全 文 ：书高寒草地禾草内生细菌犅４０１的
鉴定及生物防治潜力评价
畅涛，王涵琦，杨成德，王颖，杨小利，薛莉，陈秀蓉，徐长林
（草业生态系统教育部重点实验室 甘肃农业大学草业学院 甘肃省草业工程实验室 中－美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州７３００７０）
摘要：为了明确高寒草地禾草内生细菌Ｂ４０１的生物防治潜力，采用平板对峙法测定了其抑菌能力。抑菌谱表明，
Ｂ４０１对马铃薯坏疽病菌、马铃薯褐腐病菌、马铃薯炭疽病菌、马铃薯枯萎病菌、马铃薯干腐病菌、番茄早疫病菌、小
麦根腐病菌、孜然根腐病菌和黄瓜枯萎病菌的抑制率分别达７４．４５％，７１．５７％，７０．０５％，４８．０１％，５６．０１％，
６０．２５％，６４．６５％，４５．０１％和３１．７９％。在贮藏库中进行１０倍液喷雾，对马铃薯坏疽病的防效达５２．６７％。生物学
功能测定表明，该菌株在含有色氨酸和不含色氨酸的Ｋｉｎｇ培养基中分泌ＩＡＡ分别为３．４２和２．６０ｍｇ／Ｌ，且具有
固氮能力，无溶磷能力。对Ｂ４０１通过形态特征和生理生化测定，结合１６ＳｒＤＮＡ序列同源性分析，鉴定其为萎缩
芽孢杆菌（犅犪犮犻犾犾狌狊犪狋狉狅狆犺犪犲狌狊）。
关键词：禾草内生细菌；抑菌谱；生物学功能；鉴定
中图分类号：Ｓ８１２．２９；Ｓ４３２．４＋２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１４）０３０２８２０８
犇犗犐：１０．１１６８６／ｃｙｘｂ２０１４０３３４
随着化学农药的大量、频繁使用，造成环境污染、农药残留和增加抗性等问题也越来越严重，促使人们不断地
倡导绿色农业［１３］。因此，植物病害的生物防治成为了研究热点，其中尤以植物内生菌作为拮抗菌的研究得到众
多学者的青睐。植物内生细菌是指生活在植物的根、茎、叶、花、果实和种子中，但对植物没有任何实质性伤害的
细菌［４］。植物内生菌与植物能够互利互惠，究其原因则是由于植物为内生细菌提供生长必需的场所和营养等，而
内生细菌则通过其固氮、溶磷、抑菌及产生生物活性物质等生物功能，增强宿主植物的抗病性、抗虫性、抗旱性及
生长竞争能力等［５６］。学者通过研究发现植物内生菌对植物的促生作用体现在产ＩＡＡ来促进植物种子的发芽和
植株幼苗的生长［７１０］、通过联合固氮作用进行生物固氮［１１１３］和通过解磷或溶磷作用［１４１５］使植物能够尽可能地得
到养分的补充［１６１７］，从而使植物对生物量进行了积累。同时也有学者分离得到了具有良好拮抗作用或抑菌作用
的内生细菌。据报道，已从人参（犘犪狀犪狓犵犻狀狊犲狀犵）［１８］、棉花（犌狅狊狊狔狆犻狌犿）［１９］、桔梗（犘犾犪狋狔犮狅犱狅狀犵狉犪狀犱犻犳犾狅
狉狌犿）［２０］、向日葵（犎犲犾犻犪狀狋犺狌狊犪狀狀狌狌狊）［２１］、茄子（犛狅犾犪狀狌犿犿犲犾狅狀犵犲狀犪）［２２］、小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）［２３］、甜菜
（犅犲狋犪狏狌犾犵犪狉犻狊）［２４］、水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）［２５］和西红柿（犔狔犮狅狆犲狉狊犻犮狅狀犲狊犮狌犾犲狀狋狌犿）［２６］等植物体内分离得到内生菌
可以抑制病原菌对宿主植物进行侵染，从苦参（犛狅狆犺狅狉犪犲犳犾犪狏犲狊犮犲狀狋犻狊）［２７］、红树（犚犺犻狕狅狆犺狅狉犪犮犲犪犲）［２８］和珠芽蓼
（犘狅犾狔犵狅狀狌犿狏犻狏犻狆犪狉狌犿）［２９］等植物体内分离得到的内生菌可以抑制病原菌对其他植物的侵染。这些内生菌主
