全 文 ：书烟草柠檬酸合成酶基因的克隆及其
光诱导型植物表达载体的构建
胡清泉１，２，王奇峰２，李昆志２，陈丽梅２，玉永雄１
（１．西南大学动物科技学院，重庆４００７１６；２．昆明理工大学生物工程技术研究中心，云南 昆明６５０２２４）
摘要：紫花苜蓿为多年生优质豆科牧草。我国南方地区酸性土壤分布比较广，铝害比较严重，限制了紫花苜蓿在南
方地区的推广利用。提高有机酸合成酶基因的表达活性，增加有机酸的合成与分泌，有利于增强植物的耐铝性。
本研究根据Ｇｅｎｅｂａｎｋ中已知的烟草柠檬酸合成酶（ＣｉｔｒａｔｅＳｙｎｔｈａｓｅ，犮狊）基因的序列，通过 ＲＴ－ＰＣＲ从烟草总
ＲＮＡ中扩增犮狊基因的ｃＤＮＡ，亚克隆于Ｔ载体得到重组载体ｐＭＤ１８犮狊，对ｐＭＤ１８犮狊中的插入片断进行核酸序列
分析确认为犮狊基因的ｃＤＮＡ全长。用光诱导型启动子（Ｒｕｂｉｓｃｏ，小亚基的启动子）和双元载体ｐＰＺＰ２１１构建了犮狊
基因的光诱导型植物表达载体ｐＰＺＰ２１１ＰｒｂｃＳ犮狊，为利用基因工程手段提高紫花苜蓿耐铝毒能力，促进其在南方
地区推广利用奠定了物质基础。
关键词：柠檬酸合成酶基因；光诱导型启动子；植物表达载体；紫花苜蓿；耐铝性
中图分类号：Ｑ９４３．２；Ｑ９４６．８１＋８．６　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２００９）０４０１６１０７
　 紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）为多年生豆科牧草，是世界公认的优质饲草。自二十世纪九十年代以来，紫花
苜蓿在全球的种植面积已经超过３５００万ｈｍ２。在我国，紫花苜蓿主要生产在北方地区。近年来，由于草食畜牧
业的快速发展，我国南方的部分地区也引进了紫花苜蓿，并开始推广利用［１］。但是，我国南方地区的土壤多偏酸
性，而酸性土壤影响了紫花苜蓿在南方地区的正常生长。酸性土是典型的低产土壤，其主要原因就是铝毒害，微
摩尔水平的Ａｌ３＋即可对植物产生毒害，而酸性土壤溶液中Ａｌ３＋的浓度约为１０～１００μｍｏｌ／Ｌ
［２］。在酸性环境中，
不溶性的铝化物就转变为溶解状态的铝，进入到土壤中形成具有植物毒性的形态［３］。铝对紫花苜蓿毒害的最初
反应是抑制根的生长［４］，并因此抑制植物对水分、养分的吸收［５，６］，影响植物的生长发育。我国南方广大的酸性土
壤因铝毒害的原因限制了紫花苜蓿在该区域的大规模种植利用。要想在南方地区广泛推广利用紫花苜蓿，就必
须在改良南方酸性土壤的方法上或在培育抗铝毒的紫花苜蓿新品种上要有较大的突破。长期以来人们靠大量施
用石灰，来提高土壤的ｐＨ值，使游离铝沉淀，解除铝毒害。但是这种方法难以彻底解决土壤酸度问题，同时还存
在着潜在的环境问题以及投入成本过大的问题。从长远来看，培育出耐铝毒的紫花苜蓿品种是最为有效的方法。
因此，研究植物的耐铝机制，选育耐铝性强的品种是解决酸性土壤铝毒问题的重要途径。
在植物耐铝机制中，有机酸发挥很重要的作用。一些有机酸如柠檬酸、草酸、苹果酸、酒石酸等可与Ａｌ络合
形成稳定的复合物，这些复合物对植物的毒性较低甚至是无毒的［７］。在细胞内，有机酸与Ａｌ结合形成对植物毒
性低的Ａｌ－有机酸络合物，从而降低了细胞内Ａｌ３＋的浓度，降低了Ａｌ与细胞结构物质结合的机会，保护细胞免
受破坏；而经根系分泌进入土壤的有机酸与根际中的Ａｌ络合，降低根际中Ａｌ３＋的浓度，从而缓解Ａｌ毒对植物的
危害［８］。随着生物技术的快速发展，人们通过基因工程手段来改造现有品种使之具有耐铝性已成为可能［９，１０］。
以往的研究证明通过在植物中过量或异位表达有机酸合成酶基因，可以提高植物体内的有机酸含量。这些有机
酸通过根系分泌到土壤中，螯合土壤中的Ａｌ３＋，就能解除酸性土壤中高浓度的铝对植物的毒害。这样不仅可以
提高转基因植物对铝毒的耐受能力，而且还有利于它对磷等其他必需营养元素的吸收和利用。
第１８卷　第４期
Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．４
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
１６１－１６７
２００９年８月
 收稿日期：２００８０９１７；改回日期：２００９０１０４
基金项目：国家９７３项目（２００７ＣＢ１０８９０１），重庆市重点基金项目（ＣＳＴＸ，２００６ＢＡ１００８），教育部重点项目（１０６１４０）和云南省中青年学术与技
术带头人培养项目（２００４ＰＹ０１５）资助。
作者简介：胡清泉（１９８０），女，云南昆明人，硕士。
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｙｕｙｏｎｇｘｉｏｎｇ８＠１２６．ｃｏｍ，ｃｈｅｎｌｉｍｅｉｋｍ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
与草酸、苹果酸等有机酸相比，柠檬酸对Ａｌ络合的效果最好［１１，１２］，而植物体内柠檬酸的合成是由柠檬酸合
成酶（犮狊）催化完成的。增强柠檬酸合成酶的活性，增加柠檬酸生成量，可能会促进柠檬酸的分泌作用。由于柠檬
酸合成需要碳骨架，植物的叶片是光合作用器官，在叶片中产生的光合作用产物可以为柠檬酸的合成提供大量的
碳骨架。因此采用光诱导型植物表达载体进行转基因，使柠檬酸合成酶基因在叶中特异表达，将有利于柠檬酸的
生物合成。已有的柠檬酸合成酶基因的植物表达载体均采用组成型启动子（ＣａＭＶ３５Ｓ），ＣａＭＶ３５Ｓ的作用没有
组织特异性。用报告基因的研究结果表明ＣａＭＶ３５Ｓ的表达在根中最强，在茎、叶片、花和果实中较弱，而光诱导
的ＰｒｂｃＳ启动子，在茎中有低水平的表达，在叶片中的表达最强，比ＣａＭＶ３５Ｓ的高３～４倍［１３］。本研究根据
Ｇｅｎｅｂａｎｋ中已知的烟草犮狊基因的序列，用ＲＴ－ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，逆转录聚
合酶链式反应）从模式植物烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿）中分离柠檬酸合成酶基因，用光诱导型启动子（Ｒｕｂｉｓｃｏ小
亚基的启动子）和双元载体ｐＰＺＰ２１１构建了犮狊基因的光诱导型植物表达载体ｐＰＺＰ２１１ＰｒｂｃＳ犮狊，为利用基因工
程手段提高苜蓿耐铝毒能力奠定物质基础。
１　材料与方法
１．１　材料
１．１．１　植物材料　烟草种子由日本京都大学农学部植物生理研究室提供。
１．１．２　质粒和菌株　ｐＭＤ１８Ｔ载体购自宝生物工程（大连）有限公司。质粒载体的转化菌株为大肠杆菌（犈狊犮犺
犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻）ＤＨ５α或ＸＬ１Ｂｌｕｅ。ｐＵＣ１１８ＰｒｂｃＳＴｒｂｃＳ３Ｃ由Ｓｕｇｉｔａ等［１４］构建并提供，ｐＰＺＰ２１１由 Ｈａｊｄｕｋ
ｉｅｗｉｃｚ等［１５］构建并提供。
１．１．３　主要试剂　试验用的培养基主要是ＬＢ、ＴＢ、ＭＳ培养基，培养基及其他所用化学试剂均为国产或进口分
析纯。ＴＲＩｚｏＬＲｅａｇｅｎｔＲＮＡ提取试剂盒购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，ＴａＫａＲａＤＮＡｌｉｇａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ２．１、各种限制性
内切酶、ＴａｑＤＮＡ聚合酶、反转录酶、ＲＮＡ酶抑制剂、ｄＮＴＰ等为宝生物工程有限公司产品。
１．１．４　主要试验仪器　ＰＣＲ扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统、Ｂｅｃｋｍａｎ低温高速离心机、低温超速离心机等。
１．２　方法
１．２．１　烟草无菌苗的培养　烟草种子经过表面消毒后将其播种到 ＭＳ培养基上，于２３℃连续光照培养２～３
