全 文 ：书木聚糖酶对肉仔鸡后肠道微生物的影响
高俊勤１，江芸２，３，张耀１，高峰１，３，周光宏３，朱伟云１
（１．南京农业大学动物科技学院，江苏 南京２１００９５；２．南京师范大学金陵女子学院，江苏 南京２１００９７；
３．教育部肉品加工与质量控制重点开放实验室，江苏 南京２１００９５）
摘要：主要研究了小麦基础日粮添加木聚糖酶对肉仔鸡后肠道微生物的影响。将１２０只７日龄肉仔鸡分成２组，日
粮分别添加０，０．１％木聚糖酶，饲喂至２１日龄，研究木聚糖酶对肉仔鸡后肠道菌群数量变化的影响。结果表明，加
酶未使回肠和盲肠乳酸杆菌、双歧杆菌和大肠杆菌数量发生显著变化。利用变性梯度凝胶电泳技术研究了木聚糖
酶对肉仔鸡后肠细菌群体的影响。结果表明，加酶组回肠和盲肠的图谱比对照组条带相对较多，但差异不显著；组
内个体间的图谱相似性比组间的相似性相对较大。木聚糖酶影响肉仔鸡后肠微生物数量和种群的作用效果不明
显。
关键词：木聚糖酶；肉仔鸡；微生物；变性梯度凝胶电泳
中图分类号：Ｓ８３１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２００８）０５０１０４０７
小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）等谷物作为家禽饲料，由于含有较多的抗营养因子（水溶性非淀粉多糖，小麦中以
阿拉伯木聚糖为主）妨碍其消化吸收，造成家禽饲料利用率降低、生长受阻以及排泄粘粪、污染环境等问题［１］，从
而限制了其在家禽饲料中的广泛应用。有研究显示，应用非淀粉多糖酶制剂（如木聚糖酶）添加于麦类基础日粮，
可以防止或减轻其对家禽的上述不良效应［２］。有关酶制剂的作用机理，一般认为日粮添加的酶制剂可以破解植
物细胞壁，消除抗营养因子，降低食糜粘度，补充单胃动物内源酶的不足，从而改善消化机能，促进动物生长［３］。
肠道微生物菌群是所有动物消化系统的一个重要组成部分。微生物菌群的分布决定了代谢过程的范围，微
生物菌群的总量决定了这些代谢过程的程度，微生物菌群的数量非常依赖于日粮作为最终代谢底物的来源［４］。
因此，日粮成分和营养浓度的变化对肠道微生物菌群的数量和种类具有显著的影响［５］，相应地会影响到肠道对营
养物质消化吸收能力。外源性酶制剂通常能改善营养物质的消化率，从而改变肠道食糜的物理化学状态，肠道菌
群也可能会发生相应的变化。动物肠道微生物是一个极其复杂的生物群体，肠道菌群分析所采用的传统细菌培
养或显微观察法有一定的局限性，因为肠道微生物有９０％以上是专性厌氧菌，它们对氧的苛求、对特殊营养的要
求以及与宿主的密切关系使得能在试验室条件下被分离纯化出来的细菌只占极少部分，而约有６０％～８０％的细
菌是培养不出来的［６］，因此人们对肠道及粪样微生物的变化规律研究认识很少。近年来，随着１６ＳｒＤＮＡ或
ｒＲＮＡ分子生物学技术的发展，尤其是变性梯度凝胶电泳技术（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，
ＤＧＧＥ），因能有效分析复杂微生物群落及其多样性且无需培养微生物，而越来越受到重视，使肠道微生态的研究
获得了新的进展［７］。目前有关酶制剂对家禽肠道微生物区系的影响研究，尤其是利用ＤＧＧＥ技术研究酶制剂对
肉仔鸡后肠微生物的影响还少见报道。本研究主要研究小麦基础日粮添加木聚糖酶对肉仔鸡后肠道微生物菌群
数量的影响，并利用ＤＧＧＥ技术观察肠道微生物种类变化，为揭示木聚糖酶作用机理提供基础资料。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
小麦购自南京麒麟镇粮管所，所用酶制剂为木聚糖酶单体酶，实际测定的木聚糖酶活性为３８００Ｕ／ｇ（酶活
单位：在４０℃，ｐＨ值５．３的条件下，每ｍｉｎ从１０ｍｇ／ｍＬ的燕麦木聚糖底物溶液中释放出１μｍｏｌ还原糖的酶量
为１Ｕ）。
１０４－１１０
１０／２００８
