全 文 ：书紫花苜蓿γ生育酚甲基转移酶（γ犜犕犜）基因的
克隆与逆境下的表达分析
贾会丽１，王学敏２，高洪文２，董洁２，王运琦１，刘建宁１，石永红１
（１．山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西 太原０３００３２；２．中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京１００１９３）
摘要：紫花苜蓿是目前全国乃至世界上种植最多的牧草，在畜牧业生产中发挥着重要的作用。γ生育酚甲基转移
酶（γＴＭＴ）是维生素Ｅ合成途径中一种重要的合成酶，催化γ生育酚向α生育酚的转化，改变维生素Ｅ组成，利
于动物和人体的吸收。本实验通过ＲＡＣＥＰＣＲ技术，得到紫花苜蓿γ犜犕犜 基因的全长ｃＤＮＡ序列，命名为犕狊犜
犕犜。测序和生物信息学分析表明，此序列全长１３０６ｂｐ，包含１个长为９３９ｂｐ的完整开放阅读框（ＯＲＦ），编码３１２
个氨基酸。犕狊犜犕犜属于甲基转移酶家族（ＡｄｏＭｅｔＭＴａｓｅｓ），有１个腺苷脱氨基酶信号（ＳＬＳＴＤＤＰ），包含有２个
保守的Ｓ腺苷甲硫氨酸结合结构域（ＸＸＤＸＧＣＧＩＧ，ＶＸＸＰＧＧＸＸＩＸ）。ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ检测结果表明犕狊犜犕犜基因
在紫花苜蓿各组织中均有表达，叶片中表达量最高。受ＮａＣｌ、ＰＥＧ以及黑暗诱导后，该基因表达上调；低温胁迫后
该基因表达下降；外源ＡＢＡ不影响该基因的表达。
关键词：紫花苜蓿；γ生育酚甲基转移酶；维生素Ｅ；抗逆性
中图分类号：Ｓ８１６；Ｓ５４１＋．１０３；Ｑ９４３．２　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１２）０６０１９８０９
　　维生素Ｅ是一种脂溶性维生素，在生物体中具有重要的代谢功能和抗氧化作用［１］。有资料研究表明，维生
素Ｅ对提高动物的免疫力，改善动物肉质，提高动物繁殖性能，缓解动物应激反应等具有良好的效果［２］。在饲料
中添加生育酚，能增加肉品质的稳定性［３］，防止肉类腐败、变味、变色，并延长上架时间［４，５］；医学研究证明每天摄
入足够的维生素Ｅ会降低一些疾病的发生率，如心血管疾病、癌症等，还有利于提高机体的免疫力等［６］。γ生育
酚甲基转移酶（γｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）γ犜犕犜 是维生素Ｅ合成途径中一种重要的合成酶，催化γ生育
酚向α生育酚的转化，对于改变维生素Ｅ组成有重要作用。在拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）叶片和种子中过量
表达γ犜犕犜 基因，使维生素Ｅ各成分中α生育酚含量分别提高到９０％和９５％以上，维生素Ｅ活性提高１０
倍［７，８］。
维生素Ｅ还能参与清理植物体内由于逆境胁迫产生的自由基，维持植物体内抗氧化的动态平衡，提高植物
的抗逆性［９］。在植物中，α生育酚定位于质体的内膜、类囊体膜和微粒体膜等膜性结构上，定位和结构上的两亲
性特点决定了植物体内维生素Ｅ的主要功能与维持光合膜上ＲＯＳ水平以及减轻膜脂过氧化程度有关［１０，１１］。据
报道，逆境处理下，维生素Ｅ生物合成途径中某些关键酶基因的表达会被诱导，且不同的酶基因对不同的胁迫也
会出现响应时间以及响应强度的差别［１２］。对正常植株进行逆境处理会导致植物体内抗氧化物质的增加，从而提
高植株对自由基的清除能力［１３］。有研究表明在轮叶党参（犆狅犱狅狀狅狆狊犻狊犾犪狀犮犲狅犾犪狋犪犲）中过量表达γ犜犕犜 基因，能
提高转基因植株的抗氧化活性，且光合速率也比对照提高４８％［１４］。目前有关维生素Ｅ逆境胁迫方面的研究多
集中在生育酚环化酶（ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌｃｙｃｌａｓｅ）ＴＣ、尿黑酸异戊烯基转移酶（ｈｏｍｏｇｅｎｔｉｓａｔｅｐｈｙｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）ＨＰＴ和
对羟苯丙酮酸双加氧酶（４Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖａｔｅｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）ＨＰＰＤ，而对γ犜犕犜 的研究多集中在其生育酚
合成方面，对其抗逆性的研究很少［１５］。
紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）是目前全国乃至世界上种植最多的牧草，营养价值很高［１６］，不论青饲、放牧或调
１９８－２０６
２０１２年１２月
　　　草　业　学　报　　　
　　　ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　
第２１卷　第６期
Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．６
收稿日期：２０１１１１２１；改回日期：２０１２０１１１
基金项目：现代农业产业技术体系建设专项牧草产业体系，农业部俄罗斯牧草种质资源保护项目和山西省农业科学院畜牧兽医研究所
（ＸＭＳ１１０５）资助。
作者简介：贾会丽（１９８０），女，山西临猗人，硕士。Ｅｍａｉｌ：ｊｉａｈｕｉｌｉ３３３＠１２６．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｘｍ＠ｉａｓｃａａｓ．ｎｅｔ．ｃｎ
制干草［１７］，适口性均好，且具有抗寒、耐盐碱等优良特性［１８，１９］。因此，研究紫花苜蓿维生素Ｅ的合成途径、克隆相
关的酶基因，并通过生物技术方法增强植株的氧化活性、提高维生素Ｅ含量，对于提高紫花苜蓿抗逆性，改善其
营养品质具有十分重要的意义。本研究从紫花苜蓿中克隆了犕狊犜犕犜的全长ｃＤＮＡ序列，对其结构进行分析，
并通过模拟不同逆境（ＮａＣｌ胁迫、ＰＥＧ胁迫、黑暗胁迫、低温胁迫以及ＡＢＡ胁迫），对犕狊犜犕犜基因的抗逆性进
行探讨，为进一步研究该基因的抗逆调控机制和紫花苜蓿的生育酚品质改良打下基础。
１　材料与方法
１．１　实验材料
实验所用植物材料紫花苜蓿中苜１号（犕．狊犪狋犻狏犪ｃｖ．ＺｈｏｎｇｍｕＮｏ．１）由中国农业科学院北京畜牧兽医研究
所牧草资源研究室提供。
１．２　实验方法
１．２．１　ＲＮＡ提取及ｃＤＮＡ的合成　２０１１年４月１日将中苜１号种子用氯气消毒２４ｈ后播种于铺有滤纸的培
养皿上，置于２５℃光照培养箱内发芽，待长出２片子叶后移至营养钵中（蛭石∶珍珠岩＝３∶１），培养４周取其叶
