全 文 ：书犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１５０１１５ 犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀
李刚，修伟明，王杰，吴元凤，赵建宁，宋晓龙，杨殿林．不同植被恢复模式下呼伦贝尔沙地土壤反硝化细菌狀犻狉犓基因组成结构和多样性研究．草
业学报，２０１５，２４（１）：１１５１２３．
ＬｉＧ，ＸｉｕＷ Ｍ，ＷａｎｇＪ，ＷｕＹＦ，ＺｈａｏＪＮ，ＳｏｎｇＸＬ，ＹａｎｇＤＬ．Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｓｏｉｌｄｅｎｉｔｒｉｆｙｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｏｆｔｈｅ狀犻狉犓ｇｅｎｅ
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不同植被恢复模式下呼伦贝尔沙地土壤反硝化
细菌狀犻狉犓基因组成结构和多样性研究
李刚，修伟明，王杰，吴元凤，赵建宁，宋晓龙，杨殿林
（农业部产地环境质量重点实验室，农业部环境保护科研监测所，天津３００１９１）
摘要：本研究选取呼伦贝尔沙地５种植被恢复模式（单播冰草、单播羊柴、单播柠条、冰草＋柠条和冰草＋柠条＋羊
柴＋披碱草）为研究对象，以完全退化的沙地为对照，采用分子生物学技术分析了土壤反硝化细菌狀犻狉犓 基因组成
结构和多样性，并探讨了与土壤理化因子的相关性。结果表明，土壤反硝化细菌狀犻狉犓 基因组成存在明显差异。单
播羊柴模式土壤反硝化细菌狀犻狉犓基因多样性指数最高，其次为单播冰草和单播柠条，而两种混播模式最低，这５
种植被恢复模式均显著高于对照裸地。序列和系统发育分析结果表明，所获得的狀犻狉犓基因片段与ＮＣＢＩ数据库中
的狀犻狉犓基因的相似度在８１％～９９％之间，分别归属于苍白杆菌属、根瘤菌属及不可培养的细菌，其中与不可培养
细菌相关的片段占到总数的５０％以上。典范对应和相关分析结果表明，速效磷、ｐＨ、全氮、全磷和含水量对反硝化
细菌的影响均达到显著水平，且５种理化因子间均具有极显著相关性，说明这５种理化因子相互关联，共同对反硝
化细菌狀犻狉犓基因组成变化起到决定作用。
关键词：呼伦贝尔沙地；植被恢复；反硝化细菌；狀犻狉犓基因；ＰＣＲ－ＤＧＧＥ
犆狅犿犿狌狀犻狋狔狊狋狉狌犮狋狌狉犲犪狀犱犱犻狏犲狉狊犻狋狔狅犳狊狅犻犾犱犲狀犻狋狉犻犳狔犻狀犵犫犪犮狋犲狉犻犪狅犳狋犺犲狀犻狉犓犵犲狀犲狋狔狆犲
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犕狅狀犵狅犾犻犪
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犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔狅犳犗狉犻犵犻狀犪犾犃犵狉狅犲狀狏犻狉狅狀犿犲狀狋犙狌犪犾犻狋狔狅犳犕犻狀犻狊狋狉狔狅犳犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犲，犃犵狉狅犈狀狏犻狉狅狀犿犲狀狋犪犾犘狉狅狋犲犮狋犻狅狀犐狀狊狋犻狋狌狋犲，
犕犻狀犻狊狋狉狔狅犳犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犲，犜犻犪狀犼犻狀３００１９１，犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｗｅｓｅｌｅｃｔｅｄｆｉｖｅｖｅｇｅｔａｔｉｏｎｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｍｏｎｏｐｌａｎｔｉｎｇｏｆ犆犪狉犪犵犪狀犪犽狅狉狊犺犻狀狊犽犻犻
