全 文 ：第 18 卷 第 4 期
Vol. 18 No. 4
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2010 年 7 月
Jul. 2010
紫花苜蓿柠檬酸合成酶基因的克隆及对烟草的转化
靳苗苗1, 杨青川2* , 金 洪1* , 康俊梅2 , 龙瑞才3
( 1.内蒙古农业大学, 呼和浩特 010019; 2. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193; 3.重庆大学, 重庆 400044)
摘要: 柠檬酸合成酶是调节植物体内有机酸的活性酶之一,增加植物体内的柠檬酸可以提高植物对土壤中磷的吸
收以及抗铝毒性。通过从紫花苜蓿(Medicago sativa L . )中克隆柠檬酸合成酶基因( MsCS) ,以期获得该基因全长,
并为将来研究紫花苜蓿耐铝性以及对磷的吸收方向提供基础。首先利用 cDNA 末端快速扩增方法( RACE) ,克隆
获得 MsCS 的 cDNA 全序列, 然后利用 pBI121 构建植物超表达载体 pBI-MsCS, 通过农杆菌介导的叶盘法转化烟
草( N icotiana tabacum L. )。结果显示: 该基因序列全长为 2031 bp, 开放阅读框 1551 bp, 编码 517 个氨基酸,与其
他物种的柠檬酸合成酶具有高度的同源性。获得 17 株卡那抗性植株。经 PCR 检测有 6 株为阳性植株, 初步表明
该基因已整合到烟草的基因组中。
关键词:紫花苜蓿; 柠檬酸合成酶基因;基因克隆; 载体构建;转化
中图分类号: Q946. 5 文献标识码: A 文章编号: 1007-0435( 2010) 04-0550-06
Cloning of MsCS Gene fromMedicago sativa L.
and Transformation of Tobaccos
JIN M iao-m iao1 , YANG Qing-chuan2* , JIN Hong1* , KANG Jun-mei2 , LONG Ru-i cai3
( 1. Inn er Mongolia Agricultural University, H ohhot , Inn er Mongolia Au ton om ou s Region 010019, China; 2. In st itu te of Animal S cience,
Ch ines e Academy of Agricu ltural S cien ces, Beijing 100094, C hina; 3. Ch on g Qing University, Chongqing 400044, China)
Abstract: T he cit rate synthase, an act ive enzyme, can regulate org anic acids in plants. Increasing cit ric
acid can improve plant capabilit ies of abso rbing soil pho spho rus and also af fect resistance to aluminum tox-
icity . The gene named MsCS was cloned from alfalfa ( Med icago sat iv a L. ) for alfalfa to proceed w ith basic
resear ch o f alum inum tolerance and so il absorpt ion for phosphorus. F irst a ful-l length cDNA of MsCS was
cloned by rapid amplification of cDNA ends ( RACE) . T hen the plant expression vector named pBI-M sCS
was const ructed on pBI121 vector, and tr ansformed the tobacco by using ag robacter ium-mediated. Results
indicate that the length o f cDNA sequence w as 2031 bp and included a 1551 bp open reading fr ame which
encoded a deduced pr otein of 517-am ino-acid po lypept ide. T he am ino acid sequence comparison revealed
high homolo gy w ith cit rate synthase of other plants. We obtained a total o f 17 kanamycin resistant t rans-
genic plants. PCR detect ion conf irmed 6 po sit iv e plants, preliminary studies show ed that the MsCS had
been integrated into the tobacco genome.