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第１７卷 第５期
Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．５
收稿日期：２００７０７１２；改回日期：２００８０４０７
基金项目：国家自然科学基金项目（３０３００２５１）资助。
作者简介：高俊勤（１９８３），女，河南新郑人，硕士。
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｇａｏｆｅｎｇ０６２９＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
１．２ 试验动物
选购１日龄健康ＡＡ肉鸡１５０羽，购自安徽芜
湖和威集团。
１．３ 基础日粮
试验用基础日粮为小麦基础日粮，其组成及营
养水平见表１。
１．４ 试验设计
将７日龄健康、体重基本一致的肉仔鸡１２０羽，
随机分成２组，即小麦基础日粮对照组和基础日粮
添加０．１％木聚糖酶的加酶处理组。每组６个重
复，每个重复１０羽，分别饲养在１只小笼中。
１．５ 饲养试验
表１ 基础日粮组成及营养水平
犜犪犫犾犲１ 犆狅犿狆狅狊犻狋犻狅狀狅犳犫犪狊犪犾犱犻犲狋狊
犪狀犱狀狌狋狉犻犲狀狋狊犾犲狏犲犾
日粮组成
Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ
含量
Ｃｏｎｔｅｎｔ
营养水平
Ｎｕｔｒｉｅｎｔｌｅｖｅｌｓ
含量
Ｃｏｎｔｅｎｔ
小麦犜．犪犲狊狋犻狏狌犿（％） ５７．１ 代谢能 ＭＥ（ＭＪ／ｋｇ） １１．４
玉米犣犲犪犿犪狔狊（％） ８．４ 粗蛋白Ｃｒｕｄｅｐｒｏｔｅｉｎ（％） ２２．５
豆粕Ｓｏｙｂｅａｎｍｅａｌ（％）２９．５ 钙Ｃａｌｃｉｕｍ（％） １．１
预混料Ｐｒｅｍｉｘ（％） ５．０ 有效磷 Ａｖａｉｌａｂｌｅｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ（％）０．５
赖氨酸Ｌｙｓｉｎｅ（％） １．１
蛋氨酸 Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ（％） ０．５
预混料含Ｃａ、Ｐ、Ｎａ、Ｃｌ等常量元素、微量元素、氨基酸和维生素。
Ｐｒｅｍｉｘｃｏｎｔａｉｎｓｍｉｎｅｒａｌｓ，ａｍｉｎｏａｃｉｄｓａｎｄｖｉｔａｍｉｎｓ．
１～７日龄肉仔鸡饲喂前期商品料，７～２１日龄分别饲喂基础日粮和加酶日粮，饲料为粉料，在温控房间进行
笼养，鸡只自由采食、饮水，２４ｈ光照，并进行常规免疫接种。
１．６ 样品采集
２１日龄时每组每个重复取１只鸡（共６只），立即致死，剖开腹腔，取回肠和盲肠并结扎端口，放入经过灭菌
的离心管内，用于肠道细菌培养。每组另取６个重复中的任意４个重复，每个重复取１只（共４只）宰杀，取回肠
和盲肠食糜放入灭菌的离心管内，－２０℃冰箱保存，用于ＤＧＧＥ测定。
１．７ 样品测定及方法
１．７．１ 细菌培养 回肠和盲肠转移至无菌台，用剪刀轻轻剪开肠壁，用玻璃棒刮取肠道食糜０．５ｇ，放入１０倍的
无菌稀释液中，剧烈振荡混匀，取稀释液进行１０倍的倍比稀释。大肠杆菌接种于麦康凯培养皿上，乳酸杆菌接种
于 ＭＲＳ（ｍａｎｒｏｇｏｓａｓｈａｒｐｅ）培养基上，有氧条件下培养２４ｈ。双歧杆菌接种于ＢＳ（ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｅｌｅｃｔｉｖｅ）
培养基上，厌氧条件培养４８ｈ。以５０～１５０个菌落的平板稀释度计数。细菌数量采用平板菌落记数法进行统计，
数据用１ｇ肠道内容物中菌落总数（ｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔｓ，ＣＦＵ）的对数表示（ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇ）［８］。
