全 文 ：林业科学研究 ２０１４，２７（３）：３２３ ３２８
ＦｏｒｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ
文章编号：１００１１４９８（２０１４）０３０３２３０６
马尾松钙调素基因的克隆及响应松材
线虫侵染的表达特征
徐 亮１，２，刘振宇３，吕 全２，梁 军２，张星耀２
（１．北京林业大学林学院，北京 １０００８３；２．中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所，北京 １０００９１；
３．山东农业大学植物保护学院，山东 泰安 ２７１０１８）
收稿日期：２０１３０８１０
基金项目：国家林业局公益性行业专项（２００９０４０６１、２０１２０４５０１）
作者简介：徐亮，男，在读博士。主要研究方向：森林病理学。电话：１５２１０５０８５３８，Ｅｍａｉｌ：ｘｕｌｉａｎｇ１９８２４＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者：张星耀，博士，研究员。主要研究方向：森林病理学。Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｘｉｎｇｙａｏ＠１２６．ｃｏｍ；刘振宇，博士，教授。Ｅｍａｉｌ：ｃｏｓｍｏｓ
ｌｉｕｃｈｉｎａ＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ
摘要：松材线虫病是由松材线虫（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）侵染引起的严重病害，引起重大的经济和生态损失。钙
调素（ＣａＭ）是真核生物中 Ｃａ２＋主要传导蛋白，本研究采用 ＲＴＰＣＲ方法，首次从马尾松中克隆获得 ＣａＭ，命名为
ｐｍＣａＭ，并检测了其响应松材线虫侵染的表达特征。序列分析表明：ｐｍＣａＭ完整的开放阅读框核苷酸序列为４５０
ｂｐ，编码１４９个氨基酸的蛋白质；该蛋白含有４个ＥＦｈａｎｄ结构域，具有钙调素的典型特征，与其它植物的ＣａＭ蛋白
均有较高同源性。实时荧光定量ＰＣＲ分析显示：接种松材线虫后３０ １８０ｍｉｎ时间段，马尾松苗根、茎、叶器官中
的ｐｍＣａＭ均下调表达，但不同器官间显著下调表达的时间点存在差异；同时，不同器官 ｐｍＣａＭ表达量变化均存在
特异的随时间发展的波动特征，其中发现，根茎ｐｍＣａＭ在松材线虫接种４５ｍｉｎ时均处于表达量高峰。本研究结果
显示ｐｍＣａＭ表达响应了松材线虫侵染，揭示ｐｍＣａＭ可能参与了调控松材线虫马尾松互作早期的钙信号响应。
关键词：松材线虫病；马尾松；松材线虫；ｐｍＣａＭ；克隆表达
中图分类号：Ｓ７９１．２４８ 文献标识码：Ａ
ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＰｉｎｕｓｍａｓｓｏｎｉａｎａｐｍＣａＭ
ＲｅｓｐｏｎｓｅｔｏＢｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓＩｎｆｅｃｔｉｏｎ
ＸＵＬｉａｎｇ１，２，ＬＩＵＺｈｅｎｙｕ３，ＬＵＱｕａｎ２，ＬＩＡＮＧＪｕｎ２，ＺＨＡＮＧＸｉｎｇｙａｏ２
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，ＢｅｉｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８３，Ｃｈｉｎａ；２．ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＦｏｒｅｓｔＥｃｏｌｏｇｙ，
ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｎｄＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００９１，Ｃｈｉｎａ；３．ＣｏｌｅｇｅｏｆＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，
ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉ’ａｎ ２７１０１８，Ｓｈａｎｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｉｎｅｗｉｌｔｄｉｓｅａｓｅ（ＰＷＤ）ｃａｕｓｅｄｂｙｔｈｅｐｉｎｅｗｏｏｄｎｅｍａｔｏｄｅ（ＰＷＮ），Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ，ｉｓ
ｂｅｌｉｅｖｅｄｔｏｂｅｔｈｅｍｏｓｔｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅｄｉｓｅａｓｅｏｆｐｉｎｅｓｐｅｃｉｅｓ，ｃａｕｓｉｎｇｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｅｃｏｎｏｍｉｃａｎｄｅｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｏｓｓｅｓａｒｏｕｎｄ
ｔｈｅｗｏｒｌｄ．Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ（ＣａＭ）ｉｓａｍａｊｏｒｃａｌｃｉｕｍｂｉｎｄｉｎｇｍｅｓｓｅｎｇｅｒｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎａｌｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｃｅｌｓ．Ａ
ｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＣａＭｗａｓｃｌｏｎｅｄｆｒｏｍＭａｓｓｏｎｐｉｎｅ（Ｐ．ｍａｓｏｎｉａｎａ）ｂｙｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴＰＣＲ）ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄｎａｍｅｄａｓｐｍＣａＭ．ＡｎｄｔｈｅｐｍＣａＭｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｐｉｎｅ
ｗｏｏｄｎｅｍａｔｏｄｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎｗａｓｃｈｅｃｋｅｄｂｙｒｅａｌｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ．Ｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ
ｔｈｅｐｍＣａＭｃｏｎｓｉｓｔｅｄｏｆａｎｏｐｅｎｉｎｇｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｏｆ４５０ｂｐ，ｅｎｃｏｄｅｄａｐｒｏｔｅｉｎｏｆ１４９ａａｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｆｏｕｒＥＦｈａｎｄ
ｄｏｍａｉｎｓａｎｄｈａｖｉｎｇｔｈｅｔｙｐｉｃａｌｆｅａｔｕｒｅｓｏｆｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ．ＴｈｅｃｏｍｐａｒｉｓｏｎａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｐｍＣａＭｓｈａｒｅｄｈｉｇｈｈｏ
ｍｏｌｏｇｙｗｉｔｈＣａＭｓｆｒｏｍｏｔｈｅｒｐｌａｎｔｓ．ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ３０ １８０ｍｉｎｐｏｓｔＰＷＤｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ，ｐｍ
ＣａＭｇｅｎｅｓｉｎｒｏｏｔ，ｓｔｅｍａｎｄｌｅａｆｏｆｐｉｎｅｓｅｅｄｌｉｎｇｗｅｒｅａｌｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｂｕｔｔｈｅｔｉｍｅｓｆｏｒｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ
林 业 科 学 研 究 第２７卷
ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐｍＣａＭｗｅｒｅｄｉｆｅｒｅｎｃｅａｍｏｎｇｄｉｆｅｒｅｎｔｏｒｇａｎｓ；ｓｐｅｃｉｆｉｃｆｌｕｃｔｕａｔｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｐｍ
ＣａＭｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｍｏｕｎｔａｌｏｎｇｗｉｔｈｔｉｍｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｗｅｒｅａｐｐｅａｒｅｄｉｎｒｏｏｔ，ｓｔｅｍａｎｄｌｅａｆ，ａｎｄｔｈｅｐｍＣａＭｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎａｍｏｕｎｔｐｅａｋｅｄｉｎｒｏｏｔａｎｄｓｔｅｍ４５ｍｉｎｐｏｓｔＰＷＤｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ．ＴｈｉｓｓｔｕｄｙｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐｍＣａＭ
ｗａｓｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏＰＷＤｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄｉｎｆｅｒｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｍＣａＭｉｎｐｉｎｅｍａｙｐｌａｙａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆ
ｃａｌｃｉｕｍｓｉｇｎａｌｒｅｓｐｏｎｓｅｅａｒｌｙｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｐｉｎｅｗｏｏｄｎｅｍａｔｏｄｅｗｉｔｈＭａｓｓｏｎｐｉｎｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐｉｎｅｗｉｌｔｄｉｓｅａｓｅ；Ｐｉｎｕｓｍａｓｏｎｉａｎａ；Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ；ｐｍＣａＭ；ｃｌｏｎｉｎｇ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｎ
松材线虫病是由松材线虫（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓｘｙ
ｌｏｐｈｉｌｕｓ）侵染引起的松树树种的最具破坏性的病害，
在全球范围内造成了严重的经济、生态损失。松材
线虫病在日本每年造成１００００００ｍ３松树死亡［１］，
在韩国截至到２００５年大约７８１１ｈａ的松树遭到毁
灭［２］，在中国造成的经济损失达到４亿美元［３］。
松材线虫病是复杂的病害系统，其致病机理一
直存在争议［４］。钙调素（ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ，ＣａＭ）响应病
原物侵染并引起植物的抗感病反应，是病原物致病
机理研究中的重要内容。越来越多数据直接或间接
地揭示了 ＣａＭ响应病原侵染，可启动植物防卫反
应［５－１０］。研究发现，松材线虫侵染早期，松树质外
体钙库内流和胞内钙库释放导致胞质内游离钙离子
浓度升高，薄壁细胞中游离 Ｃａ２＋浓度变化随松材线
虫病病程的发展具有“低 －高 －低 －高”的特征，进
而诱导基因表达［１１］。Ｃａ２＋作为胞内重要的第二信
使，在植物防御反应信号转导中具有重要作用［１２］。
Ｃａ２＋的主要传感蛋白之一为 ＣａＭ，存在于所有真核
生物中。ＣａＭ结合Ｃａ２＋后可发生构象变化，并与下
游蛋白质相互作用，而调节细胞的活动［１３］。
马尾松（ＰｉｎｕｓｍａｓｏｎｉａｎａＬａｍｂ．）是中国主要
松树树种之一，分布广泛，并且大多数马尾松是以纯
林的形式存在；过去的３０年里，松材线虫病迅速蔓
延，马尾松树种因对松材线虫病高度敏感而遭到严
重破坏［３］，因此，研究马尾松松材线虫病的致病机
理，对于防控该病害具有重要意义。马尾松是否具
有ＣａＭ，马尾松 ＣａＭ是否响应松材线虫侵染，目前
尚未见报道。本研究从马尾松中克隆了 ＣａＭ，并采
用实时荧光定量 ＰＣＲ技术检测其在松材线虫侵染
早期的表达特征，以期揭示马尾松 ＣａＭ对松材线虫
的响应特征。本研究有利于对 ＣａＭ是否参与调控
松材线虫侵染早期的钙信号传递的探索，并对揭示
松材线虫病早期发病机制具有重要意义。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
健康半年生马尾松苗栽培于多菌灵消毒的营养
土（草炭∶珍珠岩∶蛭石 ＝６∶１∶２，Ｖ／Ｖ／Ｖ）中，置
２８℃恒温箱内，光照１６ｈ·ｄ－１，光照强度２００００ｌｘ，
相对湿度８０％，适应生长１个月后，用于松材线虫的
接种。
接种松材线虫虫株ＢＸＹ６１为强致病力，张星耀
实验室保存虫株。虫株首先接种于长满灰葡萄孢的
ＰＤＡ培养基中，２５℃培养７ｄ备用。
１．２ 接种与取材
线虫接种，将前端剪切成斜面的１０μＬ枪头插
进健康的半年生马尾松苗顶梢；向插好的枪头注入
１０μＬ的松材线虫虫株ＢＸＹ６１悬浮液，含线虫２０００
条。将接种后的松苗置于人工气候培养箱（温度为
２８℃，光照１６ｈ·ｄ－１，光照强度２００００ｌｘ，相对湿度
８０％）培养；每１．５ｈ向接种枪头补加１０μＬ无菌水
保湿，共补加２次。
分别在松材线虫接种后３０ｍｉｎ、４５ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、
９０ｍｉｎ和１８０ｍｉｎ进行马尾松苗根、茎和叶部位取
样，以相同时间点取材的无菌水接种样品做对照。
将获得的样品迅速置液氮中，－８０℃保存备用。
１．３ 马尾松ＣａＭ的克隆
取健康马尾松植株的茎干组织，采用 ＲＮｅａｓｙ
ｐｌａｎｔｍｉｎｉｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）提取总ＲＮＡ；采用１．０％的
琼脂糖凝胶电泳以及ＧｅｎｅＱｕａｎｔ（ＧｅｎｅＱｕａｎｔＩ，Ｐｈａ
ｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）分光光度计检测提取的 ＲＮＡ完整性
和质量；按照 ＳｕｐｅｒＳＭＡＲＴＴＭ ＰＣＲｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ
Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）操作说明书合成第一链ｃＤＮＡ。
根据ＧｅｎＢａｎｋ中松科植物的 ＣａＭ序列设计克
隆引物ＣａＭ１：５’ＡＴＡＧＡＴＴＴＧＣＧＴＴＴＧＣＣＣＧＴＴＴＣ
３’；ＣａＭ ２：５’ＧＧＣＡＴＣＣＴＣＣＧＡＡＴＧＴＣＣＴＴＡＴＴ
３’。以马尾松茎干ＲＮＡ反转录成的ｃＤＮＡ为模板，
进行ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ程序为９４℃ ３ｍｉｎ；９４℃ ３０ｓ，
５２℃３０ｓ，７２℃ １ｍｉｎ，３０个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ。
将回收的ＰＣＲ产物克隆至 ｐＤＭ１８Ｔ载体（ＴａＫａＲａ，
Ｊａｐａｎ），送北京华大基因进行测序，获得含有完整开
放阅读框的ｃＤＮＡ序列。
１．４ ＣａＭ序列分析
利用 ＮＣＢＩ中 Ｂｌａｓｔ程序（ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．
４２３