要是通过其核糖体途径产生某些细菌素和酶类及活性蛋白质类来溶解病原菌的细胞壁、抑制菌丝生长和孢子萌
发或造成畸形，也可以通过非核糖体途径产生的抗菌肽、脂肽物质或抗菌素通过锌离子通道或其他机制作用于病
原菌的细胞膜［３０３１］；从而对植物起到防病作用。由此可见，植物内生菌具有众多的生物学功能值得挖掘，而高寒
草地禾草作为优质牧草具有重要的应用价值，由于其内生菌的特殊生境，使内生菌具有耐低温等特性。因此，本
试验以高寒草地禾草内生菌Ｂ４０１为研究对象，对其生防能力和其他生物学功能进行了测定，并进行了鉴定，以
期为植物病害的生物防治和生物菌肥的研发提供菌种资源，也为高寒草地牧草内生细菌资源的开发提供理论依
据。
２８２－２８９
２０１４年６月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第２３卷 第３期
Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．３
收稿日期：２０１３０５１５；改回日期：２０１３０７０１
基金项目：国家自然科学基金（Ｎｏ．３１１６０１２２）和草业生态系统教育部重点实验室（甘肃农业大学）开放课题项目（Ｎｏ．ＣＹｚｓ２０１１０１１）资助。
作者简介：畅涛（１９８６），男，甘肃白银人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｃｈａｎｇｔ１９８６＠１２６．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｙａｎｇｃｄ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 供试菌株 供试病原菌：马铃薯坏疽病菌（犘犺狅犿犪犳狅狏犲犪狋犪）、马铃薯褐腐病菌（犛狋狔狊犪狀狌狊狊狋犲犿狅狀犻狋犻狊）、马铃
薯炭疽病菌（犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犮狅犮犮狅犱犲狊）、马铃薯枯萎病菌（犉狌狊犪狉犻狌犿犪狏犲狀犪犮犲狌犿）、马铃薯干腐病菌（犉狌狊犪狉犻狌犿狅狓
狔狊狆狅狉狌犿）、番茄早疫病菌（犃犾狋犲狉狀犪狉犻犪狊狅犾犪狀犻）、小麦根腐病菌（犅犻狆狅犾犪狉犻狊狊狅狉狅犽犻狀犻犪狀犪）、孜然根腐病菌（犉狌狊犪狉犻狌犿
狊狅犾犪狀犻）和黄瓜枯萎病菌（犉狌狊犪狉犻狌犿狅狓狔狊狆狅狉狌犿）。供试拮抗菌：Ｂ４０１，为高寒草地禾草内生菌。
以上供试病原菌和供试拮抗菌均由甘肃农业大学植物病理实验室提供。
供试农药：１０％氟硅唑（乳油，先正达有限公司）；５０％嘧菌酯（悬浮剂，先正达有限公司），均为马铃薯坏疽病
室内毒力测定较好的药剂［３２］。
供试植物及品种：马铃薯（犛狅犾犪狀狀犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿）新大坪，为来自于重病田的二级种薯。
１．１．２ 培养基 供试培养基为ＮＡ培养基、ＮＢ培养液、ＬＢ培养液和ＰＤＡ培养基，按参考文献［３３］配制。
１．２ Ｂ４０１生防能力的评价
１．２．１ Ｂ４０１抑菌能力的测定 采用平板对峙法，指示菌为马铃薯坏疽病菌、番茄早疫病菌、马铃薯干腐病菌、
黄瓜枯萎病菌、孜然根腐病菌、马铃薯褐腐病菌、马铃薯炭疽病菌、小麦根腐病菌和马铃薯枯萎病菌。将活化后的
指示菌打成６ｍｍ菌饼置于ＰＤＡ培养基的中央，与指示菌菌饼相隔２．５ｃｍ的圆周上等距离点接４次Ｂ４０１，每
个处理３次重复，２５℃下黑暗培养。采用十字交叉法测量抑菌直径并计算抑制率。
１．２．２ Ｂ４０１稳定性测定 将Ｂ４０１培养于ＮＢ平板上，连续转接（每隔３ｄ转接１次）１０代，后测定其对马铃薯