Key words: Medicago sat iv a L. ; M sCS gene; Cloning ; Vector const ruct ion; Transformat ion
柠檬酸合成酶是三羧酸循环( TCA )中合成柠
檬酸的一个关键酶, 而柠檬酸是 TCA 循环中重要
的中间产物。柠檬酸通过穿梭作用输入到细胞质中
合成其他物质的重要碳源, 如谷氨酸、脂肪酸 [ 1] ; 另
外,柠檬酸还可以从根部向外分泌,这也是植物适应
逆境的重要机制之一。柠檬酸对二价和三价阳离子
具有高亲和性, 可与质膜外部不溶性磷酸盐中的金
属离子,如铝离子, 进行螯合作用,置换出磷酸根离
子,使得磷素更易被植物吸收[ 2] ,而且这种螯合作用
也可以解决土壤中铝毒对植物的侵害。在 Fuente
等[ 3] 研究中发现在将从细菌中分离出的柠檬酸合成
酶基因导入番木瓜中, 转基因番木瓜在 300 m
L
- 1铝浓度下仍能生根且根系生长良好; 而对照在
50 m L - 1铝浓度下其根系生长受显著抑制。通
过向植物体内转入外源的柠檬酸合成酶基因,可增
强其体内柠檬酸酶活性,进一步修饰植物体内柠檬
酸代谢。修饰有机酸代谢,可提高柠檬酸合成酶的
活性,使植物体内生成更多的柠檬酸,增加植物根系
收稿日期: 2010- 03-30;修回日期: 2010- 05-18
基金项目:国家科技支撑计划( 2006BAD01A19- 3)资助
作者简介:靳苗苗( 1984- ) ,女,内蒙古鄂尔多斯人, 硕士研究生,研究方向为植物资源利用与保护方面的研究, E- mail : nan cy0194@ qq.
com ; * 通讯作者 Author for correspondence, qchyan g66@ yahoo. com. cn, jinh ong915@ 163. com
第 4期 靳苗苗等:紫花苜蓿柠檬酸合成酶基因的克隆及对烟草的转化
柠檬酸分泌量,达到鳌合酸性土壤中 A13+ 的目的,
从而降低铝对植物的毒害 [ 4]。增加植物体内的柠檬
酸可以提高植物对土壤中磷的吸收以及抗铝毒性。
紫花苜蓿( M edicago sat iv a L. ) (以下简称苜
蓿)是优良的豆科牧草, 目前全世界种植面积达
3000多万 hm2 ,我国属世界上栽培利用苜蓿较多的
国家之一。全国共有 14个省区种植苜蓿,主产区以
华北、西北为主[ 5] ,但苜蓿在南方种植相当有限。苜
蓿在南方种植受到抑制的主要因素是否为土壤偏酸
性? 根据近几年研究表明, 部分半秋眠和非秋眠紫
花苜蓿品种可在强酸性土壤中正常生长。李剑峰
等[ 6]利用沙培方法研究了紫花苜蓿生长与土壤酸度
的关系,发现仅就酸度而言, pH = 5的酸性环境最
适于苜蓿的生长发育。因此, 酸性土壤中除酸性外,
还有其他因素限制苜蓿生长。其中, A13+ 是酸性土
壤中作物生长重要的限制因素之一 [ 7, 8] , 一般通过
提高营养液中钙的浓度[ 9, 10] 以及向红壤中施用石
灰[ 11, 12]等方法, 来减轻 A13+ 对植物生长的抑制作
用。但有研究显示, 向土壤中过量施用石灰除成本
较高外, 也会给作物生长和土壤环境带来不良影
响[ 13]。因此,利用遗传转化的手段将柠檬酸合成酶
基因转化到不耐铝的植株中, 提高植物的耐铝性, 这
样可以更好地从根本上解决 A13+ 对植物的毒害。
本研究利用 cDNA 末端快速扩增方法( RACE)
获得该基因的序列全长, 构建了植物表达载体,并转
化烟草以鉴定功能, 为其应用于提高植株的耐酸性
以及抗铝毒的基因工程打下理论基础。
1 材料与方法
1. 1 实验材料
1. 1. 1 植物材料 紫花苜蓿耐盐品种中苜一号
( Zhongmu N O. 1) , 由中国农业科学院畜牧研究所
牧草研究室提供, 烟草 NC89 ( N icot iana tabacum
L. cv. NC89)由本研究室保存。
1. 1. 2 药品与试剂 RACE 试剂盒, T4 连接酶,
PMD19-T 载体, 限制性内切酶等均购自 T aKaRa
公司, T rzo l试剂,反转录酶( RTase) , RNA 酶抑制
剂( Rnase Inhibito r) , 大肠杆菌 DH5菌株购置北
京天根生物公司,高保真酶购自北京全式金公司, 植
物表达载体 PBI121, 农杆菌 LBA4404菌株由本实