周，备用。
１．２．２　植物总ＲＮＡ的提取　采用ＴＲＩｚｏＬＲｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司）提取ＲＮＡ，按说明书进行操作。
１．２．３　引物设计与合成　根据Ｇｅｎｅｂａｎｋ中烟草柠檬酸合成酶基因（ｘ８４２２６）的序列设计了一对特异性引物，在
上游引物中添加犖犮狅Ｉ酶位点，在下游引物中引入犡犫犪Ｉ酶切位点。引物由宝生物工程有限公司合成。上游引物
Ａ为：５′ＣＡＣＣａｔｇｇｔｇｔｔｃｔａｔｃｇｃｇｇｃｇｔｔｔｃ３′；下游引物Ｂ为：５′ｔｃｔａａｇａｔｃａｔｇｃｔｔｔｃｔｔｇｃａａａｔｇｇｔｔｃ３′。
１．２．４　ｃＤＮＡ的合成　第１条ｃＤＮＡ链的合成：取植物总ＲＮＡ１μｇ，ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１μＬ，１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｍｉｘ１
μＬ，用ＤＥＰＣ（ＤｉＥｔｈｙｌＰｙｒｏＣａｒｂｏｎａｔｅ，焦碳酸二乙酯）处理水补足至１０μＬ，混匀后，置于６５℃恒温干热加热器
中作用５ｍｉｎ，冰浴１０ｍｉｎ，加入反应混合物［１０×ＲＴｂｕｆｆｅｒ２μＬ，２．５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２４μＬ，０．１ｍｏｌ／ＬＤＴＴ
（ＤｉＴｈｉｏＴｈｒｅｉｔｏｌ，二硫苏糖醇）］２μＬ，ＲＮＡ 酶抑制剂１μＬ）９μＬ，混匀，２５℃保温２ｍｉｎ，加入１μＬＳｕｐｅｒ
ＣｒｉｐｔＴＭⅡ反转录酶（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司）１μＬ，再混匀，２５℃保温２０ｍｉｎ，然后４２℃保温７０ｍｉｎ，冰浴１０ｍｉｎ。第２
条ｃＤＮＡ链的ＰＣＲ扩增：以ｃＤＮＡ为模板，用犮狊基因上下游特异性引物Ａ和Ｂ作ＰＣＲ，扩增犮狊的全长ｃＤＮＡ，
ＰＣＲ扩增按９４℃２ｍｉｎ；９４℃４５ｓ，５５℃４５ｓ，７２℃１．５ｍｉｎ，３０个循环；７２℃１０ｍｉｎ的程序进行。
１．２．５　ｃＤＮＡ的ＴＡ克隆与序列测定　将ＰＣＲ扩增产物进行凝胶电泳，切下含目的片断胶条，用液氮冻融后加
入１／５０的 ＭｇＣｌ２（０．５ｍｏｌ／Ｌ）和２．５倍的无水乙醇，混匀放置于－２０℃过夜（或－８０℃，３０ｍｉｎ），离心弃上清液，
用７５％的乙醇清洗沉淀，真空干燥沉淀，用１×ＴＥ（Ｔｒｉｓｂａｓｅ／ＥＤＴＡ 缓冲液）溶解。将回收的ＰＣＲ产物与
ｐＭＤ１８Ｔｖｅｃｔｏｒ（ＴａＫａＲａ）连接（按说明书进行操作），连接反应混合物用热刺激法转化大肠杆菌ＤＨ５α的感受
态细胞（北京博大泰克），涂布于加有抗生素的平板上筛选连接成功的重组载体。将含有插入片断的阳性克隆送
Ｂａｃｋｍａｎ公司测序。
１．２．６　质粒载体的定向突变　根据质粒的ＤＮＡ序列，设计定向突变的互补引物，委托ＴａＫａＲａ合成。在点突
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变反应混合液中加入２５ｎｇ的纯化质粒作为模板，同时加入１２５ｎｇ的突变引物、１μＬｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、５μＬ
的１０×ＫＯＤ反应Ｂｕｆｆｅｒ和１μＬ的ＫＯＤ聚合酶（日本东洋纺），加双蒸水使反应终体积为５０μＬ。在ＰＣＲ仪上
于９５℃加热３０ｓ，然后按照９５℃３０ｓ，５５℃１ｍｉｎ，６８℃１０ｍｉｎ的程序进行１５个循环的反应，最后在６８℃延长反
应１０ｍｉｎ，合成含突变位点的子链。反应完成后把反应混合液置于冰上冷却２ｍｉｎ，向反应混合液加入１μＬ的
限制性内切酶ＤｐｎＩ（１０Ｕ／μＬ）和５μＬ的ＤｐｎＩ反应缓冲液，于３７℃保温１ｈ，降解不含突变位点的母链。用反