片，用Ｔｒｉｚｏｌ法提取总ＲＮＡ，参照ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＴＭＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司）将ＲＮＡ反转
录成ｃＤＮＡ。盐、干旱和ＡＢＡ处理时，植株分别用３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、１５％ＰＥＧ和０．１ｍｍｏｌ／ＬＡＢＡ处理０，２，
４，８，１２和２４ｈ；冷处理时，植株在４℃低温下胁迫０，２，４，８，１２和２４ｈ；暗处理时，植株于黑暗下胁迫０，１２，２４，４８
和７２ｈ，Ｔｒｉｚｏｌ（ＴａＫａＲａ公司）法提取各种处理的幼苗叶片ＲＮＡ，反转录成ｃＤＮＡ；组织表达特异性分析时，在同
一株紫花苜蓿上分别取根、茎、叶、花和荚果组织，Ｔｒｉｚｏｌ法提取各组织ＲＮＡ，反转录成ｃＤＮＡ。以上样品保存于
－７０℃，用于后续ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ检测。
１．２．２　紫花苜蓿γ犜犕犜 基因保守区克隆　根据
ＧｅｎＢａｎｋ登记注册的已有物种γ犜犕犜 基因ｃＤＮＡ序
列，Ｂｌａｓｔ分析后得到其相对保守序列。再以蒺藜苜蓿
（犕犲犱犻犮犪犵狅狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪）γ犜犕犜 基因ｃＤＮＡ序列为参
照，结合ＮＣＢＩ上的Ｂｌａｓｔ结果，用ＰｒｉｍｅｒＰｒｉｍｅｒ５．０
软件设计保守区特异性引物Ｐ１ 和Ｐ２（表１），以ｃＤＮＡ
为模板进行ＰＣＲ扩增，反应条件如下：９４℃预变性５
ｍｉｎ，９４℃３０ｓ，５７℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，共３５个循环，
反应结束后７２℃延伸１０ｍｉｎ。１％琼脂糖凝胶电泳检
测ＰＣＲ产物，用ＤＮＡＧｅｌＥｘｔｒａｃｔＫｉｔ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公
司，Ｋ０５１３）回收ＰＣＲ产物，将回收片段连接 ＰＭＤ
１８Ｔ载体（ＴａＫａＲａ公司，Ｄ１０１Ａ），重组质粒转化大肠
杆菌ＤＨ５ａ感受态细胞（天根生化科技有限公司，
ＣＢ１０１０１），挑选阳性克隆送至上海英骏生物技术有
限公司测序。
表１　试验中所用到的引物序列
犜犪犫犾犲１　犛犲狇狌犲狀犮犲狅犳狆狉犻犿犲狉狊狌狊犲犱犻狀狋犺犲犲狓狆犲狉犻犿犲狀狋
引物名称Ｐｒｉｍｅｒｎａｍｅ 引物序列Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′→３′）
Ｐ１ ＴＣＴＣＡＧＣＣＣＴＧＴＴＣＡＡＧＣ
Ｐ２ ＣＡＡＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＡＴＣＴＧ
Ｐ３ ＴＴＧＴＴＧＧＴＧＡＧＴＴＡＧＣＡＣＧＧＧＴＡＧＣ
Ｐ４ ＧＴＴＧＴＡＧＧＧＡＴＴＣＴＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＣ
Ｐ５ ＡＧＧＧＴＣＡＴＴＧＣＧＴＣＴＡＴＣＡＡＴＧＧＣ
Ｐ６ ＴＴＧＡＣＣＣＴＣＴＧＣＡＴＴＴＴＣＡＧＧＣＴＴ
Ｐ７ ＴＡＧＴＧＴＧＧＴＣＡＡＴＧＧＡＧＡＧＣＧＧ
Ｐ８ ＣＡＴＴＧＴＴＧＴＡＧＧＧＡＴＴＣＴＴＣＡＴＴＣＧ
Ｐ９ ＧＡＧＣＧＴＴＴＣＣＧＴＴＧＴＣＣＴＧＡ
Ｐ１０ ＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＧＧＡＡＧＣＣＡＡＡ
１．２．３　紫花苜蓿γ犜犕犜 基因３′末端和５′末端ｃＤＮＡ片段的克隆　根据已获得的紫花苜蓿γ犜犕犜ｃＤＮＡ保守
区序列，设计３′ＲＡＣＥ特异性引物Ｐ３（表１）和５′ＲＡＣＥ特异性引物Ｐ４（表１），按照ＳＭＡＲＴＴＭＲＡＣＥｃＤＮＡＡｍ
ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司）的方法进行反转录反应和ＰＣＲ扩增。反应条件如下：９４℃预变性３ｍｉｎ；９４℃３０
ｓ，７２℃３ｍｉｎ，５个循环；９４℃３０ｓ，７０℃３０ｓ，７２℃２ｍｉｎ，５个循环；９４℃３０ｓ，６８℃３０ｓ，７２℃３ｍｉｎ，２５个循环；
反应结束后７２℃延伸５ｍｉｎ。将扩增产物测序，进行序列拼接，得到紫花苜蓿γ犜犕犜 基因的全长序列。用
ＤＮＡＭＡＮ６．０软件预测其可能的开放阅读框（ＯＲＦ），设计合成１对ｃＤＮＡ全长引物Ｐ５、Ｐ６（表１），进行ＰＣＲ扩
增，将扩增产物测序后得到紫花苜蓿γ犜犕犜 基因ＯＲＦ序列。
１．２．４　ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ检测紫花苜蓿γ犜犕犜 基因组织及逆境胁迫表达特异性　参照ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ
（ＴａＫａＲａ公司，ＤＲＲ０４１Ａ）的引物设计原则，根据得到的紫花苜蓿 ＯＲＦ序列设计ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ特异性引物
９９１第２１卷第６期 草业学报２０１２年
Ｐ７、Ｐ８（表１），预计片段大小为１５１ｂｐ。选择犃犮狋犻狀基因为内参基因，用７５００荧光定量ＰＣＲ仪（ＡＢＩ公司）进行
ＰＣＲ扩增，每个反应重复３次，采用２步法，条件如下：第１步，９５℃预变性２ｍｉｎ，第２步，９５℃５ｓ，６０℃３４ｓ，４０
个循环。反应结束后，根据得到的周期阈值（ｃｙｃｌｅｔｈｒｅｓｈｏｌｄ），利用２－△△Ｃｔ方法［２０］，分别计算紫花苜蓿γ犜犕犜 基
因在根、茎、叶、花、荚果中的表达量以及各逆境胁迫下的表达量。
２　结果与分析
２．１　紫花苜蓿γ犜犕犜 基因的克隆
图１　紫花苜蓿γ犜犕犜基因保守区扩增结果
犉犻犵．１　犈犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊狉犲狊狌犾狋狅犳犮狅狀狊犲狉狏犪狋犻狏犲犳狉犪犵犿犲狀狋
Ｍ：ＤＬ２０００；１：保守片段Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｆｒａｇｍｅｎｔ．
根据 ＮＣＢＩ上的 Ｂｌａｓｔ结果，用 ＰｒｉｍｅｒＰｒｉｍｅｒ
５．０软件设计特异引物Ｐ１、Ｐ２，以紫花苜蓿ｃＤＮＡ为模
板，扩增得到４０４ｂｐ的目的片段（图１）。经Ｂｌａｓｔ比
对分析，发现此片段与已报道的γ犜犕犜 基因有较高
的相似性，其中与截形苜蓿的γ犜犕犜 基因ｃＤＮＡ序
列同源性最高，为９７％，初步确定获得的ｃＤＮＡ片段
是紫花苜蓿γ犜犕犜 基因的部分片段。
根据得到的保守区序列设计３′、５′ＲＡＣＥ特异性
引物，采用 ＲＡＣＥ技术结合ＰＣＲ的方法，扩增出γ
犜犕犜 基因的３′ＲＡＣＥ和５′ＲＡＣＥ末端序列，测序结