坏疽病菌的抑菌能力，并利用ＳＰＳＳ１６．０软件分析其稳定性。
１．２．３ Ｂ４０１对病原菌菌丝生长的影响 采用平板对峙法于接种后９ｄ观察病原菌菌丝形态并显微拍照。
１．２．４ 贮藏期防效试验 在甘肃省定西市马铃薯贮藏库进行；选择来自于重病田的２００个均匀一致的薯块，将
Ｂ４０１的发酵液（ＣＦＵ＝７．８３×１０１２）配制成１０倍液喷于薯块表面，用５０％嘧菌酯悬浮剂３０００倍液和１０％氟硅
唑乳油５０００倍液作药剂对照，清水为空白对照，于２０１０年１１月１５日喷药，２０１１年３月２３日检查发病率，利用
防效结果来评价Ｂ４０１的防病能力。
１．３ Ｂ４０１产ＩＡＡ、溶磷和固氮能力测定
１．３．１ 产ＩＡＡ的定性测定 采用Ｓａｌｋｏｗｓｋｉ比色法，对Ｂ４０１进行产ＩＡＡ的测定，３个重复均变红为阳性，表
示能分泌生长激素ＩＡＡ，均不变色为阴性，表示不分泌ＩＡＡ，颜色越深表示分泌数量越多。
１．３．２ 产ＩＡＡ的定量测定 采用纯３ＩＡＡ制作标准曲线。配制２组浓度依次为２．５，５．０，７．５，１０．０，１２．５，
１５．０，１７．５ｍｇ／Ｌ和２５，５０，７５，１００，１２５，１５０，１７５ｍｇ／Ｌ的标准液，分别取４ｍＬ，在１组中加入ＰＣ比色液４
ｍＬ，另一组中加入Ｓ２比色液４ｍＬ，黑暗静置０．５ｈ，取出后测定其ＯＤ５３０值，制作标准曲线。将培养１２ｄ的Ｂ
４０１的菌悬浮液和空白对照离心１０ｍｉｎ，转速为１００００ｒ／ｍｉｎ，取上清液４ｍＬ分别加入等量比色液，黑暗静置
３０ｍｉｎ后测定ＯＤ５３０值，以加了比色液的空白为对照。用相应的标准曲线计算菌株分泌ＩＡＡ的量。
１．３．３ 溶磷能力的定性测定 将Ｂ４０１点接于ＰＫＯ（或蒙金娜）平板培养基上，置于２８℃恒温培养箱培养５ｄ
后，观察菌株在培养基平板上形成的溶磷圈，有溶磷圈的记为阳性。
１．３．４ 固氮能力的定性测定 将Ｂ４０１用点接法接种在阿须贝培养基上，同时将２００μＬＢ４０１菌悬液接入阿
须贝液体培养基中，重复３次，以无菌水接种做对照，２８℃培养，在第３，５，７天目测其生长状况，在无氮培养基上
明显生长者和能使液体培养基变浑浊的记为阳性，继代培养３代仍为阳性，则认为具有固氮能力。
１．４ Ｂ４０１的鉴定
１．４．１ 培养性状和形态特征 Ｂ４０１活化后分别接种于ＮＡ平板、斜面及ＮＢ培养液，于２８℃下培养５ｄ后观察
培养性状。将Ｂ４０１在ＮＡ平板上活化培养１８～２４ｈ后进行革兰氏染色和芽孢染色，观察菌体和测量菌体的大
小（３０个），并显微拍照。
１．４．２ 生理生化测定 具体方法参照《伯杰细菌鉴定手册》［３４］和《常见系统细菌鉴定手册》［３５］进行。
３８２第２３卷第３期 草业学报２０１４年
１．４．３ １６ＳｒＤＮＡ序列分析 按上海生工提供的试剂盒（Ｅｚｕｐ柱式基因组ＤＮＡ抽提试剂盒，批号：８２５６１２０２）
提取ＤＮＡ并检测，对具有特异性ＤＮＡ条带的保存于－２０℃的冰箱备用。
使用引物１（５′ＣＣＧＧＡＴＣＣＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＡＴＧＧＣＴＣＡＧＣＡ３′）和引物２（５′ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＡＣＧＧＣ
ＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ３′）进行ＰＣＲ扩增，扩增条件为：９４℃预变性５ｍｉｎ，９４℃变性１０ｓ，５４℃退火２０ｓ，
６８℃延伸４０ｓ，３５个循环；最后在６８℃下延伸７ｍｉｎ，终止反应。反应体系：１０×ｂｕｆｆｅｒ（含 ＭｇＣｌ２）：５μＬ，ｄＮＴＰ
