全 文 ：书乳白香青内生解磷菌的筛选鉴定及解磷特性研究
李振东１，２，陈秀蓉１，杨成德１，李鹏１
（１．草业生态系统教育部重点实验室 甘肃农业大学 甘肃省草业工程实验室 中－美草地畜牧业可持续发展研究中心，
甘肃 兰州７３００７０；２．甘肃省社会科学院农村发展研究所，甘肃 兰州７３００７０）
摘要：选择东祁连山高寒草地优势植物乳白香青为试验材料，分离和筛选内生解磷细菌，并对筛选的解磷细菌进行
了鉴定，在此基础上，研究了其对玉米的促生作用。结果表明，从乳白香青植株中分离到４株内生解磷菌，解磷量
（Ｐ２Ｏ５）为６５．２４～３１５．３６ｍｇ／Ｌ，其中菌株ＲＡ８的解磷能力最高；经形态特征、生理生化特性和１６ＳｒＤＮＡ 序列系
统发育学分析，初步鉴定ＲＡ８为副球菌属细菌；ＲＡ８代谢产酸，但解磷能力与培养液的ｐＨ值之间无相关性，产生
的非酸类代谢物质是其解磷的主要机制；ＲＡ８可以与土壤中的土著微生物互惠协作，增强 ＲＡ８的解磷能力；经
ＲＡ８处理的玉米在第７０天和第１００天生物量显著高于对照（犘＜０．０５），第１００天株高极显著高于对照（犘＜
０．０１），即ＲＡ８对玉米的生长有明显的促进作用。
关键词：高寒草地；内生解磷细菌；生理生化特征；鉴定
中图分类号：Ｓ８１２；Ｑ９４５．７９ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１３）０６０１５００９
犇犗犐：１０．１１６８６／ｃｙｘｂ２０１３０６１９
磷是植物生长必需的三大营养元素之一，同时也是农业生产中影响作物产量的重要限制因子之一。土壤中
９５％以上的磷很难被植物直接吸收利用，为无效态磷［１］，能被植物吸收利用的有效态无机磷仅占土壤全磷量的
２％～３％［２］。当前，我国７４％的耕地土壤缺磷［３］，大量使用化学磷肥后，当季作物对磷肥利用率为５％～２５％，大
部分磷肥在土壤中积累［４］，造成土壤中养分比例失调，破坏土壤结构，改变土壤环境，给生态环境造成严重的负面
影响［５］，给农业的可持续发展带来隐患，因此，提高土壤中磷的利用效率具有重要意义。１９０８年，Ｓａｃｋｅｔｔ等［６］从
土壤中分离出３６株细菌，可在平板培养基上形成清晰的溶磷圈，说明土壤中有分解难溶性磷酸盐的细菌，此后，
国内外学者在筛选土壤溶磷微生物等方面进行了大量工作。１９８３年，Ｋｕｃｅｙ［７］认为全球微生物中有０．１％～
０．５％是溶磷微生物；１９８８年尹瑞龄［８］在研究我国旱地土壤溶磷微生物时指出，每ｇ土壤中溶磷微生物数量平均
约为１０００万，占整个土壤微生物群的２７．１％～８２．１％；１９９８年，Ａｎｔｏｕｎ和Ｂｅａｕｃｈａｍｐ［９］对根际土壤微生物的研
究表明，根际微生物中有５４％具有溶磷能力。溶磷微生物最早是从土壤中发现的，绝大多数报道中的溶磷微生
物也是从土壤中筛选的。但是，溶磷微生物不仅仅只存在于土壤中，２００６年张国霞等［１０］从野生稻（犗狉狔狕犪狉狌犳犻
狆狅犵狅狀）中分离到２２株内生固氮菌，其中２１株具有溶磷能力。近年来，随着植物内生菌研究的深入，从毛竹
（犘犺狔犾犾狅狊狋犪犮犺狔狊狆狌犫犲狊犮犲狀狊）［１１］、桑树（犕狅狉狌狊犪犾犫犪）［１２］、油菜（犅狉犪狊狊犻犮犪犮犪犿狆犲狊狋狉犻狊）［１３］、碱蓬（犛狌犪犲犱犪犺犲狋犲狉狅狆
狋犲狉犪）［１４］、菊芋（犎犲犾犻犪狀狋犺狌狊狋狌犫犲狉狅狊狌狊）［１５］、小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）［１６］、玉米（犣犲犪犿犪狔狊）［１７］、田菁（犛犲狊犫犪狀犻犪犮犪狀
狀犪犫犻狀犪）、互花米草（犛狆犪狉狋犻狀犪犪犾狋犲狉狀犻犳犾狅狉犪）、芦苇（犘犺狉犪犵犿犻狋犲狊犮狅犿犿狌狀犻狊）、柽柳（犜犪犿犪狉犻狓犮犺犻狀犲狀狊犻狊）［１８］等植物
中均分离到了内生溶磷细菌，说明植物体内也有溶磷微生物的存在。我国草地面积近４００万ｋｍ２，占全国陆地总
面积的４１．７％，其中１／３是高寒草地。但是有关高寒草地植物内生溶磷细菌的研究报道较少，２００８年７月通过
测度样地内物种数，种多度，盖度和频度，乳白香青（犃狀犪狆犺犪犾犻狊犾犪犮狋犲犪）为该样地的优势植物之一。
乳白香青属菊科香青属多年生草本植物，为藏药，具有活血散瘀、平肝潜阳、祛痰、外用止血的功能［１９］，含有
大量具有广泛生物活性的黄酮类化合物，有抗癌、抗辐射、抗炎、镇痛、解热等作用［２０］，那么乳白香青中是否有高
１５０－１５８
２０１３年１２月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第２２卷 第６期
Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．６
