全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 5期，2009年 5月444
收稿 2009-01-04 修定 　2009-03-16
资助 国家 “973”项目(2007CB108905)和 “十一五 ”科技支撑
项目(2007BAD56B02; 2008BADB3B01)。
* 通讯作者(E-mail : gaohongwen@2 63.net; Tel: 0 10-
6 2 8 9 4 5 6 0 )。
东方山羊豆液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆与分析
李鑫 1,2, 王赞 2, 王学敏 2, 高洪文 1,2,*, 陈小芳 2, 董洁 2, 徐博 2
1兰州大学草地农业科技学院, 兰州 730020; 2中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193
提要: 采用RT-PCR及RACE的方法从东方山羊豆中克隆了一种新的Na+/H+逆向转运蛋白基因。该基因全长 2 280 bp, 开
放阅读框为1 626 bp, 编码542个氨基酸残基。预测该蛋白分子量为60.0 kDa, 可能有10个跨膜区域。RT-PCR检测结果表
明, 在NaCl胁迫条件下东方山羊豆GoNHX1基因可在根、茎、叶中诱导表达, 在叶中的表达量随着处理时间的延长而逐
渐增加, 到 24 h表达量下降。
关键词: 东方山羊豆; Na+/H+逆向转运蛋白; GoNHX1; RACE
Cloning and Analysis of a Vacuolar Na+/H+ Antiporter Gene in Galega orientalis
LI Xin1,2 , WANG Zan2, WANG Xue-Min2, GAO Hong-Wen1,2,*, CHEN Xiao-Fang2, DONG Jie2, XU Bo2
1College of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730020, China; 2Institute of Animal
Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China
Abstract: The full length cDNA of a new vacuolar Na+/H+ antiporter gene (GoNHX1) in Galega orientalis was
cloned by RT-PCR and RACE. The data showed that the full length of GoNHX1 gene was 2 280 bp, the open
reading frame of GoNHX1 was 1 626 bp and encoded a putative protein of 542 amino acid residues. The
analysis showed that the putative protein was 60.0 kDa and had 10 potential transmembrane domains. RT-PCR
results revealed that GoNHX1 expression could be induced in the roots, stems and leaves by NaCl. The expres-
sion level of GoNHX1 in leaves increased with the increasing of treatment time, but decreased after 24 h with the
treatment of NaCl.
Key words: Galega orientalis; Na+/H+ antiporter; GoNHX1; RACE
盐胁迫是影响植物生长、降低农作物产量的
主要逆境因素之一。盐对植物的伤害包括渗透胁
迫和离子毒害两方面(Tester和Davenport 2003), 首
先盐分所产生的土壤溶液低渗透势妨碍了植物对水
分的吸收, 造成植物的 “生理干旱 ” (Zhu 2001); 其
次Na+的积累还导致其他营养物质的亏缺(Silberbush
和 Ben-Asher 2001)。为了能够适应高盐环境, 植
物在进化过程中, 演化出3种机制来阻止过多的Na
在胞液中积累, 即Na的外排、Na的区隔化和植物
细胞对Na的选择性吸收。其中液泡内Na区隔化
