全 文 ：书东方山羊豆脱水蛋白基因的克隆及初步分析
李玉坤１，王学敏１，王赞１，李俊１，ＶｌａｄｉｍｉｒＣ２，ＮｉｋｏｌａｙＤ２，孙桂枝１，高洪文１
（１．中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京１００１９３；２．俄罗斯瓦维洛夫全俄植物栽培研究所，圣彼得堡１９００００）
摘要：采用ＳＭＡＲＴＲＡＣＥ方法，从东方山羊豆盐诱导抑制性差减杂交ｃＤＮＡ文库中分离到了一个脱水蛋白
（犌狅犇犎犖）基因。该基因ｃＤＮＡ全长１１６９ｂｐ，开放阅读框８４３ｂｐ，编码２８１个氨基酸，编码的蛋白质分子量为
２８．７１ｋＤａ。经实时荧光定量ＰＣＲ分析，犌狅犇犎犖 基因在东方山羊豆的茎和叶中表达量明显高于根中表达量，并且
基因表达受ＡＢＡ、ＮａＣｌ和ＰＥＧ的诱导，随着诱导时间的增加，表达量呈持续增长趋势。这些结果表明，犇犎犖 基因
在东方山羊豆的抗逆性中可能起到重要的调控作用。本研究成功构建了ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ＤＨＮ植物表达载体，为
下一步转基因研究奠定了基础。
关键词：东方山羊豆；脱水蛋白基因；基因克隆；实时荧光定量ＰＣＲ；植物表达载体
中图分类号：Ｓ８１６；Ｑ９４３．２　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１２）０１０１７６０８
　 干旱、高盐、低温等非生物胁迫严重影响了植物的生存和产量，它们均可造成植物细胞缺水，产生干旱信号，
诱导植物的抗旱反应。晚期胚胎发生丰富蛋白（ｌａｔｅｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓａｂｕｎｄａｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＬＥＡ）是一种脱水保护剂，
能够在水分胁迫下保护生物大分子。ＬＥＡ蛋白可分为许多不同的家族［１，２］，脱水蛋白（ｄｅｈｙｄｒｉｎ，ＤＨＮ）属于
ＬＥＡⅡ或ＬＥＡＤ１１蛋白家族［２］。ＤＨＮ可在胚胎发生晚期或者在干旱、低温、盐胁迫和ＡＢＡ的诱导下表达［３］。
脱水蛋白一级结构保守性强，具有Ｋ，Ｓ和Ｙ等３个高度保守区域，通常以ＹＳＫ的顺序结合在一起［３］。Ｙ片段为
（Ｖ／Ｔ）ＤＥＹＧＮＰ，位于 Ｎ末端。Ｋ片段（ＥＫＫＧＩＭＤＫＩＫＥＫＬＰＧ）由１５个氨基酸组成。Ｓ片段是一个可磷酸化
的丝氨酸簇，一般位于 Ｋ片段之间，或紧跟 Ｋ片段。高度极性的φ片段的存在增加了极性氨基酸片段的比例，
加强了脱水蛋白结构的亲水性。由于 Ｋ片段和φ片段的存在，脱水蛋白能够通过形成一个保护层而保护变性的
高分子，在各种组织中都起到稳定细胞结构的作用［３，４］。
Ｋｏａｇ等［５］从玉米（犣犲犪犿犪狔狊）中分离纯化得到ＤＨＮ１，证实在受到胁迫的植物中，脱水蛋白在稳定液泡和细
胞膜的结构中起到非常重要的作用。在水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）中，已报道了多个胁迫诱导的脱水蛋白，其中
ＲＡＢ２１／１６Ａ，ＲＡＢ１６Ｂ，１６Ｃ，１６Ｄ，ＲＡＢ２５和 ＷＳＩ７２４已经证实是渗透胁迫诱导的［６９］。此外，ＬＥＡ蛋白在植物和
酵母中超表达可以提高对渗透胁迫的抵抗力［１０１２］。
东方山羊豆（犌犪犾犲犵犪狅狉犻犲狀狋犪犾犻狊）作为一种新型优良豆科牧草，在我国主要种植在西北地区。东方山羊豆品质
好、产量高、抗病抗逆性强、使用年限长［１３］，与其他牧草资源相比，东方山羊豆目前的相关研究较少［１４］。中国农业
科学院北京畜牧兽医研究所牧草资源研究室自２００７年以来对引进东方山羊豆的抗逆基因开展了研究，目前已经
取得一定进展。李鑫等［１５］从东方山羊豆中分离得到液泡膜Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因，推测该基因在转录水平