应混合液转化高效率（１０８）的大肠杆菌感受态细胞（ＤＨ５α，天根生化科技），把转化好的大肠杆菌涂于加有抗生素
的平板上，筛选突变成功的质粒。
１．２．７　质粒ＤＮＡ的制备　小量质粒ＤＮＡ的制备采用ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｐｈａｔｅ，十二烷基硫酸钠）碱裂解
法，质粒ＤＮＡ的纯化采用北京博大泰克公司的超纯质粒中量提取试剂盒，操作步骤按说明书进行。ＤＮＡ片断
与载体的连接采用ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎｋｉｔＶｅｒ２．１（ＴａＫａＲａ），操作步骤按说明书进行。
２　结果与分析
２．１　犮狊基因ｃＤＮＡ的扩增与ＴＡ克隆
从烟草幼苗中提取总ＲＮＡ（图１Ａ），用 ＭＭｕＬＶＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（小鼠白血病病毒反转录酶）反转录
成ｃＤＮＡ，以ｃＤＮＡ为模板，用犮狊基因上下游特异性引物Ａ和Ｂ作ＰＣＲ，扩增犮狊的全长ｃＤＮＡ，ＰＣＲ扩增产物
经凝胶电泳检测确认主带的分子量为１．４ｋｂ（图１Ｂ）。回收并纯化ＰＣＲ扩增产物中１．４ｋｂ的ＤＮＡ片段进行
ＴＡ克隆，将其连接到ｐＭＤ１８Ｔ载体上构建成重组载体ｐＭＤ犮狊，用连接产物转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞，
获得重组子菌落，采用碱裂解法提取质粒ＤＮＡ，用１％琼脂糖凝胶电泳检测，选取大小和理论值相符的重组质粒
做进一步的酶切检测。根据ｐＭＤ１８Ｔ载体两端的多克隆位点，用犖犮狅Ｉ和犡犫犪Ｉ双酶切重组质粒，经１％琼脂糖
凝胶电泳检测，连接成功的重组质粒ｐＭＤ犮狊含有１．４ｋｂ左右的ＤＮＡ插入片段（图２），经序列分析证明是烟草
犮狊全长基因的ｃＤＮＡ。
２．２　利用定向突变技术在中间载体ｐＵＣ１１８ＴＰｒｂｃＳ中引入犖犮狅Ｉ位点
本研究使用的光诱导型启动子是从番茄（犔狔犮狅狊狆犲狉狊犻犮狅狀犲狊犮狌犾犲狀狋狌犿）的基因组中分离出来的ｒｂｃＳ３Ｃ启动子
（ＰｒｂｃＳ），是一个由犎犻狀犱ＩＩＩ切割产生的１．７ｋｂ的ＤＮＡ片断，已经亚克隆于ｐＵＣ１１８中，该亚克隆的质粒载体名
称为ｐＵＣ１１８ＰｒｂｃＳＴｒｂｃＳ３Ｃ（图３）。为了使犮狊表达后产生的目的蛋白能定位在叶片细胞质中，用限制性内切
酶犛狆犺Ｉ将ｐＵＣ１１８ＰｒｂｃＳＴｒｂｃＳ３Ｃ中的ｒｂｃＳ３Ｃ切割出来，再用连接酶重新连接不含ｒｂｃＳ３Ｃ的载体ＤＮＡ片
断，产生１个中间载体ｐＵＣ１１８ＰｒｂｃＳＴ（图３）。然后利用１对互补引物（图３），通过定向突变技术在ｐＵＣ１１８
ＰｒｂｃＳＴ的叶绿体定位序列起始密码处引入犖犮狅Ｉ位点产生中间载体ｐＵＣ１１８ＰｒｂｃＳＴ（图３）。
图１　通过犚犜－犘犆犚扩增得到犮狊基因犮犇犖犃
犉犻犵．１　犮犇犖犃狅犳犮狊犵犲狀犲狑犪狊犪犿狆犾犻犳犻犲犱犫狔犚犜－犘犆犚
　Ａ：烟草总ＲＮＡ。Ｂ：烟草ＲＮＡ的ＲＴ－ＰＣＲ。Ｍ：λＤＮＡ／犎犻狀犱ＩＩＩｄｉｇｅｓｔｍａｒｋｅｒ（分子量标记）；１～４：犮狊基因的ＲＴ－ＰＣＲ产物 Ａ：Ｔｏｂａｃｃｏｔｏｔａｌ
ＲＮＡ．Ｂ：ＲＴ－ＰＣＲｆｏｒｔｏｂａｃｃｏｔｏｔａｌＲＮＡ．Ｍ：λＤＮＡ／犎犻狀犱ＩＩＩｄｉｇｅｓｔｍａｒｋｅｒ；１－４：ＲＴ－ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆ犮狊ｇｅｎｅ
３６１第１８卷第４期 草业学报２００９年
２．３　重组质粒ｐＵＣ１１８ＰｒｂｃＳ犮狊的构建
图２　重组质粒狆犕犇犮狊的酶切检测
犉犻犵．２　犈狓犪犿犻狀犪狋犻狅狀犳狅狉狋犺犲狉犲犮狅犿犫犻狀犻犲狀狋狆犾犪狊犿犻犱狊
狆犕犇犮狊犫狔犲狀狕狔犿犲犱犻犵犲狊狋犻狅狀
１～２：用犡犫犪Ｉ和犖犮狅Ｉ双酶切重组质粒ｐＭＤ犮狊；Ｍ：λＤＮＡ／犎犻狀犱ＩＩＩｄｉｇｅｓｔ
