全 文 ：书青藏高原东南缘老芒麦自然居群遗传
多样性的犛犚犃犘和犛犛犚分析
鄢家俊１，２，白史且１，２，张新全１，常丹１，游明鸿２，张昌兵２，李达旭２
（１．四川农业大学草业科学系，四川 雅安６２５０１４；２．四川省草原科学研究院，四川 成都６１１７３１）
摘要：基于ＳＲＡＰ和ＳＳＲ分子标记分析了青藏高原东南缘８个老芒麦自然居群遗传变异及群体遗传结构，获得下
述结果：１）１６对ＳＲＡＰ引物在９０个单株中共扩增出３８４条可统计条带，其中多态性条带３３４条，占８６．９８％；１６个
ＳＳＲ位点共检测出等位变异２２１个，平均每个位点１３．８个，其中具有多态性的位点数１９２个，占８６．８８％。２）２种
分子标记检测到老芒麦居群水平的基因多样性（犎犲）分别为０．１０９２和０．１２９６，而物种水平的基因多样性达
０．２４３４和０．３７３２。３）基于２种标记的Ｎｅｉ氏遗传分化指数犌狊狋（０．５５２５和０．５１５８）表明老芒麦居群出现了较大
程度的遗传分化，居群间的基因流非常有限，分别为０．４０５０和０．４６９４，老芒麦的遗传变异主要分布在居群间，居
群内变异相对较小，Ｓｈａｎｎｏｎ多样性指数和分子方差变异（ＡＭＯＶＡ）分析显示了相似的结果。４）基于聚类分析结
果表明各居群间存在较为明显的地理分化，８个居群分化为采集地范围内的南、北和中部３个分支。通过对老芒麦
遗传多样性和遗传结构的分析提出了对该物种遗传多样性的保护策略。
关键词：老芒麦；遗传多样性；群体遗传结构；ＳＲＡＰ；ＳＳＲ
中图分类号：Ｓ５４３．０３２；Ｑ９４３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１０）０４０１２２１３
物种的进化就是其居群内基因频率在各种进化动力作用下，随时间推移而在数量和空间分布格局上发生动
态演化的过程［１，２］。因此，鉴定植物个体的基因型并确定居群内的基因频率是植物居群遗传学和保护遗传学研
究的首要问题。
作为披碱草属的模式种，老芒麦（犈犾狔犿狌狊狊犻犫犻狉犻犮狌狊）是一种原生于欧亚大陆北部、多年生、自花授粉的异源四
倍体禾草，具有ＳｔＳｔＨＨ的染色体组构成。其自然分布横跨欧洲的瑞典到东亚的日本，甚至到达北美的阿拉斯加
和加拿大，在中国的东北、内蒙古、河北、山西、陕西、甘肃、宁夏、青海、新疆、四川和西藏等省区都有大量的野生老
芒麦分布［３５］。在青藏高原的亚高山草甸地区，老芒麦作为一种重要饲草在草地畜牧业中发挥了巨大作用。由于
其高产优质和对寒冷干旱气候的良好适应性，近年来，老芒麦已经成为青藏高原地区栽培利用最为广泛的当家草
种之一。然而，随着全球气候变暖的加剧，加上青藏高原地区的过度放牧和森林采伐，老芒麦的生存环境受到了
严重威胁。加快和深化对老芒麦遗传多样性的研究，对该地区老芒麦资源保护和合理利用都具有重要意义。利
用分子标记技术分析老芒麦种质遗传多样性的研究远落后于大田作物及其他牧草，关于其遗传结构的报道仅见
于 Ｍａ等［６］基于简单重复间序列（ｉｎｔｅｒｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ，ＩＳＳＲ）分子标记的研究，其结果指出老芒麦的遗
传变异大部分存在于居群内部（犌狊狋＝０．３３１）。这一结论与老芒麦自花授粉的特性不符，也不同于大多数披碱草
属物种的遗传变异分布方式。因此，关于老芒麦的遗传多样性和群体遗传结构有必要采用不同的研究手段进一
步探讨。
理想的遗传标记应具有对基因组取样无偏离、共显性、对变异的检测分辨率高以及不受环境条件直接影响等
特点［７］。在众多分子标记中，相关序列扩增多态性（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｌａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＲＡＰ）和简单重
复序列（ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ，ＳＳＲ），亦称为微卫星ＤＮＡ（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅＤＮＡ）因具有多态性高、重复性好、高
共显性、操作简便、稳定可靠等特点，广泛用于农作物、蔬菜的遗传研究［８１１］，在草本植物的研究［１２１４］中也取得良
１２２－１３４
２０１０年８月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第１９卷 第４期
Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．４
收稿日期：２００９１１１６；改回日期：２００９１２１６
基金项目：国家公益性农业行业专项（ｎｙｈｙｚｘ０７０２２），现代农业产业技术体系建设专项资金和国家“十一五”科技支撑计划项目
（２００８ＢＡＤＢ３Ｂ０７）资助。
作者简介：鄢家俊（１９８３），女，四川简阳人，博士。Ｅｍａｉｌ：ｙａｎｊ５１０＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｂａｉｔｕｒｆ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
好的效果。应用ＳＲＡＰ和ＳＳＲ标记相结合分析老芒麦遗传多样性及群体遗传结构的研究，在国内外尚无报道。
为避免单一分子标记方法对研究结果造成偏差，本试验采用ＳＲＡＰ和ＳＳＲ标记相结合的方法对采集自青藏高原
东南缘的老芒麦野生居群的遗传多样性和居群遗传结构进行研究，旨在探讨在青藏高原高寒生态条件下，老芒麦
的遗传背景及居群遗传变异在时空中的分布式样，生境对其遗传变异的影响，为青藏高原野生老芒麦居群保护策
略的制定和合理利用提供理论依据。
１ 材料与方法
１．１ 供试材料
本试验材料由四川省草原科学研究院于２００５年对青藏高原地区野生老芒麦资源考察收集所得，共计８个居
群，各居群分布图及生境状况见图１，表１。按居群采样法，根据居群大小收集相应数量的单株，每个单株间隔距
离１０ｍ以上，每株采集单穗装入独立信封，带回实验室按单穗发芽种植。
图１ 供试８个老芒麦自然居群采集地分布图
犉犻犵．１ 犌犲狅犵狉犪狆犺犻犮犪犾犿犪狆狊犺狅狑犻狀犵狋犺犲犾狅犮犪狋犻狅狀狅犳狋犺犲犲犻犵犺狋狆狅狆狌犾犪狋犻狅狀狊狅犳犈．狊犻犫犻狉犻犮狌狊
表１ ８个老芒麦居群的地理位置和生境状况
犜犪犫犾犲１ 犔狅犮犪狋犻狅狀狊犪狀犱狋犺犲犺犪犫犻狋犪狋犮犺犪狉犪犮狋犲狉狊狅犳犲犻犵犺狋犈．狊犻犫犻狉犻犮狌狊狆狅狆狌犾犪狋犻狅狀狊
编号
Ｉｄｅｎｔｉｔｙ
采样地点
Ｌｏｃａｔｉｏｎ
样本数
Ｓｉｍｐｌｅｓｉｚｅ
海拔
Ａｌｔｉｔｕｄｅ（ｍ）
纬度
Ｌａｔｉｔｕｄｅ
经度
Ｌｏｎｇｉｔｕｄｅ
生境
Ｈａｂｉｔａｔ
ＳＡＧ００４３ 雅江高尔寺山Ｇａｏｅｒｓｉｍｏｕｎｔａｉｎ，Ｙａｊｉａｎｇ １５ ３５２５ ３０°０２′４３″ １０１°１６′４２″ 河边灌丛Ｓｈｒｕｂｏｆｒｉｖｅｒｓｉｄｅ
ＳＡＧ００６７ 理塘Ｌｉｔａｎｇｃｏｕｎｔｙ １１ ３６７３ ３０°１８′４７″ １００°１７′５２″ 农田旁灌丛Ｓｈｒｕｂ，ｒｉｄｇｅｏｆｆａｒｍｌａｎｄ
ＳＡＧ００７３ 松潘川郎路Ｃｈｕａｎｌａｎｇｒｏａｄ，Ｓｏｎｇｐａｎ ９ ３２１４ ３２°５３′３５″ １０３°２９′４７″ 河边山坡灌丛Ｓｌｏｐｅｓｈｒｕｂｏｆｒｉｖｅｒｓｉｄｅ
ＳＡＧ００７９ 红原刷金寺Ｓｈｕａｊｉｎｓｉ，Ｈｏｎｇｙｕａｎ １５ ３４１４ ３２°０５′１６″ １０２°３３′５８″ 路边灌丛Ｓｈｒｕｂｏｆｒｏａｄｓｉｄｅ
