全 文 ：第 18 卷 第 4 期
Vol. 18 No. 4
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2010 年 7 月
Jul. 2010
东方山羊豆 4香豆酸:辅酶 A连接酶( 4CL)
基因的克隆和荧光定量表达分析
杨冬梅1, 王学敏1 ,高洪文1* , Dzyubenko Nikolay2,
Chapurin Vladimir2, 韩永增1 , 宋清晓1 , 董 洁1
( 1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193; 2.俄罗斯瓦维洛夫全俄植物栽培研究所, 圣彼得堡 190000)
摘要: 东方山羊豆( Galega or iental is L . )是 20世纪末引种到我国的牧草品种, 为发掘其基因资源, 本实验克隆出
东方山羊豆4 CL 基因, 并深入研究 4CL 基因对东方山羊豆抗逆性的影响,为今后东方山羊豆在我国的种植和应用
奠定基础。结果表明:采用 RACE 技术结合 RT-PCR 方法从东方山羊豆中获得一个编码 4CL 基因的 cDNA 全长
序列,命名为 Go4CL。该序列全长 1916 bp,开放阅读框 1653 bp, 编码 510 个氨基酸。利用 Rea-l T ime PCR 方法检
测发现, Go4 CL 基因在东方山羊豆的根中表达量最高, 叶中表达量最少。在 PEG、ABA、MeJA、SA 胁迫处理下
Go4CL 基因的表达量均有不同程度的上调, 说明此基因在植物抵御干旱、病菌侵袭和机械损伤等胁迫过程中能够
起到调控作用。
关键词:东方山羊豆; 4香豆: 酸辅酸 A 连接酶; 基因克隆;荧光定量 PCR
中图分类号: Q786; S541. 9 文献标识码: A 文章编号: 1007-0435( 2010) 03-0533-06
Cloning and Expression Analysis by Rea-l Time PCR of 4-Coumarate:
Coenzyme A ligase ( 4CL) Gene in Galega orientalis
YANG Dong-mei
1
, WANG Xue-m in
1
, GAO Hong-w en
1*
, Dzyubenko Niko lay
2
,
Chapurin Vladim ir2 , HAN Yong-zeng 1 , SONG Q ing-x iao1 , DONG Jie1
( 1. Ins titute of An imal S cien ce, Chin ese Academy of Agricul tu re Sciences, Beijing 100193, C hina;
2. N. I. Vavilov Al-l Russian Research In st itute of Plan t Indust ry, St . Petersburg 190000, Russia)
Abstract: Galega orientali s L. w as a pasture species w hich w as intr oduced to China at the end of the tw en-
t ieth century. T he 4 CL gene w as cloned in Galega oriental i s to explo re it s gene r esources. T he inf luence
of 4CL gene on the str ess-resistance in Galega or ientali s was w ell studied. Al l of the r esearch fo rmed the
basis for the implantat ion and applicat ion o f Galega or ientali s in China in future. With RACE and RT-PCR
methods, the full length cDNA, w hich encode 4-coumar ate: co enzyme A ligase, w as cloned from Galega
or iental i s. The 1, 916-bp full leng th Go4CL had a 1, 653- bp ORF, w hich encodes 510 am ino acids residues.
The results f rom Rea-l T ime PCR indicated that the expr ession of 4 CL gene w as the st rongest in the root of
Galega or iental is , and the least in leaves. Many abiot ic st ress t reatments, such as PEG, ABA, M eJA and
SA, all up regulated the expression of Go4CL gene, w hich indicated that 4CL may play a role in the bio tic
and abiot ic st ress-r esistance regulation pathw ay in plants.