收稿日期：２０１２１０１５；改回日期：２０１２１２０３
基金项目：国家自然科学基金项目（３１１６０１２２）和草业生态系统教育部重点实验室（甘肃农业大学）开放课题（ＣＹｚｓ２０１１０１１）资助。
作者简介：李振东（１９７８），男，甘肃临夏人，副研究员，博士。Ｅｍａｉｌ：ｌｉｚｈｅｎｄｏｎｇ２２＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｙａｎｇｃｄ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
效溶磷菌？但未见乳白香青内生溶磷细菌的相关研究报道，基于此，本试验选择东祁连山高寒草地优势植物乳白
香青为材料，分离筛选其内生溶磷细菌，以探寻高寒生境中优势植物的内生解磷菌资源，为挖掘和开发利用高寒
草地植物内生细菌资源奠定基础和提供依据。
１ 材料与方法
１．１ 材料和样地
２００８年７月采集于甘肃农业大学天祝高山草地试验站（Ｎ３７°１１′～３７°１３′，Ｅ１０２°１３′～１０２°２３′），该试验站位
于青藏高原东北部的甘肃省天祝县，海拔２７００～３３００ｍ，气候寒冷湿润；年均温－０．１℃，全年≥０℃积温１３８０℃；
无绝对无霜期；年降水量４１６ｍｍ，年蒸发量１５９２ｍｍ；土壤为高山黑钙土，容重０．７１ｇ／ｃｍ３，有机质含量１０％，
全氮０．０６％，速效氮０．０１７％，全磷０．０６７％，ｐＨ７．０～８．２。
供试标准菌株：枯草芽孢杆菌（犅犪犮犻犾犾狌狊狊狌犫狋犻犾犻狊）购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。供试主要试剂：溶
菌酶、蛋白酶Ｋ、ｄＮＴＰ、ＴａｑＤＮＡ聚合酶和ＤＮＡＭａｒｋｅｒ购自生工生物工程（上海）有限公司。
１．２ 试验方法
１．２．１ 解磷内生细菌的分离 将采集到的乳白香青表面消毒后，用组织研磨浸出液涂布法［２１］分离内生解磷细
菌。将所得的内生菌菌悬液涂布于Ｐｉｋｏｖａｓｋａｉａ’ｓ培养基（ＰＫＯ）［１０］上，置于２８℃培养箱中培养１４ｄ，观察有无解
磷圈及解磷圈大小。根据解磷圈与菌落比值大小确定其对无机磷的解磷作用，将ＰＫＯ平板上的所有内生菌纯
化并保存在牛肉膏蛋白胨培养基［２２］上备用。
１．２．２ 解磷能力的定量测定 按照前人［２３］的研究方法制作磷标准曲线，得出回归方程，计算细菌的解磷量。将
保存的内生菌过夜培养（２８℃，１２０ｒ／ｍｉｎ）后，取１００μＬ接种于５０ｍＬＰＫＯ无机磷培养液中，３次重复，以接无
菌水为对照，置２８℃摇床（１２０ｒ／ｍｉｎ）培养１２ｄ后，取上清液按照参考文献［２３］的方法测定解磷量。菌株解磷量
计算公式为：
菌株解磷量（ｍｇ／Ｌ）＝比色液（ｍｇ／Ｌ）×（１００／５）×取用量倍数［２３］
１．２．３ ＲＡ８菌株的解磷动态测定 将１ｍＬ过夜培养的（２８℃，１２０ｒ／ｍｉｎ）ＲＡ８菌悬液接入ＰＫＯ无机磷培养
液中，以接无菌水为对照，１５０ｒ／ｍｉｎ２８℃培养。分别在第３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９和２１天取培养液，进行以
下测定：采用平板计数法测定不同培养时间ＲＡ８菌株的活菌数，同时测定其培养液的ｐＨ值，再将培养液离心
（１００００ｒ／ｍｉｎ）１５ｍｉｎ，取上清液采用钼锑抗比色法［２３］测定菌株的解磷量，３次重复，分别计算其活菌数、ｐＨ值以
及解磷净增量。
１．２．４ ＲＡ８菌株对土壤磷溶解能力测定 称取过筛后的土壤５ｇ置于１５０ｍＬ三角瓶中，分灭菌和不灭菌２个
处理，每处理分３组：１）（未灭菌土和灭菌土作相同的处理，下同），三角瓶中加入１ｍＬＲＡ８菌株过夜培养液
（２８℃，１２０ｒ／ｍｉｎ）和９ｍＬ无菌水，以加入１ｍＬ经灭菌的ＲＡ８菌株过夜培养液和９ｍＬ无菌水为ＣＫ；２）加入５
ｍＬＲＡ８菌株过夜培养液和５ｍＬ无菌水，以加入５ｍＬ经灭菌的ＲＡ８菌株过夜培养液和５ｍＬ无菌水为ＣＫ；
３）加入１０ｍＬＲＡ８菌株过夜培养液，以加入１０ｍＬ经灭菌的ＲＡ８过夜培养液为ＣＫ；置于２８℃培养，分别在培
养的第３，５，１０，１５，２０，２５和３０天按参考文献［２３］中土壤速效磷的测定方法测定其解磷量，３次重复。
１．２．５ ＲＡ８菌株对植物生长的影响 将土碾细过筛子拌匀后等量分装到营养钵中。处理１，用ＲＡ８菌株的过
夜培养液（２８℃，１２０ｒ／ｍｉｎ）浸种玉米种子２４ｈ后种植；处理２，每钵喷洒５ｍＬＲＡ８菌株的过夜培养液，玉米种
子不处理；以不接菌为对照；每钵种５粒种子，６次重复，处理及ＣＫ均置于同一环境下培养。７ｄ后统计发芽
