全 文 ：中国测试
CHINA MEASUREMENT & TEST
Vol.42 No.3
March，2016
第 42卷第 3期
2016年 3月
响应面法优化红花酢浆草抑菌活性物质的提取工艺研究
张玉枫 1， 张金华 1， 黄 瑶 1， 李开秀 1， 杨莉娜 2， 王 丹 1
（1.成都医学院生物医学系，四川 成都 610500；2.中国科学院环境与应用微生物重点实验室，四川 成都 610041）
摘 要：为建立红花酢浆草抑菌活性物质的最佳提取工艺，在单因素实验的基础上，选取提取时间、乙醇体积分数和
固液比为自变量，抑菌圈直径为响应值，建立数学模型，求解得到最佳提取条件和理论最大抑菌圈并验证。 结果显示，
红花酢浆草抑菌活性物质的最佳提取工艺为：乙醇体积分数 73%，提取时间 78min，固液比 1∶31 g/mL。 此时，红花酢浆
草醇提取物拮抗金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为 30.17mm，较优化前提高 67.61%。 响应面优化法不仅效率高，而且
可靠性强，可准确预测抑菌圈直径。 同时，证明红花酢浆草的醇提取物具有较为广泛的抑菌谱。
关键词：红花酢浆草；抑菌活性；响应面法；抑菌谱；提取工艺
文献标志码：A 文章编号：1674-5124（2016）03-0053-06
Extraction process optimization of antibacterial active substance from
Oxalis corymbosa by response surface method
ZHANG Yufeng1，ZHANG Jinhua1，HUANG Yao1，LI Kaixiu1，Yang Li’na2，WANG Dan1
（1. Department of Biomedicine，Chengdu Medical College，Chengdu 610500，China；
2. Key Laboratory of Environmental and Applied Microbiology，Chengdu Institute of Biology，
Chinese Academy of Sciences，Chengdu 610041，China）
Abstract: An optimum process is designed for extracting antibacterial active substance from Oxalis
corymbosa. The extraction time， ethanol concentration and solid -liquid ratio are selected as
independent variables based on single factor experiment and the diameter of the inhibition zone is
considered as response value. After that， a mathematical model is established to calculate and
verify the optimal extraction conditions and the theoretically maximum inhibition zone. The optimum
extraction process is shown as follows：73% ethanol concentration，78min extraction time，1∶31g/mL
solid-liquid ratio. Under these conditions，the maximum antibacterial diameter is 30.17 mm，which
has been increased by 67.61% after optimization. The response surface optimization method
introduced in this paper is not only efficient but also reliable； with it， the inhibition zone
diameter has been accurately predicted. Besides，the alcohol extract of Oxalis corymbosa has been
proved to have a wide range of antibacterial spectra.
Keywords: Oxalis corymbosa；antimicrobial activity；response surface method；antibacterial spectrum；
extraction process
收稿日期：2015-10-18；收到修改稿日期：2015-11-23