的调节可能是决定东方山羊豆耐盐能力的重要因子。Ｃｈｅｎ等［１６］克隆了东方山羊豆的犚犃犞基因，实时荧光定量
ＰＣＲ（ｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ）分析表明，犌狅犚犃犞基因受外源脱落酸（ａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄ，ＡＢＡ）、干旱、低温和盐胁迫诱导，证明
该基因在依赖ＡＢＡ信号途径的抗逆性调控中起到一定的作用。
目前，抗逆基因工程主要集中在逆境条件下表达的某些基因和抗逆代谢过程中某些酶的研究［１７］。随着生物
技术的发展和广泛应用，克隆植物抗逆相关基因并利用转基因技术将一些与抗性密切相关的外源目的基因导入
目标植物中来提高其抗逆性是解决逆境胁迫的一条有效途径［１８］。本研究首次从东方山羊豆中克隆犇犎犖 基因，
初步探索了犇犎犖 基因在东方山羊豆抗逆性方面的作用，为深入研究该种牧草的抗逆机理，进行抗逆性改良奠定
１７６－１８３
２０１２年２月
　　　草　业　学　报　　　
　　　ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　
第２１卷　第１期
Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．１
 收稿日期：２０１０１１１２；改回日期：２０１０１２３１
基金项目：国际科技合作与交流专项（２０１０ＤＦＲ３０６２０２）和现代农业产业技术体系建设专项牧草产业体系资金资助。
作者简介：李玉坤（１９８６），女，河南温县人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｌｉｙｕｋｕｎ１９８６＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｇａｏｈｏｎｇｗｅｎ＠２６３．ｎｅｔ
了一定基础。
１　材料与方法
１．１　实验材料
１．１．１　植物材料　东方山羊豆为中国农业科学院北京畜牧兽医研究所牧草资源研究室提供。
１．１．２　药品与试剂　Ｔｒｉｚｏｌ试剂为Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品，ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ为Ｐｒｏｍｅｇａ公司产品，ＳＭＡＲＴＴＭ
ＲＡＣＥｃＤＮＡ ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ为 Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司产品，克隆载体ｐＭＤ１８Ｔ、Ｔａｑ酶、限制性内切酶、Ａｌｋａｌｉｎｅ
Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、Ｔ４ＤＮＡ连接酶均为ＴａＫａＲａ公司产品。
１．２　实验方法
１．２．１　材料的处理与总ＲＮＡ的提取　于２００９年７月开始植物材料的处理，首先将东方山羊豆的种子用氯气
消毒２４ｈ，播种于铺有滤纸的培养皿中，在光照培养箱（温度为２４℃，光照时间为１２ｈ／ｄ）中培养至种子发芽。然
后将发芽后的种子移至蛭石与珍珠岩比例为３∶１的花盆中继续培养３０ｄ。幼苗用０．２５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液处理
２，６，１０ｈ，Ｔｒｉｚｏｌ法提取总ＲＮＡ后用于克隆犇犎犖 基因的全长ｃＤＮＡ序列［１９］。再用０．２５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液、
２０％ＰＥＧ（聚乙二醇）溶液、０．１×１０－３ｍｏｌ／ＬＡＢＡ溶液分别处理幼苗０，２，４，８，１２和２４ｈ，分别提取总ＲＮＡ，用
于ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ分析。
１．２．２　犇犎犖 基因３′末端序列、５′末端序列和全长ｃＤＮＡ序列的克隆　用Ｔｒｉｚｏｌ法分别提取０．２５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ
溶液处理２，６，１０ｈ后的幼叶总ＲＮＡ后，按照质量比为１∶１∶１混合，用混合ＲＮＡ为模板反转录成ｃＤＮＡ。根
据中国农业科学院北京畜牧兽医研究所牧草资源研究室通过构建ＳＳＨｃＤＮＡ文库得到的犇犎犖 基因的ＥＳＴ序
列，用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５．０引物设计软件分别设计３′ＲＡＣＥ和５′ＲＡＣＥ特异性引物，３′ＲＡＣＥ：ＧＧＴＴＡＴＧＧＡＡ
ＣＡＡＣＴＧＧＧＴＡＴＧＧＴＧＧ；５′ＲＡＣＥ：ＣＣＡＧＴＧＣＴＴＣＣＡＧＴＴＣＣＡＣＣＡＴＡＣＣＣ。根据ＳＭＡＲＴＴＭ ＲＡＣＥｃＤ
ＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ说明书分别ＰＣＲ扩增出３′末端和５′末端序列，分别测序后，结合ＥＳＴ序列用ＤＮＡＭＡＮ
５．０软件拼接出全长ｃＤＮＡ序列，找到开放阅读框ＯＲＦ，在ＯＲＦ两端分别设计全长引物，犇犎犖ＯＲＦＦ：ＣＡＡＴ
ＧＴＣＴＣＡＧＴＡＴＡＡＴＣＡＡＧＧＴＣＡ；犇犎犖ＯＲＦＲ：ＡＧＡＧＡＴＡＣＴＡＴＡＴＧＡＴＣＴＡＧＴＧＴＣＣＡＧ。经 ＰＣＲ 扩
增，测序后得到犇犎犖 基因全长ｃＤＮＡ序列。
核酸及氨基酸序列分析、开放阅读框ＯＲＦ的查找和翻译用ＤＮＡＳｔａｒ６．１３软件进行分析，利用ＳｃａｎＰｒｏｓｉｔｅ
服务器（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｓｃａｎｐｒｏｓｉｔｅ／）对ＤＨＮ蛋白进行功能预测。从ＧｅｎｅＢａｎｋ上下载其他植
物中的１８种ＤＨＮ蛋白，利用 ＭＥＧＡ４软件ＮｅｉｇｈｂｏｒＪｏｉｎｉｎｇ法构建系统进化树。
１．２．３　ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ检测犇犎犖 基因的组织表达特异性　分别提取东方山羊豆的根、茎、叶总ＲＮＡ，反转录
为ｃＤＮＡ。根据东方山羊豆犇犎犖 基因全长ｃＤＮＡ序列设计特异性引物（预期扩增片段大小为２７０ｂｐ），犇犎犖
ＲＴＦ：ＧＧＴＣＡＡＴＡＣＧＧＴＣＡＡＣＡＡＡＣＡＣＧ；犇犎犖ＲＴＲ：ＣＡＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＴＣＴＧＧＧＴＴＣＣ。以 犃犮狋犻狀 基
因做内参，设计特异性引物（预期扩增片段大小为２００ｂｐ），犃犮狋犻狀ＲＴＦ：ＧＧＡＣＡＡＧＴＴＡＴＣＡＣＣＡＴＣＧＧ；犃犮
狋犻狀ＲＴＲ：ＴＣＡＧＧＡＡＴＡＣＣＴＧＧＡＡＡＣＡＴＡＧ。参考ＴａＫａＲａ公司的ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＴＭ试剂盒说明书，
使用ＡＢＩＰＲＩＳＭ７５００ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ，ＵＳＡ），采用两步法进行ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ扩增，第１步：９５℃
预变性３０ｓ；第２步：９５℃５ｓ，６０℃３４ｓ，４０个循环。每个ｃＤＮＡ样品做３次重复。
根据得到的Ｃｔ值，利用Ｋｅｎｎｅｔｈ和Ｔｈｏｍａｓ［２０］报道的２－△△Ｃｔ方法，分别计算犇犎犖 基因在根、茎、叶中的表
达量。把根中表达量设为对照，茎、叶分别设为２个不同处理，利用公式：
△△Ｃｔ＝（ＣｔＴａｒｇｅｔ－ＣｔＡｃｔｉｎ）处理－（ＣｔＴａｒｇｅｔ－ＣｔＡｃｔｉｎ）对照
