全 文 ：书生防木霉对草坪土壤微生物区系的
影响及定殖能力研究
古丽君，徐秉良，梁巧兰，尹婷
（甘肃农业大学草业学院 草业生态系统教育部重点实验室 甘肃省草业工程实验室
中美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州７３００７０）
摘要：为了筛选出适宜培养土壤细菌、真菌、放线菌的定向选择性培养基，对１９种培养基进行了比较试验，筛选出
的优良培养基分别为牛肉膏蛋白胨培养基＋甲霜· 霜霉、马丁氏培养基＋１ｍＬ１‰孟加拉红、高氏１号培养基＋
重铬酸钾０．１ｇ。将生防木霉施入草坪土壤中，测定了其对土壤中细菌、放线菌、真菌３种微生物数量的影响。结
果表明，施入深绿木霉菌后能够明显引起微生物群落结构发生改变。施入深绿木霉１７ｄ后，真菌的数量比对照减
少了４００１ｃｆｕ／ｇ；土壤中细菌的数量增加了１．２７×１０１０ｃｆｕ／ｇ；放线菌数量没有明显变化。定殖测定试验结果表
明，木霉在施入草坪草土壤１个月后能够很好的定殖。木霉在施入２５ｄ时，相对含量达到最低，但是３０ｄ以后木
霉的含量略有所上升，并基本保持稳定。
关键词：深绿木霉；真菌；细菌；放线菌；定殖
中图分类号：Ｓ８１２．２；Ｓ１５４．３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１３）０３０３２１０６
犇犗犐：１０．１１６８６／ｃｙｘｂ２０１３０３４１
土壤微生物是土壤生态系统的主要组成部分，其多样性与土壤肥力［１４］、土传病害密切相关［５］。土壤微生物
群落结构越稳定、物种越均匀、多样性越高，对抗病原菌的综合能力越强［６］。由于化学农药的残留对土壤环境的
破坏、对人体带来的副作用及病原菌抗药性的日益明显，利用木霉菌作为生物杀菌剂的研究引起了世界各国的广
泛兴趣。２０世纪８０年代以来，利用木霉进行生物防治的研究取得重大进展［７］，其作用机理主要是：抗菌、溶解、
竞争、重寄生和促进植物的生长［８］。近十年的统计资料表明，包括美国、英国、德国等２５个发达或较发达国家的
植物病害生物防治研究课题中，３４％是关于木霉的研究。一般研究均肯定木霉菌的防治效果。木霉可抑制多种
植物真菌病，至目前报道约２９种菌，研究最多的是灰霉菌、腐霉菌、丝核菌、炭疽菌、镰刀菌［９］。因此，深入研究木
霉菌施入土壤后对土壤中细菌、真菌和放线菌数量的影响，以及生防木霉在土壤中的定殖能力，为木霉的生物防
治提供理论依据，同时对促进农业生产具有重要意义。
１ 材料与方法
１．１ 供试菌株
深绿木霉（犜狉犻犮犺狅犱犲狉犿犪犪狌狉犲狅狏犻狉犻犱犲）由甘肃农业大学植物病理实验室筛选保存。将保存的深绿木霉Ｔ２菌
株在ＰＤＡ平板上活化３次，然后配成１×１０７ 个／ｍＬ的孢子悬浮液备用。
１．２ 土样采集
２００９年９月１１日在甘肃农业大学草坪草地采集土样，每个样地分别选取３个样点，在每个样点（１ｍ×１ｍ）
按五点取样法取深度０～１５ｃｍ的土样。装袋密封带回实验室，将土样利用四分法充分混匀，分别称取４００ｇ装
入２个浅盘中，将１×１０７ 个／ｍＬ孢子悬浮液１００ｍＬ施入其中一个浅盘中，另外一个撒等量清水做为对照，置于
２５℃下保湿培养。
第２２卷 第３期
Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．３
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
３２１－３２６
２０１３年６月
收稿日期：２０１１１２３０；改回日期：２０１２０５１５
基金项目：草业生态系统教育部省部共建重点实验室项目（ＣＹＧＧ２００６０１３），甘肃省农牧厅生物技术专项（ＧＮＳＷ２００９０４）和甘肃省教育厅项
目资助。
作者简介：古丽君（１９８４），女，河北南宫人，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｇｌｊ１９８４０４２７＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｘｕｂｌ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