率［２４２６］，分别在第３０，７０，１００天测量玉米的株高、生物量（鲜重和干重），３次重复。
１．２．６ 菌株ＲＡ８的鉴定 形态特征的观察和生理生化特征的测定参照《伯杰细菌鉴定手册》［２７］和《常见细菌系
统鉴定手册》［２２］的相关方法进行，用枯草芽孢杆菌为对照菌株；分子生物学鉴定按照参考文献［２８］中的方法
进行。
１．３ 统计分析
采用Ｅｘｃｅｌ２００３进行数据处理。
１５１第２２卷第６期 草业学报２０１３年
２ 结果与分析
２．１ 解磷内生细菌分离和定性测定
从乳白香青根、茎、叶和花中分别获得９，６，５和
１２株内生细菌，均能在ＰＫＯ平板上生长，其中，从根
分离到的菌株ＲＡ５、从叶中分离到的菌株ＲＣ３和从花
中分离到的菌株ＲＤ１２在ＰＫＯ平板培养基上形成解
磷圈，其解磷能力以ＲＤ１２最大，Ｄ／ｄ值为１．３３（表１）。
２．２ 解磷内生菌解磷能力定量测定
对３２株内生菌的解磷能力进行测定，结果表明，
表１ 解磷菌的解磷能力测定
犜犪犫犾犲１ 犛狅犾狌犫犻犾犻狕犻狀犵犮犪狆犪犮犻狋狔狅犳狆犺狅狊狆犺犪狋犲狊狅犾狌犫犻犾犻狕犻狀犵犫犪犮狋犲狉犻犪
菌株
Ｓｔｒａｉｎ
解磷圈直径
Ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇｃｉｒｃｌｅ
ｄｉａｍｅｔｅｒ（ｍｍ）
菌落直径
Ｃｏｌｏｎｙｄｉａｍｅｔｅｒ
（ｍｍ）
解磷能力
Ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇ
ａｂｉｌｉｔｙ
ＲＡ５ １３．４±１．２５ １１．３±１．１５ １．１９±０．０１
ＲＣ３ １４．４±１．１６ １１．９±１．３０ １．２２±０．０４
ＲＤ１２ ９．８±０．９３ ７．３±０．８５ １．３３±０．０４
ＲＡ５、ＲＡ８、ＲＣ３和ＲＤ１２的ＯＤ７００值大于对照（表２），说明这４株内生菌培养液中可溶磷的含量大于对照，具有
解磷能力。４株菌株的解磷量（Ｐ２Ｏ５）在６５．２４０～３１５．３６０ｍｇ／Ｌ（表２）。值得注意的是：菌株ＲＡ８在ＰＫＯ平板
上不产生溶磷圈，但是其在ＰＫＯ液体培养基中解磷能力最强。因此，对ＲＡ８的解磷特性做进一步研究。
表２ 菌株解磷量定量测定
犜犪犫犾犲２ 犙狌犪狀狋犻狋犪狋犻狏犲犱犻狊狊狅犾狏犲犱狆犺狅狊狆犺狅狉狌狊犮犪狆犪犮犻狋狔狅犳狆犺狅狊狆犺犪狋犲狊狅犾狌犫犻犾犻狕犻狀犵犫犪犮狋犲狉犻犪
项目Ｉｔｅｍ
菌株Ｓｔｒａｉｎ
ＲＡ５ ＲＡ８ ＲＣ３ ＲＤ１２
ＯＤ７００ ０．０９３±０．００３５ ０．４５３±０．０１４５ ０．１０７±０．００２６ ０．１３１±０．００９２
解磷量Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇｑｕａｎｔｉｔｙ（Ｐ２Ｏ５，ｍｇ／Ｌ） ６５．２４０±２．３９ ３１５．３６０±９．８８ ７４．９６０±１．７８ ９１．６４０±４．２５
２．３ ＲＡ８菌株的解磷动态
图１ 犚犃８菌株解磷动态
犉犻犵．１ 犇狔狀犪犿犻犮狅犳狆犺狅狊狆犺犪狋犲犱犻狊狊狅犾狌狋犻狅狀犳狅狉狊狋狉犪犻狀犚犃８
ＲＡ８菌株在培养到第３天活菌数达到最大，在培
养的第５～１３天，活菌数缓慢减少，解磷净增量持续增
加，第１３天比第１１天净增１２２．９７ｍｇ／Ｌ，净增量最
大，在培养的第１５～２１天活菌数下降较快，解磷净增
量也不断下降（图１），但培养液ｐＨ值在培养的第３天
就下降到最低点５．４，比对照低２个单位，第３～２１天
在５．４～５．８之间波动，比对照低约２个单位（图２）。
该结果说明ＲＡ８代谢产生的酸将培养液酸化，低ｐＨ
值使难溶磷部分溶解。
２．４ ＲＡ８菌株溶解土壤磷能力
在已灭菌的土壤中，在第３和５天接菌量为１ｍＬ
的处理中菌体数量较少，可溶磷净增量为负值，说明可
溶磷的吸收量大于释放量；接菌量为５和１０ｍＬ的处理菌体数量较多，可溶磷净增量为正值，可溶磷有积累，说
明可溶磷的释放量大于ＲＡ８增殖的需求量。第１０～３０天，３个处理可溶磷净增量均为正值，说明可溶磷吸收量
均小于释放量，可溶磷不断地积累（图３）。在未灭菌的土壤中，第３天，３种不同处理的土壤中可溶性磷的增量均
表现为负值，表明菌株ＲＡ８与土著微生物对磷的吸收量大于ＣＫ中土著微生物对磷的吸收，随接菌量的增加，可
溶磷的浓度降幅减少，３种处理中土壤可溶磷的浓度均比灭菌土壤中相应处理低，说明ＲＡ８与土壤中的土著微
生物之间有促进生长的作用，使得土壤中可溶磷净增量比已灭菌土壤中低。在第５天时，接菌量为１ｍＬ的处理
中可溶磷净增量为负值，说明可溶磷的吸收仍大于释放；接菌量为５和１０ｍＬ的处理可溶磷净增量为正值，说明
