全 文 ：书转红树总犇犖犃紫花苜蓿犜１代耐盐株系的
生理生化特性分析
张立全１，敖登花１，师文贵２，牛一丁１，韩岚１，哈斯阿古拉１
（１．内蒙古大学生命科学学院 内蒙古自治区牧草与特色作物生物技术重点实验室，内蒙古 呼和浩特０１００２１；
２．中国农业科学院草原研究所，内蒙古 呼和浩特０１００１０）
摘要：以花粉管通道法转红树总ＤＮＡ紫花苜蓿阿尔冈金Ｔ１ 代耐盐植株幼苗为材料，经３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ处理后，
测定叶绿素、脯氨酸、丙二醛含量和抗氧化酶活性等耐盐相关生理生化指标。结果显示，转基因株系叶绿素含量下
降０．０９～０．２９倍，而对照植株下降０．３２倍；转基因株系脯氨酸含量升高１．２～４．２倍，对照植株的脯氨酸升高０．９
倍；转基因株系丙二醛含量升高０．１５～０．２９倍，对照植株的丙二醛含量升高０．３６倍；转基因株系超氧化物歧化酶
活性升高０．２０～０．２５倍，对照植株的超氧化物歧化酶活性升高０．１９倍；转基因株系过氧化物酶和过氧化氢酶活
性分别是对照的１．６～５．６倍和１．２～１．３倍。转基因株系表现出耐盐植物的生理生化特性。
关键词：紫花苜蓿；花粉管通道法；红树总ＤＮＡ；Ｔ１ 代株系；耐盐
中图分类号：Ｑ９４３．２；Ｓ５４１＋．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１２）０２０１４９０７
土壤盐渍化影响着农业生产、生态环境以及可持续发展，是人类面临的世界性问题［１］。全球盐碱地占陆地面
积约７．６％［２］，我国是盐碱地面积较大的国家之一，有盐碱地约３４６０万ｈｍ２，其中盐渍化耕地６００万ｈｍ２［３］，并
随着生态环境的恶化和不合理开发利用，仍在进一步扩大。因此，开发利用盐碱地资源，对发展我国经济有着重
要战略意义。紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）是豆科苜蓿属多年生草本植物，其蛋白质含量高，维生素和矿物质含
量丰富，氨基酸种类齐全，动物必需氨基酸特别是赖氨酸含量高，且适口性好，易于动物的消化吸收，是利用价值
最高的优质豆科牧草［４］，素有“牧草之王”的称号。但紫花苜蓿属于中等耐盐植物，适宜在轻度盐碱地上种植［５］。
因此耐盐紫花苜蓿品种的选育，对开发利用盐碱地、发展畜牧业，促进经济发展具有举足轻重的作用。
随着生物技术的发展，利用转基因技术进行育种既可以有效地打破物种界限，又可达到定向改良植物的目
的［６］。花粉管通道法的建立使得直接将耐盐植物总ＤＮＡ导入受体植物，来选育耐盐新种质成为可能。林栖凤
等［７，８］利用花粉管通道法将海岸盐生植物红树（犚犺犻狕狅狆犺狅狉犪犪狆犻犮狌犾犪狋犪）ＤＮＡ 导入番茄（犔狔犮狅狆犲狉狊犻犮狅狀犲狊犮狌犾犲狀
狋狌犿）、辣椒（犆犪狆狊犻犮狌犿犪狀狀狌狌犿），获得了耐盐能力明显增强的变异后代。肖军等［９］利用花粉管通道法将碱蓬
（犛狌犪犲犱犪狊犪犾狊犪）总ＤＮＡ导入番茄自交系Ｓ６０，获得了抗盐植株，而且初步证实碱蓬基因整合到抗盐番茄的基因
组中。张立全等［１０］以紫花苜蓿阿尔冈金品种为受体，应用花粉管通道法导入盐生植物红树总ＤＮＡ，筛选获得了
Ｔ０ 代耐盐植株，自交获得Ｔ１ 代种子，本研究报道Ｔ１ 代植株在ＮａＣｌ胁迫下耐盐相关生理生化指标的变化。
１ 材料与方法
１．１ 实验材料
转红树总ＤＮＡ耐盐紫花苜蓿阿尔冈金Ｔ１ 代株系５个：转红树总ＤＮＡＴ０ 代耐盐植株［１０］移至实验田，开花
期罩纱网防止虫媒杂交授粉，人工辅助同株自交授粉，田间常规管理，获得Ｔ１ 代种子。
１．２ 材料处理
取未转基因种子，砂纸轻轻打磨，７０％酒精表面消毒１０ｍｉｎ后，０．１％的升汞消毒１０ｍｉｎ，无菌水冲洗４次，
第２１卷 第２期
Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．２
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
１４９－１５５
２０１２年４月
收稿日期：２０１１０２２３；改回日期：２０１１０５０６
基金项目：国家科技支撑计划子课题（２００８ＢＡＤＢ３Ｂ０１０２），内蒙古自然科学基金重大项目（２０１１ＺＤ０３），内蒙古大学“５１３人才计划”科研项目
和内蒙古大学高层次引进人才科研启动基金项目（１１５１０６）资助。
作者简介：张立全（１９７８），男，内蒙古锡盟人，实验师，博士。Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｌｉｑｕａｎ４３０＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｈａｓｉｎｄ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
播种在 ＭＳ培养基上发芽。待长出三片真叶时，移栽至装有１／２Ｈｏａｇｌａｎｄ营养液的塑料杯中，每杯１２株幼苗，