基金项目：四川省教育厅重点项目（16ZA087）；国家级大学生创新训练项目（201513705006）；中国科学院环境与应用微生物重
点实验室开放基金项目（KLCAS-2014-04）
作者简介：张玉枫（1993-），男，四川宜宾市人，专业方向为生物技术。
通讯作者：王 丹（1977-），女，辽宁辽阳市人，副教授，博士，主要从事生物制药相关方向的研究。
doi：10.11857/j.issn.1674-5124.2016.03.013
中国测试 2016年 3月
0 引 言
目前，抗生素滥用引起的致病菌株耐药问题日趋
严重[1-2]。研究发现，中草药抗菌谱广、副作用小、耐药
性低，同时兼具来源广泛、价格低廉等优点[3-4]；因此，
筛选抗菌中草药、 探究其作用机制逐渐成为研究热
点 [5-6]。 红花酢浆草（Oxalis corymbosa）又名三叶草、
大酸味草等，原产巴西和南非好望角，在我国分布广
泛[7]。 作为一种传统中药，红花酢浆草常用于治疗咽
峡炎、扁桃体炎、腮腺炎等疾病[8]。目前，已证实酢浆草
中富含多种生物活性物质，如 β-谷甾醇、β-生育酚、胡萝
卜苷、酒石酸等 [9-10]。 其中，黄酮类、总酚类物质具有
较强的抗菌及抗氧化等生物活性[11-12]。本课题组在前
期研究中，分别以细菌、真菌作为指示菌，利用杯碟
法检测黄葛兰紫荆、马蓼、千里香等 20 种植物的抑
菌活性，其中红花酢浆草乙醇提取物的抑菌活性最
佳，且抑菌谱广泛。 此外，和正交试验相比，响应曲面
法采用多元二次回归方法， 通过研究因素与因素间
的交互作用，对拟合后的回归方程进行分析，筛选最
佳提取条件，同时能直观地分析各因素的相互影响，
试验周期短，结果更加直观、可靠[13-14]。因此，本文利用
响应面法优化红花酢浆草抑菌活性物质的提取工艺。
1 材料与仪器
1.1 药品与试剂
红花酢浆草，采自成都植物园及成都医学院校园；
乙醇、氯化钠、蛋白胨、牛肉膏、琼脂等均为分析纯，
购自成都科龙公司。
1.2 菌种与培养基
巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、姜瘟病菌
（Ralstonia solanacearum）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus
acidophilus）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、
沙门氏杆菌（Salmonella enteritidis）等细菌；白色念
珠菌（Monilia albican）、八孢裂殖酵母（Schizosaccha-
romyces octosporus）、汉逊酵母 （Hansenula polymor-
pha）、假丝酵母（Candida albicans）、隐球酵母（Cryp-
tococcus neoformans）、土曲霉 （Aspergillus terreus）、
黄曲霉（Aspergillus flavus）、黑根霉（Rhizopus nigri-
cans）、放射毛霉 （Actinomucor elegans）、绿色木霉
（Trichoderma viride）等真菌保存于成都医学院生物
技术实验中心。
指示细菌培养基为 NA 培养基；指示真菌培养
基为 PDA培养基。
1.3 仪 器
旋转蒸发仪（SWITZERLAND 公司）；SHB-IIIG
真空泵：（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；ZH-
WY-100H 恒温培养振荡器（海智城分析仪器制造有
限公司）；SW-GJ-2FD 洁净工作台 （苏州安泰空气
技术有限公司）；DHG-9203A 型电热恒温鼓风干燥
箱（上海三发科学仪器有限公司）。
2 方 法
2.1 抑菌活性物质的制备
采集新鲜红花酢浆草叶和茎，洗净，50℃烘箱内
烘干。 经打粉机粉碎为≤100目的粉末，4℃避光保存。
采用冷浸法提取红花酢浆草的抑菌活性物质[15]：称取
粉末 4 g，装入 250 mL 三角瓶，按照 1∶50 g/mL 加入
50%的乙醇 200mL，室温静置 2 d。 布氏漏斗真空抽
滤，收集滤液，将滤液转移到蒸馏烧瓶中蒸馏浓缩。
蒸馏温度为 50℃，浓缩到 10 mL，45 μm 微孔滤膜过
滤除菌后，4℃冰箱避光保存。
2.2 抑菌活性检测
采用管碟法检测提取液的体外抑菌活性。 指示
菌选用革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性
菌沙门氏杆菌， 将 OD600在 2.2～2.4 的菌液稀释 100
倍，每个 LB平板加 130μL 稀释菌液，涂布均匀。 每
个平板放 3个牛津杯，每个平板设置 3 个平行组，每
个牛津杯中加入提取液 200 μL，4 ℃冰箱放置 4 h
后，37℃过夜培养，最后检测抑菌圈直径。
2.3 单因素实验
以抑菌直径为考核指标，对乙醇浓度、提取时间、