（ＵＣ），犃犵狉狅狆狔狉狅狀犮狉犻狊狋犪狋狌犿 （ＵＡ），ａｎｄ犎犲犱狔狊犪狉狌犿犳狉狌狋犻犮狅狊狌犿 （ＵＨ），ｍｉｘｅｄｐｌａｎｔｉｎｇｏｆ犃犵狉狅狆狔狉狅狀犮狉犻狊狋犪
狋狌犿ａｎｄ犎犲犱狔狊犪狉狌犿犳狉狌狋犻犮狅狊狌犿 （ＡＣ）ａｎｄｏｆ犃犵狉狅狆狔狉狅狀犮狉犻狊狋犪狋狌犿，犎犲犱狔狊犪狉狌犿犳狉狌狋犻犮狅狊狌犿，犆犪狉犪犵犪狀犪犽狅狉
狊犺犻狀狊犽犻犻，ａｎｄ犈犾狔犿狌狊狀狌狋犪狀狊（ＡＣＨＥ）ｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ狀犻狉犓ｔｙｐｅｓｏｉｌｄｅｎｉ
ｔｒｉｆｙｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａａｎｄｔｈｅｉｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｗｉｔｈｔｈｅｓｏｉｌｐｈｙｓｉｃａｌａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｆａｃｔｏｒｓ．Ｂａｒｅｌａｎｄｗａｓｕｓｅｄａｓａｃｏｎ
ｔｒｏｌ（ＣＫ）．Ｔｈｅｒｅａｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎｔｈｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｏｉｌ狀犻狉犓ｔｙｐｅｄｅｎｉｔｒｉｆｙｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａ．Ｔｈｅ
Ｓｈａｎｎｏｎｉｎｄｅｘｏｆｔｈｅ狀犻狉犓ｇｅｎｅｉｓｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｕｎｄｅｒＵＨ，ｆｏｌｏｗｅｄｂｙｕｎｄｅｒＵＡ，ＵＣ，ＡＣａｎｄＡＣＨＥ，ａｎｄｔｈｅ
ｌｏｗｅｓｔｉｎＣＫｗｉｔｈｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｆｉｖｅｍｅｔｈｏｄｓ．Ｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓ
第２４卷 第１期
Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．１
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
２０１５年１月
Ｊａｎ，２０１５
收稿日期：２０１３１２２３；改回日期：２０１４０２２５
基金项目：国家自然科学基金项目（３１１７０４３５，３１２００４２４）和“十二五”国家科技计划项目（２０１２ＢＡＤ１３Ｂ０７）资助。
作者简介：李刚（１９８１），男，辽宁辽阳人，助理研究员。Ｅｍａｉｌ：ｇａｎｇｌｉ１９８１＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ
通讯作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅｍａｉｌ：ｙａｎｇｄｉａｎｌｉｎ＠ｃａａｓ．ｃｎ
ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｏｆｔｈｅ狀犻狉犓ｆｒａｇｍｅｎｔｓｔｏｔｈｅ狀犻狉犓ｇｅｎｅｓｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄｉｎＧｅｎＢａｎｋｗａｓｂｅｔｗｅｅｎ８１％