验室保存。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 总 RNA 的提取和保守序列的克隆 TrZo l
法提取生长期为 10 d的紫花苜蓿植株的总 RNA,
将其逆转录成 cDNA。在 NCBI 上查找其他植物的
同源基因,利用 Primer 5. 0设计简并引物 M sCS-1:
5- TAT TGACGGT GAT GAGGGGAT T CT T- 3,
M sCS-2: 5-GATGTCCAAAACCAGAGAGCTTTCG-
3。以 cDNA 为模板用简并引物进行 PCR扩增,其
程序为: 94 预变性 5 m in后, 94 30 s, 55 30 s,
72 1 m in, 30 个循环, 72 延伸 10 min。PCR 产
物连接到 T 载体上,转化 DH5,筛选阳性克隆送华
大基因测序。
1. 2. 2 RACE克隆 根据所获得的保守序列,设计
引物,用 SMAT TM RA CE 试剂盒提供的 3引物与合
成的 MsCS3race 特异性引物( M sCS3-1) , 根据说
明书进行 PCR扩增,实验得到 3端序列。以同样的
方法克隆出 5端序列。测序后,利用 DNAman拼接
全长, 根据全长重新设计引物, 在引物 5端引入酶
切位点 X ba 和 Sma , 利用高保真酶扩增 M sCS
全长的 cDN A,连接到 T 载体上, 转化 DH5, 筛选
阳性克隆送华大基因测序。
1. 2. 3 载体构建 用限制性内切酶双酶切带有柠
檬酸合成酶 cDNA 的 T 载体和植物表达载体
pBI121,载体构建策略如图 1, 切胶回收目的片段
后,用 T4连接酶进行连接, 然后转化大肠杆菌, 经
抗生素的筛选后进一步提取质粒,然后酶切鉴定。
图 1 MsCS基因表达载体的构建图
Fig. 1 Schemes of constructing of expression vectors for MsCS gene
1. 2. 4 烟草转化与鉴定 制备农杆菌感受态, 将得
到的植物超表达载体质粒用冻融法导入农杆菌
LBA4404, 叶盘法转化烟草。以转化再生植株的
DNA 为模板进行 PCR 扩增, PCR所用的上下游引
物 分 别 为: M sCS7: 5-GCT CTAGAAT GT CAA
CGACAA CAACAAC-3, M sCS8: 5-A TCCCGGG-
TAT CCCAGAT CCAGCAAG-3, 其扩增程序为:
94 预变性 5 m in 后, 94 30 s, 58 30 s, 72
2 min, 30 个循环, 72 延伸 10 min。以质粒 pBI-
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草 地 学 报 第 18卷
MsCS为阳性对照, 非转基因烟草 DNA 为阴性对
照。反应完成后做电泳检测。
2 结果与分析
2. 1 MsCS基因全长 cDNA的克隆与序列分析
以紫花苜蓿总 RNA 逆转录的 cDNA 为模板,
用简并引物 M sCS-1与 MsCS-2 PCR扩增出了 759
bp的紫花苜蓿柠檬酸合成酶基因保守序列,该序列
与大豆等植物的柠檬酸合成酶基因保守区同源性达
80%以上。根据保守序列设计引物进行 5RACE
与 3RACE,分别经两轮巢式扩增,获得 5和 3序列
(图 2 A, B)。
图 2 MsCS基因的 5端和 3端 RACE产物以及MsCS基因全长 PCR 产物
F ig . 2 5, 3RACE and ful-l length PCR result of MsCS gene
M: DNA 2000 plus Marker , 1: 5RACE resu lt of M sCS gen e, 2: 3RACE result of
MsCS gene, 3: T he PCR product of ful-l length of MsCS gen e
经序列拼接设计引物, 扩增全长 cDNA, 如图 2
C。测序表明,该基因 cDNA 全序列共 2031 bp, 其
中 5端非编码区 39 bp, 3端非编码区 434 bp, 开放
阅读框包含 1551 bp, 编码 517 个氨基酸残基, 所编
码的蛋白质分子量为 56. 743 KDa。其核苷酸序列