１．３ 土壤悬浮液制备
称取施入深绿木霉孢子悬浮液３ｄ的土样和对照土样各１０ｇ置于装有９０ｍＬ无菌水和少许玻璃珠的三角
瓶中，在振荡器上以２００ｒ／ｍｉｎ振荡２０ｍｉｎ，配制成１０－１悬液，静置２ｍｉｎ［１０］，用无菌的移液管吸取１ｍＬ，加入到
９ｍＬ无菌水中即为１０－２稀释液，如此重复，可依次制成１０－３～１０－７的稀释液。
１．４ 培养基的筛选
１．４．１ 细菌培养基的筛选 酵母膏１０ｇ，葡萄糖１００ｇ，琼脂１５ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ，ｐＨ６．８（Ｂ１培养基）；牛肉
膏３ｇ，酵母膏１ｇ，蛋白胨５ｇ，葡萄糖１０ｇ，琼脂１５ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ，ｐＨ６．８～７．０（Ｂ２培养基）；牛肉膏蛋白
胨培养基（Ｂ３培养基）［１０］；牛肉膏蛋白胨培养基中去除ＮａＣｌ（Ｂ４培养基）；在Ｂ４培养基基础上临用时加入２５％
甲霜· 霜霉１．２５ｇ，ｐＨ６．８～７．０配制成Ｂ５培养基。
１．４．２ 真菌培养基筛选 马丁氏培养基（Ｆ１）：ＫＨ２ＰＯ４１．０ｇ；ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．５ｇ；蛋白胨５ｇ；葡萄糖１０ｇ；
琼脂１５～２０ｇ；蒸馏水１０００ｍＬ；加热沸腾时加１％孟加拉红水溶液３．３ｍＬ，临用时每１０００ｍＬ培养基中加
１％链霉素３ｍＬ［１１］。加热沸腾时分别加入１％孟加拉红水溶液２．０，１．０，０．５，０．４，０．３，０．２，０．１ｍＬ，配制成Ｆ２，
Ｆ３，Ｆ４，Ｆ５，Ｆ６，Ｆ７，Ｆ８培养基。
１．４．３ 放线菌培养基筛选 高氏一号培养基（Ａ１）［１２］，临用时在高氏一号培养基基础上分别加入重铬酸钾
０．３０，０．２５，０．２０，０．１５，０．１０ｇ，配制成Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６培养基。
１．５ 土壤微生物分离、培养和菌落计数
微生物数量采用稀释涂布平板法计数［１３］，细菌、真菌、放线菌的培养分别取１０－７，１０－１，１０－２的土壤悬浮液
５０μＬ，采用倾注法加入对应的培养基中，每个处理８次重复。于２５℃ 恒温培养箱中倒置培养，细菌培养３～４ｄ，
真菌培养３～５ｄ，放线菌培养５～７ｄ。
依照以上方法分别统计施入深绿木霉孢子悬浮液５，８，１１，１４，１７ｄ后土样中微生物的数量变化情况，每次制
备土壤悬浮液同时用烘干法进行土壤含水量测定［１４］，最后计算菌落数，计算公式为：
菌落数（ｃｆｕ／ｇ干土）＝每个皿菌落平均值×稀释倍数×２０×水分系数［１５］
１．６ 木霉施入草坪草土壤后的定殖力测定
按照１．２的方法将制得的木霉菌发酵液（１×１０７ 个／ｍＬ）接种于草坪草土壤中，并于接种后５，１０，１５，２０，
２５，３０和３５ｄ取１０ｇ土样配制成１０－１的土壤悬浮液１０μＬ，加入木霉选择性培养基中
［１６］，采用稀释涂布平板法
计数，２８℃培养３ｄ，测定木霉菌落数。
木霉选择性培养基配方：ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．２ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４０．９ｇ，ＫＣｌ０．１５ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４１．０ｇ，葡萄糖３．０
ｇ，玫瑰红（四氯四碘萤素钠盐，Ｃ２０Ｈ２Ｏ５Ｃｌ４Ｉ４Ｎａ２）０．０３３ｇ，琼脂粉２０ｇ，五氯硝基苯（７５％可湿性粉剂）０．２ｇ，
Ｈ２Ｏ１０００ｍＬ，ｐＨ６．０（灭菌前调节）。五氯硝基苯在培养基冷却至４５℃左右时，于倒平板前加入到三角瓶中，