ａｎｄ９９％，ａｎｄｔｈａｔｔｈｅｙｗｅｒｅｍａｉｎｌｙｆｒｏｍ犗犮犺狉狅犫犪犮狋狉狌犿，犚犺犻狕狅犫犻狌犿，ａｎｄｓｏｍｅｏｔｈｅｒｕｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂａｃｔｅｒｉａ．
Ｔｈｅｓｅｂａｃｔｅｒｉａｌｓｐｅｃｉｅｓａｃｃｏｕｎｔｅｄｆｏｒｍｏｒｅｔｈａｎ５０％ｏｆｔｈｅｔｏｔａｌｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｃａｎｏｎｉｃａｌｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅａｎｄｃｏｒ
ｒｅｌａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｅｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｏｉｌａｖａｉｌａｂｌｅｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ，ｐＨ，ｔｏｔａｌｎｉｔｒｏｇｅｎ，ｔｏｔａｌｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓａｎｄｓｏｉｌ
ｍｏｉｓｔｕｒｅｈａｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｅｆｆｅｃｔｓｏｎｔｈｅｄｅｎｉｔｒｉｆｙｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ，ａｎｄｔｈｅｒｅｗｅｒｅｖｅｒｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｃｏｒｒｅ
ｌａｔｉｏｎｓａｍｏｎｇｔｈｅｓｅｆｉｖｅｓｏｉｌｐｈｙｓｉｃａｌａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｆａｃｔｏｒｓ．Ｉｔｉｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｆｉｖｅｓｏｉｌ
ｐｈｙｓｉｃａｌａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｆａｃｔｏｒｓｐｌａｙｅｄａｄｅｃｉｓｉｖｅｒｏｌｅｉｎｔｈｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｃｈａｎｇｅｓｏｆｔｈｅ狀犻狉犓ｔｙｐｅｄｅｎｉｔｒｉｆｙｉｎｇｂａｃ
ｔｅｒｉａ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：Ｈｕｌｕｎｂｅｉｅｒｓａｎｄｙｌａｎｄ；ｖｅｇｅｔａｔｉｏｎｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ；ｄｅｎｉｔｒｉｆｙｉｎｇｍｉｃｒｏｂｅ；狀犻狉犓ｇｅｎｅ；ＰＣＲＤＧＧＥ
反硝化作用是由反硝化细菌通过异化作用使硝态氮最终转化为Ｎ２ 的生物过程，是生态系统氮循环的重要
组成部分［１］。土壤因反硝化作用而丧失了２０％～３０％的氮肥［２］。亚硝酸还原酶（ｎｉｒ）是反硝化细菌具有的关键
酶［３］，是微生物驱动的反硝化作用中的限速步骤［４］。许多研究将狀犻狉犓 和狀犻狉犛 基因作为环境样品中反硝化细菌
群落的分子标记物，而且发现狀犻狉犓 基因对环境因子的响应较狀犻狉犛基因更敏感［５］。研究人员在多种环境中均发
现狀犻狉犓 型的反硝化细菌的存在，如农田、森林、草地、沉积物以及水体等［６１０］。同时还发现，土壤性质的改变可以
影响反硝化细菌的群落结构和种群丰度，如全氮含量、ＮＯ３－含量、含水量、ｐＨ等［１１］，而反硝化细菌的群落结构
和种群丰度又能反映这些调控因子的综合作用，因此研究土壤反硝化细菌群落和对环境的响应具有重要意义。