室温（２５±１）℃，１６ｈ光照／８ｈ黑暗培养。培养２周时，每杯保留长势一致的幼苗８株，用含ＮａＣｌ浓度为０，５０，
１００，１５０，２００，２５０，３００，３５０，４００和５００ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｈｏａｇｌａｎｄ营养液胁迫处理。为避免盐冲击效应，采用每天递
增５０ｍｍｏｌ／Ｌ的方式提高盐浓度，到达最终浓度后，持续４周，试验设３次重复。
分别取５个株系Ｔ１ 代转基因种子各５００粒，砂纸轻轻打磨，７０％酒精表面消毒１０ｍｉｎ后，０．１％的升汞消毒
１０ｍｉｎ，无菌水冲洗４次，依照文献［１０］，播种在ＮａＣｌ浓度为２２５ｍｍｏｌ／Ｌ的 ＭＳ培养基上，进行耐盐性筛选。
培养２周后，选取正常发芽，且生长主根和真叶的幼苗。将其移栽至不含ＮａＣｌ的ＭＳ培养基上培养，待长出三片
真叶时，选取长势一致的６株分成２组，移栽至装有１／２Ｈｏａｇｌａｎｄ营养液的塑料杯中（３株／组），室温（２５±１）℃，
１６ｈ光照／８ｈ黑暗培养。培养２周后，其中１组用含有３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的Ｈｏａｇｌａｎｄ营养液进行胁迫处理，另
一组用不含ＮａＣｌ的Ｈｏａｇｌａｎｄ营养液持续培养作为对照。为避免盐冲击效应，采用每天递增５０ｍｍｏｌ／Ｌ的方式
提高盐浓度，到达最终浓度后，持续２周。同时以未转基因植株作为对照。
１．３ 生理生化指标测定
１．３．１ 叶绿素含量测定 采用丙酮法测定叶绿素含量［１１］。取处理植株叶片，剪去叶脉并剪碎，称取０．５ｇ放入
研钵中，加入纯丙酮５．０ｍＬ，稍许碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆，再加８０％丙酮５．０ｍＬ，将匀浆转入离心管，并
用适量８０％丙酮洗涤研钵，一并转入离心管中，离心后弃沉淀，上清用８０％丙酮定容至２０．０ｍＬ。取上述色素提
取液１．０ｍＬ，加入８０％丙酮４．０ｍＬ稀释后转入比色杯中，测定ＯＤ６６３和ＯＤ６４５值，以８０％丙酮为对照。试验设３
次重复。计算公式：叶绿素浓度（ｍｇ／Ｌ）＝８．０２×ＯＤ６６３＋２０．２１×ＯＤ６４５，叶绿素含量（ｍｇ／ｇ）＝叶绿素的浓度×
提取液体积×稀释倍数／样品鲜重。
１．３．２ 脯氨酸含量测定 标准曲线的绘制：取２５．０ｍｇ脯氨酸，倒入小烧杯中，用少量蒸馏水溶解，然后定容至
２５０．０ｍＬ。配制１００ｍｇ／Ｌ标准液。分别吸取０．５，１．０，１．５，２．０，２．５，３．０，３．５，４．０，４．５，５．０ｍＬ标准液，定容
到５０．０ｍＬ，配制成ｌ，２，３，４，５，６，７，８，９，１０μｇ／ｍＬ的脯氨酸标准液。在玻璃试管中分别加入２．０ｍＬ脯氨酸标
准液，２．０ｍＬ冰醋酸，４．０ｍＬ酸性茚三酮和２．０ｍＬ３％的磺基水杨酸，沸水中静置０．５～１．０ｈ以显色，冷却后
加入４．０ｍＬ甲苯，充分振荡约３０ｓ，吸取甲苯层于５２０ｎｍ光波长比色，求出吸光度值（犢）与脯氨酸浓度（犡）的
回归方程式。以甲苯溶液为对照。试验设３次重复。
酸性茚三酮法［１１］测定脯氨酸含量：取处理植株叶片０．５ｇ，剪碎，置于试管中，加入５．０ｍＬ３％的磺基水杨
酸，在沸水中提取１０ｍｉｎ，冷却后，３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取２．０ｍＬ上清液于试管中，加入２．０ｍＬ冰醋酸和
２．０ｍＬ酸性茚三酮，煮沸１．０ｈ，溶液即呈红色。冷却至室温后，加入４．０ｍＬ甲苯，振荡３０ｓ，静置片刻，取上层
液至１．５ｍＬ离心管中，３０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ。吸取上层脯氨酸红色甲苯液于比色杯中，以甲苯为空白对照，
测定ＯＤ５２０值。试验设３次重复。
根据回归方程式计算出２．０ｍＬ测定液中脯氨酸的含量（Ｘ，μｇ／２ｍＬ），然后计算样品中脯氨酸的含量百分
数，即脯氨酸含量（ｇ／１００ｇ）＝犡×犞犜／（犠×犞犛×１０６）×１００％，其中：犡为由标准曲线算出的２．０ｍＬ测定液中脯
氨酸的含量（μｇ／２ｍＬ）；犞犜 为提取液体积（ｍＬ）；犞犛 为测定时取用样品体积（ｍＬ）；犠 为样品鲜质量（ｇ）。
１．３．３ 丙二醛（ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ，ＭＤＡ）含量测定 硫代巴比妥酸（ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃａｃｉｄ，ＴＢＡ）法［１２］测定ＭＤＡ含
量。取处理植株叶片１．０ｇ，剪碎，置于研钵中，加１０％的三氯乙酸（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃａｃｉｄ，ＴＣＡ）２．０ｍＬ和少量的
