲＮＡ，编码区完整序列，ＮＢＳＬＲＲ类似抗性蛋白。犗狉狔狕犪
狊犪狋犻狏犪ＪａｐｏｎｉｃａＧｒｏｕｐＯｓ１０ｇ０３９４４００ｍＲＮＡ，ｓｉｍｉｌａｒｔｏＮＢＳＬＲＲｔｙｐｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎ．
Ｆａ１２ １３４ 无变化
Ｎｏｃｈａｎｇｅ
ＦＮ５６４４３４．１ 部分同源：小麦染色体３Ｂ特异ＢＡＣ文库，重叠群ｃｔｇ０９５４ｂ转座子：ＣＡＣＴＡ。犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊
狋犻狏狌犿ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ３ＢｓｐｅｃｉｆｉｃＢＡＣｌｉｂｒａｒｙ，ｃｏｎｔｉｇｃｔｇ０９５４ｂｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ：ＣＡＣＴＡ．
Ｆａ１３ ２４２ 无变化
Ｎｏｃｈａｎｇｅ
ＪＮ３８１５５５．１ 部分同源：小麦 ＢＡＣ１９９１Ｂ１８克隆细胞分裂素氧化酶／脱氢酶 （ＣＫＸ２．４）ｇｅｎｅ。犜犻狋犻犮狌犿
犪犲狊狋犻狏狌犿ｃｌｏｎｅＢＡＣ１９９１Ｂ１８ｃｙｔｏｋｉｎｉｎｏｘｉｄａｓｅ／ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＣＫＸ２．４）ｇｅｎｅ．
许多环境刺激，如冷、热、干旱、盐害和病菌感染都会导致ＤＮＡ甲基化状态的变化。多数胁迫情况下总甲基
化水平降低［３９４１］。如玉米在冷胁迫下甲基化程度降低了２．２％［１７］，水稻在干旱处理下叶和根中甲基化率分别下
降１．４９％和０．４１％［９］，红花在盐胁迫下８ｈ甲基化水平降低了０．８％［４２］，多年生黑麦草在干旱胁迫下甲基化程
度甚至降低了１０．２８％［３０］。在本研究中，干旱影响高羊茅的甲基化，总ＤＮＡ甲基化程度有所下降，与水稻中的
报道类似［９］。而全甲基化位点（Ⅲ型和Ⅳ型）在干旱胁迫下略微上升，并且比半甲基化位点（Ⅱ型）多，与玉米中的
研究结果类似［４３］。
ＤＮＡ去甲基化和甲基化，与转录的激活或者抑制密切相关［４４４７］。尽管本研究中，总的甲基化程度只下降了
１．０５％，但是在扩增的４７５个位点中，即有１３１个位点发生了甲基化或者去甲基化变化，占总位点的２７．５８％，显
示了干旱胁迫对高羊茅基因组ＤＮＡ甲基化的影响非常大。因此，推测亦会影响多个基因的表达。降低的甲基
化水平可能导致相应基因表达上升，反之亦然，甲基化升高会降低相应基因表达，这在表观遗传调控上提高了高
０７１ 草　业　学　报 第２４卷
羊茅对干旱的适应性。
本研究中，获得的１３条 ＭＳＡＰ不同类型的差异序列，呈现出不同的基因种类，包括转座子和一些胁迫应答
相关基因，这些基因可能参与干旱信号途径及生理反应。其中，５条序列（Ｆａ１～Ｆａ５）在干旱胁迫诱导下发生去甲
基化，包含２个推测的抗性蛋白基因；６条序列（Ｆａ６～Ｆａ１１）发生甲基化，涉及一些转座子等元件。
根据同源分析，推测Ｆａ６，Ｆａ７和Ｆａ１２可能是转座子基因片段。转座子在植物基因组中普遍存在，在植物基
因组中含量较高，并且基因组越大，含量越高。在拟南芥、水稻和玉米中，转座子分别占了基因组的１２％，４０％和
８５％［４８５０］。转座子一般是高度甲基化的，拟南芥中有９１％的转座子是甲基化的，甲基化水平高于编码基因，是
ＤＮＡ甲基化的主要位点［３３］。转座子是基因组不稳定性的主要来源，甲基化的转座子在防止不利环境因素改变
植物基因组ＤＮＡ序列具有重要作用，这对于维持基因组稳定性是必要的［５１５２］。转座子甲基化状态决定了其转
座能力，能通过甲基化状态的变化调节自身及下游基因的活性［５３］。转座子能插入功能基因从而引起功能基因或
者临近基因发生突变效应，影响基因表达。由于潜在的有害效应，大多数转座子在植物中的表达是被抑制的。本
研究中克隆获得１３条不同类型的差异序列，即有３条可能是转座子，推测高羊茅中转座子占较高含量。并且，干
旱诱导下２个转座子（Ｆａ６，Ｆａ７）进一步甲基化，１个（Ｆ１２）无变化，推测在维持逆境胁迫下基因组的稳定性发挥作
用，以防止不利环境因素对植物基因组ＤＮＡ序列的改变。另外，推测Ｆａ２是抗病蛋白基因，与小麦的１个Ｐ４５０
基因同源性较高，该基因在干旱胁迫下去甲基化，该基因可能参与高羊茅对干旱胁迫的适应。
植物在逆境胁迫下，ＤＮＡ甲基化的变化，从表观遗传水平上调节基因的表达，从而帮助植物面临短暂的困
境［５４］。甲基化抑制基因的表达，而去甲基化可能是真核基因组转录激活的一个必要的步骤［５５］。为了适应干旱
胁迫，高羊茅通过ＤＮＡ甲基化和去甲基化调节干旱相关的基因表达，引起生理变化。而且，去甲基化的ＤＮＡ多