１．７．２ 肠道细菌ＤＮＡ提取和ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，多聚酶链反应）扩增 ＤＮＡ提取前，先解冻样
品，移去液相，称取０．３ｇ左右食糜。参照Ｚｏｅｔｅｎｄａｌ等［９］的方法，先用珠磨仪珠磨３ｍｉｎ破碎样品，然后用Ｔｒｉｓ
饱和酚和氯仿／异戊醇反复抽提，用乙醇沉淀ＤＮＡ，适量ＴＥ（ＴｒｉｓＨＣｌＥＤＴＡ）缓冲液溶解ＤＮＡ沉淀。取出的
ＤＮＡ在－２０℃冰箱保存。
利用１对细菌通用引物扩增１６ＳｒＤＮＡ的Ｖ６Ｖ８可变区片段［１０］。ＰＣＲ上游引物为带有ＧＣ夹子的引物Ｕ
（ｕｐｐｅｒ）９６８ＧＣ：５′ＣＧＣＣＣＧＧＧＧＣＧＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＧＧＧＧＧＧＡＡＣＧＣＧＡＡ
ＧＡＡＣＣＴＴＡＣ３′。下游引物为Ｌ（ｌｏｗｅｒ）１４０１：５′ＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣ３′。反应体系和反应条件参
照朱伟云等［１１］的方法。
ＰＣＲ反应体系：１０×缓冲液５μＬ，ｄＮＴＰ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）１μＬ，ＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）３μＬ，ＴａｑＤＮＡ聚合酶（５
Ｕ／μＬ）０．２５μＬ，ＤＮＡ模板（１～１０ｎｇ／ｍＬ）１μＬ，上下游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）１μＬ，加无菌双蒸水至５０μＬ。
ＰＣＲ反应条件：预变性９４℃，４ｍｉｎ；循环３５次（变性９４℃，２０ｓ；退火５４℃，２０ｓ；延伸７２℃，４０ｓ）；最后延伸
６８℃，７ｍｉｎ；琼脂糖凝胶电泳检测ＰＣＲ产物。
１．７．３ 变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ） ＤＧＧＥ用８％聚丙烯酰胺凝胶（含丙酰胺、二丙酰胺、尿素、甲酰胺和甘
油），其中尿素浓度梯度为３５％～６０％。电泳条件：电泳温度为６０℃，首先在２００Ｖ电压下电泳１０ｍｉｎ，然后在
８５Ｖ电压下电泳１２ｈ。电泳结束后，进行硝酸银染色，凝胶显色定影后，用扫描仪进行扫描。
１．８ 数据分析与处理
数据用ＳＰＳＳ１１．０统计软件进行统计分析，并进行Ｔｔｅｓｔ检验显著性。ＤＧＧＥ凝胶采用ｑｕａｎｔｉｔｙｏｎｅ（ｂｉｏ
５０１第１７卷第５期 草业学报２００８年
Ｒａｄ）分析软件包进行图谱的条带数和相似性分析。
２ 结果与分析
２．１ 木聚糖酶对肉仔鸡后肠道微生物数量的影响
和对照组相比，加酶使回肠双歧杆菌和大肠杆菌
数量有所增加，而使乳酸杆菌数量有所减少，但差异不
显著。和对照组相比，加酶使盲肠乳酸杆菌和双歧杆
菌的数量增加，大肠杆菌数量减少，但差异不显著（表
２）。
２．２ 木聚糖酶对肉仔鸡后肠道微生物群体的影响
图１和２分别是回肠的ＤＮＡ－ＤＧＧＥ电泳图谱
和电泳条带示意图，图中１～４泳道分别为加酶处理
组，５～８泳道为对照组。对于ＰＣＲ－ＤＧＧＥ方法来
讲，不同细菌的条带分得越开，条带数越多，越能反映
表２ 回肠和盲肠菌落总数
犜犪犫犾犲２ 犅犪犮狋犲狉犻犪犾犮狅狌狀狋狊犻狀狋犺犲犻犾犲狌犿犪狀犱犮犪犲犮犪狅犳
犫狉狅犻犾犲狉犮犺犻犮犽犲狀狊 ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇ
项目Ｉｔｅｍｓ 对照组Ｃｏｎｔｒｏｌ 处理组Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
回肠Ｉｌｅｕｍ
乳酸杆菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｕｓ ６．０４±０．４８ ５．８２±０．６２