ＳＡＧ００８３ 色达翁达镇 Ｗｅｎｇｄａ，Ｓｅｄａ １０ ３３４４ ３１°５２′１３″ １００°４２′５２″ 路边灌丛Ｓｈｒｕｂｏｆｒｏａｄｓｉｄｅ
ＳＡＧ００８４ 色达旭日乡Ｘｕｒｉ，Ｓｅｄａ ８ ３５６７ ３１°５９′３２″ １００°３６′１６″ 河边灌丛Ｓｈｒｕｂｏｆｒｉｖｅｒｓｉｄｅ
ＳＡＧ００８８ 壤塘蓝木达Ｌａｎｍｕｄａ，Ｒａｎｇｔａｎｇ １２ ３３６２ ３２°２６′２４″ １０１°０２′４５″ 路边山坡灌丛Ｓｌｏｐｅｓｈｒｕｂ
ＳＡＧ００９２ 阿坝查理寺Ｃｈａｌｉｓｉ，Ａ’ｂａ １０ ３３２４ ３２°４５′４６″ １０２°０３′１９″ 河边灌丛Ｓｈｒｕｂｏｆｒｉｖｅｒｓｉｄｅ
３２１第１９卷第４期 草业学报２０１０年
１．２ 老芒麦基因组ＤＮＡ提取
单株采集新鲜幼嫩的老芒麦叶片，参照Ｄｏｙｌｅ［１５］描述的ＣＴＡＢ（十六烷基三甲基溴化铵，ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌ
ａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）法使用植物基因组提取试剂盒（天根，北京）进行基因组ＤＮＡ提取。对比已知浓度的标准
λＤＮＡ与样本ＤＮＡ在０．８％（ｗ／ｖ）琼脂糖凝胶上的电泳图谱，利用ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ软件（ＢｉｏＲａｄ，ＵＳＡ），计算出
老芒麦各种质的ＤＮＡ浓度。将所有样本的基因组ＤＮＡ用０．１×ＴＥ缓冲液［１ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ，０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＤＴＡ（乙二胺四乙酸，ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ），ｐＨ值８．０］稀释至１０ｎｇ／μＬ，储存于－８０℃冰箱内，供
ＳＲＡＰ和ＳＳＲ扩增使用。
１．３ 引物筛选与ＰＣＲ反应
１．３．１ ＳＲＡＰ引物筛选与ＰＣＲ反应 参照前人发表的引物［１１，１６１８］，由１３个上游引物和１９个下游引物组合成
２４７对ＳＲＡＰ引物序列，交由上海生物工程技术服务有限公司合成，选取４个ＤＮＡ质量较高且田间性状表现差
异较大的材料对引物进行筛选，最终选出１６对条带清晰、稳定性高、多态性好的引物用于正式试验，引物序列见
表２。
表２ 用于老芒麦犛犚犃犘分析的引物组合及其扩增结果分析
犜犪犫犾犲２ 犘狉犻犿犲狉狊犲狇狌犲狀犮犲狊狌狊犲犱犻狀犛犚犃犘犪狀犪犾狔狊犲狊狅犳犈．狊犻犫犻狉犻犮狌狊犪狀犱犻狋’狊犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狉犲狊狌犾狋狊
引物组合
Ｐｒｉｍｅｒ
ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
扩增总数
Ｔｏｔａｌ
ｂａｎｄｓ
多态性条带
Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｂａｎｄｓ
多态性比率
Ｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓ（％）
引物组合
Ｐｒｉｍｅｒ
ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
扩增总数
Ｔｏｔａｌ
ｂａｎｄｓ
多态性条带
Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｂａｎｄｓ
多态性比率
Ｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓ（％）
ｍｅ１＋ｅｍ１ １９ １５ ７８．９５ ｍｅ４＋ｅｍ１ ２７ ２２ ８１．４８
ｍｅ１＋ｅｍ５ ２３ ２１ ９１．３０ ｍｅ４＋ｅｍ１３ ３０ ２６ ８６．６７
ｍｅ１＋ｅｍ１８ ２２ １８ ８１．８２ ｍｅ９＋ｅｍ１ １７ １５ ８８．２４
ｍｅ２＋ｅｍ３ １３ ９ ６９．２３ ｍｅ１０＋ｅｍ１６ ２４ １９ ７９．１７
ｍｅ３＋ｅｍ３ １７ １２ ７０．５９ ｍｅ１１＋ｅｍ１０ ２６ ２３ ８８．４６
ｍｅ３＋ｅｍ４ １８ １４ ７７．７８ ｍｅ１２＋ｅｍ２ ２２ ２０ ９０．９１
ｍｅ３＋ｅｍ９ ２８ ２８ １００．００ ｍｅ１２＋ｅｍ３ ２２ ２２ １００．００
ｍｅ３＋ｅｍ１１ ３６ ３２ ８８．８９ ｍｅ１２＋ｅｍ５ ４０ ３８ ９５．００
平均 Ｍｅａｎ ２４ ２０．８８ ８５．５３ 总计Ｔｏｔａｌ ３８４ ３３４ ８６．９８
ＰＣＲ扩增参见Ｌｉ和Ｑｕｉｒｏｓ［１１］的方法，略有改动。扩增反应体系为：总体积２０μＬ，包括模板ＤＮＡ４μＬ（１０
ｎｇ／μＬ），１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ２μＬ，Ｍｇ
２＋２μＬ（２５ｍｍｏｌ／Ｌ），ｄＮＴＰ２．４μＬ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ），ＴａｑＤＮＡ 聚合酶０．２
μＬ（５Ｕ／μＬ），上、下游引物均为１μＬ（１０μｍｏｌ／μＬ）；灭菌水补足２０μＬ。ＰＣＲ扩增在ＰＴＣ２００型热循环仪（ＭＪ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＷａｌｔｈａｍＭＡ，ＵＳＡ）上进行，采用以下ＰＣＲ扩增程序：９４℃变性５ｍｉｎ；９４℃变性１ｍｉｎ，３５℃退火１
ｍｉｎ，７２℃延伸１ｍｉｎ，共５个循环；之后３５个循环：９４℃变性１ｍｉｎ，５０℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸１ｍｉｎ，最后７２℃延
伸１０ｍｉｎ；４℃保存。
１．３．２ ＳＳＲ引物筛选与ＰＣＲ反应 试验选取３３对披碱草属（犈犾狔犿狌狊）ＳＳＲ引物，５８对小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿）ＳＳＲ引
物共计９１对ＳＳＲ引物序列进行筛选，最终选出１６对条带清晰、稳定性高、多态性好的引物用于正式试验，其中５
对来自于披碱草属基因组，１１对来自于小麦基因组，引物序列见表３。
ＰＣＲ扩增在ＰＴＣ２００型热循环仪（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ，ＷａｌｔｈａｍＭＡ，ＵＳＡ）上进行，披碱草属引物的反应体系和
ＰＣＲ程序参照Ｓｕｎ和Ｓａｌｏｍｏｎ［１９］的方法，２０μＬ反应体系中包括：０．２ｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ，２．０ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２，１．５Ｕ
ＴａｑＤＮＡ聚合酶，引物各１５ｐｍｏｌ，模板ＤＮＡ２０ｎｇ。扩增程序分为２个阶段。第１阶段为１８个循环，反应程序
为９４℃变性１ｍｉｎ，然后退火３０ｓ，退火温度最初为６４℃，以后每３个循环降低２℃，７２℃延伸１ｍｉｎ；第２阶段为
３０个循环，反应程序为９４℃变性１ｍｉｎ，５２℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸１ｍｉｎ；最后７２℃温育１０ｍｉｎ；４℃保存。