果显示３′和５′端的片段长度分别为６６０和７４３ｂｐ（图
２）。用ＤＮＡＭＡＮ６．０软件进行拼接，得到总长度为１３０６ｂｐ的全长ｃＤＮＡ序列。以紫花苜蓿ｃＤＮＡ为模板，
用引物Ｐ５、Ｐ６ 扩增得到９３９ｂｐ的开放阅读框（ＯＲＦ）（图３），该ＯＲＦ序列与拼接获得的ＯＲＦ序列完全一致。
图２　紫花苜蓿γ犜犕犜基因３′犚犃犆犈和５′犚犃犆犈电泳结果
犉犻犵．２　犈犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊狉犲狊狌犾狋狅犳狋犺犲３′犚犃犆犈犪狀犱５′犚犃犆犈犳狉犪犵犿犲狀狋狊
Ｍ：ＤＬ２０００；２：３′ＲＡＣＥ片段３′ＲＡＣＥｆｒａｇｍｅｎｔ；３：５′ＲＡＣＥ片段 ＲＡＣＥｆｒａｇｍｅｎｔ．
２．２　紫花苜蓿γ犜犕犜 基因的生物信息学分析
利用ＤＮＡＳｔａｒ软件对紫花苜蓿γ犜犕犜 基因ｃＤＮＡ序列进行分析，该基因全长１３０６ｂｐ，包含有一个９３９
ｂｐ完整的开放阅读框，编码３１２个氨基酸，命名为 ＭｓＴＭＴ。氨基酸序列分析表明，犕狊犜犕犜基因编码蛋白分子
质量约为３４．５ｋＤａ，理论等电点ＰＩ为５．６２。总共包括４８４２个原子。在组成该酶的２０种氨基酸中，碱性氨基酸
（Ｋ、Ｒ）３４个，酸性氨基酸（Ｄ、Ｅ）４０个，疏水氨基酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｗ、Ｖ）１１８个，极性氨基酸（Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ）６６个。
通过在线软件ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｉｔｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉｂｉｎ／ｐｒｏｓｉｔｅ／对犕狊犜犕犜进行功能位点预测，发现该基因有１
个腺苷脱氨基酶信号（［ＳＡ］－［ＬＩＶＭ］－［ＮＧＳ］－［ＳＴＡ］－Ｄ－Ｄ－Ｐ）。利用ＮＣＢＩ的ＢｌａｓｔＰ在蛋白保守区数
据库对 ＭｓＴＭＴ进行蛋白保守区预测，结果显示 ＭｓＴＭＴ属于甲基转移酶家族（ＡｄｏＭｅｔＭＴａｓｅｓ）（图４）。该蛋
白还包含有２个Ｓ腺苷甲硫氨酸的结合结构域（ＸＸＤＸＧＣＧＩＧ，ＶＸＸＰＧＧＸＸＩＸ）（图５），与大豆（犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓）、
陆地棉（犌狅狊狊狔狆犻狌犿犺犻狉狊狌狋狌犿）等其他物种的γ犜犕犜结构相似［６，２１，２２］，表明该基因确实是紫花苜蓿γ犜犕犜基因。
００２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．６
从ＧｅｎＢａｎｋ中下载其他１３种植物γＴＭＴ蛋白
图３　紫花苜蓿γ犜犕犜基因犗犚犉扩增结果
犉犻犵．３　犈犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊狉犲狊狌犾狋狅犳狋犺犲犗犚犉
Ｍ：ＤＬ２０００；４：开放阅读框片段 ＯＲＦｆｒａｇｍｅｎｔ．
序列，涉及到豆科、禾本科、十字花科、茄科等多个物
种。用 ＭＥＧＡ４．０软件构建系统进化树，分析结果显
示，不同来源的γ犜犕犜 基因聚为３类。紫花苜蓿γ
犜犕犜 与豆科植物蒺藜苜蓿γ犜犕犜 亲缘关系最近，其
次是大豆（图６）。用ＤＮＡＭＡＮ６．０软件对紫花苜蓿
γＴＭＴ蛋白与大豆、蒺藜苜蓿、水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）、
拟南芥等１３种植物中的γＴＭＴ蛋白同源性进行比
较，结果显示与上述几种模式植物的同源性分别为
５８．１９％，５４．８７％，５１．０７％和５０．１２％。γＴＭＴ蛋白
在序列上的差异主要体现在蛋白质的Ｎ端，中部的功
能区则比较保守。说明虽然不同生物之间的γＴＭＴ序列同源性有一定差异，却具有功能上的保守性，推测有可
能形成类似的蛋白质三维结构。
２．３　犕狊犜犕犜基因在不同组织的表达特异性
在同一株紫花苜蓿上分别取根、茎、叶、花以及荚果，ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ分析各组织的相对表达量，结果表明，以
花中犕狊犜犕犜基因的表达量为对照，叶片中表达量最高，为对照的２１８倍，且明显高于其他组织，茎中表达量次
之，为对照的４４倍，根中表达量为对照的１２．８倍，荚果中表达量为对照的１１．８倍（图７）。说明该基因在紫花苜
蓿各个器官中均有表达，且在含有光合器官的绿色组织中表达量最高。一般认为植物细胞中α生育酚的合成部
位在绿色植物细胞所特有的质体中［２３］。叶绿体含有叶绿素，是重要的质体，主要存在于植物体绿色部分的薄壁
组织细胞中，是绿色植物进行光合作用的场所。实验结果说明该基因的表达与质体的分布有很强的相关性。
图４　犕狊犜犕犜蛋白序列犅犾犪狊狋分析
犉犻犵．４　犜犺犲犅犾犪狊狋犪狀犪犾狔狊犻狊狉犲狊狌犾狋狅犳犕狊犜犕犜狆狉狅狋犲犻狀
２．４　不同逆境胁迫处理下犕狊犜犕犜基因表达分析
２．４．１　盐胁迫下犕狊犜犕犜基因表达特性　以处理０ｈ为对照，分析ＮａＣｌ处理不同时间犕狊犜犕犜基因的表达差
异。结果表明，犕狊犜犕犜基因受ＮａＣｌ诱导表达上调，胁迫处理２ｈ后该基因的表达就已经开始上调，至８ｈ之前
表达量上调不明显，仅为对照的２．１～２．４倍，８ｈ后基因表达量迅速上升，２４ｈ后该基因的表达量达到对照的
２１．４倍（图８）。
２．４．２　ＰＥＧ胁迫下犕狊犜犕犜基因表达特性　以处理０ｈ为对照，分析ＰＥＧ模拟干旱处理不同时间犕狊犜犕犜基
因的表达差异。结果表明，随ＰＥＧ诱导时间的变化，犕狊犜犕犜基因表达呈明显单峰趋势，在４ｈ表达量最高，为
对照的４．３倍（图９）。
２．４．３　黑暗胁迫下犕狊犜犕犜基因表达特性　以处理０ｈ为对照，分析黑暗胁迫不同时间犕狊犜犕犜基因的表达差
异。结果表明，随胁迫时间的延长，犕狊犜犕犜基因的表达量出现先下降后上升趋势。黑暗胁迫２４ｈ犕狊犜犕犜表
达量最低，仅为对照的９％，随后基因的表达量迅速上升，７２ｈ基因的表达量为对照的１２．３倍（图１０）。
２．４．４　低温胁迫下犕狊犜犕犜基因表达特性　以处理０ｈ为对照，分析低温胁迫不同时间犕狊犜犕犜基因的表达差
异。结果表明，低温胁迫后，犕狊犜犕犜基因表达量均低于对照（图１１）。
１０２第２１卷第６期 草业学报２０１２年
图５　犕狊犜犕犜基因全长核苷酸序列及推测的氨基酸序列
犉犻犵．５　犖狌犮犾犲狅狋犻犱犲狊犲狇狌犲狀犮犲犪狀犱犻狋狊犱犲犱狌犮犲犱犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳犕狊犜犕犜犵犲狀犲
　波浪线部分为腺苷脱氨基酶信号；方框部分为Ｓ腺苷甲硫氨酸结合结构域；阴影部分为加尾信号。Ａｄｅｎｏｓｉｎｅｄｅａｍｉｎａｓｅｓｉｇｎａｌｗａｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｂｙ
ｗａｖｙｕｎｄｅｒｌｉｎｅ；ＴｈｅｃｏｎｓｅｎｓｕｓｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＳＡＭｄｏｍａｉｎｗａｓｂｏｘｅｄ；Ｔｈｅｓｈａｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎｓｈｏｗｔａｉｌｉｎｇｓｉｇｎａｌｓ．
２．４．５　ＡＢＡ胁迫下犕狊犜犕犜基因表达特性　以处理０ｈ为对照，分析外源ＡＢＡ处理不同时间犕狊犜犕犜基因的
表达差异。结果表明，受ＡＢＡ诱导后该基因的表达量没有明显变化（图１２），说明该基因表达不受外源ＡＢＡ诱
导。
３　讨论
本研究得到紫花苜蓿犕狊犜犕犜基因的全长ｃＤＮＡ序列。对犕狊犜犕犜氨基酸序列分析后发现该蛋白有一个
腺苷脱氨基酶信号（ＳＬＳＴＤＤＰ），属于甲基转移酶家族（ＡｄｏＭｅｔＭＴａｓｅｓ），包含有２个保守的Ｓ腺苷甲硫氨酸结
合结构域（ＳＡＭｄｏｍａｉｎ）ＸＸＤＸＧＣＧＩＧ、ＶＸＸＰＧＧＸＸＩＸ，这与已知的棉花（犌狅狊狊狔狆犻狌犿ｓｐｐ．）、大豆等的γ犜犕犜
结构特点一致［６，２２，２３］。
２０２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．６
图６　犕狊犜犕犜蛋白与其他１３种γ犜犕犜蛋白的系统进化树
犉犻犵．６　犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲狅犳γ犜犕犜狆狉狅狋犲犻狀犪狀犱狅狋犺犲狉狋犺犻狉狋犲犲狀狆狉狅狋犲犻狀狊
图７　犕狊犜犕犜基因的组织表达特异性
犉犻犵．７　犗狉犵犪狀狊狆犲犮犻犳犻犮犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狆犪狋狋犲狉狀狅犳
狋犺犲犕狊犜犕犜犵犲狀犲
图８　犕狊犜犕犜基因在犖犪犆犾胁迫下的表达模式分析
犉犻犵．８　犈狓狆狉犲狊狊犻狅狀狆犪狋狋犲狉狀狅犳犕狊犜犕犜犻狀
狉犲狊狆狅狀狊犲狋狅犖犪犆犾狊狋狉犲狊狊
图９　犕狊犜犕犜基因在犘犈犌胁迫下的表达模式
犉犻犵．９　犈狓狆狉犲狊狊犻狅狀狆犪狋狋犲狉狀狅犳犕狊犜犕犜犻狀
狉犲狊狆狅狀狊犲狋狅犘犈犌狊狋狉犲狊狊
图１０　犕狊犜犕犜基因在黑暗胁迫下的表达模式
犉犻犵．１０　犈狓狆狉犲狊狊犻狅狀狆犪狋狋犲狉狀狅犳犕狊犜犕犜犻狀
狉犲狊狆狅狀狊犲狋狅犱犪狉犽狊狋狉犲狊狊
３０２第２１卷第６期 草业学报２０１２年
图１１　犕狊犜犕犜基因在４℃低温胁迫下的表达模式
犉犻犵．１１　犈狓狆狉犲狊狊犻狅狀狆犪狋狋犲狉狀狅犳犕狊犜犕犜犻狀
狉犲狊狆狅狀狊犲狋狅犾狅狑狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲狊狋狉犲狊狊
图１２　犕狊犜犕犜基因在犃犅犃处理下的表达模式
犉犻犵．１２　犈狓狆狉犲狊狊犻狅狀狆犪狋狋犲狉狀狅犳犕狊犜犕犜犻狀
狉犲狊狆狅狀狊犲狋狅犃犅犃狋狉犲犪狋犿犲狀狋
本研究利用ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ方法检测了犕狊犜犕犜基因在紫花苜蓿中的组织表达特异性，结果发现犕狊犜犕犜
基因在各器官中均有表达，但各器官的表达峰度不同，叶片中表达量最高。欧阳青等［２４］研究了ＢｏＴＭＴ在结球
甘蓝（犅狉犪狊狊犻犮犪狅犾犲狉犪犮犲犪ｖａｒ．犮犪狆犻狋犪狋犪）不同器官中的表达特征，结果发现犅狅犜犕犜在结球甘蓝的各器官中均有表
达，但在花和叶片中的表达量明显高于根、茎和种子。一般认为植物细胞中α生育酚的生物合成部位是质体，主
要存在于植物体绿色部分的薄壁组织细胞中，是绿色植物进行光合作用的主要场所。在植物的有色组织（如绿色
的叶片）中，α生育酚是含量最高的生育酚类型，而在非绿色组织（如根、种子）中，α生育酚含量很低，绝大部分为
其生物合成前体γ生育酚［２５］。γ犜犕犜 的作用是催化γ生育酚转化为α生育酚，有研究表明在γ犜犕犜 缺失的
突变型拟南芥叶片中，γ生育酚含量显著提高，而α生育酚消失，重新导入γ犜犕犜 后，叶片又可合成α生育
酚［２１］。本实验结果表明犕狊犜犕犜基因的表达与质体的分布有很强的相关性。
维生素Ｅ中由于有酚基的存在，使其具有较强的抗氧化作用，可以保护蛋白质不受到光合损伤，避免膜结构
发生脂类过氧化。当植物受到诸如强光、干旱、高盐和极端温度等逆境胁迫后，体内的活性氧（ＲＯＳ）会增加，
ＲＯＳ的积累会诱导抗氧化物质相关基因的表达。对正常植株进行逆境处理，会导致植物体内抗氧化物质的增
加，从而提高植株对自由基的清除能力［１２，１３］。据报道，在逆境胁迫下，维生素Ｅ生物合成途径中的某些关键酶基
因的表达会被诱导，如经由强光处理，拟南芥犺狆狆犱和犺狆狋均会出现表达上调，而狋犮突变株并没有出现上调，γ
犜犕犜 基因表达量几乎没有变化［１２］。Ａｂｂａｓｉ等［２６］通过ＲＮＡｉ干扰技术分别构建了抑制烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪
犮狌犿）犺狆狋和γ犜犕犜 基因表达的株系，分别用ＮａＣｌ和山梨醇模拟盐胁迫和渗透胁迫逆境，研究转基因烟草对逆
境处理的耐受性，结果表明，犺狆狋基因被抑制的株系对２种逆境的耐受性明显下降，但是γ犜犕犜 基因被抑制的株
系会增强对山梨醇渗透逆境的抗性，却缺乏了对盐的耐受性。说明生育酚的总量及组成不同所产生的抗逆性及
抗逆机理也不尽相同。本研究通过模拟不同逆境（ＮａＣｌ胁迫、ＰＥＧ胁迫、黑暗胁迫、低温胁迫以及ＡＢＡ胁迫），
对犕狊犜犕犜基因的抗逆性进行探讨。发现犕狊犜犕犜基因受ＮａＣｌ胁迫、ＰＥＧ胁迫以及黑暗胁迫表达量上调，但
各胁迫下犕狊犜犕犜基因表达上调趋势不同，这可能是由这３种逆境的不同胁迫机制所造成。
光合激素，如甲基茉莉酸（ＪＡ）、水杨酸（ＳＡ）、脱落酸（ＡＢＡ），同样可以影响维生素Ｅ的生物合成。维生素Ｅ
合成途径相关的基因，如犺狆狆犱，启动子区具有ＡＢＡ反应元件。逆境诱导ＪＡ积累能够抑制光合作用，但活化了
抗氧化物质合成的基因。有研究报道在抗旱植物中，内源ＳＡ与α生育酚含量之间存在着相关性。抗氧化物质
（维生素Ｅ）的水平，体现了植物对外界环境和内环境的应激能力［１４］。说明维生素Ｅ既可以起到抗氧化作用，也
可以作为一种信号，传递氧化还原的状态。本研究对紫花苜蓿进行外源ＡＢＡ处理后，发现外源ＡＢＡ基本不影
响该基因的表达，这可能与 犕狊犜犕犜 启动子区域的响应元件有一定关系。或许其他光合激素如ＪＡ、ＳＡ会对
犕狊犜犕犜的表达产生影响，还需要进一步的证实。
４０２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．６
γ犜犕犜 是维生素Ｅ合成途径中最后一步的关键酶，催化γ生育酚向α生育酚的转化，对于改变维生素Ｅ组
