全 文 ：基金项目：国家高技术研究发展计划(863)项目(No. 2011AA001204)、现代农业产业技术体系岗位专家(No. CARS-28)和国家
转基因专项(No. 2009ZX08009-122B)
收稿日期：2012-02-16 接受日期：2012-03-29
研究报告
Letter
苹果属山定子柠檬酸合成酶基因(MbCS1)的克隆及表达分析
张柳霞 王忆 朱斌 王少甲 张新忠 许雪峰 韩振海﹡
中国农业大学园艺植物研究所 /北京市果树逆境生理与分子生物学重点实验室，北京 100193
*通讯作者，rschan@cau.edu.cn
摘 要 为了研究不同铁效率基因型苹果砧木铁吸收利用的分子机理，本研究以铁低效基因型山定子
(Malus baccata Borkh)为试材，根据实验室从铁高效基因型小金海棠(Malus xiaojinensis)克隆到与铁运输
相关的基因柠檬酸合成酶基因(MxCS1)的全长序列设计特异引物，通过 RT-PCR方法从山定子 cDNA中
克隆到柠檬酸合成酶基因 CS，基因全长为 1 422 bp，与金冠(Malus domestica Borkh cv. Golden Delicious)、
小金海棠中的 CS基因具有较高的同源性，将该基因命名为 MbCS1(GenBank登录号: JQ898346)。利用生
物信息学软件对山定子柠檬酸合成酶基因(MbCS1)进行预测分析，结果显示该基因预测编码 473个氨基
酸，相对分子量为 54.26 kD，理论等电点为 8.95。亚细胞定位显示MbCS1蛋白定位在细胞膜上。半定量
RT-PCR及 Real-time PCR分析均表明，正常供铁时，该基因在山定子的根、茎、新叶中都有表达；缺铁处
理(EDTA-NaFe, 4 μmol/L)时，该基因在根、茎和新叶中的表达加强，第 9天达到最高值，之后开始下降；但
各检测器官中表达增强的程度不同，其中茎中受缺铁诱导表达最明显。与小金海棠中 MxCS1基因的表达
趋势有明显的差别。本研究为高等植物抗性机理的深入研究以及铁低效资源型砧木资源的改良提供了基
础资料。
关键词 山定子，柠檬酸合成酶基因，铁胁迫，Real-time PCR
Cloning and Expression Analysis of Citrate Synthase Gene (MbCS1) in
Apple (Malus baccata Borkh)
ZHANG Liu-Xia WANG Yi ZHU Bin WANG Shao-Jia ZHANG Xin-Zhong XU Xue-Feng
HAN Zhen-Hai﹡
Institute for Horticultural Plants/Key Laboratory of Beijing Municipality of Stress Physiology and Molecular Biology for Fruit Trees, China
Agricultural University, Beijing 100193, China
* Corresponding author, rschan@cau.edu.cn
Absract In order to study the iron absorption and utilization molecular mechanism of different Fe efficiency
genotypes apple rootstocks, we used the Malus baccata Borkh as material, which is an iron-inefficient genotype
apple rootstock. Through the full-length of citrate synthase gene MxCS1 was obtained from M. xiaojinensis,
which is an iron-efficient genotype apple rootstock and previous studies have shown that it is related to iron
absorption and transport, and their specific primers were designed to clone the citrate synthase gene (CS) from
cDNA of M. baccata Borkh by using RT-PCR, which was composed of 1 422 bp and had high homology with
Online system: http://www.jabiotech.org
农 业 生 物 技 术 学 报
Journal of Agricultural Biotechnology
2012, 20(9): 1028~1034
DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2012.09.006
苹果属山定子柠檬酸合成酶基因(MbCS1)的克隆及表达分析
Cloning and Expression Analysis of Citrate Synthase Gene(MbCS1) in Apple (Malus baccata Borkh)
铁在植物体的生长发育中具有十分重要的作
用，缺铁可导致叶片黄化和光合作用降低(薛进军
等, 1999)，造成典型的缺铁失绿症。由于铁元素的
不稳定性和对细胞的毒害作用，必须与其他物质螯
合才能在植物体内进行运输和分配 (Kruger et al.,
2002)。高等植物木质部中柠檬酸作为主要的铁螯
合物参与到铁的长距离运输过程中 (Cataldo et al.,
1988)，而柠檬酸合成酶(CS)基因作为主要的限制酶
在整体的调控中起到了重要的作用。近年来，CS基
因 已 陆 续 在 拟 南 芥 (NM_129998.3)、 水 稻
(AF302906.1)、烟草 (X84226)、胡萝卜 (AB017159.