沙漠化是制约我国草原地区发展的重要环境问题，已严重威胁到我国经济的可持续发展［１２］。植被恢复是治
理沙漠化的根本解决途径。我国对沙化草地恢复研究集中在植被恢复模式设计、恢复后地表植物群落结构、土壤
理化性质、地下生物量变化及土壤动物多样性变化等的变化特征［１３１７］，而不同植被恢复模式下沙地土壤反硝化细
菌分子生态的相关研究未见报道。因此，通过研究不同植被恢复模式下沙地土壤反硝化细菌群落结构组成变化
及其与土壤理化因子的相互关联性，对认识沙地植被恢复过程反硝化细菌的响应是非常关键的。本研究运用
ＰＣＲ－ＤＧＧＥ及克隆测序技术，通过对呼伦贝尔沙地不同植被恢复模式下土壤反硝化细菌群落多样性和系统发
育研究，探讨反硝化细菌多样性对沙地植被恢复模式和环境因子的响应，以期为呼伦贝尔沙地植被恢复和重建提
供理论依据。
１ 材料与方法
１．１ 研究区概况
本试验以内蒙古呼伦贝尔市陈巴尔虎旗长期定位试验站（４９°１２′Ｎ，１１８°５４′Ｅ）为研究地点，该区域草原已显
著退化及沙化，具有呼伦贝尔地区沙地的典型特征。该区域海拔为６１８．０ｍ，年均气温－２．６℃，年均降水量
３０７．７ｍｍ，年均风速３．５ｍ／ｓ，属中温带半温润和半干旱大陆性气候。沙地周边以大针茅（犛狋犻狆犪犵狉犪狀犱犻狊）和羊
草（犔犲狔犿狌狊犮犺犻狀犲狀狊犻狊）为主要自然植被，土壤类型为沙质栗钙土。
１．２ 试验设计与样品采集
试验始于２００６年７月，分别设置单播冰草（Ｕｎｉｃａｓｔ犃犵狉狅狆狔狉狅狀犮狉犻狊狋犪狋狌犿，ＵＡ）、单播羊柴（Ｕｎｉｃａｓｔ
犎犲犱狔狊犪狉狌犿犳狉狌狋犻犮狅狊狌犿，ＵＨ）、单播柠条（Ｕｎｉｃａｓｔ犆犪狉犪犵犪狀犪犽狅狉狊犺犻狀狊犽犻犻，ＵＣ）、冰草＋柠条混播（犃犵狉狅狆狔狉狅狀
犮狉犻狊狋犪狋狌犿＋犆犪狉犪犵犪狀犪犽狅狉狊犺犻狀狊犽犻犻，ＡＣ）、冰草＋柠条＋羊柴＋披碱草混播（犃犵狉狅狆狔狉狅狀犮狉犻狊狋犪狋狌犿＋犆犪狉犪犵犪狀犪
犽狅狉狊犺犻狀狊犽犻犻＋犎犲犱狔狊犪狉狌犿犳狉狌狋犻犮狅狊狌犿＋犈犾狔犿狌狊狀狌狋犪狀狊，ＡＣＨＥ）共５种植被恢复模式，并以完全退化的沙地为对
照（ＣＫ）。每种植被恢复模式小区面积均为１ｈｍ２，各３次重复，随机区组分布。于２０１０年７月在每个小区内沿
Ｓ形采集２０点表层０～１０ｃｍ土壤样品，将同一处理３个小区的土壤样品充分混匀，并去除石块、植物根茬等杂
物，作为一个混合样。采用四分法分出约１ｋｇ土样装入无菌袋内，低温条件下带回实验室。将土样分为两部分，
一部分用于测定土壤理化性质，一部分于－７０℃条件下保存用于ＤＮＡ提取。
１．３ 土壤理化性质测定
采用烘干法测定土壤含水量，重铬酸钾容量法测定土壤有机质含量，凯氏定氮法测定土壤全氮，ＫＣｌ浸提－
６１１ 草 业 学 报 第２４卷
紫外分光光度法测定土壤硝态氮，ＫＣｌ浸提－靛酚蓝比色法测定土壤铵态氮，硫酸－高氯酸消煮法测定土壤全
磷，碳酸氢钠浸提－钼锑抗比色法测定土壤速效磷，２．５∶１．０水土比浸提后测定土壤ｐＨ。具体步骤见《土壤农
化分析》［１８］。各土壤理化指标见李刚等［１９２０］的研究结果。
１．４ ＤＮＡ提取、狀犻狉犓 基因扩增和变性梯度凝胶电泳
采用ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ?ＤＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ（ＭｏＢｉｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＳｏｌａｎａＢｅａｃｈ，ＣＡ，ＵＳＡ）按照操作说明从０．２５
ｇ土壤样品中提取总ＤＮＡ，每个处理各３次重复。
狀犻狉犓 基因扩增采用半巢式ＰＣＲ（ｓｅｍｉｎｅｓｔｅｄＰＣＲ）方法，引物序列及扩增片段大小见表１。第１轮反应：５０