分别计算出根、茎、叶的２－△△Ｃｔ（表达水平）值，式中，ＣｔＴａｒｇｅｔ为目标基因达到设定阈值所经历的循环数；ＣｔＡｃｔｉｎ为内
参基因达到设定阈值所经历的循环数；（ＣｔＴａｒｇｅｔ－ＣｔＡｃｔｉｎ）处理 为处理样品中目标基因经 Ａｃｔｉｎ校正后的循环数；
（ＣｔＴａｒｇｅｔ－ＣｔＡｃｔｉｎ）对照为对照样品中目标基因经Ａｃｔｉｎ校正后的循环数；△△Ｃｔ为处理样品中目标基因与对照样品
中目标基因循环数的差值。利用Ｅｘｃｅｌ绘出柱形图。
１．２．４　ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ检测犇犎犖 基因在不同逆境胁迫下的表达量　按照１．２．１中用于ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ分析的
材料处理方法处理东方山羊豆幼苗，分别提取叶片总ＲＮＡ，反转录为ｃＤＮＡ。同１．２．３的方法，进行不同逆境胁
７７１第２１卷第１期 草业学报２０１２年
迫下的表达量分析。每个ｃＤＮＡ样品做３次重复。
将０ｈ设为对照，２，４，８，１２和２４ｈ分别设为５个不同处理，按照１．２．３的方法，分别计算出２－△△Ｃｔ值，利用
Ｅｘｃｅｌ绘出柱形图。
１．２．５　构建植物表达载体　设计带有犅犵犾ＩＩ酶切位点的引物，犇犎犖Ｆ：ＧＡＡＧＡＴＣＴＡＡＴＧＴＣＴＣＡＧＴＡＴＡ
ＡＴＣＡＡＧＧＴＣ；犇犎犖Ｒ：ＧＡＡＧＡＴＣＴＧＴＧＴＣＣＡＧＴＡＣＡＡＧＡＴＣＣＡＧ。以 ｐＭＤ１８Ｔ犇犎犖 重组质粒为模
板，扩增出带有酶切位点的犇犎犖 基因的ＯＲＦ。用犅犵犾ＩＩ限制性内切酶酶切扩增产物和ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２植物表
达载体，对酶切后的ｐ１３０２载体进行去磷酸化后，用Ｔ４ＤＮＡ连接酶４℃连接过夜，转化大肠杆菌，涂布含有卡那
霉素的ＬＢ（ＬｕｒｉａＢｅｒｔａｎｉ培养基）平板，经抗生素筛选后挑菌，摇菌，抽提质粒，经犅犵犾ＩＩ酶切鉴定为阳性克隆的，
送北京三博远志公司测序。
２　结果与分析
２．１　犇犎犖 基因全长ｃＤＮＡ的克隆与分析
以东方山羊豆盐胁迫ｃＤＮＡ为模板，分别利用３′ＲＡＣＥ和５′ＲＡＣＥ特异性引物扩增出３′末端和５′末端片
段，其中３′末端片段经测序为３９７ｂｐ（图１Ａ），５′末端片段经测序为８１３ｂｐ（图１Ｂ）。利用ＤＮＡＭＡＮ５．０软件拼
图１　犇犎犖基因的３′末端片段、５′末端片段和全长犗犚犉扩增结果
犉犻犵．１　犃犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狉犲狊狌犾狋狊狅犳３′犚犃犆犈，５′犚犃犆犈犪狀犱犳狌犾犾犲狀犵狋犺犗犚犉狅犳犇犎犖犵犲狀犲
　Ｍ１：ＤＮＡＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；Ｍ２：ＤＮＡ２０００ｐｌｕｓｍａｒｋｅｒ；１：３′末端片段３′ＲＡＣＥｒｅｓｕｌｔｏｆ犇犎犖ｇｅｎｅ；２：５′末端片段５′ＲＡＣＥｒｅｓｕｌｔｏｆ犇犎犖
ｇｅｎｅ；３：全长ＯＲＦＴｈｅｆｕｌｌｅｎｇｔｈＯＲＦｏｆ犇犎犖ｇｅｎｅ．
图２　犇犎犖基因的核苷酸序列和氨基酸序列
犉犻犵．２　犜犺犲狀狌犮犾犲狅狋犻犱犲狊犲狇狌犲狀犮犲犪狀犱犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳犇犎犖犵犲狀犲
　阴影部分为预测的与核定位信号有关的 Ｙ片段，方框部分为３个赖氨酸富集的 Ｋ片段 ＰｕｔａｔｉｖｅｎｕｃｌｅａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓｉｇｎａｌＮＬＳ（Ｙ）ｉｓｓｈａｄｅｄ，
ｔｈｒｅｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄｌｙｓｉｎｅｒｉｃｈｒｅｐｅａｔｓ（Ｋ）ａｒｅｂｏｘｅｄ．