1)、桃子 (AF367444.1) 、柚子 (U19481.1)和柑橘
(GQ372880.1)中被分离出来，但前人的研究多集中
在该基因在铝、磷胁迫转运中的作用(Takita et al.,
1999; Etienne et al., 2002)，关于其与铁吸收转运的
关系却较少报道。
山定子(Malus baccata Borkh)是一种优良的苹
果砧木，具有抗寒、抗盐碱、根系发达等优良性状，
但在缺铁的条件下，以山定子为砧木的苹果树极易
发生黄化现象(张凌云等, 2002)，属于典型的铁低
效基因型品种；而与其相对的小金海棠则是一个典
型的苹果铁高效基因型品种(Han et al., 1998)。本实
验室已经从小金海棠中克隆到了柠檬酸合成酶基
因 MxCS1，并发现外界铁胁迫的环境会影响到该基
因的表达 (Han et al., 2012)。为了探讨在不同铁效
率基因型苹果砧木中 CS基因表达情况的异同和应
对铁胁迫中的作用差异，本研究拟从山定子中克隆
到 CS基因并对其缺铁胁迫下的时空表达模式进行
分析，以期为高等植物抗性机理的研究及铁低效资
源型砧木资源的改良提供分子基础材料。
1结果与分析
1.1 MbCS1基因的克隆
以山定子正常供铁条件下叶的 cDNA为模板，
PCR扩增获得 MbCS1基因的全长，产物经 1%琼脂
糖凝胶电泳后，条带大小约 1 400 bp(图 1)，可见产
物条带特异，与预期结果一致。
1.2 MbCS1基因生物信息学分析
1.2.1 MbCS1基因的 cDNA序列及其编码的氨基酸
利用在线软件分析表明，MbCS1基因预测编码
473个氨基酸(图 2)，相对分子量为 54.26 kD，理论
the gene encoding citrate synthase in Golden Delicious (M. domestica Borkh ) and M. xiaojinensis, thus we
designated it as MbCS1 (GenBank accession No. JQ898346). The bioinformatics analysis showed that citrate
synthase gene from M. baccata Borkh encoded 473 amino acids, whose relative molecular weight was 54.26
kD and theoretical isoelectric point was 8.95. Subcellular localization assay of the MbCS1 protein, which
used transient expression of MbCS1::GFP fusion protein in onion (Allium cepa) cells by particle
bombardment, displayed that MbCS1 encoding protein localized in cell membrane. RT-PCR and Real-time
PCR analysis suggested that MbCS1 gene was expressed in roots, shoots and leaves in M. Baccata Borkh
under normal supply of iron; and the expression of MbCS1 gene was enhanced obviously in roots, shoots and
leaves under a low iron concentration (EDTA-NaFe, 4 μmol/L) and reached to the highest value at the ninth
day, then decreased; the expression of MbCS1 gene was different in roots, shoots and leaves, enriched in
shoots than that in leaves and roots under ion deficiency induced. The expression pattern of MbCS1 gene in
M. baccata Borkh was very different from MxCS1 gene in M. xiaojinensis. The result provides solid
foundation for further study of the resistance mechanisms in higher plants and provides basis for improvement
of iron-inefficient apple rootstocks.
Keywords Malus baccata Borkh, Citrate synthase gene, Iron stress, Real-time PCR
2000
1000
750
500
250
100
bp M 1
1422
bp
图 1 MbCS1基因 cDNA全长 PCR扩增
Figure 1 PCR amplification of full-length MbCS1 cDNA