主要依赖于液泡膜上的Na+/H+逆向转运蛋白来完
成。液泡具有较大的吸收面积和单层的膜结构, 因
此相对于植物细胞内部其他结构, 液泡十分适合吸
收离子(Apse等 1999)。液泡膜Na+/H+逆向转运蛋
白利用液泡膜上的H+-ATPase和H+-PPiase建立的
跨膜质子梯度为驱动力(Blumwald 2000), 并且液泡
膜Na+/H+逆向转运蛋白上存在一段高度保守的氨
氯吡嗪嘧结合位点(LFFIYLLPPI), 这一结构域对液
泡膜Na+/H+反向转运蛋白的底物竞争性抑制剂氨
氯吡嗪咪及其衍生物敏感, 负责将Na+运入液泡区
隔化。
Blumwald和 Poole (1985)最早在甜菜(Beta
vulgaris)贮藏组织中发现液泡膜Na+/H+逆向转运蛋
白。Fukuda等(1999, 2004)从单子叶植物水稻中克
隆得到了液泡膜型Na+/H+逆向转运蛋白基因, 并且
该基因超表达的转基因水稻的耐盐性明显增强, 表
明单一转液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因对于改
造农作物的耐盐性状有显著的效果。
东方山羊豆(Galega orientalis)是一种多年生的
豆科牧草, 品质好、产量高、抗病抗逆性强、使
用年限长, 反刍家畜青饲食用不得臌胀病, 并具有
促进奶牛泌乳等功能(张清斌等 2001)。广泛种植
于俄罗斯、爱沙尼亚、白俄罗斯等国, 在北欧和
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加拿大等地也已开始种植(张自和 2002)。近年来
我国将其引进, 并在天山草甸草原区、阿尔泰山山
前地带以及平原井灌区种植, 生长发育良好(张清斌
等 2001)。东方山羊豆在我国主要种植在西北地
区, 而这一地区有些地方的土壤盐碱化问题严重, 因
此研究东方山羊豆耐盐基因等方面的工作对扩大种
植面积, 改良盐碱土均可能有积极意义。本文旨在
从东方山羊豆中分离Na+/H+逆向运转蛋白基因, 进
行生物信息学分析, 为这一优良牧草的分子改良建
立基础。
材料与方法
东方山羊豆(Galega orientalis Lam)由中国农
业科学院北京畜牧兽医研究所牧草资源研究室提
供; 大肠杆菌DH5α 购自北京天根生化科技有限公
司; cDNA Synthesis Kit, 为Promega公司产品; 克隆
载体 pMD 18-T、Taq 酶、限制性内切酶、T4
DNA连接酶、3-Full RACE Core Set为 TaKaRa
公司产品; Trizol总RNA提取试剂盒为Invitrogen公
司产品; SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit购
自 Clontech公司。
将种子用氯气消毒24 h, 播种于铺有滤纸的培
养皿上, 置于光照培养箱中培养至种子发芽(培养箱
内温度为 24℃, 光照时间为 12 h·d-1)。将发芽后
的种子移至花盆(蛭石与珍珠岩的比例为 3:1)中继
续培养 30 d, 幼苗用浓度 250 mmol·L-1 NaCl处理 8
h后, 用于提取总 RNA。
用Trizol法提取 250 mmol·L-1 NaCl处理 8 h后
的幼叶总RNA。根据柠条锦鸡儿的Na+/H+逆向转
运蛋白基因序列设计一对引物, 引物序列为P1: 5-
GGTGGACGAGATGGCTTTTG-3 ; P2: 5 -
CCAGTAGTTACCGCAACTCT-3。高保真酶 RT-
PCR扩增 cDNA片段, 纯化回收后克隆至 pMD-18
载体。重组质粒转化大肠杆菌DH5α, 菌液送至上
海英俊生物技术有限公司测序。分别用 3 -Ful l
RACE试剂盒和 SMART RACE试剂盒扩增获得
cDNA片段的 3末端和 5末端, 测序后进行序列拼
接得到基因全序列。
核酸及氨基酸序列的组成成分分析、理化性
质分析、开放阅读框(open reading flame, ORF)的
查找和翻译以及序列拼接用DNAStar 6.13软件进
行分析; 序列同源比较系统进化树由DNAMAN 5.0
软件完成。蛋白质二级结构和跨膜结构域亲水性 /
疏水性的分析分别用 SOPMA、TMHMM 2.0和
ProtScale软件完成。
取同一批东方山羊豆幼苗, 分成对照组和盐处
理组(250 mmol·L-1 NaCl处理 8 h), 分别提取其根、
茎、叶的 RNA, 根据开放阅读框序列设计引物 P1
和 P 2 进行 R T - P C R 半定量表达。 P 1 :