４２１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．４
表３ 老芒麦遗传结构犛犛犚标记引物扩增结果
犜犪犫犾犲３ 犜犺犲犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狉犲狊狌犾狋狊狅犳犛犛犚狆狉犻犿犲狉狊
引物编号
Ｐｒｉｍｅｒ
ｃｏｄｅ
等位基因数
Ｎｕｍｂｅｒｏｆ
ａｌｅｌｅｓ
多态性位点数
Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｂａｎｄｓ
多态性位点率
Ｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓ（％）
引物编号
Ｐｒｉｍｅｒ
ｃｏｄｅ
等位基因数
Ｎｕｍｂｅｒｏｆ
ａｌｅｌｅｓ
多态性位点数
Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｂａｎｄｓ
多态性位点率
Ｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓ（％）
ＥＣＧＡ４ １２ １０ ８３．３３ ＷＭＳ６３ １６ １５ ９３．７５
ＥＣＧＡ２２ １６ １４ ８７．５０ ＷＭＳ１４９ １３ １１ ８４．６２
ＥＡＧＡ１０３ １５ １５ １００．００ ＷＭＳ２６８ １５ １４ ９３．３３
ＥＣＧＡ２１０ １２ ９ ７５．００ ＷＭＳ２７１ ２３ ２１ ９１．３０
ＥＣＧＴ３５ １１ １０ ９０．９１ ＷＭＳ２９５ １２ １１ ９１．６７
ＷＭＳ５ １５ １２ ８０．００ ＷＭＳ４９７ １０ １０ １００．００
ＷＭＳ４３ １２ ９ ７５．００ ＷＭＳ５１８ １４ １１ ７８．５７
ＷＭＳ４４ １４ １１ ７８．５７ ＷＭＳＴａｇｌｕｔ １１ ９ ８１．８２
平均 Ｍｅａｎ １３．８ １２ ８６．５９ 总计Ｔｏｔａｌ ２２１ １９２ ８６．８８
小麦引物的反应体系和ＰＣＲ程序参照 Ｒｄｅｒ等［２０］的方法，２０μＬＰＣＲ反应混合物包括０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
ｄＮＴＰ，１．５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２，１．０ＵＴａｑＤＮＡ聚合酶，上下游引物各５ｐｍｏｌ，模板ＤＮＡ２０ｎｇ；ＰＣＲ扩增程序
为：９４℃变性４ｍｉｎ；９４℃变性１ｍｉｎ，５０～６０℃（根据不同引物的退火温度）退火４５ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，共３５个循
环；最后７２℃１０ｍｉｎ；４℃保存。
１．４ 老芒麦ＰＣＲ扩增产物的检测
扩增产物用６％的变性聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺∶甲叉＝１９∶１，７ｍｏｌ／Ｌ尿素，１×ＴＢＥ缓冲液）电泳分
离。２００Ｖ电压预电泳２０ｍｉｎ，每点样孔中点样１０μＬ，４００Ｖ恒压电泳约９０～１００ｍｉｎ。所用ＤＹＹ６Ｃ型电泳
仪和ＤＹＹＩＩＩ２８Ｄ型电泳槽均由北京六一仪器厂生产。用ＤＬ２０００ＴＭ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ［由宝生物工程（大连）有限
公司生产］作标准。停止电泳后用０．１％的ＡｇＮＯ３ 进行银染，并在ＮａＯＨ液中显色，凝胶用高分辨率数码相机
拍照保存。
１．５ 数据处理
只对清晰可辨的扩增条带进行统计，每个ＳＲＡＰ和ＳＳＲ位点等位变异的有无分别用数字１和０表示，形成
原始二元数据矩阵。具有相同分子量的ＤＮＡ片段被作为同一位点。计算下列遗传多样性参数：多态性位点比
率（犘犘犅）、每位点有效等位基因数（犖犲）、每位点观测等位基因数（犖犪）和 Ｎｅｉ氏基因多样性（犎犲）。在物种水平
上，计算总的基因多样性（犎狋）、居群内遗传多样性（犎狊）和Ｎｅｉ氏群体遗传分化系数犌狊狋，犌狊狋＝（犎狋－犎狊）／犎狋［２１］。
基因流（犖犿），即群体间平均每代相互迁移的个体数，依据公式犖犿＝０．５（１－犌狊狋）／犌狊狋计算［２２］。以上参数计算是
在假设居群内基因频率处于 ＨａｒｄｙＷｅｉｎｂｅｒｇ遗传平衡的前提下，利用ＰＯＰＧＥＮＥ１．３１［２３］完成。利用ＰＯＰ
ＧＥＮＥ软件，还基于ＳＲＡＰ和ＳＳＲ表型数据，计算Ｓｈａｎｎｏｎ多样性指数（犎狅），公式为犎狅＝－∑狆犻ｌｎ狆犻［２４］，式中，
狆犻指某个扩增片段的频率（包括记为１的扩增带和记为０的无效带）。犎狅 可以在２个水平上进行计算，包括居群
内平均多样性（犎狆狅狆）和总的多样性（犎狊狆）。群体间多样性比例（即类似于犌狊狋的参数）用（犎狊狆－犎狆狅狆）／犎狊狆估算。
此外，根据个体间的遗传相似性系数，利用Ａｒｌｅｑｕｉｎ３．１１［２５］进行分子方差分析（ＡＭＯＶＡ）［２６］，计算居群内、
居群间的变异方差分布和居群间的遗传分化系数Φ狊狋。为了推断各居群间的亲缘关系，利用ＮＴＳＹＳｐｃ软件［２７］，
基于Ｎｅｉ氏无偏遗传距离，构建各群体的非加权配对算术平均法（ＵＰＧＭＡ）聚类图，并通过ＦｒｅｅＴｒｅｅ软件［２８］采
用１０００次重抽样对聚类图进行ｂｏｏｔｓｔｒａｐ分析。同时为了检测居群间的遗传距离和地理距离之间是否存在相
关性，还利用ＮＴＳＹＳｐｃ软件对８个老芒麦居群的遗传距离矩阵和地理距离矩阵进行了 Ｍａｎｔｅｌ检验。另外，利
用ＮＴＳＹＳｐｃ软件，还对基于ＳＳＲ和ＳＲＡＰ的各居群的Ｎｅｉ氏遗传相似系数作了 Ｍａｎｔｅｌ检验。
５２１第１９卷第４期 草业学报２０１０年
２ 结果与分析
２．１ ＳＲＡＰ和ＳＳＲ标记的扩增多态性
１６对ＳＲＡＰ引物在８个老芒麦居群９０个单株中共扩增出３８４条可统计条带（表２），其中多态性条带３３４
条，占８６．９８％，扩增片段大部分集中在１００～１５００ｂｐ，引物组合 ｍｅ１１＋ｅｍ１０对８个居群ＤＮＡ样品的扩增结
果见图２。每对引物扩增出１３～４０条带，平均２４条，多态率为６９．２３％～１００．００％。一些ＳＲＡＰ扩增片段是某
些居群所特有的，如由引物组合ｍｅ１２＋ｅｍ２扩增的２２条带纹中，有７条是ＳＡＧ００７９居群所独有的，ＳＡＧ００７９
居群独有的条带还包括ｍｅ４＋ｅｍ１扩增的２７条带纹中的２条。ｍｅ１２＋ｅｍ３扩增的２２条带纹中有２条也是居群
ＳＡＧ００８８所特有的。总的说来，１６对 ＳＲＡＰ引物在 ＳＡＧ００７９居群中共检测到１３条特异条带，在居群
ＳＡＧ００４３、ＳＡＧ００６７、ＳＡＧ００７３、ＳＡＧ００８３、ＳＡＧ０８８和ＳＡＧ００９２中分别检测到特异条带１，５，２，３，５和２条特有
带，而在居群ＳＡＧ００８４中，未发现有特异条带。
ＳＳＲ标记的扩增结果如表３所示。其中，引物ＥＡＧＡ１０３对８个居群ＤＮＡ样品的扩增结果见图３。８个居
群９０份材料在１６个ＳＳＲ位点共检测出等位变异２２１个，平均每个位点１３．８个，变异范围为１０～２３个，扩增的
片段主要集中在５０～２５０ｂｐ。其中具有多态性的位点数１９２个，占８６．８８％，平均每对引物检测到１２个多态性
位点，多态位点率为７５％～１００％。引物 ＷＭＳ２７１的等位变异最为丰富，为２３个，引物 ＷＭＳ４９７的等位变异丰
富度最低，为１０个。以上结果说明筛选的ＳＲＡＰ和ＳＳＲ引物能够检测出老芒麦居群丰富的遗传变异，可以用于
青藏高原野生老芒麦居群遗传多样性研究。