M: DL2000 marker; 1: PCR product of MbCS1 gene
1029
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
1 ATGGTATTCTTCAGGAGCGTCACCGCGCTTTCCAAGCTCCGTTCCCGTCTTGGGCAACAGTCGAGTCTCAGAGATTCCGTCAGATGG
1 M V F F R S V T A L S K L R S R L G Q Q S S L R D S V R W
88 ACCCAAACGCAGAGCTCCACAGATCTTGATCTTCGTTCTCATTTGGCTGAATTAATTCCTGAACAACAGGAACGTCTGAAGAAACTC
30 T Q T Q S S T D L D L R S H L A E L I P E Q Q E R L K L L
175 AAGGCAGATTATGGAAAAGTTCAACTGGGCAATATCACTGTTGATATGGTGATTGGTGGAATGAGAGGAATGACAGGGTTGCTGTGG
59 K A D Y G K V Q L G N I T V D M V I G G M R G M T G L L W
262 GAAACCTCCTTACTTGATCCAGATGAGGGAATTCGCTTCAGGGGTTTGTCAATTCCAGAATGCCAGAAAGTATTACCAGCTGCAAAA
88 E T S L L D P D E G I R F R G L S I P E C Q K V L P A A K
349 CCAGGTGGAGAACCTTTGCCTGAGGGTCTTCTGTGGCTGCTTTTAACAGGAAAGGTACCTAGCAAAGAGCAAGTAGATGCATTATCC
117 P G G E P L P E G L L W L L L T G K V P S K E Q V D A L S
436 AAGGAATTGAGGACTCGTGCCGTAGTTCCAGATTATGTGTATAAGGCCATTGATGCTCTGCCTATTACAGCACATCCAATGACCCAG
146 K E L R T R A V V P D Y V Y K A I D A L P I T A H P M T Q
523 TTTACCACTGGTGTCATGGCCCTCCAGGTAGAGAGTGAATTCCAGAAGGCATATGAAAAGGGGATACATAAATCAAAGTACTGGGAG
175 F T T G V M A L Q V E S E F Q K A Y E K G I H K S K Y W E
610 CCAACTTTTGAGGATTCACTTAGCTTGATTGCACAAGTGCCAGTAGTAGCTGCCTATATTTATCGAAGAATTTTCAAGGATGGAAAA
204 P T F E D S L S L I A Q V P V V A A Y I Y R R I F K D G K
697 GTAAAACAGATTGATGGTTCTTTGGATTATGGTGCAAATTTTTCACACATGCTGGGTTTTGATGATCCCAAAGTGCATGAACTCATG
233 V K Q I D G S L D Y G A N F S H M L G F D D P K V H E L M
784 AGGCTTTATGTCACCATCCATAGTGATCATGAAGGTGGGAATGTCAGTGCTCACACGGGACACTTGGTTGCTAGTGCACTTTCAGAT
262 R L Y V T I H S D H E G G N V S A H T G H L V A S A L S D
871 CCATATCTTTCATTTGCAGCTGCTTTAAATGGCTTGGCTGGCCCACTCCATGGTTTGGCTAATCAGGAAGTATTGCTTTGGATAAAA
291 P Y L S F A A A L N G L A G P L H G L A N Q E V L L W I K
958 TCTGTGGTAGATGAAGTTGGAGAGAATGTAACTACAGAGCAGTTGAAAGATTACGTCTGGCAAACGTTAAAAAGTGGGAAGGTTGTT
320 S V V D E V G E N V T T E Q L K D Y V W Q T L K S G K V V
1045 CCTGGTTTTGGACATGGAGTCTTGCGTAAAACAGACCCACGATACACATGTCAAAGGGAGTTTGCATTGAAACACATGCCTGATGAT
349 P G F G H G V L R K T D P R Y T C Q R E F A L K H M P D D
1132 CCACTGTTTCAGTTGGTCTCCAAGCTTTATGAAGTTGTGCCTCCCATACTTACCGAACTAGGCAAGGTTAAAAACCCATGGCCCAAT
378 P L F Q L V S K L Y E V V P P I L T E L G K V K N P W P N
1219 GTAGATGCACACAGTGGAGTTCTGTTGAACCATTTTGGTTTAACTGAGGCAAGATATTTTACTGTTCTCTTTGGTGTATCGAGGAGT