（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）：１μＬ。ｐｒｉｍｅｒ１（１０μｍｏｌ／Ｌ）：１μＬ，ｐｒｉｍｅｒ２（１０μｍｏｌ／Ｌ）：１μＬ，Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒｓｅ（２Ｕ／μＬ）：
０．４μＬ，ＴａｒｇｅｔＤＮＡ（１０ｎｇ／μＬ）：１μＬ，ｄｄＨ２Ｏ：４０．６μＬ，总体积为５０μＬ。经检测，将具特异性条带的扩增产
物送上海生工测序，所测序列与 ＧｅｎＢａｎｋ数据库中已报道的序列进行同源性比较，采用Ｃｌｕｓｔａｌ１．８软件和
Ｍｅｇａ４．０软件构建系统发育树，确定Ｂ４０１的系统发育学地位。
２ 结果与分析
２．１ Ｂ４０１的生防能力评价
２．１．１ Ｂ４０１抑菌谱的测定 禾草内生菌Ｂ４０１对马铃薯坏疽病菌、马铃薯褐腐病菌、马铃薯炭疽病菌、小麦根
腐病菌和番茄早疫病菌的抑制效果明显，分别达７４．４５％，７１．９７％，７０．０５％，６４．６５％和６０．２５％；对孜然根腐病
菌、马铃干腐病菌和马铃薯枯萎病菌的抑制效果在４５％以上；对黄瓜枯萎病菌具有一定的抑制效果（表１，图１）。
表明Ｂ４０１对马铃薯上多种病原菌及其他病原菌都具有抑制作用，可以一菌多防。
表１ 犅４０１的抑菌能力测定
犜犪犫犾犲１ 犜犺犲犻狀犺犻犫犻狋犻狅狀狉犪狋犲狅犳犅４０１犪犵犪犻狀狊狋狆犪狋犺狅犵犲狀犻犮犳狌狀犵犻
病原菌
Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｆｕｎｇｉ
菌落直径Ｄｉａｍｅｔｅｒｏｆｃｏｌｏｎｙ（ｃｍ）
对照ＣＫ Ｂ４０１
抑制率
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｒａｔｅ（％）
马铃薯枯萎病菌犉．犪狏犲狀犪犮犲狌犿 ７．１３±０．０４７ ４．１５±０．０３２ ４８．０１
孜然根腐病菌犉．犛狅犾犪狀犻 ７．４５±０．０４５ ４．３７±０．００７ ４５．０１
小麦根腐病菌犅．狊狅狉狅犽犻狀犻犪狀犪 ７．７７±０．０４７ ３．１３±０．０５２ ６４．６５
番茄早疫病菌犃．狊狅犾犪狀犻 ７．１８±０．０２２ ３．２２±０．０２２ ６０．２５
马铃薯干腐病菌犉．狅狓狔狊狆狅狉狌犿 ８．１２±０．０４２ ３．９０±０．１２５ ５６．１０
马铃薯褐腐病菌犛．狊狋犲犿狅狀犻狋犻狊 ８．０３±０．００２ ２．６８±０．０４５ ７１．９７
马铃薯炭疽病菌犆．犮狅犮犮狅犱犲狊 ６．８３±０．０８７ ２．４７±０．０３２ ７０．０５
黄瓜枯萎病菌犉．狅狓狔狊狆狅狉狌犿 ６．０７±０．０８２ ４．２０±０．１２５ ３１．７９
马铃薯坏疽病菌犘．犳狅狏犲犪狋犪 ８．２３±０．０１２ ２．５５±０．０２０ ７４．４５
２．１．２ Ｂ４０１稳定性测定 将拮抗菌Ｂ４０１的１０代菌与马铃薯坏疽菌对峙培养，结果表明，Ｂ４０１原菌株与其
继代（１０代）培养菌之间抑菌效果差异不显著（犘＞０．０５），说明该菌株的抑菌效果稳定（表２）。
２．１．３ Ｂ４０１对多种病原菌菌丝生长的影响 马铃薯坏疽病菌、马铃薯炭疽病菌和马铃薯褐腐病菌菌丝被
Ｂ４０１抑制后，有明显的畸形变化，菌丝断裂、细胞壁崩解、原生质外泄，菌丝产生泡囊、扭曲、变形，导致其原生质
凝聚和末端膨大（图２），说明Ｂ４０１可以通过使菌丝发生畸形变化来影响病菌菌丝生长。
２．１．４ 贮藏期防治试验 清水对照的发病率为３８．６０％，喷雾Ｂ４０１之后的发病率为１８．２６％，其防效为
５２．６７％，比５０００倍液１０％氟硅唑的防效低３４．６６％，但和３０００倍液嘧菌酯的差异不大（表３），说明Ｂ４０１具有
较好防治效果。
２．２ Ｂ４０１生物学功能测定