双歧杆菌Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ５．５５±０．５２ ５．６５±０．４９
大肠杆菌Ｃｏｌｉｆｏｒｍｂａｃｔｅｒｉａ ５．０１±０．５８ ５．１６±０．７８
盲肠Ｃａｅｃａ
乳酸杆菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｕｓ ８．９２±０．５１ ９．４２±０．６６
双歧杆菌Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ８．８１±０．６７ ９．１４±０．６２
大肠杆菌Ｃｏｌｉｆｏｒｍｂａｃｔｅｒｉａ ８．５１±０．７６ ８．４４±０．７０
细菌菌群的多样性。图谱上的泳带反映了食糜中的优势菌群，泳带的数量和位置说明了细菌的多样性。本试验
中每个回肠样本经过变性梯度凝胶电泳都可以分离出数目不等的电泳条带，加酶使条带数有所增加，对照组每个
泳道平均６．２５±３．３０条，而加酶组平均１１．７５±６．７０条，但差异不显著。同时，图谱中不同泳道中既有相同的条
带，也有不同的条带，这说明２组既存在同一种菌群（即共有菌，如图中的ａ条带所代表的细菌），也有各自的特有
优势菌群。有的条带在相同位置其亮度也明显不同，条带灰度越深越亮，数量越多，说明同一种的细菌数量也存
在一定差异。
图３和４分别是盲肠的ＤＮＡ－ＤＧＧＥ电泳图谱和电泳条带示意图，图中１～４泳道分别为加酶处理组，５～８
泳道为对照组。和回肠相似，样本经过变性梯度凝胶电泳后，都可以分离出数目不等的电泳条带，但条带数增加
了许多，对照组每个泳道平均２８．７５±２．５０条，加酶组平均３１．００±１．４１条，但差异不显著，这说明盲肠中优势菌
群的种类相对较回肠多，同样，两组之间既有共同的条带（即同有菌，如图中的ａ和ｃ所代表的条带），也出现了
图１ 回肠微生物犇犌犌犈电泳条带
犉犻犵．１ 犇犌犌犈犾犪狀犲犫犪狀犱狊狅犳狋犺犲犻犾犲狌犿
图２ 回肠微生物犇犌犌犈电泳图谱示意
犉犻犵．２ 犇犌犌犈狆狉狅犳犻犾犲狊狅犳狋犺犲犻犾犲狌犿
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图３ 盲肠微生物犇犌犌犈电泳图谱
犉犻犵．３ 犇犌犌犈犾犪狀犲犫犪狀犱狊狅犳狋犺犲犮犪犲犮犪
图４ 盲肠微生物犇犌犌犈电泳条带示意
犉犻犵．４ 犇犌犌犈狆狉狅犳犻犾犲狊狅犳狋犺犲犮犪犲犮犪
独有的条带（即独有的优势菌种，如图中ｂ条带所代表的细菌类型）。同时，同组内的４条泳道条带的位置和数目
也不尽相同，说明不同鸡个体间肠道微生物菌群也存在一定差异。
图５和６分别是回肠和盲肠电泳结果进行相似性聚类分析，结果显示，各泳道之间带谱相似性较差，其中同
组回肠内个体相似性最高的为８０％，而盲肠最高为８５％；不同组之间相似性低，回肠除样本３外，对照组和试验
组相似性低于６０％，而盲肠图谱中，２组之间相似性也低于６５％，这说明肠道细菌的差异性组间大于组内。
３ 讨论
动物消化道微生物区系平衡对宿主消化吸收、阻止入侵病原菌和增强机体免疫有重要作用，但消化道内外环
境 如日粮、应激、胃肠道ｐＨ值、氧化还原电位、疾病等因素可影响这种平衡，所以调控消化道微生物区系的稳定
图５ 回肠微生物犇犖犃－犇犌犌犈的相似性分析
犉犻犵．５ 犛犻犿犻犾犪狉犻狋犻犲狊犫犲狋狑犲犲狀犇犖犃－犇犌犌犈狆狉狅犳犻犾犲狊狅犳狋犺犲犻犾犲狌犿
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图６ 盲肠微生物犇犖犃－犇犌犌犈的相似性分析
犉犻犵．６ 犛犻犿犻犾犪狉犻狋犻犲狊犫犲狋狑犲犲狀犇犖犃－犇犌犌犈狆狉狅犳犻犾犲狊狅犳狋犺犲犮犪犲犮犪
对动物健康生长有重要意义。家禽麦类日粮，由于含有较多的抗营养因子———水溶性非淀粉多糖，使肠道食糜粘