407 V D A H S G V L L N H F G L T E A R Y F T V L F G V S R S
1306 ATAGGGATTGGTTCTCAGTTGATATGGGACCGAGCTCTTGGTTTGCCTCTCGAAAGGCCTAAAAGTGTAACGATGGAATCGCTTGAG
436 I G I G S Q L I W D R A L G L P L E R P K S V T M E S L E
1393 AATTTCTGCAAGAAAGCAGCTTCGTCTTGA
465 N F C K K A A S S *
等电点为 8.95，其 cDNA序列及预测编码的氨基酸
序列如图 2所示。
1.2.2同源性分析
利用 DNAMAN软件将 MbCS1基因的氨基酸
序列与已知的苹果属小金海棠柠檬酸合成酶基因
(MxCS1)及金冠的柠檬酸合成酶基因(MdCS1)的氨
基酸序列进行比对后，发现存在着某些氨基酸的差
异(图 3)。
根据氨基酸序列比对结果，利用 DNAMAN软
件构建了山定子MbCS1与小金海棠、柑橘、拟南
芥、水稻等物种间的同源进化树(图 4)，所选物种
CS氨基酸的同源性均在 82%~97%之间，其中与小
金海棠亲缘关系最近，同源性为 97%，其次是桃子，
同源性为 93%，而与烟草、水稻等其余物种的亲缘
关系稍远。
1.3 MbCS1的亚细胞定位
利用基因枪法将重组质粒 MbCS1-eGFP和对
照 35S:eGFP质粒分别转入洋葱表皮细胞中。结果
显示，MbCS1-eGFP的绿色荧光仅存在洋葱表皮细
胞的细胞膜上，而对照的洋葱表皮细胞的细胞膜和
细胞核均有绿色荧光出现(图 5)。表明MbCS1蛋白
定位在洋葱表皮细胞的细胞膜上。
1.4 山定子MbCS1基因的表达特性分析
分别提取了山定子缺铁处理 0、1、3、6、9和 12
d的白色新根、茎段、新叶的总 RNA，进行 RT-PCR
及 Real-time PCR分析(图 6和图 7)。正常供铁时，
MbCS1基因在山定子的根、茎和叶均有表达；缺铁
处理时，该基因在根、茎和新叶中的表达加强，第 9
天表达最强，但表达增强的程度不同，其中茎中受
图 2 MbCS1基因的 cDNA序列及编码的氨基酸
Figure 2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of MbCS1
1030
图 4 山定子MbCS1同其他物种的 CS氨基酸序列的同源性进化树
Figure 4 The phylogenetic tree analysis of MbCS1 and other plant citrate synthase proteins
图 3 山定子MbCS1与MxCS1、MdCS1氨基酸同源性比对
Figure 3 Comparison and phylogenetic relationship of MxCS1 with reported MxCS1 and MdCS1 proteins
MbCS1：山定子 CS1；MxCS1：小金海棠 CS1；MdCS1：金冠 CS1
MbCS1: CS1 of Malus baccata Borkh; MxCS1: CS1 of Malus xiaojinensis; MdCS1: CS1 of Malus domestica Borkh cv. Golden
Delicious
缺铁诱导表达最明显。
2讨论
本实验首次从铁低效基因型，但极其耐寒的优
良苹果砧木山定子中克隆到 MbCS1基因 cDNA全
长，并且对其氨基酸序列进行了预测，与其他物种
柠檬酸合成酶基因表达的序列进行比对，发现它们
之间存在着很高的同源性，认为其属于柠檬酸合成
酶基因家族的一员。亚细胞定位试验发现，该基因
表达的蛋白定位在细胞膜上。
利用半定量 RT-PCR 及 Real-time PCR 分析
了缺铁胁迫条件下该基因在山定子的根、茎和新
叶中的表达情况。结果表明缺铁能够影响 MbCS1
基因在山定子内的表达，即该基因能够对外界铁
MbCS1. s e q MVFFRSVTALSKLRSRLGQQSSLRDSVRWTQTQSSTDLDLRSHLAELI PEQQERLKKLKADYGKVQLGNI TVDMVI GGMR 80
MxCS1. s e q MVFFRSVTALSKLRSRLGQLSSLRDSVRWI QTQTSTDLDLRSQLAELI PEQQERLKKLKADYGKVQLGNI TVDMVI GGMR 80
MdCS1. s e q MVFFRSVTALSKLRSRLGQQSSLRDSVRWTQTQSSTDLELRSQLAELI PEQQERLKKLKADYGKVQLGNI TVDMVI GGMR 80
Cons e ns us mvf f r s vt a l s kl r s r l gq s s l r ds vr w qt q s t dl l r s l a e l i pe qqe r l kkl ka dygkvql gni t vdmvi ggmr
MbCS1. s e q GMTGLLWETSLLDPLEGI RFRGLSI PECQKVLPAAKPGGEPLPEGLLWLLLTGKVPSKEQVDALSKELRTRAVVPDYVYK 160
MxCS1. s e q GMTGLLWETSLLDPLEGI RFRGLSI PECQKVLPAAKPGGEPLPEGLLWLLLTGKVPSKEQVDALSKELRTRAVVPAYVYK 160