第３期 徐 亮等：马尾松钙调素基因的克隆及响应松材线虫侵染的表达特征
ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／），氨基酸序列翻译工具（ｈｔ
ｔｐ：／／ａｕ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｄｎａ．ｈｔｍｌ），蛋白质理化参
数计算工具（ｈｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ．ｈｔ
ｍｌ），蛋白质一级结构分析工具（ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘ
ｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｓｃａｎｐｒｏｓｉｔｅ／），信号肽预测工具 Ｓｉｇ
ｎａｌＰ（ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／），
蛋白质跨膜结构域预测工具（ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．
ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ／），蛋白质疏水结构预测工具
（ｈｔｐ：／／ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｈｔｍｌ）等在线
软件对基因进行序列分析。利用ＭＥＧＡ５．０软件进
行马尾松ＣａＭ与４３个其他植物来源ＣａＭ的氨基酸
序列同源性比对。
１．５ 马尾松ＣａＭ时空表达特征分析
分别在松材线虫接种后３０ｍｉｎ、４５ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、
９０ｍｉｎ和１８０ｍｉｎ的马尾松苗根、茎和叶部位取样，
以相同时间点无菌水接种的松苗根、茎、叶为对照。
样品ＲＮＡ提取方法见上。根据克隆获得的马尾松
ＣａＭ的 ｃＤＮＡ序列设计实时荧光定量 ＰＣＲ引物
（ｐｍＣａＭ Ｆ：５’ＧＡＣＧＡＡＧＡＡＧＴＴＧＡＴＧＡＧＡＴＧＡ
３’；ｐｍＣａＭ Ｒ：５’ＴＣＣＴＣＣＧＡＴＴＧＴＣＣＴＴＡＴＴＧＡＴ
３’）；以１８ＳｒＲＮＡ作为内参，设计引物（Ｆ：５’ＣＧ
ＧＣＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＡＡＧＧＡＡ３’；Ｒ：５’ＧＣＴＧＧＡＡＴ
ＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴ３’）。采用 ＳｕｐｅｒＲｅａｌＰｒｅＭｉｘ（ＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ，ＴａＫａＲａ，Ｊａｐａｎ）荧光定量 ＰＣＲ试剂和 Ａｐ
ｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＡＢＩ７５００ＲｅａｌＴｉｍｅＳｙｓｔｅｍ实时定
量ＰＣＲ仪，以各取样点的 ｃＤＮＡ为模板进行马尾松
ＣａＭ的ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ分析，反应体系与程序参照试
剂说明。反应结束后分析荧光值变化曲线和融解曲
线，ＰＣＲ产物电泳确认扩增产物特异性。采用
２－ΔΔＣＴ法分析数据，确定基因的相对表达量。在同
一个批次完成内参基因和目标基因的 ＰＣＲ反应，每
个取样点分别设３个生物学和３个技术学重复。
２ 结果与分析
２．１ 马尾松ＣａＭ的克隆
经马尾松茎干总 ＲＮＡ反转得到的 ｃＤＮＡ片段
长度为６１３ｂｐ，经ＯＲＦｆｉｎｄｅｒ分析，该片段具有一个
完整的开放阅读框（ＯＲＦ）。该 ＯＲＦ长４５０ｂｐ，编码
１４９个氨基酸的蛋白质（图１），命名为 ｐｍＣａＭ。该
蛋白的预测分子量为１６．８３ｋＤ，理论 ｐＩ值为４．１４；
蛋白质结构预测结果表明，该蛋白具亲水性，不含跨
膜区，无信号肽序列，不属于分泌蛋白。同时发现，
该蛋白质含有４个 ＥＦｈａｎｄ保守结构域，分别在２１
至３２位、５７至６８位、９４至１０５位和１３０至１４１位氨
基酸，每个ＥＦｈａｎｄ内都有Ｃａ２＋结合位点，符合ＣａＭ
的序列特征。初步判定克隆获得的基因为马尾松
ＣａＭ基因。
ｐｍＣａＭ的起始密码子、终止密码子为粗斜体字；阴影部分为 ＥＦ
ｈａｎｄ结构域。
图１ ｐｍＣａＭ的核苷酸序列及其推测的氨基酸序列
２．２ 马尾松ｐｍＣａＭ同源性分析
从ＧｅｎＢａｎｋ数据库中筛选获得落羽松（Ｔａｘｏｄｉ
ｕｍｄｉｓｔｉｃｈｕｍ）、日本柳杉（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａｊａｐｏｎｉｃａ）、烟
草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）ＮｔＣａＭ、拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ｔｈａｌｉａｎａ）ＣＡＭ、小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍ）ＴａＣａＭ和大
豆（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）ＳＣａＭ等４３个不同植物来源的ＣａＭ
氨基酸序列，采用ＭＥＧＡ５．０软件中的邻接法对ｐｍ