ｍａｒｋｅｒ（分子量标记）１－２：ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎｉｅｎｔｐｌａｎｔｓｍｉｄｐＭＤ犮狊ｄｉｅｇｅｓｔｅｄ
ｗｉｔｈ犡犫犪Ｉａｎｄ犖犮狅Ｉ；Ｍ：ＤＮＡ／犎犻狀犱ＩＩＩｄｉｇｅｓｔｍａｒｋｅｒ
为了将ＰｒｂｃＳ启动子连接到犮狊基因的５′端，用
犖犮狅Ｉ和犡犫犪Ｉ双酶切ｐＭＤ犮狊和ｐＵＣ１１８ＰｒｂｃＳ
Ｔ，回收纯化１．４ｋｂ的犮狊基因ｃＤＮＡ片段以及载体
大片段ｐＵＣ１１８ＰｒｂｃＳ（约４．２ｋｂ），然后用连接酶
试剂盒连接犮狊基因ｃＤＮＡ 片段以及载体大片段
ｐＵＣ１１８ＰｒｂｃＳ、用连接反应混合物转化高效率
（１０８）的大肠杆菌感受态细胞，把转化好的大肠杆菌
涂于加有氨苄青霉素（Ａｍｐ，１００μｇ／ｍＬ）的平板上，
筛选Ａｍｐ抗性重组子菌落，从Ａｍｐ抗性重组子菌
落中提取质粒进行ＰＣＲ和酶切鉴定。以重组质粒
为模板，用１个位于ＰｒｂｃＳ启动子内部的引物及犮狊
基因的下游引物Ｂ进行ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ产物的理
论长度为１．６ｋｂ。ＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶电
泳，结果显示扩增产物的分子量为１．６ｋｂ，实际大
小与理论值相符合，表明已经将犮狊基因正确插入到
含有光诱导启动子ＰｒｂｃＳ的载体上（图４Ａ）。接着
对ＰＣＲ分析为阳性的重组质粒进行酶切检测，连接正确的重组质粒经犈犮狅犚Ｉ酶切应该得到１条１．０ｋｂ左右的
小片段和１条４．６ｋｂ的大片段，酶切产物经１％琼脂糖凝胶电泳检测，结果和理论相符（图４Ｂ），由此获得正确连
接的重组质粒ｐＵＣ１１８ＰｒｂｃＳ犮狊。
图３　中间载体狆犝犆１１８犘狉犫犮犛犜的构建
犉犻犵．３　犛狋狉犪狋犲犵狔犳狅狉犮狅狀狊狋狉狌犮狋犻狅狀狅犳狋犺犲犻狀狋犲狉犿犲犱犻犪狋犲狏犲犮狋狅狉狆犝犆１１８犘狉犫犮犛犜
　用犛狆犺Ｉ把ｐＵＣ１１８ＰｒｂｃＳＴｒｂｃＳ３Ｃ中的ｒｂｃＳ３Ｃ切除，并使载体自连接形成ｐＵＣ１１８ＰｒｂｃＳＴ，通过点突变技术在叶绿体定位序列的起始密码子
附近引入犖犮狅Ｉ位点ＲｅｍｏｖｅｄｒｂｃＳ３ＣｆｒｏｍｐＵＣ１１８ＰｒｂｃＳＴｒｂｃＳ３Ｃｂｙ犛狆犺ＩｄｉｇｅｓｔｉｏｎａｎｄｌｉｇａｔｅｄｔｈｅｖｅｃｔｏｒｔｏｆｏｒｍｐＵＣ１１８ＰｒｂｃＳＴ．犖犮狅Ｉｓｉｔｅ
ｗａｓｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｉｎａｓｔａｒｔｃｏｄｅｎｒｅｇｉｏｎｏｆｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｔｒａｎｓｉｔｐｅｐｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅ
４６１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．４
图４　重组质粒狆犝犆１１８犘狉犫犮犛犮狊的检测
犉犻犵．４　犈狓犪犿犻狀犪狋犻狅狀犳狅狉狋犺犲狉犲犮狅犿犫犻狀犻犲狀狋狆犾犪狊犿犻犱狊狆犝犆１１８犘狉犫犮犛犮狊
　Ａ：ＰＣＲ检测。Ｍ：λＤＮＡ／犎犻狀犱ＩＩＩｄｉｇｅｓｔｍａｒｋｅｒ（分子量标记）；１～４：以ｐＵＣ１１８ＰｒｂｃＳ犮狊为模板扩增的ＰＣＲ产物。Ｂ：酶切检测。Ｍ：λＤＮＡ／
犎犻狀犱ＩＩＩｄｉｇｅｓｔｍａｒｋｅｒ（分子量标记）；１～２：用犈犮狅犚Ｉ酶切ｐＵＣ１１８ＰｒｂｃＳ犮狊重组质粒Ａ：ＰＣＲｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｍ：λＤＮＡ／犎犻狀犱ＩＩＩｄｉｇｅｓｔｍａｒｋｅｒ；１－４：
ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔａｍｐｌｉｆｉｅｄｗｉｔｈｐＵＣ１１８ＰｒｂｃＳ犮狊ａｓｔｅｍｐｌａｔｅ．Ｂ：Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎｂｙｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．Ｍ：λＤＮＡ／犎犻狀犱ＩＩＩｄｉｇｅｓｔｍａｒｋｅｒ；１－２：
ＤｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎｉｅｎｔｐｌａｓｍｉｄｓｐＵＣ１１８ＰｒｂｃＳ犮狊ｂｙ犈犮狅犚Ｉ
２．４　犮狊基因光诱导型植物表达载体ｐＰＺＰ２１１ＰｒｂｃＳ犮狊的构建
用犎犻狀犱ＩＩＩ和犡犫犪Ｉ双酶切ｐＵＣ１１８ＰｒｂｃＳ犮狊与双元载体ｐＰＺＰ２１１，回收纯化目的片段ＰｒｂｃＳ犮狊（约２．９ｋｂ）
和ｐＰＺＰ２１１载体大片段（长度约为９．３ｋｂ），然后用连接酶试剂盒连接目的片段ＰｒｂｃＳ犮狊和ｐＰＺＰ２１１载体大片
段，用连接反应混合物转化高效率（１０８）的大肠杆菌感受态细胞，把转化好的大肠杆菌涂于加有壮观霉素（Ｓｐｅ，５０
μｇ／ｍＬ）的平板上，筛选Ｓｐｅ抗性重组子菌落，从Ｓｐｅ抗性重组子菌落中提取质粒，然后进行ＰＣＲ和酶切检测。
ＰＣＲ检测采用２组引物进行，第１组用１个位于ＰｒｂｃＳ启动子内部的引物（ｒｂｃＳ５）及犮狊基因的下游引物Ｂ作
ＰＣＲ，ＰＣＲ产物的理论长度为１．６ｋｂ；第２组的上下游引物分别是扩增犮狊全长基因的引物Ａ和Ｂ，ＰＣＲ产物的
理论长度则为１．４ｋｂ。２组ＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶电泳分析显示其片段大小分别与理论预测值相符（图
５Ａ）。这表明ＰｒｂｃＳ犮狊片断已经正确插入到植物表达载体ｐＰＺＰ２１１中。犮狊基因内部以及ＮＯＳ终止子之后均包
含１个犈犮狅犚Ｉ位点，所以采用犈犮狅犚Ｉ进行酶切检测，如果插入方向是正确的，酶切产物会出现长度约为１．４ｋｂ的
小片段。琼脂糖凝胶电泳检测结果显示酶切产物小片段的大小与理论推测相吻合（图５Ｂ），由此获得犮狊基因的
植物表达载体ｐＰＺＰ２１１ＰｒｂｃＳ犮狊（图５Ｃ）。
３　讨论
Ｔｅｓｆａｙｅ等［１６］的研究指出，用组成型构建的苹果酸脱氢酶基因植物表达载体转化的紫花苜蓿植株比较小，这
可能是组成型苹果酸脱氢酶基因主要在根中表达，造成了根中的有机酸合成前体碳骨架的不足而影响了其他代
谢所致。ＰｒｂｃＳ启动子是Ｒｕｂｉｓｃｏ小亚基基因（ｒｂｃＳ）的５′上游调控区，其作用具有光诱导特性，光诱导作用可明
显提高ＰｒｂｃＳ启动子控制的目的基因的表达量，它在驱动外源基因的表达上表现出明显的叶片组织与叶肉细胞
的特异性，而在茎、根和种子等器官中不表达或表达活性极弱。对水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）ＰｒｂｃＳ启动子与其他一些
可在转基因水稻中组成型表达的启动子，如玉米泛素基因Ｕｂｉ启动子、ＣａＭＶ３５Ｓ启动子等在转基因水稻叶片中
控制的目的基因的表达水平进行了比较，说明水稻ＰｒｂｃＳ启动子的表达量要高于后两者［１７］。作为有机酸的合成
需要碳骨架作为前体，光合作用是生成碳骨架的重要来源。叶片是植物的光合作用器官，推测如果在叶片中过量
表达柠檬酸合成酶基因，能够增强植物根部有机酸的分泌量，又不至于影响其他性状。所以构建了光诱导型植物
表达载体，用于紫花苜蓿的遗传转化，增强植物根部有机酸的分泌，有利于提高紫花苜蓿耐铝毒能力。
５６１第１８卷第４期 草业学报２００９年
图５　重组质粒狆犘犣犘２１１犘狉犫犮犛犮狊的检测
犉犻犵．５　犈狓犪犿犻狀犪狋犻狅狀犳狅狉狋犺犲狉犲犮狅犿犫犻狀犻犲狀狋狆犾犪狊犿犻犱狊狆犘犣犘２１１犘狉犫犮犛犮狊
　Ａ：ＰＣＲ检测。Ｍ：φＸ１７４ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１～３：以ｐＵＣ１１８ＰｒｂｃＳ犮狊重组质粒为模板扩增犮狊基因全长的ＰＣＲ产物；４～６：以ｐＰＺＰ２１１ＰｒｂｃＳ犮狊重