并充分摇匀。
２ 结果与分析
２．１ 培养基的筛选结果
２．１．１ 细菌培养基的筛选 加入广谱性杀菌剂２５％甲霜·霜霉的Ｂ５培养基可抑制真菌的生长，细菌生长良好
（表１），其余４种培养基中有真菌生长，影响细菌的生长和计数，所以采用Ｂ５培养基。
２．１．２ 真菌培养基的筛选 真菌培养基的设计主要是加入孟加拉红水溶液的浓度和用量不同，当加入的孟加拉
红水溶液的浓度和用量分别为１‰和１ｍＬ时，真菌菌落的生长情况良好，且数量适宜，同时也没有其他杂菌的污
染，即真菌培养基Ｆ８效果最好，其他培养基无真菌生长。
２．１．３ 放线菌培养基的筛选 高氏一号培养基中有真菌和细菌的生长，改良高氏一号培养基中加入重铬酸钾，
可以抑制其他杂菌的生长，但Ａ２、Ａ３两种培养基中重铬酸钾的用量过大，平板上没有放线菌菌落出现，Ａ４、Ａ５
两种培养基平板上出现的菌落极为稀少，只有在加入量为０．１ｇ时效果最好，即放线菌 Ａ６培养基的效果最好
（表２）。
２２３ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．３
表１ 细菌培养基的筛选结果
犜犪犫犾犲１ 犛犮狉犲犲狀犻狀犵狉犲狊狌犾狋狊狅犳犫犪犮狋犲狉犻犪犮狌犾狋狌狉犲犿犲犱犻狌犿
培养基Ｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ 细菌总数Ｔｏｔａｌｂａｃｔｅｒｉａ（ｃｆｕ／ｇ） 生长情况Ｇｒｏｗｔｈｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
Ｂ１ １．１７８６×１０１０ 生长细菌的同时，有真菌生长，无法准确计数。Ｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｂａｃｔｅｒｉａａｔｔｈｅｓａｍｅ
ｔｉｍｅ，ｔｈｅｒｅｉｓｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｆｕｎｇｉ，ｕｎａｂｌｅｔｏａｃｃｕｒａｔｅｌｙｃｏｕｎｔ．
Ｂ２ １．０４１４×１０１０ 生长细菌的同时，生长大量的真菌，无法准确计数。Ｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｂａｃｔｅｒｉａａｔｔｈｅ
ｓａｍｅｔｉｍｅ，ｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆａｌａｒｇｅｎｕｍｂｅｒｏｆｆｕｎｇｉ，ｕｎａｂｌｅｔｏａｃｃｕｒａｔｅｌｙｃｏｕｎｔ．
Ｂ３ １．６４０４×１０１０ 生长细菌的同时，生长少量的真菌，无法准确计数。Ｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｂａｃｔｅｒｉａａｔｔｈｅ
ｓａｍｅｔｉｍｅ，ｔｈｅｇｒｏｗｔｈａｍｏｕｎｔｏｆｆｕｎｇｉ，ｕｎａｂｌｅｔｏａｃｃｕｒａｔｅｌｙｃｏｕｎｔ．
Ｂ４ １．５４９６×１０１０ 生长细菌的同时，生长少量的真菌，无法准确计数。Ｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｂａｃｔｅｒｉａａｔｔｈｅ
ｓａｍｅｔｉｍｅ，ｔｈｅｇｒｏｗｔｈａｍｏｕｎｔｏｆｆｕｎｇｉ，ｕｎａｂｌｅｔｏａｃｃｕｒａｔｅｌｙｃｏｕｎｔ．
Ｂ５ ２．３７８５×１０１０ 无真菌等其它杂菌生长，计数准确。Ｎｏｆｕｎｇｉａｎｄｏｔｈｅｒｂａｃｔｅｒｉａ，ａｃｃｕｒａｔｅｃｏｕｎｔｉｎｇ．
表２ 放线菌培养基的筛选结果
犜犪犫犾犲２ 犛犮狉犲犲狀犻狀犵狉犲狊狌犾狋狊狅犳犪犮狋犻狀狅犿狔犮犲狋犲狊犮狌犾狋狌狉犲犿犲犱犻狌犿
培养基Ｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ 放线菌总数Ｔｏｔａｌａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ（ｃｆｕ／ｇ） 生长情况Ｇｒｏｗｔｈｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