８７１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．１
接后的全长ｃＤＮＡ为１１６９ｂｐ。利用ＤＨＮＯＲＦ特异性引物，扩增出全长ｃＤＮＡ的ＯＲＦ经测序为８４３ｂｐ（图
１Ｃ）。将该基因命名为犌狅犇犎犖，ＮＣＢＩ登录号为ＨＭ７７７０１９。
利用ＤＮＡＳｔａｒ６．１３软件对犇犎犖 基因ｃＤＮＡ序列进行分析，开放阅读框编码２８１个氨基酸，所编码的蛋白
质分子量为２８．７１ｋＤａ。通过ＳｃａｎＰｒｏｓｉｔｅ服务器对ＤＨＮ蛋白的氨基酸序列分析，该氨基酸序列包含１个Ｙ片
段，３个Ｋ片段（图２）。
用 ＭＥＧＡ４软件构建系统进化树（图３），分析结果显示，ＧｏＤＨＮ蛋白与豆科植物亲缘关系较近，与禾本科
和十字花科等的亲缘关系较远。其中与豌豆ＰｓＤＨＮ蛋白亲缘关系最近，其次是大豆ＧｍＭＡＴ１和ＧｍＤＨＮ５蛋
白，均属于ＹＫｎ亚型，但与豆科植物紫花苜蓿 ＭｓＣＡＳ１５Ａ蛋白和大豆ＧｍＳＲＣ１蛋白亲缘关系较远，这２个蛋白
属于ＫｎＳ亚型。
图３　东方山羊豆犇犎犖蛋白与其他植物中１８种犇犎犖蛋白的系统进化树
犉犻犵．３　犜犺犲狆犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲狅犳犱犲犺狔犱狉犻狀狊犻狀犌．狅狉犻犲狀狋犪犾犻狊犪狀犱犪狀狅狋犺犲狉犲犻犵犺狋犲犲狀狆犾犪狀狋狊
　ＨｖＤＨＮ８（大麦犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲；登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ：ＡＦ１８１４５８），ＴａＷＣＯＲ４１０（小麦犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿；登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ：
ＡＡＡ２０１８９），ＡｔＥＲＤ１０（拟南芥犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪；登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ：Ｐ４２７５９），ＨｖＤＨＮ５（大麦犎．狏狌犾犵犪狉犲；登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍ
ｂｅｒ：ＡＡＦ０１６９３），ＡｔＬＴ１３０（拟南芥犃．狋犺犪犾犻犪狀犪；登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ：Ｐ４２７５８），ＨｖＤＨＮ１（大麦 犎．狏狌犾犵犪狉犲；登录号 Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ：
Ｐ１２９５１），ＺｍＤＨＮ１（玉米犣．犿犪狔狊；登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ：Ｐ１２９５０），ＡｔＲＡＢ１８（拟南芥犃．狋犺犪犾犻犪狀犪；登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ：ＡＡＬ１６２２７），
ＧｍＤＨＮ５（大豆犌．犿犪狓；登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ：ＡＡＡ１８８３４），ＧｍＭＡＴ１（大豆犌．犿犪狓；登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ：Ｕ１０１１１），ＰｓＤＨＮ３（豌豆