图２ 犛犚犃犘引物组合犿犲１１＋犲犿１０在８个老芒麦居群中扩增的指纹图谱
犉犻犵．２ 犛犚犃犘犳犻狀犵犲狉狆狉犻狀狋狆犪狋狋犲狉狀狊犻狀犲犻犵犺狋犈．狊犻犫犻狉犻犮狌狊狆狅狆狌犾犪狋犻狅狀狊
犪犿狆犾犻犳犻犲犱犫狔狆狉犻犿犲狉狊犿犲１１＋犲犿１０
图３ 犛犛犚引物犈犃犌犃１０３在８个老芒麦居群中扩增的指纹图谱
犉犻犵．３ 犛犛犚犳犻狀犵犲狉狆狉犻狀狋狆犪狋狋犲狉狀狊犻狀犲犻犵犺狋犈．狊犻犫犻狉犻犮狌狊狆狅狆狌犾犪狋犻狅狀狊犪犿狆犾犻犳犻犲犱犫狔狆狉犻犿犲狉犈犃犌犃１０３
６２１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．４
２．２ 老芒麦的遗传多样性
基于ＳＲＡＰ标记的老芒麦物种水平的多态条带比率（犘犘犅）为８６．９８％，与ＳＳＲ标记的结果基本一致（犘犘犅
＝８６．８８％）。各居群间犘犘犅值存在着较大的差异（表４），ＳＲＡＰ检测的犘犘犅值为１５．３６％～４５．３１％，平均值为
３１．１５％；ＳＳＲ标记的犘犘犅值为３０．７７％～４１．１８％，平均值为３６．２６％。ＳＲＡＰ和ＳＳＲ标记每位点平均具有的
有效等位基因数（犖犲）基本一致，分别为１．１９和１．２２个。在假定 ＨａｒｄｙＷｅｉｎｂｅｒｇ平衡的前提下，基于ＳＲＡＰ标
记的Ｎｅｉ氏基因多样性（犎犲）在居群水平上为０．１０９２，略低于ＳＳＲ标记的结果（０．１２９６），在物种水平上ＳＳＲ标
记得到的结果也较高，为０．２６９０，而ＳＲＡＰ得到的值为０．２４３４。单个居群的Ｓｈａｎｎｏｎ多样性指数基于ＳＲＡＰ
标记的值为０．０８０８～０．２３０４，居群水平上的平均值（犎狆狅狆）为０．１６２６，在物种水平上（犎狊狆）则达到０．３７３２。基
于ＳＳＲ标记的Ｓｈａｎｎｏｎ多样性指数高于ＳＲＡＰ的结果，各居群的值为０．１６６０～０．２２８６，平均值为０．１９３０，在
物种水平上达到０．４１２３。
ＳＲＡＰ和ＳＳＲ标记的结果不完全一致（表４）。在供试８个居群中，ＳＲＡＰ标记的结果显示红原刷金寺居群
（ＳＡＧ００７９）（犘犘犅＝４５．３１％，犖犲＝１．２６，犎犲＝０．１５４０，犎狅＝０．２３０４）和壤塘蓝木达居群（ＳＡＧ００８８）（犘犘犅＝
３８．５４％，犖犲＝１．２２，犎犲＝０．１２９９，犎狅＝０．１９５３）表现出最高的变异性，而居群雅江高尔寺山居群（ＳＡＧ００４３）
表现出最低的遗传变异（犘犘犅＝１５．３６％，犖犲＝１．１０，犎犲＝０．０５４６，犎狅＝０．０８０８）。而ＳＳＲ标记的结果则是理
塘居群（ＳＡＧ００６７）的遗传多样性最高（犘犘犅＝４１．１８％，犖犲＝１．２８，犎犲＝０．１５５７，犎狅＝０．２２８６），松潘川郎路居
群（ＳＡＧ００７３）遗传多样性最低（犘犘犅＝３１．２２％，犖犲＝１．１９，犎犲＝０．１１１３，犎狅＝０．１６６０）。
表４ ８个老芒麦居群基于犛犚犃犘和犛犛犚标记的遗传多样性
犜犪犫犾犲４ 犜犺犲犵犲狀犲狋犻犮狏犪狉犻犪犫犻犾犻狋狔狅犳犲犻犵犺狋狆狅狆狌犾犪狋犻狅狀狊狅犳犈．狊犻犫犻狉犻犮狌狊狉犲狏犲犪犾犲犱犫狔犛犚犃犘犪狀犱犛犛犚犪狀犪犾狔狊犻狊
居群
Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ
多态性条带数
Ｎｕｍｂｅｒｏｆｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｂａｎｄｓ
ＳＲＡＰ ＳＳＲ
多态性位点百分率
Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ｌｏｃｉ（犘犘犅，％）
ＳＲＡＰ ＳＳＲ
观测等位基因数
Ｏｂｓｅｒｖｅｄｎｕｍｂｅｒｏｆ
ａｌｅｌｅｓ（犖犪）
ＳＲＡＰ ＳＳＲ
有效等位基因数
Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｕｍｂｅｒｏｆ
ａｌｅｌｅｓ（犖犲）
ＳＲＡＰ ＳＳＲ
Ｎｅｉ氏基因多样性
Ｎｅｉ’ｓｇｅｎｅ
ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ（犎犲）
ＳＲＡＰ ＳＳＲ
Ｓｈａｎｎｏｎ指数
Ｓｈａｎｎｏｎ’ｓｉｎｄｅｘ
（犎狅）
ＳＲＡＰ ＳＳＲ
ＳＡＧ００４３ ５９ ６８ １５．３６ ３０．７７ １．１５ １．３１ １．１０ １．２０ ０．０５４６０．１１５９０．０８０８０．１７０９
ＳＡＧ００６７ １１５ ９１ ２９．９５ ４１．１８ １．３０ １．４１ １．１９ １．２８ ０．１０８３０．１５５７０．１６０７０．２２８６
ＳＡＧ００７３ ７５ ６９ １９．５３ ３１．２２ １．２０ １．３１ １．１３ １．１９ ０．０７５１０．１１１３０．１０９９０．１６６０
ＳＡＧ００７９ １７４ ９１ ４５．３１ ４１．１８ １．４５ １．４１ １．２６ １．２４ ０．１５４００．１４２２０．２３０４０．２１３４
ＳＡＧ００８３ １２１ ８９ ３１．５１ ４０．２７ １．３２ １．４０ １．１９ １．２３ ０．１０７８０．１３４８０．１６０３０．２０３３
ＳＡＧ００８４ １３４ ７５ ３４．９０ ３３．９４ １．３５ １．３４ １．２３ １．１９ ０．１３０１０．１１４３０．１９２００．１７２７
ＳＡＧ００８８ １４８ ７６ ３８．５４ ３４．３９ １．３９ １．３４ １．２２ １．２１ ０．１２９９０．１２１４０．１９５３０．１８１４
ＳＡＧ００９２ １３１ ８２ ３４．１１ ３７．１０ １．３４ １．３７ １．２０ １．２５ ０．１１３８０．１４１３０．１７１１０．２０７８
平均 Ｍｅａｎ １１９．６３ ８０．１０ ３１．１５ ３６．２６ １．３１ １．３６ １．１９ １．２２ ０．１０９２０．１２９６０．１６２６０．１９３０
物种Ｓｐｅｃｉｅｓ ３３４ １９２ ８６．９８ ８６．８８ １．８７ １．８７ １．４１ １．４４ ０．２４３４０．２６９００．３７３２０．４１２３
２．３ 青藏高原老芒麦的群体遗传结构
根据总的遗传多样性（犎狋）和群体内遗传多样性（犎狊）计算不同群体间的分化水平（犌狊狋），结果见表５。由
ＰＯＰＧＥＮ在假设遗传平衡时，基于ＳＲＡＰ标记结果计算出８个老芒麦居群内遗传多样性（犎狊）为０．１０９２，总的
遗传多样性（犎狋）为０．２４４０，基因分化系数（犌狊狋）为０．５５２５，即表明总的遗传变异中有５５．２５％的变异存在于群体
间，群体内的遗传变异为４４．７５％。居群间每代个体的基因流（犖犿）是０．４０５０。基于Ｓｈａｎｎｏｎ多样性指数计算
的居群间的遗传分化系数（犎狊狆－犎狆狅狆）／犎狊狆＝０．５６４３，结果与犌狊狋接近。利用分子方差分析方法（ＡＭＯＶＡ）对８
个老芒麦自然居群的遗传分化程度进行分析，所得结果与Ｎｅｉ氏遗传多样性和Ｓｈａｎｎｏｎ多样性指数分析所得结
果基本一致，Φ狊狋＝０．５８６４（表６），即在总的遗传变异中有５８．６４％的变异发生在居群间，有４１．３６％的变异发生
７２１第１９卷第４期 草业学报２０１０年
在群体内，居群间和居群内的变异均极显著（犘＜０．０１）。
ＳＳＲ标记分析的结果与ＳＲＡＰ标记基本一致，犌狊狋为０．５１５８，犖犿 为０．４６９４，（犎狊狆－犎狆狅狆）／犎狊狆为０．５３１９，
Φ狊狋为０．５２４１。通过对老芒麦３种遗传分化指数分析表明，青藏高原老芒麦群体已经出现了一定程度的遗传分
化，且均支持居群间的遗传变异大于居群内。
表５ 犛犚犃犘和犛犛犚检测老芒麦居群间的遗传分化
犜犪犫犾犲５ 犌犲狀犲狋犻犮犱犻犳犳犲狉犲狀狋犻犪狋犻狅狀狑犻狋犺犻狀犪狀犱犪犿狅狀犵狆狅狆狌犾犪狋犻狅狀狊狅犳犈．狊犻犫犻狉犻犮狌狊