Ａ１ １３７５８ 除放线菌外还有真菌和细菌的生长，无法准确计数。Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎｔｏａｃｔｉｎｏｍｙ
ｃｅｔｅｓａｎｄｆｕｎｇｉａｎｄｂａｃｔｅｒｉａｇｒｏｗｔｈ，ｕｎａｂｌｅｔｏａｃｃｕｒａｔｅｌｙｃｏｕｎｔ．
Ａ２ ０ 无任何菌落生长。Ｎｏｃｏｌｏｎｙｇｒｏｗｔｈ．
Ａ３ ０ 无任何菌落生长。Ｎｏｃｏｌｏｎｙｇｒｏｗｔｈ．
Ａ４ １６０３７ 有放线菌生长，但是数量较少，部分放线菌被抑制。Ｗｉｔｈｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆａｃｔｉ
ｎｏｍｙｃｅｔｅｓ，ｂｕｔｔｈｅｑｕａｎｔｉｔｙｉｓｌｅｓｓ，ｐａｒｔｏｆａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓｗｅｒｅｉｎｈｉｂｉｔｅｄ．
Ａ５ ４３８６０ 有放线菌生长，但是数量较少，部分放线菌被抑制。Ｗｉｔｈｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆａｃｔｉ
ｎｏｍｙｃｅｔｅｓ，ｂｕｔｔｈｅｑｕａｎｔｉｔｙｉｓｌｅｓｓ，ｐａｒｔｏｆａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓｗｅｒｅｉｎｈｉｂｉｔｅｄ．
Ａ６ ２２２９６９ 放线菌生长良好，且无其它杂菌生长，计数准确。Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓｇｒｅｗｗｅｌ，
ａｎｄｎｏｏｔｈｅｒｂａｃｔｅｒｉａｆｒｏｍｇｒｏｗｉｎｇ，ａｃｃｕｒａｔｅｃｏｕｎｔｉｎ．
２．２ 深绿木霉施入对土壤微生物区系的影响
２．２．１ 深绿木霉施入后土壤中细菌的动态变化 草坪禾草土壤中施入深绿木霉使土壤中细菌数量的增长有减
缓的趋势。对照说明当草坪禾草土壤在适合的温湿条件下，土壤细菌繁殖速度明显加快；施入深绿木霉１７ｄ后，
细菌的数量与对照土壤细菌的数量有很大的差距，对照数量达到１．４５×１０１１ｃｆｕ／ｇ，而施入深绿木霉的土壤中细
菌的数量仅为１．９６×１０１０ｃｆｕ／ｇ；施入深绿木霉后，木霉菌对土壤细菌的繁殖有明显的抑制作用，但是缓慢增长
（图１）。
２．２．２ 深绿木霉施入后土壤中真菌的动态变化 草坪禾草土壤中施入深绿木霉对土壤中真菌数量有明显的影
响。施入深绿木霉５ｄ时，土壤真菌（除木霉菌外）的数量就有减少的趋势，未施入深绿木霉的土壤中的真菌数量
则有所上升；培养１１ｄ后，对照土壤中真菌数量的增长有减缓的趋势，而施入深绿木霉的土壤中真菌（除木霉菌
外）的数量依然在下降；深绿木霉对土壤真菌的生长有强烈的抑制作用（图２）。
２．２．３ 深绿木霉施入后土壤中放线菌的动态变化 深绿木霉对草坪禾草土壤中放线菌的数量变化没有明显的
影响。施入深绿木霉后，土壤放线菌的数量呈波浪式缓慢上升，而对照则呈平稳式逐渐上升，两者在数量上并无
显著差异（图３）。
２．３ 深绿木霉在土壤中的定殖能力
木霉在２０ｄ之前仍有大量孢子存在。木霉在施入后５ｄ，为不施入木霉空白对照的２６倍。定期取样检测菌
落形成单位数随着时间的延长，数量逐渐下降，２０ｄ时仍然为空白对照的９．１３倍。施入２５ｄ时，木霉的相对含
３２３第２２卷第３期 草业学报２０１３年
量为２．５６×１０４ｃｆｕ／ｇ，达到最低，但是３０ｄ以后木霉的含量略有所上升，并基本保持稳定。木霉能够在施入１个
月之后很好的定殖在草坪草土壤中（图４）。
图１ 深绿木霉的施入对细菌数量的影响
犉犻犵．１ 犈犳犳犲犮狋狅犳犜．犪狌狉犲狅狏犻狉犻犱犲狅狀犫犪犮狋犲狉犻犪犾狆狅狆狌犾犪狋犻狅狀
图２ 深绿木霉的施入对真菌数量的影响
犉犻犵．２ 犈犳犳犲犮狋狅犳犜．犪狌狉犲狅狏犻狉犻犱犲狅狀犳狌狀犵犻狆狅狆狌犾犪狋犻狅狀