石英砂，冰浴中研磨，再加入８．０ｍＬＴＣＡ充分研磨，匀浆液４２００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，吸取２．０ｍＬ上清液，加入
２．０ｍＬ０．６％的ＴＢＡ溶液（用１０％的ＴＣＡ配制），混匀，在试管上加塞，沸水中反应１５ｍｉｎ，迅速冷却，４０００
ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液测定ＯＤ５３２和ＯＤ４５０值。对照管以２．０ｍＬ水代替上清液。试验设３次重复。计算公
式：ＭＤＡ（μｍｏｌ／Ｌ）＝６．４５×ＯＤ５３２－０．５６×ＯＤ４５０，ＭＤＡ（μｍｏｌ／ｇ）＝ＭＤＡ（μｍｏｌ／Ｌ）×犞／犠，其中，犞 为上清液
使用量（ｍＬ），犠 为样品鲜重（ｇ）。
１．３．４ 超氧化物歧化酶（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ）活性测定 粗酶液制备：取处理植株叶片１．０ｇ，加入约
５．０ｍＬ酶提取液，用５０ｍｍｏｌ／ＬｐＨ７．８的磷酸缓冲液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｓｏｌｕｔｉｏｎ，ＰＢＳ）配制，含有０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
乙二胺四乙酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ，ＥＤＴＡ），０．３％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００和４．０％聚乙烯吡咯烷酮（ｐｏｌｙｖｉ
０５１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．２
ｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ，ＰＶＰ），冰浴充分研磨，冷冻离心（４℃，１４０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ），取上清液，－４℃存放备用。
氮蓝四唑（ｎｉｔｒｏｂｌｕｅｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，ＮＢＴ）光还原法［１１］测定ＳＯＤ活性。取直径相同的玻璃试管，分别加入
２．９５ｍＬ反应混合液（１．５ｍＬ５０ｍｍｏｌ／ＬＰＢＳｐＨ７．８，０．３ｍＬ１３０ｍｍｏｌ／Ｌ甲硫氨酸溶液，０．３ｍＬ７５０μｍｏｌ／Ｌ
ＮＢＴ溶液，０．３ｍＬ１００μｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，０．３ｍＬ２０μｍｏｌ／Ｌ核黄素溶液，０．２５ｍＬ蒸馏水）和０．０５ｍＬ粗酶提取
液，混合后放在透明试管架上，在光照培养箱内照光（８０００ｌｘ），１０ｍｉｎ后立即避光，迅速测定ＯＤ５６０值，以ＰＢＳ代
替酶液的照光管为对照。试验设３次重复。以抑制ＮＢＴ光化还原５０％的酶量作为一个活性单位（Ｕ）。计算公
式：ＳＯＤ总活性（Ｕ／ｇ）＝（ＯＤＣＫ－ＯＤＥ）×ＶＴ／（０．０５×ＯＤＣＫ×Ｗ×ＶＳ），其中，ＳＯＤ总活性以每ｇ样品鲜质量的
酶单位表示（Ｕ／ｇ）；ＯＤＣＫ：照光对照管的吸光度；ＯＤＥ：样品管的吸光度；ＶＴ：样品提取液总体积（ｍＬ）；ＶＳ：测定时
样品用量（ｍＬ）；Ｗ：样品鲜重（ｇ）。
１．３．５ 过氧化物酶（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＰＯＤ）活性测定 粗酶液制备：如１．３．４。愈创木酚法［１１］测定ＰＯＤ活性。在试
管中加入２．９５ｍＬ反应混合液［０．２％愈创木酚０．９５ｍＬ，０．２％过氧化氢（Ｈ２Ｏ２）２．０ｍＬ］和０．０５ｍＬＰＢＳ（５０．０
ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．８）为调零对照。另取试管加入２．９５ｍＬ反应混合液和０．０５ｍＬ粗酶提取液，迅速摇匀，立即测
定ＯＤ４７０值，于０，３０，６０，９０，１２０，１５０和１８０ｓ读数１次。试验设３次重复。以每 ｍｉｎ每ｇ重的ＯＤ４７０变化０．０１
为１个酶活力单位（Ｕ）。计算公式：ＰＯＤ活性（Ｕ／ｇ·ｍｉｎ）＝ΔＯＤ４７０×犞犜／（犠×犞犛×０．０１×狋），其中，ΔＯＤ４７０：反
应时间内吸光度的变化；Ｗ：样品鲜质量（ｇ）；ｔ：反应时间（ｍｉｎ）；ＶＴ：提取酶液总体积（ｍＬ）；ＶＳ：测定时取用酶液
体积（ｍＬ）。
１．３．６ 过氧化氢酶（ｃａｔａｌａｓｅ，ＣＡＴ）活性测定 粗酶液制备：如１．３．４。参照张永峰和殷波［１３］的方法测定ＣＡＴ
活性。取２．９５ｍＬ反应混合液（１．０ｍＬ０．２％ Ｈ２Ｏ２，１．９５ｍＬ蒸馏水），加０．０５ｍＬ粗酶提取液，迅速混匀，立即
测定０，６０，１２０，１８０和２４０ｓ时的 ＯＤ２４０值。试验设３次重复。以每 ｍｉｎ每 ｍｇ重的吸光度变化值（ΔＯＤ２４０／