ＣａＭ编码的氨基酸序列与它们进行比较构建系统进
化树（见图２）。结果显示，ｐｍＣａＭ编码的蛋白与这
些植物的ＣａＭ均具有很高的同源性，其中与落羽松
（ＢＡＦ３２１４０．１）、日本柳杉（ＢＡＦ３１９９５．１）的 ＣａＭ以
及已知的烟草ＮｔＣａＭ１２相似性最高（９８％以上），
并处于一个独立分支中。烟草 ＮｔＣａＭ３１２、拟南芥
ＣＡＭ２３，５７、小麦ＴａＣａＭ１４以及大豆ＳＣａＭ１３
５２３
林 业 科 学 研 究 第２７卷
处于另一个大分支中，拟南芥 ＣＡＭ１、４处于一个独
立小分支中，它们和ｐｍＣａＭ编码蛋白间的相似性也
比较高（９３％）。而拟南芥 ＣＡＭ８、烟草 ＮｔＣａＭ１３
以及大豆ＳＣａＭ４５与ｐｍＣａＭ编码蛋白间的相似性
较远（仅７７％），单独处于一个大分支中；此外，拟
南芥ＣＡＭ９则处于一个与上述所有 ＣａＭ亲缘关系
都较远的独立分支上，其中，与 ｐｍＣａＭ编码蛋白的
相似性仅有５０％。聚类分析进一步证实了作者获
得的ｐｍＣａＭ为马尾松ＣａＭ基因。
进化树分支处的数字代表 Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ值（重复抽样次数为５００）；
直线标尺代表１０％序列差异。
图２ ｐｍＣａＭ编码蛋白与４３个其他植物来源的
ＣａＭ的进化树分析
２．３ 马尾松ｐｍＣａＭ表达模式分析
采用扩增ｐｍＣａＭ的特异引物ｐｍＣａＭＦ、ｐｍＣａＭ
Ｒ，以不同样品 ｃＤＮＡ为模板，进行实时荧光定量
ＰＣＲ，获得松材线虫接种后的马尾松苗 ｐｍＣａＭ的时
空表达特征（图３所示）。研究发现，相对于无菌水
接种的对照组，马尾松苗的ｐｍＣａＭ表达响应松材线
虫侵染，除茎干 ４５ｍｉｎ时相对表达量为 １外，根、
茎、叶ｐｍＣａＭ在接种后３０ １８０ｍｉｎ整个时间段均
呈下调表达特征。但不同器官间 ｐｍＣａＭ表达显著
下调的时间点存在差异，松材线虫接种 ６０ｍｉｎ、９０
ｍｉｎ、１８０ｍｉｎ，马尾松苗根部 ｐｍＣａＭ表达显著下调
（相对表达量相差２倍以上）；６０ｍｉｎ、９０ｍｉｎ，茎干处
ｐｍＣａＭ表达显著下调；而３０ｍｉｎ、４５ｍｉｎ、１８０ｍｉｎ，
叶部ｐｍＣａＭ表达显著下调。同时发现，不同器官中
ｐｍＣａＭ表达均存在特异的时序表达特征，松材线虫
接种、无菌水接种，马尾松苗根部 ｐｍＣａＭ表达量分
别在接种４５ｍｉｎ、６０ｍｉｎ达到高峰；茎干 ｐｍＣａＭ表
达量则分别在接种４５ｍｉｎ、９０ｍｉｎ达到高峰；叶部
ｐｍＣａＭ表达量在松材线虫接种３０ １８０ｍｉｎ整个
过程中变化不大，趋于恒定，但在无菌水接种 ３０
ｍｉｎ、４５ｍｉｎ以及１８０ｍｉｎ达到高峰。综上所述，本
研究结果显示了松材线虫接种早期，马尾松苗根茎
叶ｐｍＣａＭ表达响应了松材线虫侵染，其表达量变化
均存在特异的随时间发展的波动特征；其中发现，根
茎ｐｍＣａＭ在松材线虫接种 ４５ｍｉｎ均出现表达量
高峰。
３ 讨论
松材线虫病是造成松树毁灭性的灾害，但关于
松材线虫病的致病机理一直存在争议。从松材线虫
－松树互作的角度来研究松材线虫病的致病机理，
具有重要意义。前期研究发现，松材线虫侵染早期，
马尾松树体内大量防卫相关蛋白基因以及钙相关蛋
白基因受诱导表达［１４］，而且在松材线虫侵染早期，
马尾松不同器官均出现胞外 Ｃａ２＋瞬时内流的现象，
并且不同器官间Ｃａ２＋流特征存在明显差异（数据未
显示）。结合前人研究［１１］，推测松树体内的钙可能
作为信号参与调控松树早期的防卫反应。
ＣａＭ是植物细胞内高度保守的 Ｃａ２＋结合蛋白，
而研究发现 ＣａＭ响应病原物侵染［５－１０］。Ｈｅｏ等［１５］
发现大豆叶斑病杆菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅｐｖ．
ｇｌｙｃｉｎｅａ）或病原激发子可诱导大豆 ＳＣａＭ４和
ＳＣａＭ５基因表达，却不诱导其他 ＣａＭ亚型基因表
达；组成型表达 ＳＣａＭ４和 ＳＣａＭ５可诱导大豆枯斑
自动生成和一系列 ＳＡＲ相关基因表达。霍建飞
等［１６］发现，相比亲和组合，非亲和叶锈菌（Ｐｕｃｃｉｎｉａ
ｔｒｉｔｉｃｉｎａ）接种小麦，小麦 ＣａＭＳＦ１、ＣａＭＳＦ４表达
量上调，ＣａＭＳＦ２表达量下调，ＣａＭＳＦ３表达量相
差不大；因此提出，ＣａＭＳＦ１、ＣａＭＳＦ４可能与小麦
抗叶锈病相关，ＣａＭＳＦ２可能与小麦感叶锈病相
６２３
第３期 徐 亮等：马尾松钙调素基因的克隆及响应松材线虫侵染的表达特征
１，ｐｍＣａＭ相对表达量＝不同样品 ｐｍＣａＭ表达量／无菌水接种
３０ｍｉｎｐｍＣａＭ表达量；２，不同小写字母分别表示无菌水接种、
松材线虫接种后，不同时间点间，ｐｍＣａＭ相对表达量差异显著
（Ｐ＜０．０５）；３，表达同一时间，无菌水接种、松材线虫接种
间，ｐｍＣａＭ相对表达量差异显著（相对表达量相差２倍以上）。
图３ 马尾松ｐｍＣａＭ响应松材线虫ＢＸＹ６１侵染在
根茎叶中的时序表达特征
关，ＣａＭＳＦ３整个过程可能不参与小麦抗叶锈病反
应。此外，Ｙａｍａｋａｗａ［１７］和Ｔａｋａｂａｔａｋｅ［１８］等发现烟草
花叶病毒（ｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ，ＴＭＶ）侵染可诱导
ＮｔＣａＭ１、ＮｔＣａＭ２以及 ＮｔＣａＭ１３表达上调，Ｎｔ
ＣａＭ３ＮｔＣａＭ１２未显示响应；ＮｔＣａＭ１３敲除品种对
烟草花叶病毒的敏感性轻微增加，对亲和病原细菌
Ｒａｌｓｔｏｎｉａｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ、病原真菌 Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ、
Ｐｙｔｈｉｕｍａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ抗性减少。关于马尾松树
体内是否存在ＣａＭ，以及其是否响应松材线虫侵染，
国内外未见报道。本研究首次克隆获得马尾松 ｐｍ
ＣａＭ，该基因编码的蛋白为１４９个氨基酸、亲水性的
酸性蛋白质，具有４个直接与Ｃａ２＋结合的ＥＦｈａｎｄ保
守结构域，符合 ＣａＭ典型特征。同源性分析知，ｐｍ
ＣａＭ编码蛋白与已知的松科植物、烟草、拟南芥、大豆
以及小麦等的 ＣａＭ具有高同源性，其中与已知的烟
草ＮＴＣａＭ１、ＮＴＣａＭ２相似性高达９８％以上，进一步
证实了马尾松体内ＣａＭ的存在，ｐｍＣａＭ为编码ＣａＭ
的基因。同时，本研究发现，相对无菌水接种，在松材
线虫接种后的３０ １８０ｍｉｎ，除茎干４５ｍｉｎ外，马尾
松根茎叶 ｐｍＣａＭ表达均下调；而且不同器官间 ｐｍ
ＣａＭ表达显著下调的时间点存在差异，叶部 ｐｍＣａＭ
在接种３０ｍｉｎ、４５ｍｉｎ、１８０ｍｉｎ显著下调，根部在６０
ｍｉｎ、９０ｍｉｎ、１８０ｍｉｎ显著下调，茎部则在６０ｍｉｎ、９０
ｍｉｎ显著下调（图３所示）；结果表明马尾松苗ｐｍＣａＭ
表达响应松材线虫侵染，并且具有器官特异性。
Ｃａ２＋在植物防御反应信号转导中具有重要作
用，ＣａＭ作为细胞内主要的 Ｃａ２＋受体蛋白，在介导
Ｃａ２＋信号传导途径中发挥重要作用［１９，２０］。霍建飞
等［２１］通过用ＣａＣ１２和ＣａＭ拮抗剂ＴＦＰ、ＣＰＺ和Ｗ７
预处理小麦种子后，接种亲和及非亲和小麦叶锈菌
后的结果表明：小麦叶片接种非亲和性叶锈菌后，
ＴＦＰ、ＣＰＺ和Ｗ７浸种处理抑制了ＰＯＤ、ＰＡＬ、ＰＰＯ和
ＣＡＴ活性的上升；小麦叶片接种亲和性叶锈菌后，
ＣａＣ１２预处理加剧了ＰＯＤ、ＰＡＬ、ＰＰＯ和 ＣＡＴ活性的
上升；间接说明了ＣａＭ参与调控小麦防御反应中的
钙信号传递，Ｃａ２＋ＣａＭ信使系统可能在小麦抗叶锈
病过程中起着重要作用。我们前期研究发现，松材
线虫侵染早期，马尾松苗根茎叶均发生瞬时 Ｃａ２＋内
流；而呈现明显 Ｃａ２＋内流的早晚时间依次为接种后
的７ｍｉｎ（茎）＝７ｍｉｎ（叶）＞１５ｍｉｎ（根）；Ｃａ２＋内流
最大流速分别为 ３７００ｐｍｏｌ·ｃｍ－２·ｓ－１（根）＞１
３００ｐｍｏｌ·ｃｍ－２·ｓ－１（叶）＞４５０ｐｍｏｌ·ｃｍ－２·ｓ－１
（茎）；Ｃａ２＋内流持续时间则分别为大于６７ｍｉｎ（茎）
＞４３ｍｉｎ（叶）＞２４ｍｉｎ（根），同时发现，马尾松不同
器官均出现特异的钙振荡特征（数据未显示）；结合
金钢［１１］研究发现的松树质外体钙库内流和胞内钙
库释放共同导致细胞内游离钙离子浓度升高，以及
伴随松材线虫病病程的发展，松树细胞中 Ｃａ２＋浓度
变化具有“低－高－低－高”的特征；推测知 Ｃａ２＋参
与了松材线虫－马尾松互作早期的信号传递，而且
不同器官间钙信号特征存在差异。本研究中，松材
线虫接种，马尾松苗根、茎 ｐｍＣａＭ在接种４５ｍｉｎ均
处于表达量高峰，叶部ｐｍＣａＭ在３０ １８０ｍｉｎ整个
过程恒定不变；而对照无菌水接种，马尾松苗根、茎
ｐｍＣａＭ分别在接种 ６０ｍｉｎ，９０ｍｉｎ处于表达量高
峰，叶部 ｐｍＣａＭ则在接种 ３０ｍｉｎ、４５ｍｉｎ、１８０ｍｉｎ
７２３
林 业 科 学 研 究 第２７卷
处于表达量高峰（图３所示）；表明松材线虫侵染后，
马尾松苗不同器官 ｐｍＣａＭ表达量变化均存在特异
的随时间发展的波动特征。其中发现，松材线虫接
种４５ｍｉｎ，马尾松苗根茎 ｐｍＣａＭ均处于表达量高
峰，ｐｍＣａＭ做为Ｃａ２＋主要的传导蛋白，可能参与调
控根茎中钙信号传递；而叶中ｐｍＣａＭ表达量在接种
后的３０ １８０ｍｉｎ整个过程变化不明显，进一步推
测说明马尾松苗不同器官 ｐｍＣａＭ在调控钙信号传
递方面存在差异；松树钙／钙调素信号系统在松材线
虫病发生发展过程中可能发挥了重要的调控作用。
综上所述，本研究首次证实了马尾松体内 ＣａＭ
基因的存在；同时发现，马尾松根茎叶 ｐｍＣａＭ表达
响应松材线虫的侵染，其表达量变化均存在特异的
随时间发展的波动特征；结合作者前期发现的 Ｃａ２＋
作为信号物质参与了松材线虫－马尾松互作早期的
信号传递，推测松材线虫接种后，ｐｍＣａＭ参与调控
马尾松体内钙信号传递。下一步工作将证实钙／钙
调素信号通路的确存在，找到与ｐｍＣａＭ编码蛋白互
作的下游蛋白（钙调素结合蛋白ＣａＭＢＰ），并对松材
线虫侵染过程中，马尾松体内 “Ｃａ２＋ｐｍＣａＭ
ＣａＭＢＰ”复合物的功能进行研究，进而来揭示松材线
虫病发生发展过程中，松树体内的钙介导的信号通
路的调控机制。
４ 结论
本研究首次从马尾松上克隆获得 ｐｍＣａＭ。实
时荧光定量 ＰＣＲ研究发现，接种松材线虫后，马尾
松苗根茎叶 ｐｍＣａＭ均下调表达，但不同器官间 ｐｍ
ＣａＭ显著下调表达的时间点存在差异；而且松材线
虫接种后，马尾松苗根茎叶ｐｍＣａＭ表达量变化均存
在特异的随时间发展的波动特征，其中发现，根茎
ｐｍＣａＭ在松材线虫接种４５ｍｉｎ均出现表达量高峰。
总之，本研究结果显示马尾松ｐｍＣａＭ表达响应了松
材线虫侵染，推测松材线虫－松树互作早期，ｐｍＣａＭ
参与调控马尾松体内的钙信号传递。
参考文献：
［１］ＦｏｒｅｓｔｒｙＡｇｅｎｃｙ．Ａｎｎｕａｌｒｅｐｏｒｔｏｎｔｒｅｎｄｓｏｆｆｏｒｅｓｔａｎｄｆｏｒｅｓｔｒｙｆｉｓｃａｌ