MdCS1. s e q GMTGLLWETSLLDPLEGI RFRGLSI PECQKVLPAAKPGGEPLPEGLLWLLLTGKVPSKEQVDALSKELRTRAVVPDYVYK 160
Cons e ns us gmt gl l we t s l l dpl e gi r f r gl s i pe c qkvl pa a kpgge pl pe gl l wl l l t gkvps ke qvda l s ke l r t r a vvp yvyk
MbCS1. s e q AI DALPI TAHPMTQFTTGVMALQVESEFQKAYEKGI HKSKYWEPTFEDSLSLI AQVPVVAAYI YRRI FKDGKVKQI DGSL 240
MxCS1. s e q AI DALPI TAHPMTQFTTGVMALQVDSEFQKAYEKGI HKSKYWEPTFEDSLSLI AQVPVVAAYI YRRI FKDGKVRPVNDSL 240
MdCS1. s e q AI DALPI TAHPMTQFTTGVMALQVESEFQKAYEKGI HKSKYWEPTFEDSLSLI ARVPVVAAYI YRRI FKDGKVKQI DDSL 240
Cons e ns us a i da l pi t a hpmt qf t t gvma l qv s e f qka ye kgi hks kywept f e ds l s l i a vpvva a yi yr r i f kdgkv s l
MbCS1. s e q DYGANFSHMLGFDDPKVHELMRLYVTI HSDHEGGNVSAHTGHLVASALSDPYLSFAAALNGLAGPLHGLANQEVLLWI KS 320
MxCS1. s e q DYGANFSHMLGFDDPI VHELMRLYVTI HSDHEGGNVSAHTGHLVASALSDPYLSFAAALNGLAGPLHGLANQEVLLWI KS 320
MdCS1. s e q DYGANFSHMLGFDDPKVYELMRLYVTI HSDHEGGNVSAHTGHLVASALSDPYLSFAAALNGLAGPLHGLANQEVLLWI KS 320
Cons e ns us dyga nf s hml gf ddp v e l mr l yvt i hs dhe ggnvs a ht ghl va s a l s dpyl s f a a a l ngl a gpl hgl a nqe vl l wi ks
MbCS1. s e q VVDEVGENVTTEQLKDYVWQTLKSGKVVPGFGHGVLRKTDPRYTCQREFALKHMPDDPLFQLVSKLYEVVPPI LTELGKV 400
MxCS1. s e q VVDEVGENVTTKQLKDYVWKTLKSGKVVPGFGHGVLRKTDPRYTCQREFALKHMPDDPLFQLVSKLYEVVPPVLTELGKV 400
MdCS1. s e q VVDEVGENATTQQLKDYVWQTLKSGKVVPGFGHGVLRKTDPRYTCQREFALKHMPDDPLFQLVSKLYEVVPPI LTELGKV 400
Cons e ns us vvde vge n t t ql kdyvw t l ks gkvvpgf ghgvl r kt dpr yt c qr e f a l khmpddpl f ql vs kl ye vvpp l t e l gkv
MbCS1. s e q KNPWPNVDAHSGVLLNHFGLTEARYFTVLFGVSRSI GI GSQLI WDRALGLPLERPKSVTMESLENFCKKAAS 472
MxCS1. s e q KNPWPNVDAHSGVLLNHFGLTEARYFTVLFGVSRSI GI GSQLI WDRALGLPLERPKSVTMESLENFCKKAAS 472
MdCS1. s e q KNPWPNVDAHSGVLLNHFGLTEARYFTVLFGVSRSI GI GSQLI WDRALGLPLERPKSVTMESLENFCKKAAS 472
Cons e ns us knpwpnvda hs gvl l nhf gl t e a r yf t vl f gvs r s i gi gs ql i wdr a l gl pl e r pks vt me s l e nf c kka a s
93%
97%
87%
84% 86%
82%
100%95%90%85%80%
PpCS1 (AF367444.1) Prunus persica
MbCS1 (JQ898346) Malus baccata
MxCS1 (HM459855.1) Malus xiaojinensis
CrCS1 (GQ372880.1) Citrus reticulata
DcCS1 (AB017159.1) Daucus carota
NtCS1 (X84226) Nicotiana tabacum
AtCS1 (NM_129998.3) Arabidopsis thaliana
OsCS1 (AF302906.1) Oryza glaberrima
苹果属山定子柠檬酸合成酶基因(MbCS1)的克隆及表达分析