可溶磷的吸收小于释放。培养的前１０ｄ，接菌量为１ｍＬ的处理可溶磷增量少于接菌量为５和１０ｍＬ的处理，说
明ＲＡ８的起始菌体数量少，其解磷量少，可溶磷的积累量少，ＲＡ８数量的增加增强了解磷作用，第１０～３０天，３
２５１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．６
个处理的可溶磷吸收均小于释放，可溶磷净增量均
图２ 犚犃８菌株解磷过程中狆犎值的变化
犉犻犵．２ 犆犺犪狀犵犲狊狅犳狆犎狏犪犾狌犲犻狀狆犺狅狊狆犺狅狉狌狊狊狅犾狌犫犻犾犻狕犪狋犻狅狀
犱狔狀犪犿犻犮狅犳狊狋狉犪犻狀犚犃８
图３ 菌株犚犃８对土壤磷的溶解动态
犉犻犵．３ 犇犻狊狊狅犾狌狋犻狅狀狅犳犱狔狀犪犿犻犮犚犃８狋狅狊狅犻犾狆犺狅狊狆犺狅狉狌狊
Ａ１、Ａ５、Ａ１０分别表示未灭菌土壤中接菌量为１，５，１０ｍＬ的３种处理；
Ｂ１、Ｂ５、Ｂ１０分别表示已灭菌土壤中接菌量为１，５，１０ｍＬ的３种处理。Ａ１，
Ａ５ａｎｄＡ１０ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｓｔａｎｄｆｏｒｔｈｒｅｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ１，５，
ａｎｄ１０ｍＬｉｎｓｏｉｌｗｉｔｈｏｕｔｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ；Ｂ１，Ｂ５ａｎｄＢ１０ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｓｔａｎｄ
ｆｏｒｔｈｒｅｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ１，５ａｎｄ１０ｍＬｉｎｓｏｉｌｗｉｔｈｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ．
为正值，可溶磷不断地积累，解磷量随接菌量的增加
和培养时间的延长逐渐增加。但是，由于接菌量的
不同，起始菌浓度大的处理，解磷量积累早，故试验
结束时其积累量也大；不灭菌土壤解磷量变化趋势
与灭菌土壤一致（图３）。
土壤的２种处理方法相比，接菌后，在未灭菌土
壤中，各种土壤微生物（包括接入的ＲＡ８）吸收可溶
磷，在已灭菌土壤中，可溶磷的减少则是由ＲＡ８生
长所吸收，因此，第３天未灭菌土壤中可溶磷大幅低
于ＣＫ，在已灭菌土壤中只有接菌液１ｍＬ的处理中
可溶磷低于ＣＫ。未灭菌土壤中可溶磷含量除接菌
量为５和１０ｍＬ处理在第５～１０天有一个停滞外均
持续增加；已灭菌土壤中的可溶磷含量第３～２０天
持续增加，第２０～３０天可溶磷含量增长处于稳定状
态。第３０天可溶磷积累量：在未灭菌土壤中，接菌
量１，５和１０ｍＬ 处理分别是７８．１５，１０７．２２和
１１５．５３ｍｇ／Ｌ，在灭菌土壤中，接菌量１，５和１０ｍＬ
处理分别是３８．２１，６４．５８和７７．６０ｍｇ／Ｌ。该结果
表明，接菌量大，ＲＡ８菌体的基数大，解磷能力强，
可溶磷积累多；ＲＡ８能与土壤中的土著微生物互惠
协作，土著微生物能增强ＲＡ８的解磷能力（图３）。
２．５ ＲＡ８菌株对玉米的促生作用
ＲＡ８菌株对玉米的发芽率没有影响，在第３０
天时，灌根处理的玉米生物量显著高于对照（犘＜
０．０５），但株高与对照差异不显著；在第７０天时，两
处理玉米株高显著高于对照，灌根处理的玉米生物
量极显著高于对照（犘＜０．０１），拌种处理的玉米生
物量显著高于对照（犘＜０．０５）；在第１００天，两处理
的玉米株高极显著高于对照，生物量显著高于对照，但两处理间差异不显著（表３）。该结果表明，ＲＡ８对玉米在
第３０天时促生效果不明显，到第７０天时才有显著的促生效果。
表３ 犚犃８对盆栽玉米的促生作用
犜犪犫犾犲３ 犌狉狅狑狋犺狆狉狅犿狅狋犻狀犵犲犳犳犲犮狋狊狅犳犚犃８狅狀犿犪犻狕犲
项目
Ｉｔｅｍ
发芽率Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
ｒａｔｅ（％）
株高Ｐｌａｎｔｈｅｉｇｈｔ（ｃｍ）
３０ｄ ７０ｄ １００ｄ
鲜重Ｆｒｅｓｈｗｅｉｇｈｔ（ｇ）
３０ｄ ７０ｄ １００ｄ
干重Ｄｒｙｗｅｉｇｈｔ（ｇ）
３０ｄ ７０ｄ １００ｄ
浇灌 Ｗａｔｅｒ ９３．３３ａ ４７．２ａ ６８．７ａ ８０．０Ａａ ５．８１Ａａ １９．３７Ａａ ２７．６４Ａａ ０．６１ａ ２．４４Ａａ ３．３２ａ
拌种Ｓｅｅｄｄｒｅｓｓｉｎｇ ８０．００ａ ４６．０ａ ６７．７ａ ７９．２Ａａ ４．１１ａｂ １８．１１ａ ２５．７６ａ ０．５０ａｂ ２．２７ａ ３．１１ａ