ｙｅａｒ２００３［Ｒ］；Ｔｈｅｍｉｎｉｓｔｒｙｏｆａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ｆｏｒｅｓｔｒｙａｎｄｆｉｓｈｅｒｉｅｓｏｆ
Ｊａｐａｎ：Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ，２００４
［２］ＳｈｉｎＨ，ＬｅｅＨ，ＷｏｏＫＳ，ｅｔａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｓｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ
ｂｙｐｉｎｅｗｏｏｄｎｅｍａｔｏｄｅｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｉｎＪａｐａｎｅｓｅｒｅｄｐｉｎｅ［Ｊ］．Ｔｒｅｅ
Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００９，２９：４１１－４２１
［３］ＹａｎｇＢＪ，ＰａｎＨＹ，ＴａｎｇＪ，ｅｔａｌ．Ｐｉｎｅｗｏｏｄｎｅｍａｔｏｄｅｄｉｓｅａｓｅ
［Ｍ］．Ｂｅｉｊｉｎｇ：ＣｈｉｎｅｓｅＦｏｒｅｓｔｒｙＰｒｅｓｓ，２００３：６－１４３
［４］张星耀，骆有庆．中国森林重大生物灾害［Ｍ］．北京：中国林业出
版社，２００３
［５］王艳辉，贾 慧，司贺龙，等。不同基因型玉米受 ＨＴ毒素胁迫
后细胞内ＣａＭ的动态变化 ［Ｊ］．河北农业大学学报，２００７，３０：
４－７
［６］ＹａｎｇＴ，ＰｏｏｖａｉａｈＢＷ．Ｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ：Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ
ｏｆｐｌａｎｔｃａｔａｌａｓｅｂｙｃａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ［Ｊ］．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ
ＵＳＡ，２００２，９９：４０９７－４１０２
［７］ＨａｒｄｉｎｇＳＡ，ＯｈＳ，ＲｏｂｅｒｔｓＤＭ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇａ
ｆｏｒｅｉｇｎｃａｌｍｏｄｕｌｉｎｇｅｎｅｓｈｏｗｓａｎｅｎｈａｎｃｅｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆａｃｔｉｖｅｏｘｙ
ｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］．ＥＭＢＯＪ，１９９７，１６：１１３７－１１４４
［８］ＫｉｍＭＣ，ＬｅｅＳＨ，ＫｉｍＪＫ，ｅｔａｌ．Ｍｌｏ，ａｍｏｄｕｌａｔｏｒｏｆｐｌａｎｔｄｅ
ｆｅｎｓｅａｎｄｃｅｌｄｅａｔｈ，ｉｓａｎｏｖｅｌｃａｌｍｏｄｕｌｉｎｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．Ｊ
ＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００２，２７７：１９３０４－１９３１４
［９］ＫｉｍＭＣ，ＰａｎｓｔｒｕｇａＲ，ＥｌｉｏＣ，ｅｔａｌ．Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｓｗｉｔｈ
ＭＬｏｐｒｏｔｅｉｎｔｏｒｅｇｕｌａｔｅｄｅｆｅｎｓｅａｇａｉｎｓｔｍｉｌｄｅｗｉｎｂａｒｌｅｙ［Ｊ］．Ｎａ
ｔｕｒｅ，２００２，４１６：４４７－４５１
［１０］ＫａｎｇＣＨ，ＪｕｎｇＷＹ，ＫａｎｇＹＨ，ｅｔａｌ．ＡｔＢＡＧ６，ａｎｏｖｅｌｃａｌｍ
ｏｄｕｌｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ，ｉｎｄｕｃｅｓｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｃｅｌｄｅａｔｈｉｎｙｅａｓｔ
ａｎｄｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＣｅｌＤｅａｔｈＤｉｆｅｒ．２００６，１３：８４－９５
［１１］金 钢．黑松与松材线虫互作过程中细胞程序性死亡的研究
［Ｄ］．南京：南京林业大学，２００７
［１２］ＴａｖｅｒｎｉｅｒＥ，ＷｅｎｄｅｈｅｎｎｅＤ，ＢｌｅｉｎＪ－Ｐ，ｅｔａｌ．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｏｆ
ｆｒｅｅｃａｌｃｉｕｍｉｎａｃｔｉｏｎｏｆｃｒｙｐｔｏｇｅｉｎ，ａｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓｅｌｉｃｉｔｏｒｏｆｈｙ
ｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅｒｅａｃｔｉｏｎｉｎｔｏｂａｃｃｏｃｅｌｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ，１９９５，
１０９：１０２５－１０３１