ｍｇ·ｍｉｎ）来表示。计算公式：ＣＡＴ活性（Ｕ／ｍｇ·ｍｉｎ）＝Ｅ２４０×３／（０．０４３６×Ｆｗ），式中，Ｅ２４０为２４０ｎｍ处每
ｍｉｎ吸光度的降低值；Ｆｗ为每０．０１ｍＬ所用酶液中含样品的鲜重量（ｍｇ）；０．０４３６为２４０ｎｍ处１μｍｏｌ过氧化
氢的吸光度。
１．４ 数据处理
数据处理采用ＳＡＳ软件的ＡＮＯＶＡ程序进行方差分析，显著性检验采用Ｄｕｎｃａｎ法，采用Ｅｘｃｅｌ２００３软件
作图。数据结果表示为平均值±标准差。
２ 结果与分析
２．１ ＮａＣｌ胁迫浓度的选定
不同浓度ＮａＣｌ胁迫处理未转基因幼苗１周时，３５０～５００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ胁迫处理苗均枯死（图１）。胁迫处
理２周时，３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ胁迫处理苗出现盐害症状。胁迫处理４周时，３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ胁迫处理苗全部枯
死。因此，选定胁迫转基因Ｔ１ 代幼苗的ＮａＣｌ浓度为３００ｍｍｏｌ／Ｌ。
２．２ 叶绿素含量分析
对照植株和各转基因株系在０和３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ胁迫时，叶绿素含量存在显著差异（犘＜０．０５）（图２）。
在３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ胁迫时，对照植株下降０．３２倍，而转基因株系下降０．０９～０．２９倍。说明转基因株系叶绿
素合成受盐胁迫影响比对照植株小，即转基因株系的耐盐性比对照植株的耐盐性增强。
２．３ 脯氨酸含量分析
相关性分析，得吸光度值（狔）与脯氨酸浓度（狓）的回归方程式：狔＝０．０６６７狓＋０．０５３７（犚２＝０．９９５５）。对照
植株和转基因株系在０ｍｍｏｌ／Ｌ胁迫时，除株系 Ｍｓｒａ７外，其他株系与对照植株的脯氨酸含量无显著差异。在
３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ胁迫时，株系 Ｍｓｒａ４，Ｍｓｒａ７，Ｍｓｒａ１２的脯氨酸含量与对照植株存在显著差异（犘＜０．０５）（图
３），且转基因株系的脯氨酸升高１．２～４．２倍，而对照植株的脯氨酸升高０．９倍。说明转基因株系在盐胁迫时，具
有耐盐渗透调节作用的脯氨酸含量增多，表现出耐盐植物的生理特性。
１５１第２１卷第２期 草业学报２０１２年
图１ 用不同浓度的犖犪犆犾胁迫处理未转基因植株１周
犉犻犵．１ 犜犺犲狊狋狉犲狊狊狋狉犲犪狋犿犲狀狋狅犳狌狀狋狉犪狀狊犳狅狉犿犲犱狆犾犪狀狋犾犲狋狊狑犻狋犺犱犻犳犳犲狉犲狀狋犮狅狀狋犲狀狋犖犪犆犾犳狅狉狅狀犲狑犲犲犽
１：０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ处理 Ｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈ０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ；２：５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ处理 Ｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈ５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ；３：１００ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ处理 Ｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈ１００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ；４：１５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ处理Ｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈ１５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ；５：２００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ处理Ｔｈｅ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈ２００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ；６：２５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ处理Ｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈ２５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ；７：３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ处理Ｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈ
３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ；８：３５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ处理 Ｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈ３５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ；９：４００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ处理 Ｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈ４００ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ；１０：５００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ处理 Ｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈ５００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ．
图２ 犖犪犆犾对犜１ 代转基因株系叶绿素的影响
犉犻犵．２ 犈犳犳犲犮狋狅犳犖犪犆犾狅狀犮犺犾狅狉狅狆犺狔犾犮狅狀狋犲狀狋狅犳
犜１狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋犾犲狋狊
图３ 犖犪犆犾对犜１ 代转基因株系脯氨酸的影响
犉犻犵．３ 犈犳犳犲犮狋狅犳犖犪犆犾狅狀狆狉狅犾犻狀犲犮狅狀狋犲狀狋狅犳
犜１狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋犾犲狋狊
不同小写字母表示差异显著（犘＜０．０５）。Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｏｗｅｒｃａｓｅｌｅｔｔｅｒｓｏｎｔｈｅｓａｍｅｂａｒｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｅｒｅｎｃｅａｔ犘＜０．０５．下同。Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．
２．４ 丙二醛含量分析
分别在０和３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ胁迫处理时，转基因株系和对照植株之间的ＭＤＡ含量均无显著差异，但转基
因株系的 ＭＤＡ含量在０和３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ胁迫处理之间存在显著差异（犘＜０．０５）（图４），且在３００ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ胁迫时，ＭＤＡ含量明显升高，而且转基因株系的 ＭＤＡ含量升高比例为０．１５～０．２９倍，对照植株的 ＭＤＡ
含量升高比例为０．３６倍。即用ＮａＣｌ胁迫处理后，转基因株系 ＭＤＡ含量升高幅度低于对照植株。
２．５ ＳＯＤ活性分析
在０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ胁迫处理时，转基因株系 Ｍｓｒａ７和 Ｍｓｒａ８与对照植株之间的ＳＯＤ活性变化存在显著
差异（犘＜０．０５）（图５）。在３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ胁迫处理时，除转基因株系 Ｍｓｒａ３外，其他转基因株系与对照植
株之间的ＳＯＤ活性变化存在显著差异（犘＜０．０５）。对照植株和转基因株系的ＳＯＤ活性变化在０和３００
ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ胁迫处理之间亦存在显著差异（犘＜０．０５），而且在３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ胁迫时，转基因株系的ＳＯＤ
活性升高０．２０～０．２５倍，而对照植株的ＳＯＤ活性升高０．１９倍，即转基因株系的ＳＯＤ活性明显高于对照植株。