图３ 深绿木霉的施入对放线菌数量的影响
犉犻犵．３ 犈犳犳犲犮狋狅犳犜．犪狌狉犲狅狏犻狉犻犱犲狅狀犪犮狋犻狀狅犿狔犮犲狋犲狊狆狅狆狌犾犪狋犻狅狀
图４ 深绿木霉在草坪草土壤中的定殖能力
犉犻犵．４ 犆狅犾狅狀犻狕犪狋犻狅狀犪犫犻犾犻狋犻犲狊狅犳犜．犪狌狉犲狅狏犻狉犻犱犲
３ 结论与讨论
土壤细菌、真菌和放线菌是土壤三大类微生物种群，可以反映土壤微生物总量，因此，筛选能够准确反映各类
微生物数量的培养基具有重要意义。本试验筛选出了适宜培养土壤细菌、真菌、放线菌的定向选择培养基。细菌
培养基为Ｂ５（牛肉膏蛋白胨培养基＋甲霜· 霜霉），可以有效地抑制真菌的生长，计数准确，分离的细菌数量达
２．３８×１０１０ｃｆｕ／ｇ；放线菌培养基为 Ａ６（高氏１号培养基＋０．１ｇ重铬酸钾），放线菌生长良好，达２．２３×１０５
ｃｆｕ／ｇ，优于贾学文等［１７］筛选出的最佳细菌培养基ＳＡＢＡ和放线菌培养基ＳＧＥＡ。
土壤中细菌、放线菌数量增加，真菌数量降低，有利于植物生长［１８］，马建华等［１９］报道秸秆生物反应堆处理土
壤，微生物结构由易发病的真菌型向有利于植物生长的细菌型转变。土壤中施入深绿木霉后放线菌数量呈波浪
式缓慢上升，细菌的增长速度减慢，而真菌数量显著降低。细菌数量有所增长，但速度较对照缓慢，产生该结果的
原因，可能是深绿木霉施入初期，大量的木霉菌侵占了有限的空间，同时也和细菌竞争有限的资源。放线菌最突
出的特征是使土壤具有拮抗能力［２０］。深绿木霉对放线菌数量的变化影响不大，不会破坏土壤自身的拮抗作用。
有许多土壤真菌是重要的植物病原菌［２１］，深绿木霉的施入降低了土壤中真菌的数量，则意味着深绿木霉不仅可
以防治草坪草根腐病［９］，同时也可以降低其他真菌病害侵染的机率。土壤中有益微生物和有害微生物数量上的
变化，还有待更详细的研究。
４２３ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．３
定殖能力是反映生防菌在土壤中存活状况、群体数量和能否很好发挥生防作用的一个较好的指标。木霉菌
株施入草坪草土壤后，随着时间的延长，数量逐渐下降。但即使在施入２０ｄ后，木霉菌数量仍为对照土中的９．１３
倍，３０ｄ后木霉的数量趋于稳定，表明木霉菌株在土壤中有很强的定殖能力。然而，从对照来看，土壤中也有相
当数量的木霉菌，因此，本研究所测得的定殖能力只是相对定殖能力，而不是绝对的定殖能力。
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５２３第２２卷第３期 草业学报２０１３年
犐犿狆犪犮狋犪狀犱犮狅犾狅狀犻狊犪狋犻狅狀犪犫犻犾犻狋狔狅犳犜狉犻犮犺狅犱犲狉犿犪犫犻狅犮狅狀狋狉狅犾狅狀犾犪狑狀狊狅犻犾犿犻犮狉狅犳犾狅狉犪
ＧＵＬｉｊｕｎ，ＸＵＢｉｎｇｌｉａｎｇ，ＬＩＮＧＱｉａｏｌａｎ，ＹＩＮＴｉｎｇ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＧｒａｓｓｌａｎｄＳｃｉｅｎｃｅ，ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＧｒａｓｓｌａｎｄＥｃｏｓｙｓｔｅｍ，
ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＧａｎｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅ，ＳｉｎｏＵ．Ｓ．
ＣｅｎｔｅｒｓｆｏｒＧｒａｚｉｎｇｌａｎｄＥｃｏｓｙｓｔｅｍＳｕｓｔａｉｎａｂｉｌｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ）
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６２３ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．３