μＬ的反应体系中含有１×Ｂｕｆｆｅｒ，４００μｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ，０．４μｍｏｌ／Ｌ的每种引物，１．２５Ｕ的ＴａｑＨｏｔＳｔａｒｔ聚合
酶（ＴａＫａＲａ），５０ｎｇ的模板ＤＮＡ。第２轮反应：５０μＬ的反应体系中含有１×Ｂｕｆｆｅｒ，４００μｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ，０．４
μｍｏｌ／Ｌ的每种引物，１．２５Ｕ的ＴａｑＨｏｔＳｔａｒｔ聚合酶（ＴａＫａＲａ），以３μＬ第１轮ＰＣＲ产物作为模板。ＰＣＲ反应
均采用“ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ”方法。第１轮反应条件：９５℃，５ｍｉｎ；９５℃，３０ｓ，４５℃，４０ｓ，７２℃，４０ｓ，１０个循环，每个循环
降低０．５℃；９５℃，３０ｓ，４３℃，４０ｓ，７２℃，４０ｓ，２０个循环；７２℃，５ｍｉｎ。第２轮反应条件：９５℃，５ｍｉｎ；９５℃，３０ｓ，
５５℃，４０ｓ，７２℃，４０ｓ，１０个循环，每个循环降低０．５℃；９５℃，３０ｓ，５３℃，４０ｓ，７２℃，４０ｓ，２０个循环；７２℃，５ｍｉｎ。
表１ 狀犻狉犓基因扩增引物
犜犪犫犾犲１ 犘狉犻犿犲狉狊狌狊犲犱犳狅狉狀犻狉犓犵犲狀犲犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀
半巢式ＰＣＲＳｅｍｉｎｅｓｔｅｄＰＣＲ 引物Ｐｒｉｍｅｒ 引物序列（５′３′）Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′３′） 产物大小Ｐｒｏｄｕｃｔｓｉｚｅ（ｂｐ）
第１轮Ｓｔｅｐ１ ｎｉｒＫ１Ｆ ＧＧＭＡＴＧＧＴＫＣＣＳＴＧＧＣＡ ５１５
ｎｉｒＫ５Ｒ ＧＣＣＴＣＧＡＴＣＡＧＲＴＴＲＴＧＧ
第２轮Ｓｔｅｐ２ ｎｉｒＫ１ＦＧＣ ＧＧＭＡＴＧＧＴＫＣＣＳＴＧＧＣＡ ４３０
ｎｉｒＫ３Ｒ ＧＡＡＣＴＴＧＣＣＧＧＴＶＧＹＣＣＡＧＡＣ
Ｍ＝Ａ／Ｃ；Ｋ＝Ｇ／Ｔ；Ｓ＝Ｇ／Ｃ；Ｒ＝Ａ／Ｇ；Ｖ＝Ｇ／Ａ／Ｃ；Ｙ＝Ｃ／Ｔ．ＧＣ 夹 子 ＧＣｃｌａｍｐ：ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＣＣＣＧＣＧＣＣＣＧＧＣＣＣＧＣ
ＣＧＣＣＣＣＣＧＣＣＣＣ．
ＤＧＧＥ分析采用ＤｃｏｄｅＴＭ通用突变检测系统（ＢｉｏＲａｄ，ＵＳＡ）进行。聚丙烯酰胺凝胶（３７．５∶１）浓度为８％，
变性剂梯度为４５％～６５％［１００％变性剂含有７ｍｏｌ／Ｌ尿素和４０％（ｖ／ｖ）去离子甲酰胺］。将２５μＬＰＣＲ产物和
５μＬ６×ｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ混合后共同上样，６０℃、１５０Ｖ１０ｈ。ＳＹＢＲ
ＴＭ ＧｒｅｅｎＩ（１∶１００００）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）染液中染
色２５ｍｉｎ。用ＧｅｌＤｏｘＸＲ凝胶成像系统（ＢｉｏＲａｄ，ＵＳＡ）观察并拍照。根据ＤＧＧＥ图谱，共回收２６条ＤＧＧＥ
条带。
１．５ ＤＧＧＥ条带测序和系统发育分析
用不带ＧＣ夹的ｎｉｒＫ１Ｆ和ｎｉｒＫ３Ｒ引物扩增切割后的ＤＧＧＥ条带。将确定为单一条带的ＰＣＲ产物进行电
泳纯化回收。用ｐＧＥＭＴｅａｓｙＶｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）对回收的目的片段克隆。由上海生工生物技术公司进行测序，
测序结果经Ｂｌａｓｔ比对分析，获得相近典型菌株序列。将测序获得的狀犻狉犓 基因序列提交至ＮＣＢＩ，获得登录号。
用 Ｍｅｇａ５．２．１中的邻接法（ＮｅｉｇｈｂｏｒＪｏｉｎｉｎｇ）建立系统发育树。
１．６ 数据分析方法