Key words: Galega or iental i s; 4CL ; Gene clone; Rea-l T ime PCR
木质素是植物体内具重要生物功能的次生代谢
产物,不仅能够增强植物体的机械强度, 促进植物体
内水分的疏导, 还能增强植物抵抗非生物逆境和抵
御病原微生物的能力 [ 1~ 4]。木质素中因蕴含着大量
能量,是植物生物质能源的重要来源之一 [ 5]。而饲
草中的过高木质素会影响其适口性和牲畜的消化吸
收[ 6] 。4香豆酸:辅酶 A连接酶 ( 4CL, EC 6.2. 1. 12)
是木质素生物合成途径中连接苯丙酸途径与木质素
特异合成途径的关键酶,是木质素生物合成的限速
酶之一[ 7] 。目前已从多种植物中,包括火炬松( Pi-
nns taeda )、欧芹 ( P etrosel inum cr isp um )、大豆
( Gly cine max )、紫穗槐( A mor p ha f r uticosa. L )等,
克隆出 4 CL 基因[ 8~ 11]。研究表明调控 4CL 基因
的表达能有效改变植物中和木质素含量, 而且很少
收稿日期: 2009- 12-24;修回日期: 2010- 02-01
基金项目:现代农业产业技术体系建设专项资金、十一五科技支撑项目( 2008BADB3B01)资助
作者简介:杨冬梅( 1985- ) ,女,回族,内蒙古锡林浩特市人,硕士研究生,研究方向为牧草种质资源, ydm9986@ 126. com; * 通讯作者 Au-
thor for correspondence; E-mail: gaohongw en@ 263. net
草 地 学 报 第 18卷
出现转基因植株异常生长 [ 12, 13]。
东方山羊豆( Galega oriental i s L. )是多年生豆
科植物,具有较高的饲用价值。20世纪 90年代初,
我国科学家分别从白俄罗斯、哈萨克斯坦引种,主要
种植在甘肃、新疆等地[ 14] , 与其他牧草资源相比, 其
相应的研究较少,但具有广阔的应用前景和重要研
究价值。
本研究通过设计简并引物, 利用 RT- PCR方法
及RA CE 技术,克隆东方山羊豆4 CL 基因的 cDNA
全长序列, 并利用 Rea-l T ime PCR方法检测在多种
逆境胁迫下东方山羊豆 4 CL 基因的表达模式。以
期揭示该基因在东方山羊豆抗逆途径中的调控作
用。为今后利用基因工程方法改变 4CL 基因在东
方山羊豆中的表达量, 获得抗性优良而且木质素含
量适宜而不影响牲畜消化吸收的东方山羊豆牧草奠
定基础,使其在我国能够广泛种植和应用。
1 材料与方法
1. 1 供试材料
东方山羊豆( Galega orientali s )为中国农业科
学院北京畜牧兽医研究所牧草资源研究室保存。将
东方山羊豆种子种皮磨破, 氯气灭菌 24 h。培养皿
灭菌,将种子平铺在用无菌水浸湿的滤纸上, 人工光
照培养箱培养, 24 , 相对湿度 70%, 光照强度约 5
000 Ix,光照 12 h/黑暗 12 h, 3- 5 d种子萌发,将萌
发的种子转入装有蛭石和珍珠岩(比例为 31)的花
盆中继续培养 30 d, 用于 RNA提取[ 15] 。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 目的基因保守区的克隆 用 Tr izol法提取
东方山羊豆叶片总 RNA。按照 Rever tAidT M First
St rand cDNA Synthesis Kit ( Fermentas, Canada)
说明书,合成 cDNA第一链。
根据 GENBANK 上东方山羊豆近源物种编码
的 4CL 蛋白保守区序列, 通过简并引物专业设计网
站 CODEH OP( http: / / blocks. fhcrc. org/ codehop.