遗传多样性参数
Ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ
Ｎｅｉ氏基因多样性
Ｎｅｉ’ｓｇｅｎｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙ（犎犲）
ＳＲＡＰ ＳＳＲ
遗传多样性参数
Ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ
Ｓｈａｎｎｏｎ指数
Ｓｈａｎｎｏｎ’ｓｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｄｅｘ（犎狅）
ＳＲＡＰ ＳＳＲ
犎狊 ０．１０９２ ０．１２９６ 犎狆狅狆 ０．１６２６ ０．１９３０
犎狋 ０．２４４０ ０．２６７６ 犎狊狆 ０．３７３２ ０．４１２３
犎狊／犎狋 ０．４４７５ ０．４８４２ 犎狆狅狆／犎狊狆 ０．４３５７ ０．４６８１
犌狊狋 ０．５５２５ ０．５１５８ （犎狊狆－犎狆狅狆）／犎狊狆 ０．５６４３ ０．５３１９
犖犿 ０．４０５０ ０．４６９４
犎狊：居群内基因多样性；犎狋：总的基因多样性；犎狊／犎狋：居群内基因多样性比例；犌狊狋：遗传分化系数；犖犿：基于犌狊狋估算的基因流。犎狆狅狆：基于ＳＲＡＰ
和ＳＳＲ表型条带计算的居群内遗传多样性；犎狊狆：基于ＳＲＡＰ和ＳＳＲ表型条带计算的总的遗传多样性；犎狆狅狆／犎狊狆：基于ＳＲＡＰ和ＳＳＲ表型条带计算
的居群内遗传多样性比例；（犎狊狆－犎狆狅狆）／犎狊狆：基于ＳＲＡＰ和ＳＳＲ表型条带计算的居群间遗传多样性比例。
犎狊：Ｗｉｔｈｉｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｇｅｎｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙ；犎狋：Ｔｏｔａｌｇｅｎｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙ；犎狊／犎狋：Ｒａｔｉｏｏｆｇｅｎｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙｗｉｔｈｉｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ；犌狊狋：Ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｃｏ
ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ；犖犿：Ｇｅｎｅｆｌｏｗｅｓｔｉｍａｔｅｄｆｒｏｍ犌狊狋；犎狆狅狆：Ｗｉｔｈｉｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙ；犎狊狆：Ｔｏｔａｌｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙ；犎狆狅狆／犎狊狆：Ｒａｔｉｏｏｆｇｅｎｅｔｉｃｄｉ
ｖｅｒｓｉｔｙｗｉｔｈｉｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ；（犎狊狆－犎狆狅狆）／犎狊狆：Ｒａｔｉｏｏｆｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｍｏｎｇｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．
表６ 基于犛犚犃犘和犛犛犚数据对老芒麦居群的分子方差分析（犃犕犗犞犃）
犜犪犫犾犲６ 犃狀犪犾狔狊犻狊狅犳犿狅犾犲犮狌犾犪狉狏犪狉犻犪狀犮犲（犃犕犗犞犃）犫犪狊犲犱狅狀犛犚犃犘犪狀犱犛犛犚犿犪狉犽犲狉狊
犳狅狉狋犺犲犲犻犵犺狋狆狅狆狌犾犪狋犻狅狀狊狅犳犈．狊犻犫犻狉犻犮狌狊
方差组分
Ｖａｒｉａｎｃｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ
ＳＲＡＰ
居群间
Ａｍｏｎｇｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ
居群内
Ｗｉｔｈｉｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ
合计
Ｔｏｔａｌ
ＳＳＲ
居群间
Ａｍｏｎｇｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ
居群内
Ｗｉｔｈｉｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ
合计
Ｔｏｔａｌ
自由度ｄ犳 ７ ８２ ８９ ７ ８２ ８９
方差和ＳＳＤ ２４２５．０３ １６７７．９７ ４１０３．００ １４４３．８６１ １２６４．５５９ ２７０８．４２０
变异组分Ｖａｒｉａｎｃｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ２９．７４ ２０．９７ ５０．７１ １７．４０７ １５．８０７ ３３．２１４
变异百分比Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｖａｒｉａｔｉｏｎ（％） ５８．６４ ４１．３６ １００ ５２．４１ ４７．５９ １００
遗传分化系数Φ狊狋 ０．５８６４ ０．５２４１
概率值犘 ＜０．０１ ＜０．０１ ＜０．０１ ＜０．０１
犘：９９９９次随机置换后进行显著性检验。
犘ｖａｌｕｅｓｗｅｒｅｅｓｔｉｍａｔｅｄｂｙａｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｄｕｒｅｂａｓｅｄｏｎ９９９９ｒｅｐｌｉｃａｔｅ．
２．４ 老芒麦居群之间的亲缘关系和聚类分析
为了进一步分析老芒麦各居群间的遗传关系，计算了８个居群间的遗传相似性系数和遗传距离（犇），基于
ＳＳＲ和ＳＲＡＰ标记的遗传相似性矩阵进行 Ｍａｎｔｅｌ相关性检测，两者存在极显著的相关性（狉＝０．８２２４，犘＜
０．０１），因此将２种标记进行合并，基于３８４个ＳＲＡＰ标记和２２１个ＳＳＲ标记计算出各居群两两间的Ｎｅｉ氏遗传
距离，结果见表７。老芒麦各居群间犇值的变化范围为０．０６１６～０．２８６２，其中以红原刷金寺（ＳＡＧ００７９）和色达
旭日乡（ＳＡＧ００８４）２个居群的遗传一致性最高（０．９４０３），遗传距离最近（０．０６１６），以阿坝查理寺（ＳＡＧ００９２）和
理塘（ＳＡＧ００６７）２个居群的遗传一致性最低（０．７５１１），遗传距离最远（０．２８６２）。
８２１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．４
表７ 老芒麦８个居群的遗传相似性（对角线上）和遗传距离（对角线下）
犜犪犫犾犲７ 犖犲犻’狊犵犲狀犲狋犻犮犻犱犲狀狋犻狋狔（犪犫狅狏犲犱犻犪犵狅狀犪犾）犪狀犱犵犲狀犲狋犻犮犱犻狊狋犪狀犮犲（犫犲犾狅狑犱犻犪犵狅狀犪犾）
犪犿狅狀犵犲犻犵犺狋狆狅狆狌犾犪狋犻狅狀狊狅犳犈．狊犻犫犻狉犻犮狌狊
居群Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ＳＡＧ００４３ ＳＡＧ００６７ ＳＡＧ００７３ ＳＡＧ００７９ ＳＡＧ００８３ ＳＡＧ００８４ ＳＡＧ００８８ ＳＡＧ００９２
ＳＡＧ００４３ ０．９１２７ ０．７６０１ ０．７９０４ ０．７９８５ ０．７６６４ ０．７８５９ ０．７７１４