ＤＧＧＥ图谱采用ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ软件（ＢｉｏＲａｄ，ＵＳＡ）进行数字化处理。各样品采用ＵＰＧＭＡ法进行聚类分
析，并用Ｓｈａｎｎｏｎ－Ｗｉｅｎｅｒ指数（犎）和均匀度（犈犎）评价土壤反硝化细菌狀犻狉犓 基因多样性。计算公式如下：
犎＝－∑犘犻ｌｎ犘犻
犈犎＝犎／ｌｎ犛
式中，犎 为Ｓｈａｎｎｏｎ－Ｗｉｅｎｅｒ指数，犈犎 为均匀度指数，犛为ＤＧＧＥ胶中条带数目，犘犻为第犻条带灰度占该样品
总灰度的比率。
采用ＳＰＳＳ１６．０进行单因素方差分析（ＡＮＯＶＡ）和相关分析（ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ）。采用Ｃａｎｏｃｏ４．５软件
包进行典范对应分析（ｃａｎｏｎｉｃａｌｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ，ＣＣＡ）。
７１１第１期 李刚 等：不同植被恢复模式下呼伦贝尔沙地土壤反硝化细菌狀犻狉犓基因组成结构和多样性研究
２ 结果与分析
图１ 土壤反硝化细菌狀犻狉犓基因犇犌犌犈图谱
犉犻犵．１ 犇犌犌犈犳犻狀犵犲狉狆狉犻狀狋犻狀犵狅犳狊狅犻犾犱犲狀犻狋狉犻犳狔犻狀犵
犫犪犮狋犲狉犻犪犾狀犻狉犓犵犲狀犲
１－２６为克隆条带。１－２６ｗｅｒｅｔｈｅｎｕｍｂｅｒｓｏｆｔｈｅｅｘｃｉｓｅｄｂａｎｄｓ．
图２ 土壤反硝化细菌狀犻狉犓基因聚类分析
犉犻犵．２ 犆犾狌狊狋犲狉犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狊狅犻犾犱犲狀犻狋狉犻犳狔犻狀犵犫犪犮狋犲狉犻犪犾狀犻狉犓犵犲狀犲
图中数字表示相似度。Ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｓｉｎｔｈｅ
Ｆｉｇｕｒｅｒｅｐｒｅｓｅｎｔｔｈｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ．
２．１ 土壤反硝化细菌狀犻狉犓 基因ＤＧＧＥ图谱分析
ＤＧＧＥ（图１，３次重复之一）结果表明，不同植被
恢复模式土壤反硝化细菌狀犻狉犓 基因ＤＧＧＥ图谱存在
差异。采用聚类分析发现（图２），ＵＡ与 ＵＣ先聚，相
似性达到７３％；再依次与ＡＣ、ＵＨ和ＡＣＨＥ聚类，相
似性分别为５６％，５０％和３９％；最后再与ＣＫ相聚，相
似度仅为２０％，这说明５种植被恢复模式土壤反硝化
细菌狀犻狉犓 基因结构组成较对照沙地发生了明显的变
化。王奇赞等［２１］认为相似性较好的群体之间的相似
性应高于６０％。由此可知，仅ＵＡ与ＵＣ的反硝化细
菌狀犻狉犓 基因结构组成较相似。条带４，５，６，７，１７，１８
和１９为ＵＡ和ＵＣ所共有（图１），说明ＵＡ和ＵＣ恢
复模式下土壤性状相近，具有更多相似的反硝化细菌，
而条带７，１８和１９又存在于ＡＣ和ＡＣＨＥ中，说明这
几种反硝化细菌适应了这４种植被恢复模式所形成的
土壤环境。
２．２ 土壤反硝化细菌狀犻狉犓 基因多样性分析
对土壤反硝化细菌狀犻狉犓 基因Ｓｈａｎｎｏｎ指数（犎）
和均匀度指数（犈犎）分析发现（表２），５种植被恢复模
式土壤反硝化细菌狀犻狉犓 基因Ｓｈａｎｎｏｎ指数均显著高
于对照沙地，其中 ＵＨ 最高，为１．３７０，其次为 ＵＡ、
ＵＣ、ＡＣ和ＡＣＨＥ，分别为１．０９０，１．０７０，０．９００和
０．８４０。５种植被恢复模式土壤反硝化微生物均匀度
指数与Ｓｈａｎｎｏｎ指数呈相似的变化趋势，均显著高于
对照沙地，依次为 ＵＨ＞ＵＣ＞ＵＡ＞ＡＣＨＥ＞ＡＣ，其
中ＵＣ与ＵＡ之间无显著差异。
２．３ 土壤反硝化细菌狀犻狉犓 基因测序结果及系统发
育分析
Ｂｌａｓｔ比对结果表明（表３），２６个阳性克隆与已知
序列的相似度较高，在８１％～９９％之间，在数据库中