２．６ ＰＯＤ和ＣＡＴ活性分析
对照植株和转基因株系在０和３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ胁迫时，ＰＯＤ和ＣＡＴ活性变化均存在显著差异（犘＜
２５１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．２
０．０５）（图６，７）。在３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ胁迫时，转基因株系ＰＯＤ和ＣＡＴ活性分别是对照的１．６～５．６倍和１．２
～１．３倍。说明转基因株系清除盐胁迫产生的过氧化氢（ｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅ，Ｈ２Ｏ２）的能力明显高于对照。
图４ 犖犪犆犾对犜１ 代转基因株系丙二醛的影响
犉犻犵．４ 犈犳犳犲犮狋狅犳犖犪犆犾狅狀犕犇犃犮狅狀狋犲狀狋狅犳
犜１狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋犾犲狋狊
图５ 犖犪犆犾对犜１ 代转基因株系犛犗犇的影响
犉犻犵．５ 犈犳犳犲犮狋狅犳犖犪犆犾狅狀犛犗犇犪犮狋犻狏犻狋狔狅犳
犜１狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋犾犲狋狊
图６ 犖犪犆犾对犜１ 代转基因株系犘犗犇活性的影响
犉犻犵．６ 犈犳犳犲犮狋狅犳犖犪犆犾狅狀犘犗犇犪犮狋犻狏犻狋狔狅犳
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图７ 犖犪犆犾对犜１ 代转基因株系犆犃犜活性的影响
犉犻犵．７ 犈犳犳犲犮狋狅犳犖犪犆犾狅狀犆犃犜犪犮狋犻狏犻狋狔狅犳
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３ 讨论
植物叶片光合色素含量是衡量植物在盐胁迫下耐盐性的重要指标之一。因为盐害使叶绿体内蛋白质含量减
少，叶绿素和蛋白质的联系被削弱，叶绿体趋于分解，同时盐分提高了叶绿素酶的活性，进一步促进叶绿素降
解［１４］，从而影响叶绿体的功能，降低光合效率，抑制植物的正常生长。本研究中，对照植株和各转基因株系分别
在０和３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ胁迫时，叶绿素含量均存在显著差异（犘＜０．０５），且对照植株和转基因株系在３００
ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ胁迫时，叶绿素含量均被降低，表明盐分确实引起了叶绿素的降解。但各转基因株系的叶绿素下
降率均低于对照植株，说明各转基因株系耐受盐胁迫的能力增强。
脯氨酸是植物体内重要的渗透调节物质，逆境条件会引起植物体内脯氨酸含量的上升，是植物对逆境胁迫的
一种生理生化反应［１５］，与渗透调节和保护质膜的稳定性有关［１６］，且脯氨酸的积累和耐盐性之间存在一定的线性
关系［１７］，亦可以作为评价耐盐性的参考指标［１８］。Ｗａｎｇ和 Ｈａｎ［１９］研究了紫花苜蓿在盐胁迫时脯氨酸含量的变
化，发现紫花苜蓿的耐盐性提高导致了脯氨酸的积累。本研究中，在０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ胁迫时，只有转基因株系
Ｍｓｒａ７与对照植株的脯氨酸含量存在显著差异（犘＜０．０５）。转基因株系在３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ胁迫时的脯氨酸
３５１第２１卷第２期 草业学报２０１２年
含量比０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ胁迫时升高，且转基因株系的脯氨酸升高比例高于对照植株，其中３个转基因株系（Ｍｓ
ｒａ４，Ｍｓｒａ７，Ｍｓｒａ１２）的脯氨酸含量与对照株系存在显著差异（犘＜０．０５），说明转基因株系的耐盐性明显提高。
逆境胁迫会造成植物细胞膜系统过氧化而受损，引起膜脂过氧化产物丙二醛的含量升高，丙二醛含量的高低
代表膜脂过氧化的程度［２０］，因此丙二醛含量可直接作为耐盐评价的鉴定指标［２，２１］。本研究中，在０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ胁迫时，转基因株系和对照植株的丙二醛含量无显著差异，但在３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ胁迫时，各转基因株系
丙二醛含量明显升高，但与对照植株相比，转基因株系丙二醛含量受ＮａＣｌ胁迫影响的升高率较低，说明各转基
因株系的耐盐性增强。
植物受到盐胁迫时，会导致细胞毒素活性氧（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）的产生，比如：超氧化物自由基