提取温度、固液比和提取次数 5 个提取条件进行优
化，各个变量的取值范围见表 1。
2.4 响应面法确定最佳提取工艺
通过单因素实验，选取提取时间、乙醇体积分数
和固液比这 3 个主要的提取条件，提取温度设定为
50℃，提取次数设定为 1 次。以提取液对金黄色葡萄
球菌的抑菌圈直径为响应值，进行响应面法的 Box-
Behnken优化设计。 以提取温度、乙醇体积分数和固
液比为变量，通过 Design Expect8.0.6进行试验设计，
结果见表 2。
3 结 果
3.1 抑菌谱测定
由表 3可见，红花酢浆草乙醇提取物不仅抑制巨
大芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌等 11 种
编号
乙醇体积
分数/%
提取时间/
min
提取温度/
℃
固液比/
（g·mL-1）
提取次数/
次
1 10 10 40 1∶5 1
2 30 40 50 1∶15 2
3 50 70 60 1∶25 3
4 70 100 70 1∶35 -
5 90 130 80 1∶45 -
表 1 5 个提取条件的取值范围
54
第 42卷第 3期
图 4 固液比对抑菌圈直径的影响
1∶25
固液比/（g·mL-1）
0
5
10
15
20
抑
菌
圈
直
径
/m
m
1∶151∶05 1∶35 1∶45
a a
b b b b b b b
c
金黄色葡萄球菌
沙门氏杆菌
细菌，还可以抑制白色念珠菌、土曲霉、绿色木霉等
10种真菌的生长，具有较广的抑菌谱。
3.2 单因素实验
3.2.1 提取时间对抑菌效果的影响
分别以革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏
阴性菌沙门氏杆菌为指示菌，考察提取时间对乙醇
提取物抑菌活性的影响。 由图 1可知，随着时间的增
加，乙醇提取物的抑菌圈直径逐渐增大；当提取时间
超过 70min 后，抑菌圈直径开始减小。 究其原因，可
能是提取时间过长，导致有效物质的分解失活，最终
确定最佳提取时间为 70min。
3.2.2 提取温度对抑菌效果的影响
由图 2可见，随着提取温度的增加，乙醇提取物
的抑菌圈直径逐渐增大。 当超过 50℃后，继续升高
温度，抑菌圈直径开始降低。这可能是因为温度过高
导致有效物质失活，因此确定最佳提取温度为 50℃。
3.2.3 乙醇体积分数对抑菌效果的影响
研究发现，随着乙醇体积分数的增加，红花酢浆
草乙醇提取物的抑菌圈直径逐渐增大，当乙醇体积
分数达到 70%时，达到最大值。 而乙醇提取分数为
90%时，提取物抑菌活性下降。 这可能是因为乙醇
体积分数过大时水溶性的有效物质溶解减少，其他
没有活性的脂溶性物质溶解增加，故确定最佳乙醇
体积分数为 70%。
3.2.4 固液比对抑菌效果的影响
从图 4中可见，对于金黄色葡萄球菌而言，固液
比从1∶5 增加到 1∶15 后抑菌圈直径增大，但继续增
大固液比后，抑菌圈直径变化不大。 T检验可以看出
不同固液比之间没有显著性差异。而以沙门氏杆菌作
为指示菌时，随着固液比从 1∶5增加到 1∶35的过程中，
抑菌圈直径逐渐增大，但继续增大固液比后，抑菌圈
直径开始降低。 T检验可以看出 1∶35 下的固液比与
1∶5、1∶25 和 1∶45 下的抑菌圈直径之间的 P＜0.05，有
显著性差异，存在统计学意义，于是最佳固液比值确
定为 1∶35。
3.2.5 提取次数对抑菌效果的影响
从图 5中可以看出， 对于金黄色葡萄球菌而言，
随着提取次数从 1次变为 2次后， 抑菌圈直径显著增
大，而 3 次时抑菌圈直径略微减小，但差异不显著。
当以沙门氏杆菌作为指示菌时，从图中可以看出随着
提取次数的增加抑菌圈直径逐渐增大。 但从减少生
产能耗的角度，提取次数确定为 1次。
3.3 响应面法确定最佳提取工艺
3.3.1 Box-Behnken 试验设计及结果
根据单因素试验结果，确定影响红花酢浆草乙
醇提取物对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径的主要因素
金黄色葡萄球菌
沙门氏杆菌
a a a
a a a
b
b
b b
10 40 70 100 130
提取时间/min
0
5
10
15
20
抑
菌
圈
直
径
/m
m
柱形图以平均值±标准差表示，重复次数为 3 次，不同
字母之间表示差异显著（T 检验 P<0.05），下同。
图 1 提取时间对抑菌圈直径的影响
0
5
10
15
20
抑
菌
圈
直
径
/m
m
30 40 50 60 70
提取温度/℃
a a a a a a ac
b b
金黄色葡萄球菌
沙门氏杆菌
图 2 提取温度对抑菌圈直径的影响
图 3 乙醇体积分数对抑菌圈直径的影响
10 30 50 70 90
乙醇体积分数/%
0
5
10
15
20
抑
菌
圈
直
径
/m
m
a a
b b b
b
b
b
c c
金黄色葡萄球菌
沙门氏杆菌
水平 X1：提取时间/min X2：乙醇体积分数/% X3：固液比/（g·mL-1）