Cloning and Expression Analysis of Citrate Synthase Gene(MbCS1) in Apple (Malus baccata Borkh) 1031
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
图 5 MbCS1-eGFP融合蛋白在洋葱表皮细胞中的定位
Figure 5 Subcellular localization MbCS1-eGFP fusion proteins in onion epidermal cells
A、D：暗场下观察到的对照和MbCS1-eGFP融合蛋白的绿色荧光情况；B、E：明场下的洋葱表皮细胞；C、F：叠加后的对照和
MbCS1-eGFP融合蛋白的绿色荧光
A, D: Green fluorescent protein of control and MbCS1-eGFP under dark condition; B, E: Onion cell stained with light field; C, F:
Green fluorescent protein of control and MbCS1-eGFP after superposition
胁迫的环境做出应答反应。随着缺铁时间的延长，
根、茎和叶中 MbCS1基因的表达趋势均为先上升
后下降。铁胁迫下，植物可以通过促进柠檬酸的合
成来增加铁的吸收 (Tiffin, 1970; Gray et al.,
1996)，而此时 MbCS1基因表达的加强可以促进柠
檬酸的合成，以从周围的组织中转运更多的铁；但
当柠檬酸积累到足够程度时，其合成开始减少
(Todorovsky et al., 2002)，本实验中也可以看出缺
铁处理 9 d后 MbCS1基因的表达开始呈现下降趋
势。其中茎中 MbCS1基因表达上调的幅度最大，
推测可能是由于茎中木质部是铁与柠檬酸螯合后
运输的主要部位，承担了主要的运输任务，所以缺
铁条件下茎中 MbCS1 基因表达变化相对根和新
叶中更加明显。
研究表明低铁处理可以使小金海棠和山定子
中柠檬酸的含量上升，但小金海棠中柠檬酸的含量
上升得较快且幅度较大(Han, 2010)。与其相对应的
是，本实验结果证实缺铁处理条件下山定子与小金
海棠中 CS1基因的表达趋势有明显的区别。Han等
(2012) 对小金海棠柠檬酸合成酶基因 MxCS1在缺
铁条件下的表达分析时，发现根和叶中 MxCS1基
因的表达量在缺铁处理 24 h时达到最高，而本试
验中发现 MbCS1基因的表达量在缺铁处理第 9天
才达到最高。而其他与铁转运相关基因 SAMS(朱妍
婕等, 2009)、YSL1(刘丽丽等, 2009)等在两种植物
中的表达趋势和表达量都没有发现明显的区别。这
种 CS1基因表达模式的差异可能是导致山定子和
小金海棠对铁应答不同的原因之一。小金海棠能够
对外界缺铁环境迅速做出反应，而山定子反应能力
相对较弱，证明了 CS基因能够在高等植物铁胁迫
应答中发挥作用。
3材料与方法
3.1植物材料
图 6 MbCS1基因的半定量 RT-PCR分析
Figure 6 Semiquantitative RT-PCR detection of MxCS1
mRNA
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0 0 1 3 6 9 12
根 Root
茎 Shoot
叶 Leaf
相
对
表
达
量
Re
la
tiv
e
ex
pr
es
sio
n
le
ve
l
处理时间 /d Days of treatment
图 7 根、茎和叶中的MbCS1基因的表达情况
Figure 7 Expression pattern of MbCS1 gene in the roots,
shoots and leaves
MbCS1
Actin
MbCS1
MbCS1
Actin
Actin
0 d 1 d 3 d 6 d 9 d 12 d
根
Root
茎
Stem
新叶
Young
leaves
A
B
C
D
E
F
1032
山定子(Malus baccata Borkh)组培苗在生长培
养基(MS＋0.5 mg/L IBA+0.2 mg/L 6-BA)生长到茎
木质化后转移至生根培养基中 (1/2 MS+0.5 mg/L
IBA)，待一个月长出白根后，转移到半营养液(Han
et al., 1994)练苗 2周，然后用完全营养液培养，每
隔 1周换 1次营养液。日光灯恒定光源，光强 1
500 lx，16 h光照 /8 h黑暗，室温 23~26℃，相对湿
度 85%。待每株水培苗长出 10~12片真叶时开始进
行缺铁胁迫 (EDTA-NaFe, 4 μmol/L)，以正常供铁
(EDTA-NaFe, 40 μmol/L)作为对照。分别取正常供
铁及缺铁处理 0、1、3、6、9 和 12 d 的白色新生根、
茎段、新叶(顶端第 1~2片未完全展开的叶子)，液
氮速冻后置于-80℃冰箱保存备用。
3.2 实验方法
3.2.1总 RNA的提取与 cDNA的合成
总 RNA的提取采用改进的 CTAB法 (张玉刚
等, 2005)，用 25 μL DEPC水溶解，然后用 1%的琼
脂糖凝胶电泳检测。去除基因组 DNA污染后，参照
M-MLV反转录试剂盒(购自 TaKaRa,大连)说明书
合成 cDNA第一条链。
3.2.2基因全长的获得
根据实验室已克隆到的苹果砧木小金海棠(M.