（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｒａｄｉｃａｌｓ，Ｏ２·－）、Ｈ２Ｏ２、羟基自由基（ｈｙｄｒｏｘｙｌｒａｄｉｃａｌ，ＯＨ－），他们可损伤细胞核蛋白组成、细胞膜、
脂质和核酸，从而导致细胞正常代谢的破坏［２２］。植物酶促抗氧化保护系统包括ＳＯＤ、ＣＡＴ和ＰＯＤ，目前已有许
多研究报道证实了抗氧化酶的活性与植物耐盐性相关［３，１３，２３］。研究结果显示，在０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ盐胁迫下，转基
因株系的ＣＡＴ和ＰＯＤ活性与对照植株存在显著差异（犘＜０．０５），而在３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ胁迫时，转基因株系的
ＳＯＤ、ＣＡＴ和ＰＯＤ活性明显高于对照植株，说明转基因株系的耐盐胁迫能力明显增强。
以上结果表明，利用花粉管通道法将盐生植物红树总ＤＮＡ导入紫花苜蓿阿尔冈金，经３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ筛
选获得Ｔ１ 代转基因植株，其耐盐性明显提高，为进一步选育耐盐紫花苜蓿新品种提供了种质材料。
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ＺＨＡＮＧＬｉｑｕａｎ１，ＡＯＤｅｎｇｈｕａ１，ＳＨＩＷｅｎｇｕｉ２，ＮＩＵＹｉｄｉｎｇ１，ＨＡＮＬａｎ１，ＨＡＳＩＡｇｕｌａ１
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＨｅｒｂａｇｅ
＆ＥｎｄｅｍｉｃＣｒｏｐＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｏｈｈｏｔ０１００２１，Ｃｈｉｎａ；２．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＧｒａｓｓｌａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈ，
ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｏｈｈｏｔ０１００１０，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｗｉｔｈ３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌｓｔｒｅｓｓ，ｔｈｅｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｉｎｄｅｘｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌ，
ｐｒｏｌｉｎｅａｎｄＭＤＡｃｏｎｔｅｎｔ，ａｎｄａｎｔｉｏｘｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ，ｏｆＴ１ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃａｌｆａｌｆａｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｗｉｔｈ犚犺犻狕狅狆犺狅狉犪犪狆犻犮
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５．６ｔｉｍｅｓａｎｄ１．２－１．３ｔｉｍｅｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ．Ｔｈｉｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｔｒａｎｓ
ｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｌｅｔｓｈａｄｔｈｅｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｔｐｌａｎｔｓ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ａｌｆａｌｆａ（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）；ｐｏｌｅｎｔｕｂｅｐａｔｈｗａｙ；犚犺犻狕狅狆犺狅狉犪犪狆犻犮狌犾犪狋犪ｔｏｔａｌＤＮＡ；Ｔ１ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｌｅｔｓ；ｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅ
５５１第２１卷第２期 草业学报２０１２年