-1 40 40 1∶25
0 70 70 1∶35
1 100 100 1∶45
表 2 响应面分析实验因素水平表
张玉枫等：响应面法优化红花酢浆草抑菌活性物质的提取工艺研究 55
中国测试 2016年 3月
方差来源 预测值 标准差 F 值 P 值
常数项 29.99 0.38 - -
X1 0.47 0.30 2.42 0.164 1
X2 0.39 0.30 1.66 0.239 1
X3 -0.73 0.30 5.95 0.044 8
X1×X2 1.26 0.42 8.87 0.020 6
X1×X3 -0.83 0.42 3.85 0.090 6
X2×X3 -0.51 0.42 1.48 0.263 0
X1×X1 -1.77 0.41 18.51 0.003 6
X2×X2 -3.57 0.41 75.11 <0.000 1
X3×X3 -1.39 0.41 11.35 0.011 9
表 5 回归方程系数显著性结果
图 5 提取次数对抑菌圈直径的影响
1 2 3
提取次数
0
5
10
15
20
抑
菌
圈
直
径
/m
m
a a b b b
b
金黄色葡萄球菌
沙门氏杆菌 试验编号 X1 X2 X3 Y1/mm
1 0 -1 1 23.71
2 -1 -1 0 25.11
3 1 0 -1 28.19
4 0 0 0 29.81
5 1 1 0 26.70
6 0 01 0 30.00
7 -1 1 0 23.44
8 0 1 1 23.44
9 0 -1 -1 25.66
10 -1 0 1 27.13
11 1 0 1 26.59
12 0 1 -1 27.38
13 0 0 0 30.44
14 -1 0 -1 25.41
15 1 -1 0 23.33
16 0 0 0 29.72
17 0 0 0 30.00
表 3 Box-Behnken 试验设计及结果
为提取时间、乙醇体积分数和固液比。按表 2的因素
与水平设计一个 3 因素 3 水平的优化试验方案，其
中中心点为 5个，总共 17组试验。
3.3.2 建立数学模型
利用 Design-Expert.8.0.6 软件对表 4 中实验数
据进行多元回归拟合，可得到提取时间、乙醇体积分
数和固液比与抑菌直径的二次多元回归方程：
Y1=29.99+0.47×X1+0.39×X2-0.73×X3+
1.26×X1×X2-0.83×X1×X3-0.51×X2×X3-
1.77×X1×X2-3.57×X2×X2-1.39×X3×X3
3.3.3 方差分析
对表 3中的实验结果进行统计学分析， 得到的
方差分析结果如表 4 所示。 F 检验（P=0.000 9）证明
回归方程在统计学上是显著的，相关系数 r2=0.952 0，
说明响应面 95.20%的变化可以用该模型来解释。
只有 0.08%的改变不能通过该模型拟合得到 ，可
能是噪点的干扰。 回归方程系数显著性结果见表 5。
X3（P=0.044 8）、X1 和 X2 的交互作用（P=0.020 6）、
X1 的二次项（P=0.003 6）、X2 的二次项（P<0.001)、
X3 的二次项（P=0.011 9）对抑菌圈的直径影响显著。
X1、X2、X1和 X3的交互作用、X2和 X3 的交互作用对
抑菌圈直径没有显著性影响。
3.3.4 响应曲面分析
应用 Design-Expert.8.0.6 软件绘制响应曲面图，
可直观反映各因素对响应值影响的变化趋势，图示
表明在所选因素水平范围内，均有最大响应值出现。
如图 6所示，在本试验水平范围内，当固液比处于中
心水平（C=0）时，提取时间和乙醇体积分数交互影
响红花酢浆草抑菌物质提取的曲面图和等高线图，
由等高线的形状可以看出两因素的交互作用显著
（椭圆形代表两因素交互作用显著）。
如图 7所示，在本试验水平范围内，当乙醇体积
分数处于中心水平（B=0）时，提取时间和固液比不
同水平上的变化，引起响应值的变化不显著，所以提
取时间和固液比的交互作用不明显。
如图 8所示，在本试验水平范围内，当提取时间
处于中心水平（A=0）时，随着固液比和乙醇体积分
数的改变，响应值抑菌圈直径变化不大，所以说乙醇
体积分数和固液比的交互作用不明显。
Source 平方和 自由度 均方差 F 值 P 值
model 117.22 9 13.02 14.80 0.000 9
X1 2.31 1 2.31 2.63 0.149 1
X2 1.82 1 1.82 2.07 0.193 1
X3 4.03 1 4.03 4.58 0.069 6
X1×X2 1.59 1 1.59 1.80 0.221 1
X1×X3 2.76 1 2.76 3.13 0.120 1
X2×X3 2.10 1 2.10 2.39 0.166 1
X1×X1 17.93 1 17.93 30.37 0.002 8
X2×X2 69.87 1 69.87 79.40 <0.00 1
X3×X3 6.67 1 6.67 7.58 0.028 4