没有找到完全相同的序列，这些序列可能是之前没有
描述过的基因序列。从系统发育树（图３）可以看出，
２６个阳性克隆分属于布鲁氏菌科（Ｂｒｕｃｅｌａｃｅａｅ）的苍
白杆菌属（犗犮犺狉狅犫犪犮狋狉狌犿）、根瘤菌科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）的
根瘤菌属（犚犺犻狕狅犫犻狌犿）以及不可培养的细菌。
２．４ 土壤反硝化细菌狀犻狉犓 基因与土壤理化因子的
典范对应分析
在ＣＣＡ分析结果中（表４，图４），前２个排序轴合
并解释了样本中４７．２％的样本总变异，这一比例虽然
不高，但其中可能包含丰富信息［２２］。在此排序图中，
表２ 土壤反硝化细菌狀犻狉犓基因犇犌犌犈条带数、
犛犺犪狀狀狅狀指数和均匀度指数
犜犪犫犾犲２ 犖狌犿犫犲狉狅犳犇犌犌犈犫犪狀犱狊，犛犺犪狀狀狅狀犻狀犱犲狓犪狀犱
犲狏犲狀狀犲狊狊犻狀犱犲狓狅犳狀犻狉犓犵犲狀犲狅犳犱犲狀犻狋狉犻犳狔犻狀犵犫犪犮狋犲狉犻犪
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
条带数
Ｎｕｍｂｅｒｏｆｂａｎｄｓ
Ｓｈａｎｎｏｎ指数
Ｓｈａｎｎｏｎｉｎｄｅｘ
均匀度指数
Ｅｖｅｎｎｅｓｓｉｎｄｅｘ
ＣＫ ４．３±０．６ａ ０．５００±０．０１０ａ ０．３１０±０．０１０ａ
ＵＡ １１．７±０．６ｄ １．０９０±０．０３０ｄ ０．４４０±０．０１０ｄ
ＵＨ １２．３±１．５ｄ １．３７０±０．０２０ｅ ０．５２０±０．０１０ｅ
ＵＣ １０．０±１．０ｃ １．０７０±０．０１０ｄ ０．４８０±０．００３ｄ
ＡＣ ９．３±０．６ｃ ０．９００±０．０１０ｃ ０．３８０±０．００４ｂ
ＡＣＨＥ ７．３±０．６ｂ ０．８４０±０．００３ｂ ０．４１０±０．００２ｃ
注：同列不同字母表示差异显著（犘＜０．０５）．狀＝３．
Ｎｏｔｅ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｗｉｔｈｉｎｔｈｅｓａｍｅｃｏｌｕｍｎｉｎｄｉｃａｔｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ犘＜０．０５．狀＝３．
８１１ 草 业 学 报 第２４卷
表３ 犇犌犌犈条带比对结果
犜犪犫犾犲３ 犚犲狊狌犾狋狊狅犳狋犺犲犅犾犪狊狋犪狀犪犾狔狊犻狊狅狀狋犺犲犇犌犌犈犫犪狀犱狊犲狇狌犲狀犮犲狊
条带
Ｓｏｕｒｃｅｏｆｂａｎｄ
登录号
ＧｅｎＢａｎｋＩＤ
比对菌名称
Ｓｐｅｃｉｅｓｎａｍｅｏｆｔｈｅｓｕｂｊｅｃｔ
比对菌登录号
ＧｅｎＢａｎｋＩＤｏｆｔｈｅｓｕｂｊｅｃｔ
相似度
Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ（％）
１ ＫＪ１８４６３５ 不可培养苍白杆菌属Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ犗犮犺狉狅犫犪犮狋狉狌犿ｓｐ． ＧＵ１３６４５９．１ ９９
２ ＫＪ１８４６３７ 人苍白杆菌犗犮犺狉狅犫犪犮狋狉狌犿犪狀狋犺狉狅狆犻 ＧＵ２０７４０２．１ ９９
３ ＫＪ１８４６３６ 不可培养苍白杆菌属Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ犗犮犺狉狅犫犪犮狋狉狌犿ｓｐ． ＧＵ１３６４５９．１ ９７
４ ＫＪ１８４６３８ 不可培养细菌Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＡＹ６８３８５６．１ ９６
５ ＫＪ１８４６３９ 不可培养细菌Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＨＭ４３８９２５．１ ９７