ＳＡＧ００６７ ０．０９１３ ０．７８６８ ０．７９９９ ０．８３３６ ０．７７６６ ０．７９９７ ０．７５１１
ＳＡＧ００７３ ０．２７４３ ０．２３９８ ０．８２０８ ０．８５１６ ０．８００２ ０．８０１２ ０．７６７９
ＳＡＧ００７９ ０．２３５２ ０．２２３３ ０．１９７５ ０．８６０２ ０．９４０３ ０．８９９８ ０．８７１０
ＳＡＧ００８３ ０．２２５０ ０．１８２０ ０．１６０７ ０．１５０６ ０．８６３９ ０．８４９７ ０．８３８６
ＳＡＧ００８４ ０．２６６０ ０．２５２８ ０．２２２９ ０．０６１６ ０．１４６３ ０．９０４２ ０．８７８０
ＳＡＧ００８８ ０．２４０９ ０．２２３６ ０．２２１７ ０．１０５６ ０．１６２９ ０．１００７ ０．９０３２
ＳＡＧ００９２ ０．２５９６ ０．２８６２ ０．２６４１ ０．１３８１ ０．１７６０ ０．１３０２ ０．１０１８
根据Ｎｅｉ氏遗传距离利用ＵＰＧＭＡ法构建了老
图４ 老芒麦８个居群基于犖犲犻氏遗传距离犝犘犌犕犃聚类
犉犻犵．４ 犇犲狀犱狉狅犵狉犪犿（犝犘犌犕犃）犫犪狊犲犱狅狀犖犲犻’狊犵犲狀犲狋犻犮犱犻狊狋犪狀犮犲
狅犳犲犻犵犺狋狑犻犾犱狆狅狆狌犾犪狋犻狅狀狊狅犳犈．狊犻犫犻狉犻犮狌狊
分支上的数字表示基于１０００次置换后的最优自举（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ）值
Ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｓａｂｏｖｅｔｈｅｌｉｎｅｓａｒｅｔｈｅｂｏｏｔｓｔｒａｐｖａｌｕｅｓ
ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇｅａｃｈｎｏｄｅ（１０００ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）
图５ ８个老芒麦居群间遗传距离与地理距离的相关关系
犉犻犵．５ 犜犺犲犮狅狉狉犲犾犪狋犻狅狀犫犲狋狑犲犲狀犵犲狀犲狋犻犮犱犻狊狋犪狀犮犲犪狀犱犵犲狅犵狉犪狆犺犻犮
犱犻狊狋犪狀犮犲犳狅狉犲犻犵犺狋狆狅狆狌犾犪狋犻狅狀狊狅犳犈．狊犻犫犻狉犻犮狌狊
芒麦居群遗传关系聚类图（图４）。从聚类图可看出，８
个自然居群聚成３支：ＳＡＧ００４３和ＳＡＧ００６７聚成一
支；ＳＡＧ００７９、ＳＡＧ００８４、ＳＡＧ００８８、ＳＡＧ００９２ 和
ＳＡＧ００８３聚成一支；ＳＡＧ００７３居群单独成一支。聚
成一支的表明它们有较近的亲缘关系，由居群的采集
地分布图（图１）可以看出，８个居群在采集地范围内分
成了南、北和中部３支，而对居群间的遗传距离和地理
距离之间的 Ｍａｎｔｅｌ（狉＝０．６７，犘＜０．０５）检测也表明，
在采集地范围，老芒麦的遗传变异分布和地理位置有
一定的相关性，其相关关系如图５所示。
３ 讨论
３．１ ＳＲＡＰ和ＳＳＲ分子标记分析老芒麦遗传多样性
的可行性
通过对老芒麦８个自然居群的ＰＣＲ扩增，１６对
ＳＲＡＰ引物共扩增出３８４条清晰的可统计条带，多态
性条带比率为８６．９８％，在除ＳＡＧ００８４以外的居群内
都检测到了特有条带；１６对ＳＳＲ引物，共检测出２２１
个等位基因，平均每个位点检测到１３．８个等位基因，
多态率达８６．８８％。结果高于应用ＳＲＡＰ标记对鸭茅
（犇犪犮狋狔犾犻狊犵犾狅犿犲狉犪狋犪）（犘犘犅＝８４．４％）［２９］和狗牙根
（犆狔狀狅犱狅狀犱犪犮狋狔犾狅狀）（犘犘犅＝７９．８％）［３０］遗传多样性
的研究，也高于Ｓｕｎ等［３１，３２］用ＳＳＲ标记对犈．犪犾犪狊犽犪
狀狌狊（犘犘犅＝７８．６％）和犈．犮犪狀犻狀狌狊（犘犘犅＝２３．６％）的
研究结果，高于用ＲＡＰＤ（ｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒ
ｐｈｉｃＤＮＡ，随机扩增多态性ＤＮＡ标记）分子标记对该
属其他物种的研究（基于ＲＡＰＤ方法报道的犈．狋狉犪
犮犺狔犮犪狌犾狌狊的 犘犘犅 为 ６９．３％［３３］，犈．犪犾犪狊犽犪狀狌狊 的
犘犘犅 为４９．５％［３４］），也较 Ｍａ等［６］利用ＩＳＳＲ分子标
９２１第１９卷第４期 草业学报２０１０年
记研究老芒麦遗传多样性的犘犘犅值（犘犘犅＝７７．２％）高。Ｎｙｂｏｍ［３５］指出更多的引物和更丰富的材料来源，对于
检测到丰富的遗传变异有利。与Ｓｕｎ等［３１，３２］的研究相比，本研究所用的ＳＳＲ引物更多，且采用了来自披碱草属
和小麦的ＳＳＲ引物，能够覆盖较广的基因组范围，所以能检测到丰富的变异类型，说明来自小麦和披碱草属的
ＳＳＲ引物在老芒麦的遗传多样性检测中具有通用性，较好地显示了青藏高原老芒麦丰富的遗传变异。说明
ＳＲＡＰ和ＳＳＲ标记均具有较高的扩增效率，可广泛用于老芒麦遗传结构及其变化规律的研究中。
３．２ 老芒麦的遗传多样性
本研究利用ＳＲＡＰ和ＳＳＲ分子标记对青藏高原东南缘８个老芒麦自然居群的遗传多样性分析，２种标记检
测到老芒麦的多态位点率基本一致。目前尚未见关于ＳＲＡＰ分子标记对披碱草属物种遗传多样性的研究报道，
但是ＳＳＲ标记已经广泛应用于披碱草属物种的遗传多样性检测，Ｓｕｎ等［３１，３２，３６］利用ＳＳＲ标记检测到来自北美的
犈．犪犾犪狊犽犪狀狌狊居群的平均多态位点比率（犘犘犅）为７８．６％，来自挪威的３个犈．犪犾犪狊犽犪狀狌狊居群平均犘犘犅 为
８０．９５％，而对犈．犮犪狀犻狀狌狊居群遗传多样性进行ＳＳＲ标记得到的犘犘犅值为２３．６％。本研究中，８个老芒麦居群
基于ＳＲＡＰ和ＳＳＲ标记的平均犘犘犅值为３１．１５％和３６．２６％，略高于犈．犮犪狀犻狀狌狊而低于犈．犪犾犪狊犽犪狀狌狊。然而在
物种水平上，老芒麦基于ＳＲＡＰ和ＳＳＲ分子标记的犘犘犅值达８６．９８％和８６．８８％，则意味着居群间的分子水平
变异占有相当大的比重。所以，就犘犘犅值而言，青藏高原老芒麦群体的遗传多样性在披碱草属物种中处于偏低
水平，而在物种水平的遗传多样性很丰富。
各供试老芒麦居群基于ＳＲＡＰ和ＳＳＲ的平均Ｎｅｉ氏基因多样性（犎犲）分别为０．１０９２和０．１２９６。基于ＳＳＲ
标记来自北美的犈．犪犾犪狊犽犪狀狌狊的平均犎犲＝０．４１４［３１］，来自挪威的犈．犪犾犪狊犽犪狀狌狊的平均犎犲＝０．４１４［３６］，而犈．
犮犪狀犻狀狌狊的平均犎犲＝０．１１７［３２］；而基于ＲＡＰＤ方法报道的犈．犳犻犫狉狅狊狌狊的平均犎犲＝０．０９［３７］，犈．犪犾犪狊犽犪狀狌狊的平均
犎犲＝０．１６２［３４］，犈．狋狉犪犮犺狔犮犪狌犾狌狊的平均犎犲＝０．２３［３３］。可以看出，老芒麦群体的平均基因多样性在披碱草属物种
中较低，仅高于犈．犮犪狀犻狀狌狊和犈．犳犻犫狉狅狊狌狊。基于条带表型频率的Ｓｈａｎｎｏｎ多样性指数也显示老芒麦在群体水平
的多样性低于物种水平。Ｈａｍｒｉｃｋ和Ｇｏｄｔ［３８］，Ｎｙｂｏｍ和Ｂａｒｔｉｓｈ［３９］，Ｎｙｂｏｍ［３５］通过对种子植物的遗传多样性
研究总结指出不同物种的平均犘犘犅，犎犲，犖犲 值如下，温带物种：犘犘犅＝４８．５％，犎犲＝０．１４６，犖犲＝１．２１；单子叶植
物：犎犲＝０．１９０，犖犲＝１．２１；自交物种：犘犘犅＝２０．３％，犎犲＝０．１２４，犖犲＝１．１８；地理广布种：犘犘犅＝５８．９％，犎犲＝
０．２０２，犖犲＝１．３１。因此，根据本研究的ＳＲＡＰ和ＳＳＲ数据，青藏高原老芒麦在群体水平的遗传多样性较低，而
在物种水平上显示出较高的遗传多样性。
老芒麦在物种水平相对较高的多样性与其生物学特性有关。Ｈａｍａｒｉｃｋ和Ｇｏｄｔ［３８］在有关种子植物等位酶