２．２．１ ＩＡＡ的定性测定 结果表明，不含色氨酸的培养液颜色变化较为明显，含１００ｍｇ／Ｌ色氨酸的培养液在
比色反应中呈红色，与对照差异明显（图３），说明在Ｋｉｎｇ培养基中加入１００ｍｇ／Ｌ的色氨酸能够增加Ｂ４０１合成
ＩＡＡ的量。
４８２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．３
图１ 犅４０１与９种病原菌的对峙照片
犉犻犵．１ 犅４０１犮狅狀犳狉狅狀狋狀犻狀犲犽犻狀犱狊狅犳狆犪狋犺狅犵犲狀犻犮犳狌狀犵犻狆犺狅狋狅狊
Ａ：小麦根腐病菌犅．狊狅狉狅犽犻狀犻犪狀犪；Ｂ：黄瓜枯萎病菌犉．狊狅犾犪狀犻；Ｃ：孜然根腐病菌犉．狊狅犾犪狀犻；Ｄ：马铃薯炭疽病菌犆．犮狅犮犮狅犱犲狊；Ｅ：马铃薯枯萎病菌犉．
犪狏犲狀犪犮犲狌犿；Ｆ：马铃薯干腐病菌犉．狅狓狔狊狆狅狉狌犿；Ｇ：番茄早疫病菌犃．狊狅犾犪狀犻；Ｈ：马铃薯褐腐病菌犛．狊狋犲犿狅狀犻狋犻狊；Ｉ：马铃薯坏疽病菌犘．犳狅狏犲犪狋犪．
２．２．２ ＩＡＡ 的定量测定 Ｂ４０１经连续培养１２ｄ
后，用ＰＣ和Ｓ２两种比色液测定ＯＤ５３０值，结果表明，
不含色氨酸的Ｋｉｎｇ培养液 ＯＤ５３０值为ＰＣ＝０．０８９和
Ｓ２＝０．０７３，通过标准曲线分泌ＩＡＡ 的浓度为２．６
ｍｇ／Ｌ；含１００ｍｇ／Ｌ色氨酸的Ｋｉｎｇ培养液ＯＤ５３０值为
ＰＣ＝０．１３２和Ｓ２＝０．０７７，其分泌ＩＡＡ的浓度为３．４２
ｍｇ／Ｌ，ＩＡＡ的合成量与前者相差较大，说明色氨酸的
存在能较明显增加Ｂ４０１合成ＩＡＡ的量。可认为外
源色氨酸是Ｂ４０１合成ＩＡＡ必须前体物质。
２．２．３ 溶磷能力的定性测定 结果表明，Ｂ４０１在
ＰＫＯ无机磷培养基和蒙金娜培养基上（有机磷培养
基）分别培养５ｄ之后，没有溶磷圈出现，说明Ｂ４０１
没有溶解有机磷和无机磷的能力。
表２ 继代培养菌株对坏疽病菌的抑制结果
犜犪犫犾犲２ 犜犺犲犻狀犺犻犫犻狋犻狅狀狉犪狋犲狅犳狊狌犫犮狌犾狋狌狉犲
犫犪犮狋犲狉犻犪犪犵犪犻狀狊狋犘．犳狅狏犲犪狋犪
项目
Ｉｔｅｍ
菌落直径
Ｄｉａｍｅｔｅｒｏｆｃｏｌｏｎｙ
（ｃｍ）
抑制率
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｒａｔｅ
（％）
对照ＣＫ ８．２３±０．０１２
１０代Ｂ４０１ＳｕｂｃｕｌｔｕｒｅＢ４０１ ２．６８±０．０１２ ７２．８２ａ
Ｂ４０１ ２．５５±０．０２０ ７４．４５ａ
注：不同小写字母表示差异显著（犘＜０．０５）。
Ｎｏｔｅ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｍａｌｌｅｔｔｅｒｓｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｔ犘＜０．０５
ｌｅｖｅｌ．
图２ 犅４０１对病原菌菌丝的影响
犉犻犵．２ 犐狀犳犾狌犲狀犮犲狅犳犅４０１犪犵犪犻狀狊狋犺狔狆犺狅犪犲狅犳狆犪狋犺狅犵犲狀犻犮犳狌狀犵犻
Ａ：炭疽处理Ｉｎｈｉｂｉｔｈｙｐｈｏａｅｏｆ犆．犮狅犮犮狅犱犲狊；Ｂ：炭疽对照Ｎｏｒｍａｌｈｙｐｈｏａｅｏｆ犆．犮狅犮犮狅犱犲狊；Ｃ束梗孢处理Ｉｎｈｉｂｉｔｈｙｐｈｏａｅｏｆ犛．狊狋犲犿狅狀犻狋犻狊；Ｄ：束梗孢
对照Ｎｏｒｍａｌｈｙｐｈｏａｅｏｆ犛．狊狋犲犿狅狀犻狋犻狊；Ｅ：坏疽病处理Ｉｎｈｉｂｉｔｈｙｐｈｏａｅｏｆ犘．犳狅狏犲犪狋犪；Ｆ：坏疽病对照Ｎｏｒｍａｌｈｙｐｈｏａｅｏｆ犘．犳狅狏犲犪狋犪．
５８２第２３卷第３期 草业学报２０１４年
表３ 犅４０１的防治效果
犜犪犫犾犲３ 犜犺犲犮狅狀狋狉狅犾犲犳犳犻犮犪犮狔狅犳犅４０１犪犵犪犻狀狊狋狆狅狋犪狋狅犵犪狀犵狉犲狀犲