对照ＣＫ ８６．６７ａ ４１．４ａ ６０．４ｂ ６９．０Ｂｂ ２．６９Ｂｂ １２．１５Ｂｂ １７．２１Ｂｂ ０．２６ｂ １．５２Ｂｂ ２．１４ｂ
注：同列不同大写字母表示差异极显著（犘＜０．０１），同列不同小写字母表示差异显著（犘＜０．０５）。
Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅｄａｔａｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃａｐｉｔａｌｌｅｔｔｅｒｓｉｎｓａｍｅｃｏｌｕｍｎｓｈｏｗｅｘｔｒｅｍｅｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（犘＜０．０１）；ｔｈｅｄａｔａｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｍａｌｌｅｔｔｅｒｓ
ｉｎｓａｍｅｃｏｌｕｍｎｓｈｏｗｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（犘＜０．０５）．
３５１第２２卷第６期 草业学报２０１３年
２．６ ＲＡ８菌株的鉴定
２．６．１ 形态特征和生理生化特性 菌株ＲＡ８菌落圆形，边缘整齐，中央隆起，肉色，无光泽，不透明（图４），菌体
短杆状，革兰氏阴性（图５），菌体大小为０．５～０．８μｍ×１．２～１．９μｍ，具有运动性，兼性厌氧，生理生化特性测试
结果见表４，所测试项目中标准菌株的反应均与文献报道一致。
图４ 犚犃８的菌落
犉犻犵．４ 犜犺犲犮狅犾狅狀狔狅犳犚犃８
图５ 犚犃８革兰氏染色
犉犻犵．５ 犜犺犲犵狉犪犿狊狋犪犻狀狅犳犚犃８
２．６．２ １６ＳｒＤＮＡ 序列系统发育学分析 提取的菌
株ＲＡ８基因组ＤＮＡ经０．８％琼脂糖凝胶电泳检测，
条带清楚，无非特异性条带，可用作１６ＳｒＤＮＡＰＣＲ
扩增的模板。菌株ＲＡ８１６ＳｒＤＮＡＰＣＲ扩增产物采
用１％琼脂糖凝胶电泳检测，在１０００～２０００ｂｐ之间有
一条明亮的ＰＣＲ目的条带，并且无其他非特异性条带
（图６），经生工生物工程（上海）有限公司测序，获得菌
株ＲＡ８的１６ＳｒＤＮＡ基因有１３７６个碱基，其在Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ中的登录号为ＦＪ１４７０８９。
经Ｂｌａｓｔ相似性分析，菌株 ＲＡ８与马氏副球菌
犘犪狉犪犮狅犮犮狌狊犿犪狉犮狌狊犻犻（ＡＹ８８１２３６、ＮＲ＿０４４９２２、ＦＲ６９１
４１８）和犘犪狉犪犮狅犮犮狌狊犮犪狉狅狋犻狀犻犳犪犮犻犲狀狊（ＮＲ＿０２４６５８）相似
度均达９９％。从系统发育树来看，ＲＡ８与副球菌的２
株模式菌株［２９］犘．犮犪狉狅狋犻狀犻犳犪犮犻犲狀狊ＮＢＲＣ１６１２１（ＡＢ００
６８９９）和犘．犱犲狀犻狋狉犻犳犻犮犪狀狊ＡＴＣＣ１７７４１（ＪＦ５０８２０３）聚
在一起，ＲＡ８与模式菌株犘．犮犪狉狅狋犻狀犻犳犪犮犻犲狀狊ＮＢＲＣ
１６１２１和马氏副球菌多个菌株的遗传距离均小于
０．００５；与模式菌株［２７］犘．犱犲狀犻狋狉犻犳犻犮犪狀狊ＡＴＣＣ１７７４１
聚在另一支，但两者遗传距离小于０．０２５（图７），说明
菌株ＲＡ８与副球菌属多个种的遗传距离都很近。因
此，初步鉴定ＲＡ８属于副球菌属（犘犪狉犪犮狅犮犮狌狊ｓｐ．）。
表４ 犚犃８和枯草芽孢杆菌部分生理生化特征
犜犪犫犾犲４ 犛狅犿犲狆犺狔狊犻狅犾狅犵犻犮犪犾犪狀犱犫犻狅犮犺犲犿犻犮犪犾
犮犺犪狉犪犮狋犲狉犻狊狋犻犮狊狅犳犚犃８犪狀犱犅．狊狌犫狋犻犾犻狊
试验项目 Ｔｅｓｔｉｔｅｍ ＲＡ８ 枯草芽孢杆菌犅．狊狌犫狋犻犾犻狊
接触酶Ｃａｔａｌａｓｅ ＋ ＋
硝酸盐还原Ｎｉｔｒａｔｅｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ＋ ＋
Ｖ．Ｐ．试验 Ｖ．Ｐ．ｔｅｓｔ － ＋
利用柠檬酸盐Ｕｓｅｏｆｃｉｔｒａｔｅ － ＋
利用丙酸盐Ｕｓｅｏｆｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ － －
淀粉水解Ｓｔａｒｃｈｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ － ＋
葡萄糖产气Ｇａｓｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｆｒｏｍｇｌｕｃｏｓｅ
－ －
葡萄糖利用Ｕｓｅｏｆｇｌｕｃｏｓｅ － ＋
甘露醇利用Ｕｓｅｏｆｍａｎｉｃｏｌ － ＋
木糖利用Ｕｓｅｏｆｘｙｌｏｓｅ － ＋
阿拉伯糖利用Ｕｓｅｏｆａｒａｂｉｎｏｓｅ － ＋