残差 6.61 7 0.88 - -
失拟差 4.45 3 1.48 3.48 0.129 8
纯误差 1.71 4 0.43 - -
总离差 123.38 16 - - -
表 4 响应面二次模型方差分析表
56
第 42卷第 3期
（a）响应面图
50.00
58.00
66.00
74.00
82.00
90.00
乙醇体积分数/%
40.00
40.00
35.00
30.00
25.00固液比/（g·mL-1）
20
22
24
26
28
30
32
抑
菌
圈
直
径
/m
m
28
27
26
25
29
5
30
27
26
27
26
25
50.00 58.00 66.00 74.00 82.00 90.00
乙醇体积分数/%
25.00
30.00
35.00
40.00
45.00
固
液
比
/（
g·
m
L-
1 ）
（b）等高线图
图 8 乙醇体积分数和固液比交互作用等高线图
因素 X1/min X2/% X3/（g·mL-1）
逻辑值 0.26 0.126 -0.363
理论值 77.81 72.52 1∶31.37
实际值 78.00 73.00 1∶31
表 6 模型最佳条件的验证
抑
菌
圈
直
径
/m
m
固液比/（g·mL-1） 提取时间/min40.00 52.00
64.00
76.00
88.00
100.0045.00
40.00
35.00
30.00
25.00
20
22
24
26
28
30
32
（a）响应面图
27
28
29
27
30
29
5
27
固
液
比
/（
g·
m
L-
1 ）
提取时间/min
45.00
40.00
35.00
30.00
25.00
40.00 46.00 52.00 58.00 64.00 70.00 76.00 82.00 88.00 94.00 100.00
（b）等高线图
图 7 提取时间和固液比交互作用等高线图
32
30
28
26
24
22
20抑
菌
圈
直
径
/m
m
90.00
82.00
74.00
乙醇体积分数/%
66.00
58.00
50.00
100.00
88.00
提取时间/min
76.00
64.00
52.00
40.00
（a）响应面图
26
30528
26
26
24
乙
醇
体
积
分
数
/%
40.00 46.00 52.00 58.00 64.00 70.00 76.00 82.00 88.00 94.00 100.00
提取时间/min
50.00
58.00
66.00
74.00
82.00
90.00
（b）等高线图
图 6 提取时间和乙醇体积分数交互作用等高线图
3.3.5 最大抑菌直径和最佳提取条件的确定
应用 Design-Expert8.0.6 软件预测的理想结果
为：提取时间为 77.81 min，固液比为 1 ∶31.37，乙醇
体积分数为 72.52%；此时，获得的抑菌圈直径可达
30.21mm，如图 9所示。为了便于试验，提取时间定为
78 min，固液比采用 1 ∶31 g/mL，乙醇体积分数定为
73%（见表 6）。用以上最佳提取条件重复实验 3次，抑
菌圈直径为 30.25，30.16，30.11mm，平均值为 30.17mm，
与预测值有很好的拟合性，证明了模型的可行性。
4 结束语
通过单因素实验和响应面法 Box-Behnken 分析
建立了红花酢浆草抑菌活性物质的最佳提取工艺：
提取时间 78 min，固液比 1∶31 g/mL，乙醇体积分数
73%，此时获得的抑制金黄色葡萄球菌的抑菌圈最大
值为 30.17mm， 较优化之前提高了 67.61%（优化前
后的抑菌圈直径对比如图 10所示）。由此可见，本文
利用响应面法建立数学模型可靠性强，能准确预测
抑菌圈的直径，这为下一步的抑菌活性物质的分离、
纯化，抑菌作用机制研究提供理论依据。
张玉枫等：响应面法优化红花酢浆草抑菌活性物质的提取工艺研究 57
中国测试 2016年 3月
优化前
对照
优化后
图 10 优化前后的抑菌圈直径
30.2118
24
26
28
30
32
抑
菌
圈
直
径
/m
m
乙醇体积分数/% 提取时间/min40.00 52.00
64.00
76.00
88.00
100.0090.00
82.00
74.00
66.00
58.00
50.00
（a）响应面图
90.00
82.00
74.00
66.00
58.00
50.00
乙
醇
体
积
分
数
/%
30
26
28
26 24
Prediction 30.2118
40.00 46.00 52.00 58.00 64.00 70.00 76.00 82.00 88.00 94.00 100.00
提取时间/min
（b）等高线图
图 9 响应面模拟最大抑菌圈直径
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（编辑：莫婕）
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