成有重要作用。通过过量表达γ犜犕犜 基因来提高植物体内α生育酚的比例已经涉及到多个物种［１１，２７］，但在栽
培利用面积最广泛的紫花苜蓿上的研究几乎没有，且对γ犜犕犜 的研究多集中在其生育酚合成方面，对其抗逆性
的研究很少，本试验将继续构建植物增强表达载体，进行犕狊犜犕犜基因功能研究，进一步为改善紫花苜蓿的品质
和抗性创造条件。
参考文献：
［１］　潘卫东，李晓峰，陈双燕，等．植物维生素Ｅ合成相关酶基因的克隆及其在体内功能研究进展［Ｊ］．植物学通报，２００６，
２３（１）：６８７７．
［２］　王改琴，李维，王恬．维生素Ｅ对家禽抗氧化、免疫功能和繁殖性能的影响研究进展［Ｊ］．家畜生态学报，２００９，３０（６）：１５．
［３］　王军，田玉民，刘璐．维生素Ｅ对畜禽肉色稳定性影响的研究进展［Ｊ］．安徽农业科学，２００８，（３３）：１４５４５１４５４７．
［４］　胡英考．植物维生素Ｅ合成及其生物技术改良［Ｊ］．中国生物工程杂志，２００４，２４（１）：３２３５．
［５］　何河，方热军．日粮中添加维生素Ｅ对牛肉品质的影响［Ｊ］．饲料博览，２００８，（２）：１３１６．
［６］　ＳｈｉｎｔａｎｉＤ，ＤｅｌａＰｅｎｎａＤ．ＥｌｅｖａｔｉｎｇｔｈｅＶｉｔａｍｉｎＥｃｏｎｔｅｎｔｏｆｐｌａｎｔｓｔｈｒｏｕｇｈｍｅｔａｂｏｌｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，
２８２（１１）：２０９８２１００．
［７］　ＣｈｏＥＡ，ＬｅｅＣＡ，ＫｉｍＹＳ，犲狋犪犾．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｇａｍｍａｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｔｒａｎｓｇｅｎｅｉｍｐｒｏｖｅｓｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌｃｏｍ
ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｌｅｔｔｕｃｅ（犔犪狋狌犮犪狊犪狋犻狏犪Ｌ．）［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌｅｓａｎｄＣｅｌｓ，２００５，１９（１）：１６２２．
［８］　ＶａｎＥｅｎｅｎｎａａｍＡＬ，ＬｉｎｃｏｌｎＫ，ＤｕｒｒｅｔｔＴＰ，犲狋犪犾．ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｖｉｔａｍｉｎＥｃｏｎｔｅｎｔ：ｆｒｏｍ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊ｍｕｔａｎｔｔｏｓｏｙｏｉｌ［Ｊ］．
ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌ，２００３，１５（１２）：３００７３０１９．
［９］　张一弓，张丽静，傅华．植物维生素Ｅ合成酶基因克隆及其逆境生理研究进展［Ｊ］．草业学报，２００９，１８（５）：２３５２４２．
［１０］　ＭｕｎｎéＢｏｓｃｈＳ．Ｔｈｅｒｏｌｅｏｆαｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌｉｎｐｌａｎｔｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００５，１６２（７）：７４３７４８．
［１１］　ＶｉｄｉＰＡ，ＫａｎｗｉｓｃｈｅｒＭ，ＢａｇｉｎｓｋｙＳ，犲狋犪犾．Ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌｃｙｃｌａｓｅ（ＶＴＥ１）ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄｖｉｔａｍｉｎＥａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｉｎｃｈｌｏｒｏ
ｐｌａｓｔｐｌａｓｔｏｇｌｏｂｕｌｅｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｐａｒｔｉｃｌｅｓ［Ｊ］．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６，２８１（１６）：１１２２５１１２３４．
［１２］　ＣｏｌａｋｏｖａＥ，ＤｅｌａＰｅｎｎａＤ．Ｔｈｅｒｏｌｅｏｆｈｏｍｏｇｅｎｔｉｓａｔｅｐｈｙｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅａｎｄｏｔｈｅｒｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌｐａｔｈｗａｙｅｎｚｙｍｅｓｉｎｔｈｅｒｅｇｕｌａ
ｔｉｏｎｏｆｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌｓｙｎｔｈｅｓｉｓｄｕｒｉｎｇａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００３，１３３（１０）：９３０９４０．
［１３］　ＮｏｃｔｏｒＧ，ＦｏｙｅｒＣＨ．Ａｓｃｏｒｂａｔｅａｎｄｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ：ｋｅｅｐｉｎｇａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｕｎｄｅｒｃｏｎｔｒｏｌ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙ，１９９８，４９（６）：２４９
２７９．
［１４］　ＧｈｉｍｉｒｅＢＫ，ＳｅｏｎｇＥＳ，ＧｏｈＥＪ，犲狋犪犾．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ犆狅犱狅狀狅狆狊犻狊犾犪狀犮犲狅犾犪狋犪ｐｌａｎｔｓｖｉａｏｖｅｒ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅγｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（γ犜犕犜）ｇｅｎｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＧｒｏｗｔｈＲｅｇｕｌａｔｉｏｎ，２０１１，６３（１）：１６．
［１５］　李殷．植物维生素Ｅ生物合成途径及调控［Ｄ］．上海：复旦大学，２００９．
［１６］　张冬玲，刘建宁，王运琦，等．山西省中部地区紫花苜蓿引种试验［Ｊ］．中国草食动物，２０１０，３０（５）：４３４６．