项目Ｉｔｅｍ Ｂ４０１ １０％氟硅唑Ｆｌｕｓｉｌａｚｏｌｅ５０％嘧菌酯 Ａｚｏｘｙｓｔｒｏｂｉｎ ＣＫ
病薯率Ｒａｔｅｏｆｄｉｓｅａｓｅｐｏｔａｔｏ（％） １８．２６±０．１３４ ５．０４±０．２２０ １８．３４±０．１９８ ３８．６０±０．１２０
防效Ｃｏｎｔｒｏｌｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（％） ５２．６７ ８６．９３ ５２．４８
２．２．４ 固氮能力的定性测定 结果表明，Ｂ４０１点接
图３ 犅４０１比色反应
犉犻犵．３ 犅４０１犮狅犾狅狉犻犿犲狋狉犻犮狉犲犪犮狋犻狅狀
图４ 犅４０１的革兰氏染色和芽孢染色
犉犻犵．４ 犌狉犪犿狊狋犪犻狀犻狀犵（犃），狊狆狅狉犲狊狋犪犻狀犻狀犵（犅）狅犳犅４０１
图５ 犅４０１的１６犛狉犇犖犃电泳图
犉犻犵．５ １６犛狉犇犖犃犘犆犚犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊犿犪狆狅犳犅４０１
于阿须贝培养基后，在第３天时形成菌落，第５天时形
成明显的菌落；接种于液体培养基后，５ｄ后培养液变
浑浊。连续培养３代后，Ｂ４０１在第５天时同样能形
成菌落并能使培养液变浑浊，说明Ｂ４０１具有固氮能
力。
２．３ Ｂ４０１的鉴定
２．３．１ 形态观察 经革兰氏染色，Ｂ４０１为 Ｇ＋（图
４Ａ），其芽孢中生（图４Ｂ），菌体大小为２．８～６．０μｍ×
０．８～１．４μｍ。其在平板培养基上菌落大小约为０．４
ｃｍ，中间凸起如凸镜状，边缘平整，黏度较大，硬度小
且不透明，呈乳黄色。斜面培养基上，菌苔丰富，光滑，
颜色呈乳黄色，边缘呈刺毛状。液体培养基中，不形成
菌膜，沉淀少，无气泡，菌液颜色为培养液颜色。
２．３．２ 生理生化测定 Ｂ４０１具有将硝酸盐还原为
亚硝酸盐的能力，好氧生长，能够利用葡萄糖、阿拉伯
糖、木糖和甘露醇产酸，ＶＰ测定为阳性；能够水解酪
朊、淀粉、明胶、酪氨酸；能够利用丙酸盐和柠檬酸盐；
不能产生苯丙氨酸脱氨酶和卵磷脂酶，但能产生接触
酶；能够形成吲哚，表明该菌对植物具有促生作用；可
以在ｐＨ６．８和５．７的营养肉汤中生长，生长时可以
不需要ＮａＣｌ和ＫＣｌ；能够在１０％的氯化钠溶液中生
长；生长温度在５～５０℃。结合形态特征和生理生化
测定结果，初步认为Ｂ４０１属于芽孢杆菌属，种待定。
２．３．３ １６ＳｒＤＮＡ基因鉴定 提取Ｂ４０１的基因组
ＤＮＡ，在０．８％琼脂糖凝胶上电泳检测，条带清楚，且
无非特异性条带，满足１６ＳｒＤＮＡ的要求，可以进行
ＰＣＲ扩增。
１６ＳｒＤＮＡ的扩增和测序：用１６ＳｒＤＮＡ引物扩
增，产物经琼脂糖凝胶电泳检测，在１５００ｂｐ处有一明亮的ＰＣＲ特异性条带 （图５）。将ＰＣＲ产物送往上海生工测
序，所得Ｂ４０１的１６ＳｒＤＮＡ基因序列碱基长度为１４７５ｂｐ。
Ｂ４０１的１６ＳｒＤＮＡ序列系统发育分析：用ＢＬＡＳＴ软件经同源性比较，结果表明，Ｂ４０１与已报道的犅犪犮犻犾
犾狌狊犪狋狉狅狆犺犪犲狌狊（ＪＱ９１７９２０．１），犅犪犮犻犾犾狌狊狋犲狇狌犻犾犲狀狊犻狊 （ＪＦ４１１２８８．１），犅犪犮犻犾犾狌狊狊狌犫狋犻犾犻狊 （ＡＢ５４２９１２．１），犅犪犮犻犾犾狌狊
狆狌犿犻犾狌狊（ＥＵ３７９２７２．１）和犅犪犮犻犾犾狌狊犪狋狉狅狆犺犪犲狌狊（ＨＦ５４５３２５．１）等多株芽孢杆菌属的种相似性在９９％以上。将相似序
列用Ｃｌｕｓｔａｌ１．８软件进行多重序列比较后，再用 Ｍｅｇａ４．０软件邻接法构建系统发育树，Ｂ４０１与犅．犪狋狉狅狆犺犪犲狌狊同
源性最近（图６），再结合菌体形态，生理生化特征将Ｂ４０１确定为芽孢杆菌属的萎缩芽孢杆菌（犅犪犮犻犾犾狌狊犪狋狉狅狆犺犪犲狌狊）。