htm l) ,在线设计简并引物,引物序列为 4CL-DF: 5-
TCT GGTA CT ACTGGTCT GCCAAARGGNGT N-
ATG-3; 4CL-DR: 5-ACCAGT TT CAGGAT CA-
ACAA TCT TNADYT CNGC-3。以 上述 合成 的
cDNA 为模板, 4CL-DF、4CL-DR为引物,进行 PCR
扩增,反应条件如下: 94 预变性 5 min, 94 30
sec, 55 30 sec, 72 1 m in, 共 30个循环, 反应结
束后 72 延伸 10 min。1%琼脂糖电泳检测 PCR
产物, 然后用 DNA Gel Extract Kit ( Fermentas,
Canada)回收 PCR产物,将回收片段连接 PMD18-T
载体( T aKaRa, Japan ) , 重组质粒转化大肠杆菌
DH5感受态细胞(北京天根生化科技有限公司) ,
经蓝白斑筛选,阳性克隆送至上海英俊生物技术有
限公司测序。
1. 2. 2 3末端和 5末端 cDNA 片段的克隆 根据
已获得的东方山羊豆 cDNA 保守区序列设计
RA CE 基因特异性引物。5RACE 引物: 4CL-5
GSP: 5-TGGCCCT GCCTCAGTCAT TCCGT-3,
3RACE 引物: 4CL-3 GSP: 5-T T CCCCAAAG-
CAATT CTT GGACAGGG-3。
按照 SMART TM RACE cDNA Amplificat ion
Kit ( Clontech, USA ) 的方法进行反转录反应和
PCR扩增。以合成的 5- RA CE-Ready f irst-st rand
cDNA 为模板,以 4CL-5GSP 和 UPM 为引物, 扩增
5末端序列;以 3- RACE-Ready first-st rand cDNA
为模板, 4CL-3GSP 和 UPM 为引物, 扩增 3末端
序列。将扩增产物测序,进行序列拼接,得到东方山
羊豆 4CL 基因的全长序列。
1. 2. 3 Rea-l T ime PCR检测东方山羊豆 4CL 基因
的组织表达特异性 根据东方山羊豆 4CL 全长序
列设计特异性引物, 4CL-RT-F: 5-CCA TT GT AT-
TGGCGAT TGC-3; 4CL-RT-R: 5-A GT CA TT C-
CGT AT CCCTGT CC-3, 预期扩增片段长度为 160
bp 左右。以东方山羊豆 Act in 做为内参基因,设计
内参引物: Act in-F: 5-GGACAAGT TAT C AC-
CATCGG -3; A ct in-R: 5-T CA GCAAT ACCT G-
GAAACA TAG-3, 预期扩增片段长度为 200 bp左
右。分别提取同一批东方山羊豆 30 d 幼苗根、茎、
叶的 RNA, 反转录成 cDNA。采用 2 步法 Real
T ime PCR, 反应体系 ( 20 L ) 为: 2 SYBR
Prem ix Ex Taq
TM
( T akara, Japan) 10 L; 4CL-RT-
F( 10 mol L - 1 ) : 0. 4 L; 4CL-RT-R( 10 mo l
L
- 1
) : 0. 4 L; 50 ROX Reference Dye II 0. 4 L;
cDNA 2. 0 L; ddH 2O 6. 8 L, 每个反应做 3个重
复。使用仪器为: ABI 7500 Rea-l T ime PCR System。
PCR扩增程序为: 95 预变性 30 sec; 95 5 sec, 60
34 sec, 40个循环, 反应结束后确认 Real T ime PCR
的扩增曲线和融解曲线,进行相对定量分析。
1. 2. 4 Rea-l T ime PCR分析东方山羊豆 4CL 基因
逆境胁迫下的表达模式 对东方山羊豆 30 d幼苗
分别进行不同胁迫处理:将幼苗小心由花盆中取出,
根部洗净, 过程中尽量不损伤根系。对于干旱和
ABA处理,将根部分别浸于 20%的 PEG6000(聚乙
二醇)、100 mol L- 1 ABA ( Abscisic acid)溶液中
处理 2、4、8、12、24 h; 对于 SA 和 MeJA 处理,分别
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第 4期 杨冬梅等:东方山羊豆 4香豆酸:辅酶 A连接酶( 4CL)基因的克隆和荧光定量表达分析
用 200 mol L- 1 SA( Salicylic acid)和 100 mo l
L- 1 MeJA( Methyl jasmonate)溶液喷幼苗叶片至饱