组质粒为模板，用１个位于ＰｒｂｃＳ启动子内部的引物（ｒｂｃＳ５）及犮狊基因的下游引物Ｂ扩增的ＰＣＲ产物。Ｂ：酶切检测。Ｍ：φＸ１７４ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；１～
３：用犈犮狅犚Ｉ酶切ｐＰＺＰ２１１ＰｒｂｃＳ犮狊重组质粒。Ｃ：构建成功的ｐＰＺＰ２１１ＰｒｂｃＳ犮狊重组质粒 Ａ：ＰＣＲｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｍ：φＸ１７４ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１－３：
ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆ犮狊ｆｕｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡａｍｐｌｉｆｉｅｄｗｉｔｈｐＵＣ１１８ＰｒｂｃＳ犮狊ａｓｔｅｍｐｌａｔｅ；４－６：ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｗｉｔｈｐＰＺＰ２１１ＰｒｂｃＳ犮狊ａｓｔｅｍｐｌａｔｅｕｓｉｎｇ
ｒｂｃＳ５ｐｒｉｍｅｒｌｏｃａｔｅｄｉｎＰｒｂｃＳｐｒｏｍｏｔｅｒｒｅｇｉｏｎａｎｄｐｒｉｍｅｒＢｉｎｔｈｅ３ｅｎｄｏｆ犮狊ｃＤＮＡ．Ｂ：Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎｂｙｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．Ｍ：φＸ１７４ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；
１－３：ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎｉｅｎｔｐｌａｓｍｉｄｓｐＰＺＰ２１１ＰｒｂｃＳ犮狊ｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈ犈犮狅犚Ｉ．Ｃ：ＤｉａｇｒａｍｏｆｔｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎｉｅｎｔｐｌａｓｍｉｄｓｐＰＺＰ２１１ＰｒｂｃＳ犮狊
本研究根据Ｇｅｎｅｂａｎｋ中已知的烟草犮狊基因的序列，通过ＲＴ－ＰＣＲ从烟草总ＲＮＡ中扩增柠檬酸合成酶基
因的ｃＤＮＡ，亚克隆于Ｔ载体得到重组载体ｐＭＤ１８犮狊，对ｐＭＤ１８犮狊中的插入片断进行核酸序列分析确认为犮狊
基因的ｃＤＮＡ全长。用光诱导型启动子（Ｒｕｂｉｓｃｏ小亚基的启动子）和双元载体ｐＰＺＰ２１１构建了犮狊基因的光诱
导型植物表达载体ｐＰＺＰ２１１ＰｒｂｃＳ犮狊，为利用基因工程手段提高苜蓿耐铝毒能力，促进紫花苜蓿在南方地区的推
广应用奠定物质基础。
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犆犾狅狀犻狀犵狅犳狋狅犫犪犮犮狅犮犻狋狉犪狋犲狊狔狀狋犺犪狊犲犮犇犖犃犪狀犱犮狅狀狊狋狉狌犮狋犻狅狀狅犳犻狋狊犾犻犵犺狋犻狀犱狌犮犻犫犾犲狆犾犪狀狋犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狏犲犮狋狅狉
ＨＵＱｉｎｇｑｕａｎ１，２，ＷＡＮＧＱｉｆｅｎｇ２，ＬＩＫｕｎｚｈｉ２，ＣＨＥＮＬｉｍｅｉ２，ＹＵＹｏｎｇｘｉｏｎｇ１
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ａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ６５０２２４，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪ｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｍｏｓｔｈｉｇｈｌｙｖａｌｕｅｄｆｏｒａｇｅｌｅｇｕｍｅｓ．Ａｌｕｍｉｎｕｍｔｏｘｉｃｉｔｙｉｓｔｈｅｍａｉｎ