明胶液化Ｇｅｌａｔｉｎｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ － ＋
酪蛋白水解Ｃａｓｅｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ － ＋
－：阴性Ｎｅｇａｔｉｖｅ；＋：阳性Ｐｏｓｉｔｉｖｅ．
图６ 犚犃８１６犛狉犇犖犃犘犆犚电泳图
犉犻犵．６ １６犛狉犇犖犃犘犆犚犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊犿犪狆狅犳犚犃８
３ 讨论
Ｓｕｎｄａｒａ和Ｓｉｎｈａ［３０］利用Ｃａ３（ＰＯ４）２ 作为磷源，
经过１４ｄ的摇瓶培养，发现几株芽胞杆菌属细菌释放
的可溶性磷达７０．５２～１５６．８０ｍｇ／Ｌ，埃希氏菌属为
１５９．７０～１７０．３０ｍｇ／Ｌ。Ｐａｕｌ和Ｓｕｎｄａｒａｒａｏ［３１］测定
从 豆 科 植 物 根 际 分 离 的 芽 胞 杆 菌 属 细 菌 溶 解
４５１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．６
Ｃａ３（ＰＯ４）２的效率高达１９％，其中解磷能力最强的是巨大芽孢杆菌（犅犪犮犻犾犾狌狊犿犲犵犪狋犲狉犻狌犿）。林启美等［３２］发现以
磷矿粉为唯一磷源培养解磷细菌５ｄ后，培养液中可溶性磷的含量最高为１１７．３ｍｇ／Ｌ；范丙全等［３３］测定解磷草
酸霉菌（犘犲狀犻犮犻犾犾犻狌犿狅狓犪犾犻犮狌犿）培养１０ｄ时，溶解无机磷的量为１９４．２ｍｇ／Ｌ；冯瑞章等［３４］所筛选的解磷菌溶解
无机磷的量为１０２．５～２２７．１ｍｇ／Ｌ，本试验筛选出的解磷菌对无机磷的溶解量为６５．２４～３１５．３６ｍｇ／Ｌ，菌株
ＲＡ８对无机磷的溶解量为３１５．３６ｍｇ／Ｌ，均高于上述报道，说明乳白香青内生菌株ＲＡ８具有较强的解磷能力。
图７ 犚犃８的１６犛狉犇犖犃系统发育树
犉犻犵．７ １６犛狉犇犖犃狆犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲狅犳犚犃８
菌株ＲＡ８对已灭菌土壤中难溶磷具有溶解能力，说明其不仅能溶解培养基中简单的难溶磷盐，而且还能溶
解土壤中复杂的难溶磷盐；菌株ＲＡ８对难溶磷盐的溶解能力在未灭菌土壤中比在已灭菌土壤中强，说明其能很
好地适应植物体外复杂的土壤环境，可以利用土壤中生物活性物质或与土壤中的土著微生物互惠协作增强其对
土壤中难溶磷盐的溶解能力，这与覃丽金等［３５］的报道一致。菌株ＲＡ８源自植物体内，在已灭菌和未灭菌土壤中
均能正常生长，并能溶解土壤中难溶磷盐，说明ＲＡ８是兼性内生菌，此与Ｌｏｄｅｗｙｃｋｘ等［３６］的报道一致。覃丽金
等［３５］报道将热带牧草根际筛选出的２株解磷细菌接种到柱花草（犛狋狔犫狊犪狀狋犺犲狊ｓｐｐ．）根际，结果表明，２株解磷细
菌均能显著促进柱花草的生长和土壤有效磷含量的提高；蔡磊等［３７］报道的解磷菌株发酵液对小麦苗期的生长有
明显的促进作用；本研究筛选的ＲＡ８菌株对玉米的生长也有明显的促进作用，说明菌株ＲＡ８通过溶解土壤中难
溶磷盐，供给玉米生长所需的磷，促进其生长。应用内生解磷菌，利用其兼性内生特性，既可利用定殖于植物根际
的高效溶磷能力为植物提供有效磷素营养，又可发挥定殖于植物体内的促生和生防效应，促进植物生长，提高作
物产量。同时也能解决溶磷细菌易受土著微生物的影响，难以在土壤中成功定殖，应用效果不稳定等问题。该研
究结果进一步证实了植物内生细菌也是筛选优良解磷菌的重要资源库［１０１８］。
目前对溶磷菌溶磷机理的研究报道较多，Ｓｐｅｒｂｅｒ［３８］认为解磷微生物的解磷作用是由于微生物分泌出多种
有机酸，它们与Ｃａ２＋、Ｆｅ３＋、Ｆｅ２＋、Ａｌ３＋等离子螯合而使难溶性磷酸盐溶解。ＰＫＯ平板培养测定解磷菌解磷能
力，主要是通过菌株自身产生有机酸，经渗透扩散于其周围形成一个明显的环，来确定该菌株是否具有解磷能
力［３９］，这种方法可以简单直观地作出定性判断，但是，对于不以有机酸为主要解磷机制的解磷菌，不能在ＰＫＯ
平板上产生解磷圈，但经液体振荡培养，可溶解多种形态的磷，所以，液体培养可能是更为合理的方法之一［３４］，本
试验中筛选出的菌株ＲＡ８就是一例，在ＰＫＯ平板培养基上不形成溶磷圈，但在ＰＫＯ液体培养基中１２ｄ的解磷
量为３１５．３６ｍｇ／Ｌ。从菌株ＲＡ８的解磷动态来看，培养液ｐＨ值在培养的第３天就下降到最低点５．４，比对照低
２个单位，第３～２１天在５．４～５．８之间波动，比对照低近２个单位。ＲＡ８在培养的第３天活菌数就达到最大，在