度增加，排空速度和吸收能力下降，造成养分积累，从而会引起发酵微生物数量增加和微生物区系变化［１２］。
Ｃｈｏｃｔ等［１３］报道，小麦日粮添加木聚糖酶使鸡肠道食糜粘度下降，微生物区系改变，回肠挥发性脂肪酸显著减少，
而盲肠挥发性脂肪酸显著增加。Ｄａｎｉｃｋｅ等［１４］也报道，黑麦（犛犲犮犪犾犲犮犲狉犲犪犾犲）日粮添加木聚糖酶使食糜停留时间
缩短，消化道（嗉囊、小肠）肠杆菌、肠球菌、总厌氧菌数量显著减少。而本试验未发现木聚糖酶对肉仔鸡回肠和盲
肠双岐杆菌、乳酸杆菌和大肠杆菌数量的显著影响，结果与高峰等［１５］和 Ｅｎｇｂｅｒｇ等［１６］报道相一致，但和Ｃｈｏｃｔ
等［１３］和Ｄａｎｉｃｋｅ等［１４］报道似乎相反。产生矛盾的确切原因目前尚难解释清楚，这可能由于动物肠道微生物是一
个极其复杂的生物群体，加上传统细菌培养技术有一定的局限性，所以目前被认知的肠道细菌占少数；而这些少
数细菌数量的变化与否可能很难反映肠道微生物整体变化［１７，１８］。
变性梯度凝胶电泳技术自从 Ｍｕｙｚｅｒ等［１０］首次用于分析土壤环境微生物区系以来，已迅速用于动物肠道微
生物的研究。其主要原理是长度相同而碱基组成不同的ＤＮＡ序列在变性梯度凝胶的特定位置形成条带，其条
带反映的是样品中的优势菌群，根据条带的数量、位置及灰度获知微生物区系的多样性及复杂性［１９］。本试验结
果表明，盲肠的条带数远远多于回肠的条带数，说明盲肠是微生物大量生长与繁殖的重要场所。不论回肠还是盲
肠，加酶组的电泳条带数总体上比对照组相对较多，但差异不显著，而且组内个体间的图谱相似性大于组间整体
的相似性，这说明肠道细菌的差异性组间大于组内，酶的添加在一定程度上影响了肠道菌群的建立，但不明显。
当然，ＤＧＧＥ技术本身也具有一定局限性，ＤＧＧＥ只能检测到细菌总数超过１％的菌群，所以样品中尚有一些细
菌未能充分反映。如果通过对这些 ＤＮＡ 片段进行测序以及和国际标准基因库作比对，就可以得出这些在
ＤＧＧＥ中被分离ＤＮＡ片断所代表的微生物的种属关系，从而确定不同肠道内所含有的微生物的具体种类，就更
能确切反映添加酶后，对后肠微生物菌群的影响，这有待进一步试验研究。
综上所述，本试验结果表明，消除抗营养因子，进而提高营养物质的消化率可能是木聚糖酶的主要作用机制，
而影响微生物的数量和种群的作用效果并不明显。
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９０１第１７卷第５期 草业学报２００８年
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《草业学报》扩刊启事
《草业学报》是中国草学会，兰州大学草地农业科技学院主办的专业学术类期刊。主要刊载国内外草业科学
及相关领域（如生态学、畜牧学、农学、林学等）创新性研究论文、综述、专论和学科前沿动态等。
《草业学报》为英国ＣＡＢＩ文献数据库来源期刊，国家科技部“中国科技论文统计源期刊”，中国科学引文数据
库（ＣＳＣＤ）核心期刊。２００７年科技部中国科技信息所《中国科技期刊引证报告》统计影响因子为１．４８６，名列全国
１７２３种科技期刊第３２位。在全国同行业畜牧兽医类期刊中始终排名第１位。
承蒙广大作者的厚爱，本刊投稿量日渐增大，有许多颇具参考价值的文章被拒，我们也深感惋惜。为回馈广
大作者多年来对《草业学报》的厚爱和信任，也为使尚有价值发表的文章能被录用，《草业学报》决定从２００９年起
扩增每期页数，由原１５０页扩至２５０页。欢迎投稿，本刊对录用的稿件争取在１年内刊出。在此感谢广大作者和
读者多年来对《草业学报》的支持和信任。
本刊标准刊号：ＩＳＳＮ１００４５７５９ ＣＮ６２１１０５／Ｓ
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０１１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．５） １０／２００８