多样性的综述中曾指出，地理分布范围与植物在物种水平和群体水平的变异高低有显著相关性，分布范围广的物
种较狭域物种能保持更多的变异。老芒麦分布于北半球的寒温带，是欧亚大陆的广布种，在青藏高原的高山、亚
高山草甸地区广泛分布，因此广泛的地理分布使得老芒麦在物种水平上显示出较高的变异水平。物种的繁殖能
力与遗传多样性也有一定的关系，Ｈｕｈ［４０］指出具有高繁殖能力的物种通常也具有高水平的遗传多样性。在田间
条件下，每个成熟老芒麦单穗可以产生１００粒以上的种子，而据野外观察，老芒麦在野生状态每穗也有４０粒左右
的成熟种子，通过实验室测定野生老芒麦种子的发芽率基本能达到８５％以上，可见老芒麦强大的繁殖能力足以
维持其高水平的遗传多样性。
而老芒麦在群体水平的遗传多样性却较低，造成群体内遗传衰退的原因有选择作用、群体有效规模下降、遗
传漂变以及自交等［４１］。根据笔者的实地考察发现，由于人类的过度放牧和滥砍滥挖，造成老芒麦生境的严重破
碎化，使得老芒麦各群体的分布不连续，加上老芒麦的适口性好，在牲畜能够到达的地方几乎都找不到成熟的老
芒麦，仅在比较隐蔽的灌丛中或人迹罕至的地方能采集到成熟的种子，恶劣的生境导致老芒麦群体的有效规模变
小。而根据前人的研究，种群规模和其遗传多样性有显著的相关性［４２，４３］。在本次研究中，遗传多样性水平相对
较高的居群均位于人迹罕至的地方，生境保护相对完好，种群规模也相对较大。而位于农牧民居住点附近或交通
要道旁的居群，有大量的人畜活动，生境破坏较为严重，残存的老芒麦生长在高山红柳（犛犪犾犻狓犮犺犲犻犾狅狆犺犻犾犪ｖａｒ．
ｍｉｃｒｏｓｔａｃｈｙｏｉｄｅｓ）、沙棘（犎犻狆狆狅狆犺犪犲狉犺犪犿狀狅犻犱犲狊）等灌丛中，长势较差。研究表明，物种生境的破坏，不仅缩小了
０３１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．４
物种适宜的生存环境，而且增加了相近个体的交配机会。因此，繁育群体变小引起的遗传漂变和老芒麦的自交特
性可能是导致老芒麦群体内遗传变异丢失的重要原因。
３．３ 老芒麦的群体遗传结构
一个物种或群体的进化潜力，在很大程度上取决于它的居群遗传结构［３８］，即遗传变异在空间的分布式样。
确定一个物种的居群遗传结构，是了解其生物学属性，探讨物种进化过程和机制的重要一步［４４］。遗传分化是研
究居群遗传结构的重要参数，基于ＳＲＡＰ和ＳＳＲ标记使用Ｎｅｉ氏遗传多样性、Ｓｈａｎｎｏｎ多样性指数和分子方差
变异ＡＭＯＶＡ分析对老芒麦居群的遗传结构进行分析，发现２种标记的结果基本一致，均表明老芒麦的遗传变
异主要存在于居群间，居群内的遗传变异则相对较小。其分化系数大于单子叶植物的平均分化系数（犌狊狋＝
０．２３１）和多年生草本植物的平均分化系数（犌狊狋＝０．２３３）［３８］，说明老芒麦居群发生了较大程度的遗传分化。
植物的居群遗传结构受多种因素的影响，Ｈａｍａｒｉｃｋ和Ｇｏｄｔ［３８］的研究表明，植物的繁育系统、基因流和种子
扩散机制、繁殖方式及自然选择等因素对植物的遗传结构有明显的影响。一般来说，自交物种居群间的遗传变异
要高于居群内的遗传变异，而异交物种则相反。Ｈａｍｒｉｃｋ［４５］的统计表明，自交繁育的植物有５１％的遗传变异存
在于居群之间。Ｄíａｚ等［４６］利用等位酶分析研究发现犈．犪犾犪狊犽犪狀狌狊的遗传变异大部分存在于居群间（犌狊狋＝
０．９５），Ｚｈａｎｇ等［３４］的发现与之相近（犌狊狋＝０．６３），另外利用等位酶分析研究在犈．犮犪狀犻狀狌狊（犌狊狋＝０．６２）［４７］、犈．
犵犾犪狌犮狌狊（犌狊狋＝０．５４９）［４８］和犈．犳犻犫狉狅狌狊（犌狊狋＝０．６５）［３７］上均得到了类似的结论。Ｓｕｎ等［４９］利用ＳＳＲ标记对犈．犳犻
犫狉狅狌狊的研究发现５４％的变异存在于居群之间。Ｄｅｗｅｙ［５０］指出广义披碱草属物种具有自花传粉的生殖特性，从
本研究的结果也证明了老芒麦的有性繁殖符合自交物种的特点。但是，Ｍａ等［６］利用ＩＳＳＲ分子标记对老芒麦群
体遗传结构的研究则发现只有３３％的变异存在于居群间，这可能与所采用的标记方法不同有关。
除了居群的繁育系统外，居群间高水平的遗传分化也可能由遗传漂变导致［５１］，居群较小或从其他居群中分
离出来时，遗传漂变影响居群遗传结构并增加它们之间的差异［５２］。在野外实地考察中，发现老芒麦居群分布片
段化明显且大部分居群较小，表明一定程度的遗传漂变存在于该物种居群间。基因流也是使群体遗传结构均质
化的主要因素之一，具有有限基因流的物种比具有广泛基因流的物种有较大的遗传分化。Ｗｒｉｇｈｔ［５３］指出，如果
基因流估计值犖犿＜１，则遗传漂变可以导致居群间明显的遗传分化。在本研究中老芒麦基于ＳＲＡＰ和ＳＳＲ标记
的犖犿 为０．４０５０和０．４６９４，低于每代连续迁移的植物物种的基因流，表明老芒麦居群间的基因流被限制。在
植物中，花粉、种子的扩散和传播是基因流的２种主要形式。尽管老芒麦是风媒传粉植物，但野外观察发现，能够
生长到成熟期的老芒麦多位于灌木丛中，风的驱动力减弱，花粉的传播距离受限，从而影响了不同历史时期群体
间的基因交流。加之青藏高原复杂的地形，高大山脉的分割导致群体之间彼此隔离，阻碍了种子和花粉的远距离
传播，进一步促使群体间的遗传分化。此外，老芒麦是牦牛、藏绵羊等牲畜喜食的优良牧草，野生老芒麦大多在营
养生长期就被牲畜采食，完成生育期产生成熟种子的植株较少且多分布在灌丛中，种群的维持多靠多年生根茎的
繁殖，导致种群自我更新缓慢，限制了种群个体数量的扩大。因此，以近交为主的繁育系统、低的基因流、种子和
花粉传播受阻以及有限的种群规模都是导致老芒麦居群间产生遗传分化的原因之一。
３．４ 老芒麦遗传多样性的保护策略
因自然因素与人为因素（如过度利用）造成的生境恶劣程度若超过物种对生境压力适应的最大极限，那么必
将导致该物种遗传多样性的丧失［５４，５５］。虽然老芒麦在我国的自然分布比较广泛，但随着开发利用的不断扩大，
特别是西部退耕（牧）还草工程的开展，一些外来物种的引进，导致老芒麦生长的自然环境不断遭到破坏，遗传多
样性也受到威胁。因此，对青藏高原野生老芒麦制定有效的保护策略和措施，从而开展合理的保护工作就显得十
分关键。通过前面的分析，掌握了老芒麦的遗传多样性和居群遗传结构状况，明确了老芒麦在群体水平较低的遗
传多样性除受自身的繁育系统影响外，还和其生境遭到人为破坏从而导致老芒麦分布片段化并由此引发群体数
量的降低有关。因此，对其就地保护时应阻止过渡放牧、停止滥挖滥伐，保护适宜老芒麦生存的生境，才能保证其
正常生长、繁育，从而保护其遗传多样性。在就地保护时除了对所有种群进行必要的保护外，应选择遗传多样性
程度高的居群进行重点保护，如理塘（ＳＡＧ００６７）、红原刷金寺（ＳＡＧ００７９）和壤塘蓝木达（ＳＡＧ００８８）居群。同时
１３１第１９卷第４期 草业学报２０１０年
由于老芒麦的遗传多样性在居群内和居群间都有较高的分布，在迁地保护时尽量在较多的居群中取样的同时，应
在每个居群中收集尽可能多的单株，以涵盖该物种的基因库，最大程度地保护老芒麦的遗传多样性。此外，对老
芒麦遗传距离的聚类分析表明，来源地较近的居群也具有较高的遗传一致性而优先聚为一类，因此收集、保护老
芒麦种质资源时，应扩大收集范围，尽量保证其生态型或地理来源的多样性，这样才能最大限度的保护和利用其
遗传多样性。
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ＹＡＮＪｉａｊｕｎ１，２，ＢＡＩＳｈｉｑｉｅ１，２，ＺＨＡＮＧＸｉｎｑｕａｎ１，ＣＨＡＮＧＤａｎ１，