犘．狊犪狋犻狏狌犿；登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ：Ｐ２８６４１），ＰｓＤＨＮ１（豌豆犘．狊犪狋犻狏狌犿；登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ：Ｐ２８６３９），ＰｓＤＨＮ２（豌豆犘．狊犪狋犻狏狌犿；登
录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ：Ｐ２８６４０），ＳｏＣＡＰ１６０（菠菜犛狆犻狀犪犮犻犪狅犾犲狉犪犮犲犪；登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ：ＡＡＣ４９９９９），ＰｔＣＯＲｃ１１９（枸橘犘狅狀犮犻狉狌狊狋狉犻犳狅犾犻
犪狋犪；登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ：ＡＡＡ９９９６３），ＭｓＣＡＳ１５Ａ（紫花苜蓿犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪；登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ：ＡＡＡ１６９２７），ＯｓＷＳＩ７２４（水稻
犗．狊犪狋犻狏犪；登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ：ＢＡＡ０５５３９），ＧｍＳＲＣ１（大豆犌．犿犪狓；登录号Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ：ＢＡＡ１９７６８）．
９７１第２１卷第１期 草业学报２０１２年
２．２　犇犎犖 基因的组织特异性表达分析
图４　犇犎犖基因在东方山羊豆的不同组织中的相对表达量
犉犻犵．４　犜犺犲狉犲犾犪狋犻狏犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狅犳犇犎犖犵犲狀犲犻狀
犱犻犳犳犲狉犲狀狋狋犻狊狊狌犲狊狅犳犌．狅狉犻犲狀狋犪犾犻狊
图５　犇犎犖基因在受到犃犅犃、犖犪犆犾和犘犈犌诱导后的相对表达量
犉犻犵．５　犜犺犲狉犲犾犪狋犻狏犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狅犳犇犎犖犵犲狀犲
犻狀犱狌犮犲犱犫狔犃犅犃，犖犪犆犾犪狀犱犘犈犌
Ａ：ＡＢＡ诱导 ＡＢＡｉｎｄｕｃｅｄ；Ｂ：ＮａＣｌ诱导 ＮａＣｌｉｎｄｕｃｅｄ；
Ｃ：ＰＥＧ诱导ＰＥＧｉｎｄｕｃｅｄ．
根据１．２．３中的公式，计算犇犎犖 基因在东方
山羊豆不同组织中的相对表达量（图４）。结果表
明，犌狅犇犎犖 在根中表达量最少，茎中最多，叶中次
之。以东方山羊豆根中犇犎犖 基因的表达量为对
照，茎中的表达量为根中的６倍，叶中表达量为根中
的５．５倍。
２．３　犇犎犖 基因在不同逆境胁迫下的表达分析
根据１．２．４中的公式，计算了犇犎犖 基因在分
别受到ＡＢＡ、ＮａＣｌ和ＰＥＧ胁迫０，２，４，８，１２和２４
ｈ的相对表达量（图５）。结果显示，犇犎犖 基因在
ＡＢＡ胁迫诱导下，４ｈ时表达量达到一个小高峰，然
后下降，在２４ｈ诱导后表达量猛增到４ｈ表达量的
２倍（图５Ａ）。在 ＮａＣｌ的胁迫诱导下，犇犎犖 基因
的表达量逐步增加，在２４ｈ达到最高峰，为对照（０
ｈ）的６５００倍（图５Ｂ）。在ＰＥＧ诱导１２ｈ后，犇犎犖
基因的表达量达到一个最高峰，为对照（０ｈ）的
４２０００倍，诱导２４ｈ后，表达量相对１２ｈ时有所下
降，但仍然是对照（０ｈ）的３５０００倍（图５Ｃ）。
２．４　植物表达载体的构建及鉴定
用犅犵犾ＩＩ限制性内切酶分别酶切带有犅犵犾ＩＩ酶
切位点的犇犎犖 基因ＯＲＦ和ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２载体
后，经过连接、转化，挑取菌落，抽提质粒，经犅犵犾ＩＩ
酶切鉴定，得到与预期大小一致的目的片段（图６）。
鉴定为阳性的质粒经测序序列完全正确，表明植物