［１７］　夏银素，王成章，詹发柏，等．苜蓿草粉饲粮添加纤维素酶对蛋鸡生产性能、蛋品质及养分利用率的影响［Ｊ］．草业学报，
２０１１，２０（５）：１８３１９１．
［１８］　李源，刘贵波，高洪文，等．紫花苜蓿种质耐盐性综合评价及盐胁迫下的生理反应［Ｊ］．草业学报，２０１０，１９（４）：７９８６．
［１９］　姜健，杨宝灵，夏彤，等．紫花苜蓿耐盐种质资源的遗传多样性分析［Ｊ］．草业学报，２０１１，２０（１）：１１９１２５．
［２０］　ＬｉｖａｋＫＪ，ＳｃｈｍｉｔｔｇｅｎＴＤ．ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｌａｔｉｖｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄａｔａｕｓｉｎｇｒｅａｌｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲａｎｄｔｈｅ２△△ＣＴ ｍｅｔｈｏｄ［Ｊ］．
Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００１，２５（４）：４０２４０８．
［２１］　ＢｅｒｇｍüｌｅｒＥ，ＰｏｒｆｉｒｏｖａＳ，ＤｒｍａｎｎＰ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊ｍｕｔａｎｔｄｅｆｉｃｉｅｎｔｉｎγｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓ
ｆｅｒａｓｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２００３，５２（８）：１１８１１１９０．
［２２］　胡英考，孟宪萍，李雅轩，等．大豆γ生育酚甲基转移酶基因的克隆与表达分析［Ｊ］．大豆科学，２０１１，３０（２）：１９８２０４．
［２３］　邹礼平，高和平．棉花γ生育酚甲基转移酶基因全长ｃＤＮＡ的克隆与序列分析［Ｊ］．江苏农业学报，２００９，２５（３）：４９０４９３．
［２４］　欧阳青，樊春涛，孙卉，等．结球甘蓝γ生育酚甲基转移酶ｃＤＮＡ的克隆、分析及其异源表达酶蛋白的功能研究［Ｊ］．自然
科学进展，２００３，１３（７）：７０９７１５．
［２５］　ＧｒｕｓａｋＭＡ．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅｎｕｔｒｉｅｎｔｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｓｔｏｅｎｈａｎｃｅｈｕｍａｎｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｎｄｈｅａｌｔｈ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙ，１９９９，
５０（６）：１３３１６１．
５０２第２１卷第６期 草业学报２０１２年
［２６］　ＡｂｂａｓｉＡＲ，ＨａｊｉｒｅｚａｅｉＭ，ＨｏｆｉｕｓＤ，犲狋犪犾．Ｓｐｅｃｉｆｉｃｒｏｌｅｓｏｆαａｎｄγｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌｉｎａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅｓｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏ
ｂａｃｃｏ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００７，１４３（４）：１７２０１７３８．
［２７］　ＬｅｅＢＫ，ＫｉｍＳＬ，ＫｉｍＫＨ，犲狋犪犾．Ｓｅｅｄｓｐｅｃｉｆｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐｅｒｉｌａγｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｇｅｎｅｉｎｃｒｅａｓｅｓａｔｏ
ｃｏｐｈｅｒｏｌｃｏｎｔｅｎｔｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｅｒｉｌａ（犘犲狉犻犾犾犪犳狉狌狋犲狊犮犲狀狊）［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌＴｉｓｓｕｅａｎｄＯｒｇａｎＣｕｌｔｕｒｅ，２００８，９２（１）：４７５４．
犆犾狅狀犻狀犵狋犺犲犵犲狀犲狅犳γ狋狅犮狅狆犺犲狉狅犾犿犲狋犺狔犾狋狉犪狀狊犳犲狉犪狊犲（γ犜犕犜）犳狉狅犿犪犾犳犪犾犳犪犪狀犱
犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犪狀犪犾狔狊犻狊犻狀犪犱狏犲狉狊犲狊犻狋狌犪狋犻狅狀狊
ＪＩＡＨｕｉｌｉ１，ＷＡＮＧＸｕｅｍｉｎ２，ＧＡＯＨｏｎｇｗｅｎ２，ＤＯＮＧＪｉｅ２，ＷＡＮＧＹｕｎｑｉ１，
ＬＩＵＪｉａｎｎｉｎｇ１，ＳＨＩＹｏｎｇｈｏｎｇ１
（１．ＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＳｈａｎｘｉＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，
Ｔａｉｙｕａｎ０３００３２，Ｃｈｉｎａ；２．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆ
ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１９３，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ａｌｆａｌｆａｐｌａｙｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｌｉｖｅｓｔｏｃｋｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｉｓｔｈｅｍｏｓｔｗｉｄｅｌｙｃｕｌｔｉｖａｔｅｄｆｏｒａｇｅｐｌａｎｔ
ｉｎＣｈｉｎａ．γｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（γ犜犕犜）ｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｅｎｚｙｍｅｉｎｔｈｅｖｉｔａｍｉｎＥｓｙｎｔｈｅｔｉｃｐａｔｈ
ｗａｙ．γ犜犕犜ｃａｔａｌｙｚｅｓｔｈｅｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｆｒｏｍγｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌｔｏαｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌｗｈｉｃｈｃｈａｎｇｅｓｔｈｅｖｉｔａｍｉｎＥｃｏｍｐｏｓｉ