xiaojinensis)MxCS1基因全长(HM459855)设计特异
性引物：
F: 5-ATGGTATTCTTCAGGAGCGTC-3；
R: 5-TCAAGACGAAGCTGCTTTCTT-3。
进行 RT-PCR扩增。扩增体系均用高真 DNA
聚合酶，PCR扩增体系 (20 μL)：ddH2O 7.0 μL、2×
HiF Mix(0.5 U/μL)10 μL、上、下游引物(10 mmol/L)
各 1.0 μL和模板 1.0 μL。PCR全长扩增程序为：
94℃预变性 5 min；94℃变性 45 s，55℃退火 45 s，
72℃延伸 1 min，共 35个循环；72℃延伸 10 min。
PCR产物经 1%的琼脂糖凝胶电泳后，回收纯化目
的片段，连接到 pEasy-T1 载体，转化大肠杆菌
(Escherichia coli)DH5α，菌液 PCR扩增呈阳性的菌
落，小量提取质粒酶切鉴定后，阳性克隆送北京六
合华大基因科技股份有限公司测序。
3.2.3 MbCS1基因的序列分析
利用 http://www.bio-soft.net/sms/index.html 将
测序获得的核苷酸序列翻译为氨基酸序列；用 http:
//web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam 计 算
该蛋白的相对分子量和理论等电点；利用 http:
//www.ncbi.nlm.nih网站进行 MbCS1基因的氨基酸
和核苷酸相似性分析，并从中挑选了小金海棠、拟
南芥、桃子等来源于不同植物编码的柠檬酸合成酶
CS基因的氨基酸序列；并通过 DNAMAN5.2软件
将这些序列与山定子柠檬酸合成酶基因的氨基酸
序列进行比对，然后构建了同源性进化树。
3.2.4 MbCS1基因亚细胞定位
用限制性内切酶 XhoⅠ和 SamⅠ分别双酶切
MbCS1的 PCR产物和 pEZS-NL质粒，将 MbCS1基
因插入到 pEZS-NL载体的 XhoⅠ和 SamⅠ酶切位
点之间，构建 MbCS1-eGFP的瞬时表达载体。通过
基因枪法将含有 MbCS1-eGFP 质粒和 eGFP 对照
质粒的金粉轰击洋葱(Allim cepa)表皮细胞，然后
将洋葱表皮细胞置于MS培养基上 28℃培养 24 h。
利用荧光显微镜(购自 Nikon,日本)观察洋葱表皮
的荧光情况。
3.2.5 MbCS1 基因的半定量 RT-PCR 及荧光定量
PCR分析
半定量 RT-PCR以合成的单链 cDNA为模板，
采用 MbCS1基因特异性引物和 β-actin内参引物进
行扩增。扩增体系：cDNA模板(25 ng/μL) 1 μl，上
下游引物(10 μmol/L)各 1 μL，TaqMix(0.05 U/μL)
10 μL，ddH2O 7 μL；PCR 程序为：94℃预变性 5
min；94℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 1
min，共 30个循环；72℃延伸 10 min。PCR产物经
1%的琼脂糖凝胶电泳后定量。
将 cDNA 稀释 5 倍后取 2 μL进行荧光定量
PCR，所用染料为 IQ SYBR Green Supermix (购
自 TaKaRa, 大连 )，采用 7500 Real-time PCR
system (ABI) 进行测定，用一步法进行扩增
(ABI7500)， 以 β-actin 为 内 参 (Sophia et al.,
2007)。扩增体系：cDNA模板(25 ng/μL)2 μL，上
下游引物 (10 μmol/L) 各 0.3 μL，SYBR Green
Supermix 10 μL，ROX 0.4 μL，ddH2O 7 μL；反应
条件为 95℃ 30 s; 95℃ 5 s, 60℃ 34 s, 40 个循
环。所用引物序列如下：
β-actinF: 5-TGGTGAGGCTCTATTCCAAC-3；
β-actinR: 5-TGGCATATACTCTGGAGGCT-3；
MbCS1F: 5-GTTCTCGTCTCGGGCAACTGTC-3；
MbCS1R: 5-TTCCTCTCATTCCACCAATCACC-3。
苹果属山定子柠檬酸合成酶基因(MbCS1)的克隆及表达分析
Cloning and Expression Analysis of Citrate Synthase Gene(MbCS1) in Apple (Malus baccata Borkh) 1033
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
参考文献
Cataldo D A, McFadden K M, Garland T R and Wildung R E,
1988. Organic constituents and complexation of nickel
(Ⅱ), iron (Ⅲ ), cadmium (Ⅱ ), and plutonium (Ⅳ ) in
soybean xylem exudates. Plant Physiology, 86 (3):
734~739
Etienne C, Moing A, Dirlewanger E, Raymond P, Monet R and
Rothan C, 2002. Isolation and characterization of six peach
cDNAs encoding key proteins in organic acid metabolism
and solute accumulation: Involvement in regulating peach
fruit acidity. Physiologia Plantarum, 114(2): 259~270
Gray N K, Pantopoulos K, Dandekar T, Ackrell B A and
Hentze M W, 1996. Translational regulation of
mammalian and Drosophila citric acid cycle enzymes via
iron-responsive elements. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the USA, 93(10): 4925~4930
Han D G, 2010. Cloning and characterization of MxCS1 gene in
apple Malus xiaojinensis and the role of citric acid and
nicotianamine in iron transposition. Dissertation for Ph.D.,
China Agricultural University, Supervisor: Han Z.H., pp.