表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２犇犎犖 构建成功。
３　讨论
本研究得到的犌狅犇犎犖 基因的氨基酸序列中
（图２），在 Ｎ 末端有一个 Ｙ 片段（ＶＤＱＹＧＮＰ），
Ｃｌｏｓｅ［３］认为该片段的存在与犇犎犖 基因在植物和
细菌中的核定位有关。在该氨基酸序列的中间部位
和Ｃ末端包含有３个 Ｋ 片段（ＥＥ／Ｄ／ＫＫＧＩＭＤ
ＫＩＫＥＫＩＰＧ），Ｓｏｕｌａｇｅｓ等［１９］通过二级结构预测证
明Ｋ片段可能形成α螺旋结构，参与脱水蛋白的亲
水或疏水作用。纯化的玉米脱水蛋白Ｇ５０中１５％
的氨基酸形成了α螺旋结构，但Ｇ５０中没有任何疏
水位点，却能参与疏水作用，推测 Ｋ片段形成的α
螺旋结构，赋予了 Ｇ５０参与疏水相互作用的潜
力［２１］。脱水蛋白通过 Ｋ片段可能参与部分变性蛋
白质及膜的疏水相互作用来防止蛋白质和膜进一步
变性［１９］。在某些植物的脱水蛋白中，如拟南芥（犃狉
犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）ＲＡＢ１８，还含有一个Ｓ保守片
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段，Ｓ片段是一个可磷酸化的丝氨酸簇，该片段的磷酸
图６　酶切鉴定
犉犻犵．６　犐狀犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犲狀狕狔犿犲犱犻犵犲狊狋犻狅狀
Ｍ：ＤＮＡＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；１：ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２；
２：ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２犌狅犇犎犖
化可能也与核定位信号有关，可以参与脱水蛋白的入
核过程［３］。
通过构建系统进化树（图３），将脱水蛋白分为５
类［４］。结果表明，属于同一亚型的脱水蛋白亲缘关系
有的近有的远，如ＧｏＤＨＮ蛋白与菠菜（犛狆犻狀犪犮犻犪狅犾
犲狉犪犮犲犪）ＳｏＣＡＰ１６０蛋白虽然同属于 ＹＫｎ亚型，但是
亲缘关系较远；与豌豆（犘犻狊狌犿狊犪狋犻狏狌犿）ＰｓＤＨＮ蛋白
亲缘关系最近，而且同属于ＹＫｎ亚型。与拟南芥Ａｔ
ＲＡＢ１８蛋白亲缘关系虽然较近却不属于同一亚型。
说明在脱水蛋白的进化过程中，分离较晚的蛋白有可
能进化为不同的亚型，而较早分离的蛋白可能源于同
一亚型，并且在进化过程中，一直保持不变。
ＹＫｎ亚型脱水蛋白是一类酸性蛋白，对这一类蛋白的抗性研究主要集中在干旱和冷害环境胁迫下，如大豆
（犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓）Ｍａｔ１编码一个Ｙ２Ｋ型脱水蛋白，主要由干旱脱水诱导产生，而在 ＡＢＡ诱导下并无明显表达［２２］。
菠菜ＣＡＰ１６０编码一个ＹＫ型脱水蛋白，主要受低温诱导，在转基因烟草中的高效表达可以提高其抗寒性［２３］。
桃树 （犘狉狌狀狌狊狆犲狉狊犻犮犪）ＰｐＤｈｎ１编码一个 Ｙ２Ｋ２型脱水蛋白，也在低温诱导时大量表达［２４］。以上结果表明大部
分ＹＫ型脱水蛋白在抗旱和耐寒方面可能发挥重要作用。本实验增加了盐胁迫方面的研究，通过模拟逆境处理
后（图５），犌狅犇犎犖 基因在ＮａＣｌ、ＰＥＧ和ＡＢＡ胁迫条件下表达均上调，其中ＮａＣｌ和ＰＥＧ模拟的盐胁迫和干旱
环境，诱导犌狅犇犎犖 基因表达量成千上万倍的提高，暗示ＧｏＤＨＮ脱水蛋白与植物的抗盐和抗旱性密切相关。
ＡＢＡ诱导犌狅犇犎犖 基因的表达量虽然低于 ＮａＣｌ和ＰＥＧ，但是与对照相比仍然提高了２００倍，表明外源激素
ＡＢＡ的存在也可以诱导脱水蛋白的表达量上调。
脱水蛋白参与细胞的渗透调节过程，可以提高植物的抗旱和抗盐性［２５］。向日葵（犎犲犾犻犪狀狋犺狌狊犪狀狀狌狌狊）脱水蛋