和,用保鲜膜密封处理 2、4、8、12、24 h。分别提取
叶片 RNA。按照 1. 2. 4的方法对各胁迫处理不同
时间下东方山羊豆 4CL 基因的表达进行定量分析。
2 结果与分析
2. 1 东方山羊豆 4CL 基因的克隆
利用简并引物 4CL-DF、4CL-DR, 以东方山羊
豆的 cDNA 为模板, 扩增得到 564 bp 的目的片段
(图 1)。Blast 比对分析, 发现此片段与已报道的
4CL 基因家族的保守区有较高的相似性,其中与紫
穗槐的一致性达 86. 23%, 初步确定获得的 cDNA
片段是东方山羊豆 4CL 基因的片段。
图 1 保守区扩增片段
Fig. 1 The results of the conserved domain of Go4CL gene
根据得到的保守区序列设计 3、5GSP 引物,
采用 RACE 技术结合 RT-PCR方法, 克隆出 4 CL
基因 3RACE 和 5RACE 末端序列。测序结果显
示 3和 5端片段的长度分别为 848 bp和 1164 bp
(图 2,图 3) ,将 3和5端片段进行拼接, 去掉重叠部
分和 U PM , 得到全长序列为 1916 bp,将该基因命
名为 Go4CL , GenBank登录号为 GU181284。
图 2 3RACE扩增片段
F ig . 2 T he results of 3 RACE of Go4CL gene
图 3 5RACE扩增片段
Fig . 3 The results o f 5 RACE of Go4 CL gene
2. 2 Go4CL 基因的生物信息学分析
利用DNAStar 软件对 Go4CL 基因 cDNA 序列
进行分析,该基因全长 1916 bp,包括 78 bp 的 5非
编码区( 5U TR) , 185 bp的 3非编码区( 3U TR)和
一个完整的开放阅读框( ORF) 1653 bp, 该 ORF 编
码 530个氨基酸 (图 4)。氨基酸序列分析表明:
Go4CL 基因编码蛋白分子量为 60. 448 KDa, 等电
点为 5. 597; 利用 ScanPr osite 服务器 ( ht tp: / /
www . expasy. org / tools/ scanprosite/ ) 对 Go4CL
基因编码蛋白进行功能预测表明: 该蛋白含一个
AMP-binding 保守结构域 LPYSSGT TGLPK ( 193-
204 bp) 和一个催化活化中心 GEICIRG ( 393-399
bp)。将 cDNA 全长序列与其他物种的同源序列进
行 Blast 比对表明: Go4CL 与紫穗槐、大豆、蓖麻
( Ricinus communis )、银合欢( L eucaena leucocephala)、
毛果杨( Populus tri chocarpa)的 4CL 基因序列有较
高相似性,分别为 86%、84%、83%、82%、82%。
2. 3 东方山羊豆与其他物种 4CL 蛋白的进化关系
选取一些有代表性植物的 4 CL 蛋白进行同源
进化比对,构建进化树(图 5)。结果表明, 东方山羊
豆与紫穗槐、大豆 4CL 蛋白的亲缘关系最近。而与
玉米( Zea may s )、烟草 ( N icotiana tabacum )、银合
欢( L eucaena leucocep hala )的亲缘关系较远。
2. 4 Go4CL 基因的组织特异性表达
运用 Rea-l T ime PCR, 根据得到的 Ct 值, 利用
Livak KJ 和 Schm it tgen TD [ 16] 报道的方法, 即
2
- Ct方法分析计算 Go4CL 基因在根、茎、叶相对表
达量。根据定义, 对照样本中 Ct= 0, 其目标基
因表达量为 20 = 1,即对照样本中基因表达量的倍
数变化为 1。2- Ct代表目标基因在其他样本中相
对于对照样本基因表达量的倍数差异。数据分析使
用以下公式:
Ct= ( CtTarget- CtActin ) - ( Ct Target- CtA ctin ) CK
535
草 地 学 报 第 18卷536
第 4期 杨冬梅等:东方山羊豆 4香豆酸:辅酶 A连接酶( 4CL)基因的克隆和荧光定量表达分析
以东方山羊豆根中 4CL 基因的表达量为对照,
分析茎、叶相对于根中 4CL 基因表达量的倍数差
异,结果显示东方山羊豆 4CL 基因在根、茎、叶中均
有表达,在根中表达量最高,茎次之,叶中表达量最
少(图 6)。
图 6 东方山羊豆 4 CL 基因的组织表达特异性
Fig. 6 The organ- specific expression pattern of the Go4CL gene