ＹＯＵＭｉｎｇｈｏｎｇ２，ＺＨＡＮＧＣｈａｎｇｂｉｎｇ２，ＬＩＤａｘｕ２
（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧｒａｓｓｌａｎｄ，ＳｉｃｈｕａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａ’ａｎ６２５０１４，Ｃｈｉｎａ；
２．ＳｉｃｈｕａｎＧｒａｓｓｌａｎｄＳｃｉｅｎｃｅＡｃａｄｅｍｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ６１１７３１，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｈｅｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓｏｆｔｈｅｓｔｕｄｙｗｅｒｅｔｏｑｕａｎｔｉｆｙｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙｉｎｅｉｇｈｔｎａｔｕｒａｌｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｏｆ
犈犾狔犿狌狊狊犻犫犻狉犻犮狌狊ｃｏｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍＳｏｕｔｈｅａｓｔｅｒｎＭａｒｇｉｎｏｆＱｉｎｇｈａｉ－ＴｉｂｅｔａｎＰｌａｔｅａｕ，ａｎｄｔｏｅｘｐｌｏｒｅｉｔｓｇｅｎｅｔｉｃ
ｖａｒｉａｔｉｏｎｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｐａｔｔｅｒｎ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｌａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＳＲＡＰ）ｍａｒｋｅｒｓａｎｄｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｒｅｐｅａｔ（ＳＳＲ）ｍａｒｋｅｒｓｗｅｒｅｅｍｐｌｏｙｅｄ．Ｔｈｅｆｏｌｏｗｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ：１）Ａｔｏｔａｌｏｆ３８４ｆｒａｇｍｅｎｔｓｗｅｒｅｉ
ｄｅｎｔｉｆｉｅｄｗｉｔｈ１６ＳＲＡＰｐｒｉｍｅｒｓｓｅｔｓ，ｏｆｗｈｉｃｈ８６．９８％ ｗｅｒｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ａｔｏｔａｌｏｆ２２１ａｌｅｌｅｓ
ｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄａｔ１６ＳＳＲｌｏｃｉ，ｗｉｔｈ１９２（８６．８８％）ｂｅｉｎｇｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｃｏｎｓｉｄｅｒａｂｌｅｇｅｎｅｔｉｃｖａｒｉａｔｉｏｎ
ａｔｔｈｅｓｐｅｃｉｅｓｌｅｖｅｌ．２）Ｔｈｅｍｅａｎｇｅｎｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙ（犎犲）ｗａｓｅｓｔｉｍａｔｅｄｔｏｂｅ０．１０９２ａｎｄ０．１２９６ｗｉｔｈｉｎｐｏｐｕｌａ
ｔｉｏｎｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＳＲＡＰａｎｄＳＳＲｍａｒｋｅｒｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄ０．２４３４ａｎｄ０．３７３２ａｔｔｈｅｓｐｅｃｉｅｓｌｅｖｅｌ．３）Ａｈｉｇｈ
ｌｅｖｅｌｏｆｇｅｎｅｔｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｍｏｎｇｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂａｓｅｄｏｎＮｅｉ’ｓｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎａｌｙｓｉｓｂｏｔｈｉｎ
ＳＲＡＰ（犌狊狋＝０．５５２５）ａｎｄＳＳＲ（犌狊狋＝０．５１５８）ｍａｒｋｅｒｓ，ａｎｄａｎｉｎｄｉｒｅｃｔｅｓｔｉｍａｔｅｏｆｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｍｉｇｒａｎｔｓｐｅｒ
ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（０．４０５０ｂｙＳＲＡＰｍａｒｋｅｒｓ，０．４６９４ｂｙＳＳＲｍａｒｋｅｒｓ）ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｇｅｎｅｆｌｏｗｗａｓｌｏｗａｍｏｎｇｐｏｐｕ
ｌａｔｉｏｎｓ．４）Ｓｈａｎｎｏｎ’ｓｉｎｄｅｘａｎａｌｙｓｉｓａｎｄＡＭＯＶＡａｎａｌｙｓｉｓｄｉｓｐｌａｙｅｄｔｈｅｓａｍｅｒｅｓｕｌｔｔｈａｔｍａｉｎｌｙｇｅｎｅｔｉｃｖａｒｉａ
ｔｉｏｎｏｆ犈．狊犻犫犻狉犻犮狌狊ｅｘｉｓｔｅｄａｍｏｎｇｔｈｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ａｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌｐａｔｔｅｒｎｏｆｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ
ｔｉｏｎ，ｗｈｅｒｅｔｈｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｆｒｏｍｓｏｕｔｈ，ｎｏｒｔｈａｎｄｍｉｄｄｌｅａｒｅａｏｆｓａｍｐｌｉｎｇｓｉｔｅｓｗｅｒｅｃｌｅａｒｌｙｓｅｐａｒａｔｅｄｆｒｏｍ
ｅａｃｈｏｔｈｅｒ，ｗａｓｒｅｖｅａｌｅｄｂｙｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓ．Ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｖａｉｌａｂｌｅｆｏｒｔｈｅｎａｔｉｖｅ犈．狊犻犫犻狉犻
犮狌狊，ｓｏｍｅｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｗｅｒｅｐｒｏｐｏｓｅｄ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犈犾狔犿狌狊狊犻犫犻狉犻犮狌狊；ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙ；ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅ；ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｌａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
（ＳＲＡＰ）；ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ（ＳＳＲ）
４３１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．４