６８２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．３
图６ 犅４０１的１６犛狉犇犖犃系统发育树
犉犻犵．６ １６犛狉犇犖犃狆犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲狅犳犅４０１
３ 结论与讨论
李振东等［２９］分离得到的以色氨酸为合成ＩＡＡ
途径的内生菌Ｚ５在外源色氨酸诱导时分泌ＩＡＡ的
浓度为６８．６２ｍｇ／Ｌ，是不加色氨酸产ＩＡＡ浓度的
１３．４倍，Ｂ４０１无外源色氨酸诱导时分泌ＩＡＡ的浓
度为２．６０ｍｇ／Ｌ，外源色氨酸诱导分泌ＩＡＡ的浓度
为３．４２ｍｇ／Ｌ，二者对比较为明显；说明Ｂ４０１能够
产ＩＡＡ，且以色氨酸为前体物合成ＩＡＡ的途径是
Ｂ４０１合成ＩＡＡ多种途径［３６］的其中一条。Ｆｏｒｃｈｅｔ
ｔｉ等［２１］和Ｚｈａｎｇ等［３７］认为生物菌肥应针对于具有固氮和分泌ＩＡＡ能力的植物内生菌进行开发，而本研究结果
表明，Ｂ４０１能够在阿须贝培养基上生长，且能使无氮培养液变浑浊，连续培养之后，此结果差异不显著，说明Ｂ
４０１不仅具有分泌ＩＡＡ的能力还具有固氮的能力，证明Ｂ４０１对植物具有促生作用，但对其固氮酶活性和对盆栽
或大田作物的促生作用还需进一步研究。
近年来，学者对于拮抗菌的抑菌机制进行了深入的研究，明确了拮抗菌可以通过分泌几丁质酶、β葡聚糖酶
和胞外蛋白酶等酶类物质及以抗菌肽为主的多肽物质来抑制病原菌的生长［３０］。甘肃马铃薯产业是农民较为重
要的经济产业支柱，但据报道，甘肃近年来的马铃薯发病严重，烂薯率较高，其中尤以检疫病害马铃薯坏疽病最为
严重［３２］。本试验研究表明，Ｂ４０１对马铃薯坏疽病菌、炭疽病和褐腐病具有较好的抑制作用，抑制率分别达
７４．４５％，７０．０５％和７１．９７％，且能使以上病原菌的菌丝断裂、扭曲和变形，并使病原菌的细胞壁崩解，但不清楚
是其分泌物中的哪一种抑菌物质在起作用，还需要进一步研究其抑菌机理。经测定，Ｂ４０１的室内拮抗能力较好
且其１０代稳定性良好。由于马铃薯块茎贮藏期长，于贮藏库中不易进行化学防治，而Ｂ４０１在贮藏期对马铃薯
块茎进行喷雾处理后，其可以定殖在马铃薯块茎表面，且在贮藏期的防效能够达到５２．６７％，具有不污染环境和
不造成农药残留，还能较好地防治马铃薯贮藏期的主要病害，克服了化学防治的缺点。但对Ｂ４０１的发酵工艺的
优化以及在大田中使用的稳定性和防治效果等还需要进一步研究。
高寒草地禾草内生细菌Ｂ４０１为Ｇ＋，其芽孢中生，菌体大小为２．８～６．０μｍ×０．８～１．４μｍ。结合生理生
化特征及１６ＳｒＤＮＡ序列分析将其鉴定为犅．犪狋狉狅狆犺犪犲狌狊。Ｂ４０１能够产生ＩＡＡ，具有固氮能力，无溶磷能力，且
抑菌谱较广，说明该菌株具有防病促生的作用，与何红等［３８］认为植物内生菌具有植物保护和促生的生物学作用
观点一致，因此Ｂ４０１不仅能用于生物农药的开发，还能用于微生物肥料的研发，应用前景广阔。
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犵狉犪狀犱犻犳犾狅狉狌犿）ｒｏｏｔａｎｄｔｈｅｉｒａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ［Ｊ］．ＣｕｒｒｅｎｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１０，６１：３４６３５６．
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犲狀犱狅狆犺狔狋犻犮犫犪犮狋犲狉犻犪犻狀犵狉犪狊狊犲狊狅狀犪犾狆犻狀犲犵狉犪狊狊犾犪狀犱狊