ATGGCTTTTGAAATGACTTCTGTTGTCT; P2:
TCACGGCGATTGATGACCATTGCGTT。
取同一批东方山羊豆幼苗, 分别用250 mmol·L-1
NaCl处理 2、4、8、12和 24 h。提取其叶 RNA,
以 P1和 P2为引物进行 RT-PCR半定量表达。
实验结果
1 东方山羊豆Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆
用东方山羊豆的 cDNA为模板, 通过RT-PCR
得到 1 636 bp片段。Blast比对分析发现该片段与
已发表的Na+/H+逆向转运蛋白基因具有很高的同
源性, 表明获得的 cDNA片段是东方山羊豆中Na+/
H+逆向转运蛋白基因的一部分。
RACE试剂盒分别克隆了cDNA 3末端序列和
5末端序列, 测序结果表明, 3和 5端片段的长度
分别为 480 bp和 1 044 bp, 将以上片段拼接, 得到
全长 2 280 bp (图 1), 其中开放阅读框 1 626 bp, 该
基因命名为GoNHX1, 蛋白质序列GenBank登录号
为ABY59540。
2 GoNHX1基因生物信息学分析
用DNAStar 6.13软件对GoNHX1基因 cDNA
序列进行分析, 该基因全长 2 280 bp, 其中开放阅
读框 1 626 bp, 编码 542个氨基酸。对氨基酸序
列进行分析表明, 该蛋白分子量为 60.0 kDa, 等电
点为 8.558, pH 7.0时的电荷为 8.350; 碱性氨基酸
(K、R) 41个; 酸性氨基酸(D、E) 35个; 疏水氨
基酸(A、I、F、W、V) 231个; 极性氨基酸(N,
C, Q, S, T, Y) 144个。通过 SOPMA软件预测东
方山羊豆Na+/H+逆向转运蛋白的二级结构(图 2),
表明该蛋白含约 44.18%的 α-螺旋、19.96%的 β-
折叠、5.36%的 β-转角和 30.50%的不规则卷曲。
用ProtScale软件预测东方山羊豆Na+/H+逆向转运
蛋白氨基酸序列的疏水性 /亲水性的结果(图 3)表
明, 整体来看, 疏水性氨基酸均匀分布在整个肽链
中, 且多于亲水性氨基酸。因此, 推测整个多肽链
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图 1 东方山羊豆液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因 cDNA全长核苷酸序列及推导的氨基酸序列
Fig.1 The full nucleotide and deduced amino acid sequences of GoNHX1 in Galega orientalis
阴影部分是 GoNHX1 基因的氨氯吡嗪嘧结合位点, 下划线部分分别是翻译起始和终止密码子。
表现为疏水性 , 没有明显的亲水区域。运用
TMHMM软件对东方山羊豆的Na+/H+逆向转运蛋
白跨膜结构进行分析, 结果显示GoNHX1含有 12
个疏水区域, 其中10个是跨膜区域(图4), 另外2个
镶嵌于膜结构内。这与在番杏( T e t r a g o n i a
tetragonioides) TtNHX1基因编码的Na+/H+逆向转运
蛋白具有 12 个跨膜区域以及菊芋( He l i an th us
tuberosus) HtNHX1基因编码的Na+/H+逆向转运蛋
白具有 11个跨膜区有一定的差别(吕慧颖等 2004;
严一诺等 2007)。
3 GoNHX1与其他Na+/H+逆向转运蛋白亲缘关系
比较
图5结果表明, GoNHX1与液泡型Na+/H+逆向
转运蛋白如柠条锦鸡儿 C k N H X 1、紫花苜蓿
MsNHX1以及大豆GmNHX1亲缘关系较近, 与质膜
型Na+/H+逆向转运蛋白如拟南芥 AtSOS1、番茄
SlSOS1等的亲缘关系较远。
4 RT-PCR分析东方山羊豆中GoNHX1基因的表
达特性
GoNHX1基因在对照组的东方山羊豆中根、
茎、叶中均不表达, 在 250 mmol·L-1 NaCl处理 8 h
后在根、茎、叶中都有表达, 且叶和茎中的表达
量高于根(图 6)。分别用 250 mmol·L-1 NaCl处理
东方山羊豆叶 2、4、8、12和 24 h, GoNHX1基
因表达量逐渐增强, 到 12 h表达量最大, 到 24 h明
显减弱(图 7)。
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讨　　论
比较东方山羊豆液泡型Na+/H+逆向转运蛋白
基因GoNHX1与柠条锦鸡儿 CkNHX1、紫花苜蓿