ｔｉｏｎｓｏｔｈａｔｉｔｃａｎｂｅｅａｓｉｌｙａｂｓｏｒｂｅｄｂｙｈｕｍａｎｓａｎｄａｎｉｍａｌｓ．ＴｈｅｆｕｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｏｆａｌｆａｌｆａγ犜犕犜 ｗａｓ
ｃｌｏｎｅｄｂｙＲＡＣＥＰＣＲａｎｄｔｅｒｍｅｄ犕狊犜犕犜．ＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｆｕｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｏｆｔｈｉｓ
ｇｅｎｅｗａｓ１３０６ｂｐ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇａ９３９ｂｐｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ（ＯＲＦ），ｗｈｉｃｈｅｎｃｏｄｅｄａｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｏｆ３１２ａｍｉｎｏ
ａｃｉｄｓ．犕狊犜犕犜ｂｅｌｏｎｇｓｔｏｔｈｅＡｄｏＭｅｔＭＴａｓｅｓ，ｗｈｉｃｈｐｏｓｓｅｓｓａｎａｄｅｎｏｓｉｎｅｄｅａｍｉｎａｓｅｓｉｇｎａｌ（ＳＬＳＴＤＤＰ）ａｎｄ
ｔｗｏｃｏｎｓｅｒｖｅｄＳＡＭｄｏｍａｉｎｓ（ＸＸＤＸＧＣＧＩＧ，ＶＸＸＰＧＧＸＸＩＸ）．ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲｒｅｓｕｌｔｓｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｔｈｅ犕狊犜
犕犜ｇｅｎｅｉｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎａｌｏｒｇａｎｓｏｆａｌｆａｌｆａ，ｂｕｔｅｓｐｅｃｉａｌｙｉｎｔｈｅｌｅａｖｅｓ．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆ犕狊犜犕犜ｉｎ
ｌｅａｖｅｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｗｉｔｈＮａＣｌ，ＰＥＧａｎｄｄａｒｋｓｔｒｅｓｓ，ｂｕｔｄｅｃｒｅａｓｅｄｗｉｔｈｃｏｏｌｉｎｇｓｔｒｅｓｓ．ＥｘｏｇｅｎｏｕｓＡＢＡｄｉｄｎｏｔ
ａｆｆｅｃｔｔｈｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪；γｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（γ犜犕犜）；ｖｉｔａｍｉｎＥ；ｓｔｒｅｓｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
６０２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．６
海滨雀稗体细胞突变体犛犘２００８３的特异性分析
常盼盼１，２，钟小仙１，刘智微１
（１．江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏 南京２１００１４；２．南京农业大学动物科技学院草业科学系，江苏 南京２１００９５）
摘要：以海滨雀稗体细胞突变体ＳＰ２００８３和Ａｄａｌａｙｄ（对照）为材料，对其植物学特征和叶片表皮气孔特性进行了
比较，结合染色体鉴定和ＲＡＰＤ技术，探索了海滨雀稗体细胞突变体ＳＰ２００８３的特异性。结果表明，与对照Ａｄａ
ｌａｙｄ相比，ＳＰ２００８３匍匐茎节间长、茎直径分别显著减小３４．７７％和１１．７６％，叶片长度、宽度分别显著增加
２２．５５％和１１．１１％，而直立茎节间长、茎直径无显著差异；叶片上表皮气孔器密度显著增加２０．５８％，气孔器长度
和宽度分别显著减小９．６４％和６．３１％；叶片下表皮气孔器密度显著增加４０．６２％，气孔器长度和宽度分别显著减
小６．７３％和５．３３％。ＳＰ２００８３体细胞染色体数目为２狀＝２０，与对照Ａｄａｌａｙｄ染色体数目相同。ＲＡＰＤ结果显示，
采用随机引物Ｓ３６９扩增，ＳＰ２００８３缺失１条约１１００ｂｐ的条带，表明其在ＤＮＡ水平上与Ａｄａｌａｙｄ存在差异。
关键词：海滨雀稗；体细胞；突变体；ＲＡＰＤ；气孔特性；植物学特性
中图分类号：Ｑ９４４．３　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１２）０６０２０７０６
　　 海滨雀稗（犘犪狊狆犪犾狌犿狏犪犵犻狀犪狋犻狌犿，Ｓｅａｓｈｏｒｅｐａｓｐａｌｕｍ）为禾本科（Ｇｒａｍｉｎｅａ）雀稗属（犘犪狊狆犪犾狌犿）植物，原产
于美洲，分布于世界热带、亚热带，尤其美洲热带之海岸，为潮间带草滩植被的主要组分，能在复杂的逆境条件下
生长，其抗性主要表现在耐盐、耐涝、抗旱、耐践踏等方面，是目前已知耐盐能力最强的草坪草种。其叶色翠绿，景
观效果优于狗牙根（犆狔狀狅犱狅狀ｓｐｐ．）和假俭草（犈狉犲犿狅犮犺犾狅犪狅狆犺犻狌狉狅犻犱犲狊），已成为２１世纪最具发展潜力的暖季型
草坪草种［１７］。美国较早开展了海滨雀稗品种的选育工作，２０世纪末海滨雀稗品种 Ａｄａｌａｙｄ从美国引进中国，
１９９８年自深圳的观澜湖高尔夫球场引至江苏省，试种结果表明，Ａｄａｌａｙｄ能生长在全盐含量为０．８％～１．０％的
滨海盐土，海水短期淹没、较长期浸泡均能忍受，抗寒性强，综合性状优，在江苏省连云港以南地区可自然越冬。
邹轶等［８］及景艳霞和袁庆华［９］系统研究了海盐胁迫对海滨雀稗Ａｄａｌａｙｄ生长及植株体内阳离子含量的影响，初
步明确了盐胁迫下海滨雀稗不同于紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）的阳离子积累规律。邹轶等［１０］系统研究了海盐
胁迫对海滨雀稗Ａｄａｌａｙｄ植株形态和生长的影响，并进一步明确了 Ａｄａｌａｙｄ对海盐胁迫的生理响应，在此基础
上，在江苏省和浙江省新围垦海涂，初步建立了海滨雀稗Ａｄａｌａｙｄ种茎直播和草块直铺技术体系，因其耐盐性强、
景观效果好，在长江中下游及其以南地区正在备受关注。但由于海滨雀稗Ａｄａｌａｙｄ与其他二倍体海滨雀稗种质
一样，由于自交不亲和［１１，１２］，只能以无性繁殖方式扩繁，明显影响海涂大面积草地建植以及沿海开发区大面积厂
区和边坡地绿化的成本。
截至目前，全世界只有一个商品化种子直播型海滨雀稗杂交品种“ＳｅａＳｐｒａｙ”（Ｑ３６３１３×Ｈｙｂ７），由美国纯