于甲基化的ＤＮＡ，表明激活表达的基因多于被抑制的基因。转座子在调节高羊茅对环境适应中可能起重要作
用。综上，去甲基化基因表达的激活，以及甲基化基因表达的抑制，都可能增强高羊茅的干旱适应性。
４　结论
在干旱胁迫下，高羊茅ＤＮＡ甲基化状态发生变化，总甲基化水平在对照组和干旱处理组中分别是４３．１６％
和４２．１１％，下降了１．０５％，发生甲基化／去甲基化变化的位点达２７．５８％。许多胁迫耐受相关基因，包括一些转
座子，甲基化状态发生了改变。这些变化在表观遗传水平上调整植株以适应逆境胁迫。本论文为高羊茅进一步
抗逆研究打下基础，并提供有用的基因信息和资源。
犚犲犳犲狉犲狀犮犲狊：
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［２３］　ＧｕＪＬ，ＢｉａｎＸＪ，ＸｕＫ，犲狋犪犾．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｌｏｗｃｏｎｔｒｏｌｅｄｒｅｌｅａｓｅｎｉｔｒｏｇｅｎｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒｏｎｔａｌｆｅｓｃｕｅｔｕｒｆｇｒｏｗｔｈａｎｄｎｉｔｒｏｇｅｎｖｏｌａｔｉｌｉｚａ
ｔｉｏｎ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１３，２２（２）：２３５２４２．
［２４］　ＰｅｎｇＹ，ＬｉＺ．ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｄｒｏｕｇｈｔｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇｏｎｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓｔｏｈｅａｔｓｔｒｅｓｓｉｎｔｗｏＫｅｎｔｕｃｋｙｂｌｕｅｇｒａｓｓｅｓ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅ
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ｂｙａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＧｅｎｅｒａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，１９９７，２５３（６）：７０３７１０．
［２９］　ＢａｓｓａｍＢＪ，ＣａｅｔａｎｏＡｎｏｌｅｓＧ，ＧｒｅｓｓｈｏｆｆＰＭ．ＦａｓｔａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｅｓｉｌｖｅｒｓｔａｉｎｉｎｇｏｆＤＮＡｉｎｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｓ．ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
１９９１，１９６（１）：８０８３．
［３０］　ＴａｎｇＸＭ，ＴａｏＸ，ＷａｎｇＹ，犲狋犪犾．ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｏｆｐｅｒｅｎｎｉａｌｒｙｅｇｒａｓｓｕｎｄｅｒｄｒｏｕｇｈｔｕｓｉｎｇｔｈｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｍｐｌｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＭＳＡＰ）ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＧｅｍｏｍｉｃｓ，２０１４，２８９：１０７５１０８４．．
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ｃｌｅａｒＤＮＡ．ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１９９１，１６（５）：７５３７７０．
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ｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＭＳＡＰ）．ＭａｒｉｎｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，１４（６）：６９２７００．
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