培养的第７～１３天活菌数基本稳定，而解磷净增量持续增加，第１３天比第１１天净增了１２２．９７ｍｇ／Ｌ，净增量最
大，在培养的第１５～２１天活菌数下降较快，解磷净增量也不断下降，分析可能的原因有以下３个方面，第一，ＲＡ８
活菌数下降，使其产生的非酸类解磷代谢物质减少。第二，培养液中Ｃａ３（ＰＯ４）２ 的数量减少；第三，培养液中可
溶磷的含量增加，形成产物抑制；但是，菌株ＲＡ８在ＰＫＯ平板上却不形成解磷圈，且解磷量与培养液的ｐＨ之间
缺乏相关性，说明ＲＡ８解磷的主要机制不是有机酸溶解难溶磷，即非酸类代谢物质是其解磷的主要机制，这与
Ｔｈｏｍａｓ［４０］和Ａｓｅａ等［４１］报道的解磷菌培养液ｐＨ 与解磷量之间相关性较差或缺乏相关性一致，但与Ｐａｕｌ和
５５１第２２卷第６期 草业学报２０１３年
Ｓｕｎｄａｒａｒａｏ［３１］及和王继雯等［４２］报道的解磷菌培养液酸碱度变化与解磷量之间存在显著相关性不一致，这种差异
可能与不同研究菌株的解磷机制不同有关。
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犛犮狉犲犲狀犻狀犵，犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀犪狀犱狊狅犾狌犫犻犾犻狕犻狀犵狆狉狅狆犲狉狋犻犲狊狅犳狋犺犲犲狀犱狅狆犺狔狋犻犮狆犺狅狊狆犺犪狋犲狊狅犾狌犫犻犾犻狕犻狀犵
犫犪犮狋犲狉犻犪犻狊狅犾犪狋犲犱犳狉狅犿犃狀犪狆犺犪犾犻狊犾犪犮狋犲犪
ＬＩＺｈｅｎｄｏｎｇ１，２，ＣＨＥＮＸｉｕｒｏｎｇ１，ＹＡＮＧＣｈｅｎｇｄｅ１，ＬＩＰｅｎｇ１
（１．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＧｒａｓｓｌａｎｄＥｃｏｓｙｓｔｅｍ，ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ；
ＣｏｌｅｇｅｏｆＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ，ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；ＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＧａｎｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅ；ＳｉｎｏＵ．Ｓ．ＣｅｎｔｅｒｓｆｏｒＧｒａｚｉｎｇｌａｎｄＥｃｏｓｙｓｔｅｍ
Ｓｕｓｔａｉｎａｂｉｌｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；２．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＲｕｒａｌＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，
ＧａｎｓｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｏｃｉａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｏｓｃｒｅｅｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｙｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａ，ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄ
ｆｒｏｍ犃狀犪狆犺犪犾犻狊犾犪犮狋犲犪犾，ｔｈｅｄｏｍｉｎａｎｔｇｒａｓｓｏｆｔｈｅａｌｐｉｎｅｇｒａｓｓｌａｎｄｓｉｎｔｈｅＥａｓｔｅｒｎＱｉｌｉａｎＭｏｕｎｔａｉｎｓ．Ｔｈｅｙ
ｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄｕｓｉｎｇＰｉｋｏｖａｓｋａｉａ’ｓｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ （ＰＫＯ），ａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｔｅｓｔｓａｎｄ１６ＳｒＤＮＡａｎａｌｙｓｉｓ．Ｈｏｗｔｈｅｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａａｆｆｅｃｔｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｃｏｒｎｗａｓ
ａｌｓｏｓｔｕｄｉｅｄ．Ｆｏｕｒｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｌｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｏｎｍｅｄｉａｗｉｔｈｐｈｏｓｐｈａｔｅ
（Ｐ２Ｏ５）ｃｏｎｔｅｎｔｓｂｅｔｗｅｅｎ６５．２４ａｎｄ３１５．３６ｍｇ／Ｌ．ＩｓｏｌａｔｅＲＡ８ｈａｄｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇｃａｐａｃｉｔｙ
ａｎｄｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓ犘犪狉犪犮狅犮犮狌狊ｓｐ．ｏｎｔｈｅｂａｓｉｓｏｆｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ，ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓ
ｔｉｃｓ，ａｎｄｏｎｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅ１６ＳｒＤＮＡｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅ．ＲＡ８ｃａｎｐｒｏｄｕｃｅａｃｉｄ，ｂｕｔｔｈｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ
（Ｐ２Ｏ５）ｃｏｎｔｅｎｔｈａｄｎｏｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅｐＨｖａｌｕｅｏｆｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉａ．Ｉｔｗａｓｔｈｅｎｏｎａｃｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｃｓｕｂ
ｓｔａｎｃｅｓｏｆＲＡ８ｔｈａｔｐｌａｙｅｄａｒｏｌｅｉｎｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇｐｈｏｓｐｈａｔｅ．ＲＡ８ｃａｎｃｏｏｐｅｒａｔｅｗｉｔｈｉｎｄｉｇｅｎｏｕｓ
ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｉｎｔｈｅｓｏｉｌ，ａｎｄａｓａｒｅｓｕｌｔ，ＲＡ８ｈａｓａｓｔｒｏｎｇｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇｃａｐａｃｉｔｙｉｎｔｈｅｓｏｉｌ．Ｔｈｅ
ｐｌａｎｔｂｉｏｍａｓｓｏｆｔｈｅｃｏｒｎｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＲＡ８ｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（犘＜０．０５）ｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌａｔｔｈｅ
７０ｔｈｄａｙａｎｄ１００ｔｈｄａｙ，ａｎｄｔｈｅｐｌａｎｔｈｅｉｇｈｔｏｆｔｈｅｃｏｒｎｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＲＡ８ｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（犘＜０．０１）ｈｉｇｈｅｒ
ｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌａｔｔｈｅ１００ｔｈｄａｙｓｈｏｗｉｎｇｔｈａｔＲＡ８ｃａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｃｏｒｎ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ａｌｐｉｎｅｇｒａｓｓｌａｎｄ；ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａ；ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃ
ｔｅｒｉｓｔｉｃｓ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
８５１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．６