［１３］ＺｉｅｌｉｎｓｋｉＲＥ．Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎａｎｄｃａｌｍｏｄｕｌｉｎｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎ
ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＡｎｎｕＲｅｖＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ，１９９８，４９：
６９７－７２５
［１４］ＸｕＬ，ＬｉｕＺＹ，ＺｈａｎｇＫ，ｅｔａｌ．ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＰｉｎｕｓｍａｓ
ｓｏｎｉａｎａｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏＢｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｅｃ
ｔｉｏｎｕｓｉｎｇｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＩｎｔＪＭｏｌＳｃｉ，
２０１３，１４：１１３５６－１１３７５
［１５］ＨｅｏＷＤ，ＬｅｅＳＨ，ＫｉｍＭＣ，ｅｔａｌ．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｏｆｓｐｅｃｉｆｉｃｃａｌｍ
ｏｄｕｌｉｎｉｓｏｆｏｒｍｓｉｎｓａｌｉｃｙｌｉｃａｃｉｄｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｄｉｓ
ｅａｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓ［Ｊ］．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，１９９９，
９６：７６６－７７１
［１６］霍建飞，宋水山，李 星，等．ＣａＭ及各亚型基因参与小麦抗叶
锈病反应的研究 ［Ｊ］．华北农学报，２０１０，２５（４）：１７５－１７９
［１７］ＹａｍａｋａｗａＨ，ＭｉｔｓｕｈａｒａＩ，ＩｔｏＮ，ｅｔａｌ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｙａｎｄｐｏｓｔ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｙｒｅｇｕｌａｔｅｄｒｅｓｐｏｎｓｅｏｆ１３ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎｇｅｎｅｓｔｏｔｏｂａｃ
ｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｉｎｄｕｃｅｄｃｅｌｄｅａｔｈａｎｄｗｏｕｎｄｉｎｇｉｎｔｏｂａｃｃｏｐｌａｎｔ
［Ｊ］．ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ，２００１，２６８：３９１６－３９２９
［１８］ＴａｋａｂａｔａｋｅＲ，ＫａｒｉｔａＥ，ＳｅｏＳ，ｅｔａｌ．Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｎｄｕｃｅｄｃａｌｍｏｄｕ
ｌｉｎｉｓｏｆｏｒｍｓｉｎｂａｓａｌｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｇａｉｎｓｔｂａｃｔｅｒｉａｌａｎｄｆｕｎｇａｌｐａｔｈｏ
ｇｅｎｓｉｎｔｏｂａｃｃｏ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌＰｈｙｓｉｏｌ，２００７，４８（３）：４１４－４２３
［１９］ＬｅｅＳＨ，ＪｏｈｎｓｏｎＪＤ，ＷａｌｓｈＭＰ，ｅｔａｌ．Ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆ
Ｃａ２＋／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｎｚｙｍｅｓｂｙｐｌａｎｔｃａｌｍｏｄｕｌｉｎｉｓｏｆｏｒｍｓ
ａｎｄｆｒｅｅＣａ２＋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｅｍＪ，２０００，３５０：２９９－３０６
［２０］ＮａｔｈＭ，ＧｏｅｌＡ，ＴａｊＧ，ｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ
ｉｎｓｉｌｉｃｏａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃａｌｍｏｄｕｌｉｎｇｅｎｅｓｆｒｏｍｃｅｒｅａｌｓａｎｄｍｉｌｅｔｓｆｏｒ
ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｃａｌｃｉｕｍａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ
［Ｊ］．ＪＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓＢｉｏｉｎｆｏｒｍ，２０１０，３：２９４－３０１
［２１］霍建飞，宋水山，李 星，等．Ｃａ２＋·ＣａＭ信使系统参与小麦
抗叶锈病反应的初步研究 ［Ｊ］．华北农学报，２００８，２３：２３４
－２３９
８２３