及其推导的氨基酸序列如图 3。该核酸序列与大
豆,葡萄,南瓜的 CS 基因同源性分别达 87%、81%
和 80%。在 ht tp: / / www . expasy . org/ tools/ scan-
prosite/上输入 M sCS 蛋白序列,其分析表明紫花苜
蓿 CS氨基酸序列包含植物 CS 的特征, 含有一段
13个氨基酸的高等植物柠檬酸合成酶高度保
守区域(图 3) 基因已登录在 NCBI 上, 登录号为
ADG37655. 1。
柠檬酸普遍存在于各种生物的三羧酸循环中,
对生物体内的糖代谢, 脂肪及蛋白质的代谢具有重
要的生理意义。利用 DNAMAN 和 MEGA 4 软件
将紫花苜蓿的 CS与毛果杨, 蓖麻,高粱,水稻,拟南
芥,大豆的 CS 序列相似性比较, 发现紫花苜蓿 CS
基因与大豆的 CS基因相似性高达90%以上(图 4)。
2. 2 植物表达载体的构建及酶切鉴定
用内切酶 X ba 和 Sma 分别双酶切带有
M sCS cDNA 的 T-载体和植物表达载体 pBI121,分
别回收切开的载体 pBI121和带黏性末端的 MsCS,
用 T 4连接酶连接过夜, 连接产物转化大肠杆菌
DH5,菌落经 PCR 扩增初步鉴定基因已连接于载
体上。挑选阳性菌落摇菌, 提取质粒, 用 X ba 和
Sma进行双酶切鉴定 (图 5) , 得到目的片段大小
与预测一致。经测序表明, 得到序列完全正确, 植物
超表达载体 pBI121-M sCS构建成功。
2. 3 转基因烟草的获得和鉴定
用冻融法将构建的植物表达载体 PBI121-
M sCS导入根癌农杆菌 LBA4404中,挑取阳性菌落
摇菌,提取质粒 DNA ,双酶切鉴定,得到 2个条带,
大小与预期一致, 说明植物超表达载体 pBI121-
M sCS已成功转入农杆菌中。叶盘于卡那抗性培养
基上筛选培养, 2周左右即长出愈伤,并从中长出丛
生小芽。待芽长至 1~ 2 cm 左右切下, 放于培养基
上生根培养, 获得 17株抗性植株。提取抗性烟草植
株的基因组 DNA, PCR扩增检测, 以携带目的基因
的质粒载体为阳性对照, 非转基因的烟草基因组
DNA 为阴性对照, 电泳结果显示有 6 株为阳性
(图 6)。
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第 4期 靳苗苗等:紫花苜蓿柠檬酸合成酶基因的克隆及对烟草的转化
图 3 MsCS基因 cDNA及其氨基酸序列
Fig . 3 cDNA sequence anpredicted amino acid sequence of MsCS gene
Analys is of the am ino acid sequen ce of MsC S show s a Plan t cit rate synthase con served region( 375- 387,
double u nderlined) an d the deduced amino acid s equence. A putative polydenylat ion is boxed
3 讨论
柠檬酸合成酶基因是参与草酰乙酸和乙酰辅酶
A缩合产生柠檬酸的一个关键酶,这个生化反应在
TCA 循环、脂肪酸的 -氧化作用和光呼吸的乙醛酸
循环途径中起重要作用。酶的活性受 AT P、
NADH、琥珀酰辅酶 A 和长链脂肪酰辅酶 A 等抑
制[ 14] ,也是柠檬酸循环中的限速酶。Yang 等[ 15] 对
决明的研究发现, 柠檬酸的分泌与铝浓度密切相关,
随着土壤中铝浓度不断升高, 其分泌的量也随之增
加;柠檬酸合成酶的活性及柠檬酸的积累均与铝胁
迫存在一定关联。近年来对有机酸和植物受铝胁迫
之间的关系较为重视。铝毒可诱导植物根系积累和
分泌有机酸; 而有机酸,尤其是低分子有机酸可影响
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草 地 学 报 第 18卷
图 4 紫花苜蓿 CS与其它植物 CS的相似性比较
F ig. 4 sequences alignment of CS gene from
bacter ia, fung i, alga, and plants
XP 002322875. 1 P op ulus t ri chocarp a 毛果杨; XP 002532688. 1