种子测试机构（ＰｕｒｅＳｅｅｄＴｅｓｔｉｎｇ）与乔治亚大学研究基金会（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＧｅｏｒｇｉａＲｅｓｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ）合作
培育而成［１３］。据报道，２００５年海滨雀稗杂交品种“ＳｅａＳｐｒａｙ”已正式引入我国，但尚未见其在江浙海涂推广应
用，推测可能与生态适应性和抗寒性有关。近年来，江苏省农业科学院钟小仙等［１４］一直致力于可自交结实型海
滨雀稗新品种选育，以幼穗离体培养获得的胚性愈伤组织为材料，从经一定浓度和时间的秋水仙素诱导处理获得
的再生植株上，收获到了体细胞突变体 Ｍ１种子，Ｍ１种子均能正常发芽成苗。本研究通过比较能自交结实的海
滨雀稗突变体ＳＰ２００８３和对照品种Ａｄａｌａｙｄ的植物学特征和叶片气孔特性，结合细胞遗传学鉴定和ＤＮＡ分子
检测，探索海滨雀稗突变体ＳＰ２００８３的特异性，为育成具有完全自主知识产权、可种子繁殖的海滨雀稗新品种提
第２１卷　第６期
Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．６
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
２０７－２１２
２０１２年１２月
收稿日期：２０１１１２０５；改回日期：２０１２０３１２
基金项目：宁波市科技计划项目 （２００８Ｃ１００３３）和慈溪市农业社会发展科技计划（ＣＲ２００７２３）资助。
作者简介：常盼盼（１９８７），女，黑龙江密山人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｃｐｐ２０１１２３６＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｚｈｐａｎｓｙ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
供基础保证［１５］，为大面积盐渍土利用提供技术支撑。
１　材料与方法
１．１　试验材料
海滨雀稗品种Ａｄａｌａｙｄ，２狀＝２０，为自交不亲和二倍体，２０世纪末从美国夏威夷引进我国，２００６年江苏省农
业科学院从杭州白云草业研究所有限公司引进；海滨雀稗突变体ＳＰ２００８３，以Ａｄａｌａｙｄ幼穗诱导产生的颗粒状
愈伤组织为材料［１６］，经秋水仙素诱导获得了再生植株，２００９年，经田间结实性鉴定，获得了可自交结实的再生植
株并收获到种子，２０１０年４月播种出苗后植株成坪。
１．２　试验方法
１．２．１　植物学特征的观测　每种材料分别选取２０个匍匐茎，测量从顶端向后第４个节的节间长度及直径；选取
２０个直立茎，测量中间１个节的节间长度及直径；选取３０片新出的第３片完全展开叶，测量叶片长度和宽度。
１．２．２　叶片气孔特性的观测　分别选取２种供试材料新出的第３片完全展开叶中间部位长１ｃｍ、宽为叶片自
然宽度的部分叶片，采用离析法［１７］，浸泡在等量的３０％过氧化氢醋酸溶液中，在６０℃烘箱内放置２４ｈ，待叶肉
组织和表皮细胞分离后，把离析材料取出，放入装有适量蒸馏水的培养皿中，用镊子分离叶片上、下表皮，１％番红
染色１～２ｍｉｎ，制成临时装片，在ＯＬＹＭＰＵＳＣＸ３１光学显微镜下观察和拍照。
采用形态学图像分析系统（ＪＤ８０１，江苏捷达软件工程有限公司，南京）测定气孔的密度、宽度和长度。每种
供试材料选择３０个视野拍照，统计气孔器数目，计算其密度。每种供试材料拍摄１５个视野，统计气孔器长度和
宽度。气孔器长度是指气孔关闭状态下哑铃形气孔器的长度；气孔器宽度是气孔关闭状态下垂直于哑铃形气孔
器的最宽值［１８］。
１．２．３　细胞学鉴定　分别取海滨雀稗ＳＰ２００８３和Ａｄａｌａｙｄ茎节，将其放入１／２Ｈｏａｇｌａｎｄ营养液中培养生根，待
根长至１～２ｃｍ时，于上午９：００前后取出切下根尖，经自来水冲洗后加入到装有预处理液８羟基喹啉的离心管
中，置于４℃冰箱中处理２～４ｈ。材料预处理后用自来水冲洗３０ｍｉｎ后用卡诺氏固定液于冰箱中固定２４ｈ，固
定后的材料用蒸馏水冲洗后放入装有预热的１ｍｏｌ／Ｌ盐酸的离心管中于６０℃恒温水浴中解离４～６ｍｉｎ，解离后
的材料用蒸馏水冲洗３０ｍｉｎ后，置于卡宝品红中染色３０ｍｉｎ。染色后滴１滴４５％冰醋酸于载玻片压片观察，在
显微镜下镜检。在实际操作中，不同学者所统计细胞的数目有很大差别，一般认为８５％以上的细胞具有相同染
色体数时，方能确定该植物染色体数［１９，２０］。本试验选择２５个染色体分散良好、形态清晰的中期分裂相细胞进行
观察、拍照和统计染色体数目。
１．２．４　ＲＡＰＤ分子鉴定　取海滨雀稗体细胞突变体ＳＰ２００８３、原始对照Ａｄａｌａｙｄ（ＣＫ１）及其幼穗离体培养再
生植株（ＣＫ２）的幼嫩叶片，采用Ｋａｒｒｏｔｅｎ公司生产的植物ＤＮＡ提取试剂盒（ＫａｒｒｏｔｅｎＴＭＰｌａｎｔＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ
Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ）提取ＤＮＡ。选取 ＲＡＰＤ随机引物３４条委托上海生工生物工程有限公司合成。扩增反应在
ＴａＫａＲａ公司ＰＣＲＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＤ上进行，反应体积２５μＬ，内含１０×Ｂｕｆｆｅｒ（含 Ｍｇ
２＋），１０μｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ，
ＴａｑＤＮＡ聚合酶０．３μＬ，引物０．５μｍｏｌ／Ｌ，总ＤＮＡ模板１μＬ。ＰＣＲ反应程序为：９４℃预变性４ｍｉｎ；９４℃变性
１ｍｉｎ，３６℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸１．５ｍｉｎ，共４５个循环，最后再７２℃ 延伸７ｍｉｎ，４℃ 保存。扩增产物用１．４％
的琼脂糖凝胶电泳分离，ｔａｌｏｎ全自动凝胶成像分析系统观察并记录结果。对表现多态性的引物，重复３次，选择
重复性好的引物进行分析。
随机选用３４个合成引物对海滨雀稗突变体ＳＰ２００８３、对照Ａｄａｌａｙｄ（ＣＫ１）和Ａｄａｌａｙｄ幼穗离体培养再生植
株（ＣＫ２）进行了ＲＡＰＤＰＣＲ反应体系扩增，筛选出２个多态性和重复性好的引物Ｓ３６９和Ｓ１３１。Ｓ３６９序列为５′
ＣＣＣＴＡＣＣＧＡＣ３′；Ｓ１３１序列为５′ＴＴＧＧＴＡＣＣＣＣ３′。
１．３　统计分析
采用ＳＰＳＳ１３．０软件进行差异显著性分析。
２　结果与分析
２．１　植物学特征的比较
与Ａｄａｌａｙｄ相比，ＳＰ２００８３匍匐茎节间长度及匍匐茎直径分别减小３４．７７％和１１．７６％，差异显著（犘＜
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