ｐｒｏｂｌｅｍｉｎｔｈｅａｃｉｄｓｏｉｌｓｔｈａｔａｒｅｗｉｄｅｌｙｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄｉｎｓｏｕｔｈＣｈｉｎａ，ａｎｄｔｈｉｓｒｅｓｔｒｉｃｔｓｅｘｔｅｎｄｉｎｇｔｈｅｕｓｅｏｆ犕．
狊犪狋犻狏犪ｉｎｔｈｉｓｄｉｓｔｒｉｃｔ．Ｔｈｅａｌｕｍｉｎｕｍｔｏｌｅｒａｎｃｅｏｆｐｌａｎｔｓｃａｎｂｅｅｎｈａｎｃｅｄｂｙｅｘｃｒｅｔｉｏｎｏｆｏｒｇａｎｉｃａｃｉｄｂｙ
ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｏｒｇａｎｉｃａｃｉｄｓｙｎｔｈａｓｅｇｅｎｅａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ａｃＤＮＡｆｏｒｔｈｅ犮狊ｇｅｎｅ（ｅｎｃｏｄｅｓｃｉｔｒａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ）
ｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＲＴ－ＰＣＲｆｒｏｍｔｏｂａｃｃｏａｎｄｓｕｂｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏａＴｃｌｏｎｉｎｇｖｅｃｔｏｒｔｏｙｉｅｌｄｐＭＤ１８犮狊．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ａｎａｌｙｓｅｓｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｈａｔｔｈｅｉｎｓｅｒｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｉｎｐＭＤ１８犮狊ｃｏｎｔａｉｎｅｄｔｈｅｆｕｌｌｅｎｇｔｈｏｆ犮狊ｃＤＮＡ．Ｕｓｉｎｇｔｈｅ
ｐｒｏｍｏｔｅｒｆｏｒｔｈｅＲｕｂｉｓｃｏｓｍａｌｓｕｂｕｎｉｔｇｅｎｅ（ａｌｉｇｈｔｉｎｄｕｃｉｂｌｅｐｒｏｍｏｔｅｒ）ａｎｄｔｈｅｂｉｎａｒｙｖｅｃｔｏｒｐＰＺＰ２１１，ａ
ｌｉｇｈｔｉｎｄｕｃｉｂｌｅｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＰＺＰ２１１ＰｒｂｃＳ犮狊ｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．Ｉｔｃａｎｂｅｕｓｅｄｆｏｒｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒ
ｉｎｇｔｏｅｎｈａｎｃｅｔｈｅａｌｕｍｉｎｕｍｔｏｌｅｒａｎｃｅｏｆ犕．狊犪狋犻狏犪ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｅｘｔｅｎｄｔｈｅｕｓｅｏｆ犕．狊犪狋犻狏犪ｉｎｓｏｕｔｈＣｈｉｎａ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｃｉｔｒａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅｇｅｎｅ；ｌｉｇｈｔｉｎｄｕｃｉｂｌｅｐｒｏｍｏｔｅｒ；ｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ；犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪；ａｌｕｍｉ
ｎｕｍｔｏｌｅｒａｎｃｅ
７６１第１８卷第４期 草业学报２００９年