MsNHX1以及大豆GmNHX1基因的结果表明, 它们
的亲缘关系较近, 与NHX基因家族其他基因如拟南
芥的 AtNHX2、AtNHX3、AtNHX4、AtNHX5和
AtNHX6基因比较, 其亲缘关系较远, 与质膜型Na+/
H+逆向转运蛋白基因如拟南芥 AtSOS1 和番茄
S lS O S1 等基因比较, 其亲缘关系更远。此外,
GoNHX1氨基酸序列包括一段Na+/H+逆向转运蛋
白上存在高度保守的氨氯吡嗪嘧的结合位点(即
LFFIYLLPPI) , 这充分说明了本研究所克隆的
GoNHX1是植物液泡膜 Na+/H+反向转运蛋白基
因。正常条件下东方山羊豆的Na+/H+逆向转运蛋
白基因GoNHX1在东方山羊豆的根、茎、叶中均
不表达, 但受到盐诱导后根、茎、叶均有不同程
度的表达, 并且在叶中表达量随着处理时间的延长
而逐渐增加, 到了 12 h达到最大, 到 24 h表达量下
降, 这可能由于Na+在叶片中积累到一定程度后, 破
坏了液泡膜渗透性。
AtNHX1的C末端亲水区定位于液泡膜内并对
它的转运活性起调节作用(Yamaguchi等 2003), 已
图 4 东方山羊豆Na+/H+逆向转运蛋白跨膜区分析
Fig.4 Analysis of prediction of transmembrane helixes of GoNHX1
图 3 东方山羊豆Na+/H+逆向转运蛋白疏水性 /亲水性的预测
Fig.3 Predicted hydrophobicity/hydrophilic of GoNHX1
图 2 东方山羊豆Na+/H+逆向转运蛋白二级结构的预测
Fig.2 Predicted secondary structure of GoNHX1
α-螺旋: 蓝色; 延伸链: 红色; β-转角: 绿色; 不规则卷曲: 紫色。
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图 5 Na+/H+ 逆向转运蛋白的进化树
Fig.5 A phylogenetic tree of GoNHX1
序列号为 GoNHX1 (ABY59540)、MsNHX1 (AAS84487)、
CkNH X1 (ABG89 337 )、GmNH X1 (AAY43 006 )、AtNHX1
( A B Q 5 8 8 6 5 )、A t N H X 2 ( N P _ 1 8 7 1 5 4 )、O s N H X 1
( A B 0 2 1 8 7 8 )、A t N H X 3 ( N P _ 2 0 0 3 5 8 )、A t N H X 4
( N P _ 1 8 7 2 8 8 )、A t N H X 5 ( N P _ 1 7 5 8 3 9 )、A t N H X 6
(NP_178079)、AtSOS1 (AAF76139)、SlSOS1 (CAG30524)、
PtSOS1 (ABO32636)。
图 6 RT-PCR分析 250 mmol·L-1 NaCl处理的东方山羊豆
不同组织中GoNHX1基因的表达
Fig.6 RT-PCR of GoNHX1 in the different organs of Galega
orientalis with 250 mmol·L-1 NaCl treatment
1~ 3 分别是对照组根、茎、叶; 4 ~6 分别是盐处理组(25 0
mmol · L -1 N a Cl 处理 8 h)根、茎、叶。
图 7 250 mmol·L-1 NaCl处理的东方山羊豆叶片不同时间
的GoNHX1基因的表达
Fig.7 Expression levels of GoNHX1 in the leaves of Galega
orientalis with the treatment of 250 mmol·L-1 NaCl
C末端结合。结合了 AtCaM15的 AtNHX1 Na+/K+
选择性提高而Na+/H+交换的活性降低(Yamaguchi
等 2005)。由于GoNHX1与AtNHX1蛋白质C末端
有较高的同源性, 且GoNHX1的C末端亲水区也定
位于液泡膜内, 据此可以推测GoNHX1与 AtNHX1
一样也受相似的调控。这些结果暗示了液泡膜
Na+/H+逆向转运蛋白基因在转录水平的调节可能是
决定东方山羊豆耐盐能力的重要因子, 这也为利用
过量表达液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因进行东
方山羊豆品种的基因工程改良提供了依据。
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