2. 5 Go4CL 基因逆境胁迫下的表达模式
以未做处理的东方山羊豆叶片作为对照, 分析
不同处理在 2 h、4 h、8 h、12 h、24 h时, Go4CL 的表
达差异。结果表明: Go4CL 受 ABA 诱导表达上调,
8 h 达到最高峰, 为对照的 6. 58 倍, 24 h 达到第 2
次高峰,为对照组的 4. 37倍; Go4CL 受 MeJA 诱导
表达上调, 在2~ 24 h 其表达量一直维持在对照组
的 2- 3倍; Go4CL 在 SA 诱导初期表达迅速上调,
但随着时间的延长, 其表达量持续下降,到 24 h时,
其表达量在对照水平之下; Go4CL 在 PEG 处理后
表达上调,在2 h达到第一次高峰, 为对照组的3. 57
倍,随后基因的表达量逐渐下降, 在 12 h 达到最低
点,为对照组的 1. 27 倍, 24 h 时基因表达量又有明
显上调,为对照组的 1. 96倍(图 7)。
3 讨论
通过 Go4CL 基因全长 cDNA 序列与其他物种
的同源序列进行 Blast 比对, Go4CL 与紫穗槐、大豆
4CL 基因有很高的同源性。氨基酸序列分析表明
其含有预测的 Amp-binding 保守结构域 LPYSS-
GTT GLPK 和催化活化中心 GEICIRG, 目前在所
有已知的 4CL 蛋白序列中这 2段序列几乎绝对保
守,而且催化活化中心的 C残基被认为直接参与催
化活化反应[ 17] 。Hu等 [ 18]研究发现杨树 4 CL 基因
家族中,只有具有这 2个保守结构域的 4CL 基因才
能够调控木质素的合成,而家族的其他成员可能参
与其他次生代谢物质如黄酮类物质的合成。因此可
以证明本研究中所克隆的Go4CL 是 4香豆酸辅酶
A连接酶基因,并对东方山羊豆木质素的合成能够起
到调控作用。
本研究利用Rea-l T ime PCR方法检测了Go4CL 在
东方山羊豆中的组织表达特异性。Go4CL 基因在根、
茎、叶中均有表达,在根中表达量最高,在叶片中表达
量最少。而在前人的报道中,烟草的 4CL 基因在衰老
的茎部表达最强[ 19]。拟南芥木质素在种子萌发后 2-
3 d就在子叶和根部开始沉积, 此时 4CL 的表达也与
木质素的积累相一致,而在成熟植物中,木质素大量积累
的茎秆部表达最强[ 20]。
图 7 Go4CL 在模拟胁迫下的表达模式分析 ( A) ABA; ( B) MeJA; ( C) SA; (D) PEG
F ig. 7 Expression pat tern of Go4CL in r esponse to va rious simulat ive stresses: ( A) ABA ; ( B) MeJA ; ( C) SA ; ( D) PEG
537
草 地 学 报 第 18卷
Go4CL 在受到 PEG 模拟干旱胁迫诱导后增强
表达,多种激素也诱导该基因增强表达。由于 A BA
是植物系统抗性的重要介导信号, SA 是传导植物
抗病反应的重要信号物质, MeJA 是介导植物机械
伤害反应的重要信号物质, 同时也是植物抗病诱导
的介导信号,因此说明在植物受到干旱、病菌侵袭、
机械伤害等胁迫时, 4CL 基因在抗逆调控途径中起
到一定调控作用。并且, 已有报道发现大豆 4CL 基
因对抵御大豆疫霉根腐病病原体侵袭具有明显的应
答效应[ 21]。Bahr am 等[ 22 ] 发现拟南芥在受到持续
机械伤害时, 4CL 基因表达量会迅速增加并能维持
12 h,之后其表达量才逐渐下降。然而对于 4CL 基
因对植物抗逆性的调控机理, 在以前的研究中未见
详细报道。本实验将继续进行转基因的研究, 控制
4CL 基因在东方山羊豆中继续的表达量,进一步改
善东方山羊豆的抗性和品质。
4 结论
获得的 Go4CL 的全长 cDNA 序列与近缘物种
4CL 基因同源性很高, 并且含有 4CL 基因特有的
保守结构域,确定 Go4CL 是东方山羊豆4CL 基因,
并能调控木质素的合成。
利用 Rea-l T ime PCR 方法研究 Go4 CL 的组织
表达特异性,发现其在根中表达量最高, 茎次之, 叶
中最少。
在逆境条件下, Go4CL 基因的表达量都有不同
程度的增加,说明 Go4CL 基因在东方山羊豆抵御逆
境胁迫起到一定的调控作用。为今后进行东方山羊
豆的抗性和品质改良奠定基础。
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(责任编辑 李 扬)
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