ＣＨＡＮＧＴａｏ，ＷＡＮＧＨａｎｑｉ，ＹＡＮＧＣｈｅｎｇｄｅ，ＷＡＮＧＹｉｎｇ，ＹＡＮＧＸｉａｏｌｉ，
ＸＵＥＬｉ，ＣＨＥＮＸｉｕｒｏｎｇ，ＸＵＣｈａｎｇｌｉｎ
（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＧｒａｓｓｌａｎｄＥｃｏｓｙｓｔｅｍ，ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，
ＣｏｌｅｇｅｏｆｐｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ，ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＧａｎｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅ；ＳｉｎｏＵ．Ｓ．ＣｅｎｔｅｒｆｏｒＧｒａｚｉｎｇｌａｎｄ
ＥｃｏｓｙｓｔｅｍＳｕｓｔａｉｎａｂｉｌｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：ＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｏｎｔｒｏｌｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆＢ４０１ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａｉｎｇｒａｓｓｅｓｏｎａｌｐｉｎｅｇｒａｓｓｌａｎｄｓ，
ｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃａｂｉｌｉｔｙｗａｓｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｂｙｄｕａｌｃｕｌｔｕｒｅａｇａｉｎｓｔｐｌａｎｔｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｆｕｎｇｉ．Ｂ４０１
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ｉｎｇｔｈｅｓｔｏｒａｇｅｐｅｒｉｏｄ．ＴｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＩＡＡｓｅｃｒｅｔｅｄｂｙＢ４０１ｉｎＫｉｎｇ’ｓｍｅｄｉｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ１００ｍｇ／Ｌ
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ｏｎｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙａｎｄｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｓ，ｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈ１６ＳｒＤＮＡｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ，
Ｂ４０１ｗａｓｉｎｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓ犅犪犮犻犾犾狌狊犪狋狉狅狆犺犪犲狌狊．
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９８２第２３卷第３期 草业学报２０１４年