白基因 犎犪犇犺狀１和 犎犪犇犺狀２在干旱胁迫下的转录活性显著高于供水条件的转录活性，耐旱品种累积的转录物
明显高于敏感品种，并且其累积量与耐旱品种芽细胞膨压的维持和干旱的适应性呈正相关［２６］。桦树（犅犲狋狌犾犪
狆犾犪狋狔狆犺狔犾犾犪）脱水蛋白Ｐｅｕｄｈｎ１，在未胁迫的植株中仅有少量表达，而在ＰＥＧ６０００和 ＮａＣｌ处理后，该蛋白在根
和叶中大量积累，并在复水后持续积累［２７］。在模拟盐胁迫下诱导２４ｈ后，犌狅犇犎犖 基因的表达量是对照的６５００
倍，显著高于对照；在模拟干旱胁迫下诱导１２ｈ后，犌狅犇犎犖 基因的表达量是对照的４２０００倍，诱导２４ｈ后，表
达量虽然有所下降，但仍然显著高于对照（图５）。犌狅犇犎犖 可能通过参与细胞内的渗透调节过程，来提高东方山
羊豆的抗旱耐盐能力。而高强度的诱导表达可能暗示着东方山羊豆具有非常强的抗旱耐盐能力。
构建植物表达载体是有一定策略的，构建载体时目的基因与载体的连接可分为同源粘末端的连接、平末端的
连接、定向克隆、接头连接和同聚物加尾连接等［２８］。本研究中，为了消除载体自身连接，采用碱性磷酸酶（ａｌｋａ
ｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ＣＩＡＰ）对载体进行去磷酸化。最后得到植物表达载体的重组质粒及菌株并通过酶切鉴定，确定
连接正确。
目前对脱水蛋白的基因表达、结构和功能的研究已取得了很大的进展，但其具体的分子保护机制大多数只限
于推测。例如，在逆境下脱水蛋白具有稳定细胞膜和保护蛋白质的作用虽然已被普遍认同，但其在植物体内具体
是怎样发挥作用的并不清楚。尤其是在牧草领域，对于脱水蛋白的研究很少。本实验为进一步研究东方山羊豆
脱水蛋白在逆境条件下的表达调控规律和生理生化机制奠定了一定理论基础，也为牧草抗逆性改良提供了候选
基因。
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犆犾狅狀犻狀犵犪狀犱犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狋犺犲犱犲犺狔犱狉犻狀（犇犎犖）犵犲狀犲犳狉狅犿犌犪犾犲犵犪狅狉犻犲狀狋犪犾犻狊
ＬＩＹｕｋｕｎ１，ＷＡＮＧＸｕｅｍｉｎ１，ＷＡＮＧＺａｎ１，ＬＩＪｕｎ１，ＶｌａｄｉｍｉｒＣ２，
ＮｉｋｏｌａｙＤ２，ＳＵＮＧｕｉｚｈｉ１，ＧＡＯＨｏｎｇｗｅｎ１
（１．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１９３，Ｃｈｉｎａ；２．Ｎ．Ｉ．
ＶａｖｉｌｏｖＡｌＲｕｓｓｉａｎＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰｌａｎｔＩｎｄｕｓｔｒｙ，Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ１９００００，Ｒｕｓｓｉａｎ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：ＵｓｉｎｇｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡ ｅｎｄｓ （ＲＡＣＥ）ｍｅｔｈｏｄ，ａｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇｄｅｈｙｄｒｉｎ
（犌狅犇犎犖）ｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍａｃＤＮＡＳＳＨ （ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ｌｉｂｒａｒｙｉｎｄｕｃｅｄｂｙｓａｌｔ
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