Ricinu s c ommuni s 蓖麻; XP 002451828. 1 S org hum bicolor 高粱;
NP 001046373 Ory z a sat i v a J ap onica Group 水稻; NP 181807. 1
A r abidop sis thaliana 拟南芥; ADG37655. 1 al f al f a紫花苜蓿;
BAG09389. 1 Glycine max 大豆
图 5 双酶切鉴定
Fig . 5 Identif ication of pBI-MsCS
M : DNA 2000 plu s Mar ker 1: pBI121-MsCS
digested w ith X ba and Sma
根尖的土壤环境, 对植物的根际营养具有重要的作
用[ 16] 。当根系处于高水平铝环境中时,一些植物根
际的 pH 值上升, 从而刺激根系分泌柠檬酸、苹果酸
等[ 17] 。柠檬酸亦可与三价铝离子形成稳定的螯合结
构,这样在解铝毒方面要比苹果酸更为有效。
图 6 烟草再生植株的 PCR检测
F ig . 6 obtainment o f transgenic tobacco plants and ident ification by PCR
A:抗性烟草幼苗; B:抗性生根烟草; C : PCR 鉴定图
A: tob acco s eedings of ant-i kanamycin; B: tobacco shoots of an t-i kanamycin; C: PCR ident ifi cat ion
M : DNA 2000 plu s Mar ker; 1: + CK; 2:-CK; 3-8: t ran sgenic tobacco plants
柠檬酸在植物对于土壤中难溶性磷的吸收也起
着重要作用。磷是植物必需的营养元素, 也是作物
生长的一个主要限制因子。一般情况下, 磷素只有
在中性土壤 pH 值范围内才能被植物吸收。在酸性
土壤中,磷酸根离子与铝离子形成低溶解性的磷酸
铝化合物, 极易对根系产生毒害作用。在低磷的环
境下,许多植物通过调节有机酸代谢中酶的活性来
提高有机酸的分泌量, 以提高植物对土壤中难溶性
磷的利用 [ 18]。Koyama 等[ 19] 研究胡萝卜细胞系中
过量表达拟南芥的线粒体型 CScDNA 的实验中发
现,转基因细胞在磷酸铝培养基上柠檬酸的分泌量
是野生的 2. 8- 4. 0 倍, 最高 CS 活性为 0. 24p mol
mg - 1 pro min- 1是野生型细胞 CS 活性的 1. 9
倍。实验结果说明, 转基因细胞对于磷酸盐的吸收
大大提高,生长速率也高于野生型细胞。
柠檬酸对于植物的耐铝毒以及对土壤中磷的吸
收等方面有很重要的调节作用, 在尝试对柠檬酸代
谢进行遗传操作时, 从整体上考虑柠檬酸上游和下
游的酶以及代谢产物亦很重要。增加与柠檬酸合成
有关的酶类, 如柠檬酸合成酶等的活性,可增加柠檬
酸的生成量。研究紫花苜蓿柠檬酸合成酶基因及其
功能,进一步揭示紫花苜蓿柠檬酸合成与积累的机
理,对于提高植物的耐铝性研究具有借鉴作用。
4 结论
紫花苜蓿柠檬酸合成酶基因在 NCBI上登录号
为 ADG37655. 1, 该基因 cDNA 序列全长 2031bp,
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第 4期 靳苗苗等:紫花苜蓿柠檬酸合成酶基因的克隆及对烟草的转化
其中 5端非编码区 39bp, 3端非编码区 434 bp, 其
包含一个完整的开放阅读框 1551 bp,编码 517个氨
基酸残基, 所编码的蛋白质分子量为 56. 743 KDa。
利用软件分析发现,该基因与大豆、拟南芥、水稻和
高粱的 CS基因具有高度的同源性, 且都达到 90%
以上。在对烟草进行遗传转化的实验中, 成功地构
建了植物表达载体 pBI121-M sCS ,并利用农杆菌介
导法以及叶盘法,成功地将紫花苜蓿的柠檬酸合成
酶基因转化到烟草中去, 表明该基因可在烟草中初
步表达。
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(责任编辑 李 扬)
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