34~40 (韩德果, 2010.小金海棠 MxCS1基因的克隆与
功能分析及 CA和 NA在铁转运中的作用.博士学位论
文,中国农业大学,导师:韩振海, pp. 34~40)
Han DG, Wang Y, Zhang L, Ma L, Zhang X Z, Xu X F and
Han Z H, 2012. Isolation and functional characterization
of MxCS1: A gene encoding a citrate syntase in Malus
xiaojinensis. Biologia Plantarum, 56(1): 50~56
Han Z H, Shen T, Korcak R F and Baligar V C, 1998. Iron
absorption by iron-efficient and -inefficient species of
apples. Journal of Plant Nutrition, 21(1): 181~190
Han Z H, Wang Q and Shen J, 1994. Comparison of some
physiological and biochemical characteristics between
Fe-efficient and Fe-inefficient species in the genus Malus.
Journal of Plant Nutrition, 17(7): 1257~1264
Kruger C, Berkowitz O, Stephan U W and Hell R, 2002. A
metal-binding member of the late embryogenesis abundant
protein family transports iron in the phloem of Ricinus
communis L. Journal of Biological Chemistry, 277 (28):
25062~25069
Liu L L, Xu X F, Kong J, Wang Y, Li T Z and Han Z H, 2009.
Cloning of MxYSL1 gene in Malus xiaojinensis and its
expression analysis. Journal of Agricultural
Biotechnology, 17(2): 288~293(刘丽丽,许雪峰,孔瑾,王
忆,李天忠,韩振海, 2009.小金海棠MxYSL1基因的克
隆与表达分析.农业生物技术学报, 17(2): 288~293)
Sophia K, Juliana D, Julia L, Abdul N and Achim E, 2007.
Identification of differentially expressed genes in Malus
domestica after application of the non-pathogenic bacterium
Pseudomonas fluorescens BK3 to the phyllosphere. Journal
of Experimental Botany, 58(3): 733~741
Takita E, Koyama H, Shirano Y, Shibata D and Hara T, 1999.
Structure and expression of the mitochondrial citrate
synthase gene in carrot cells utilizing Al-phosphate. Soil
Science and Plant Nutrition, 45(1): 197~205
Tiffin L O, 1970. Translocation of iron citrate and phosphorus
in xylem exudate of soybean. Plant Physiology, 45 (3):
280~283
Todorovsky D S, Dumanova D G, Todorovsa R V and Getsova
M M, 2002. Preparation and characterization of
yttrium-iron citric acid complexes. Croatica Chemica
Acta, 75(1): 155~164
|Xue J J, Wang X R, Tai S Z, Tian Z W, Yu D C, Li S H and
Zhang F S, 1999. The effect of different fertilizering
methods on chlorophyⅡ and iron content in apple tree.
Journal of Fruit Science, 16(4): 246~249(薛进军,王秀茹,
台社珍,田自武,余德才,李绍华,张福锁, 1999. 铁肥品
种和施肥方式对黄化苹果树复绿和铁含量的影响.果
树科学, 16(4): 246~249)
Zhang LY, Zhai H and Zhang X F, 2002. Screening of
Fe-efficient apple rootstock genotypes. Scientia
Agricultura Sinica, 35(1): 68~71(张凌云, 翟衡, 张宪法,
2002.苹果砧木铁高效基因型筛选.中国农业科学, 35
(1): 68~71)
Zhang Y G, Cheng J H, Han Z H, Xu X F and Li T Z, 2005.
Comparison of methods for total RNA isolation from
Malus xiaojinensis and cDNA LD-PCR amplification.
Biotechnology Bulletin, 177(4): 50~53(张玉刚, 成建红 ,
韩振海,许雪峰,李天忠, 2005.小金海棠总 RNA提取
方法比较及 cDNA 的 LD-PCR 扩增 . 生物技术通报 ,
177(4): 50~53)
Zhu Y J, Kong J, Wang Y and Han Z H, 2009. Study on
expression and function of S-adenosylmethionine
synthetase gene MxSAMS from Malus Xiaojinensis.
Journal of Agricultural Biotechnology, 17(1): 121~125(朱
妍婕,孔瑾,王忆,韩振海, 2009.小金海棠 S-腺苷甲硫
氨酸合成酶基因(MxSAMS)的克隆和表达分析.农业生
物技术学报, 17(1): 121~125)
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