６ ＫＪ１８４６４０ 人苍白杆菌犗犮犺狉狅犫犪犮狋狉狌犿犪狀狋犺狉狅狆犻 ＧＵ２０７４０２．１ ９７
７ ＫＪ１８４６４１ 不可培养苍白杆菌属Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ犗犮犺狉狅犫犪犮狋狉狌犿ｓｐ． ＧＵ１３６４６２．１ ９９
８ ＫＪ１８４６４２ 不可培养细菌Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＥＵ７９０８５９．１ ８４
９ ＫＪ１８４６４３ 不可培养细菌Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＡＹ１２１５６２．１ ９７
１０ ＫＪ１８４６４４ 不可培养细菌Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＨＭ０６１０９１．１ ９６
１１ ＫＪ１８４６４５ 不可培养细菌Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＨＭ０６１０９１．１ ９６
１２ ＫＪ１８４６４６ 不可培养细菌Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＨＭ０６１０９１．１ ９６
１３ ＫＪ１８４６４７ 不可培养细菌Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＥＵ７９０８５９．１ ８５
１４ ＫＪ１８４６４８ 人苍白杆菌犗犮犺狉狅犫犪犮狋狉狌犿犪狀狋犺狉狅狆犻 ＧＵ２０７４０２．１ ９９
１５ ＫＪ１８４６４９ 根瘤菌属犚犺犻狕狅犫犻狌犿ｓｐ． ＤＱ０９６６４５．１ ８１
１６ ＫＪ１８４６５０ 不可培养苍白杆菌属Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ犗犮犺狉狅犫犪犮狋狉狌犿ｓｐ． ＧＵ１３６４５９．１ ９９
１７ ＫＪ１８４６５１ 不可培养细菌Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＵ２７０５３８．１ ９１
１８ ＫＪ１８４６５２ 不可培养细菌Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＨＭ４３８９２５．１ ９６
１９ ＫＪ１８４６５３ 不可培养苍白杆菌属Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ犗犮犺狉狅犫犪犮狋狉狌犿ｓｐ． ＧＵ２０７４０２．１ ９９
２０ ＫＪ１８４６５４ 根瘤菌属犚犺犻狕狅犫犻狌犿ｓｐ． ＤＱ０９６６４５．１ ８３
２１ ＫＪ１８４６５５ 根瘤菌属犚犺犻狕狅犫犻狌犿ｓｐ． ＤＱ０９６６４５．１ ８１
２２ ＫＪ１８４６５６ 人苍白杆菌犗犮犺狉狅犫犪犮狋狉狌犿犪狀狋犺狉狅狆犻 ＧＵ２０７４０２．１ ９８
２３ ＫＪ１８４６５７ 不可培养细菌Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＡＹ１２１５６７．１ ９５
２４ ＫＪ１８４６５８ 不可培养细菌Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＪＦ７７２６５８．１ ９７
２５ ＫＪ１８４６５９ 不可培养细菌Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＪＦ７７２６５８．１ ９７
２６ ＫＪ１８４６６０ 不可培养细菌Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＨＭ０６１０９１．１ ９６
第１排序轴由速效磷（ＡＰ）、全磷（ＴＰ）、全氮（ＴＮ）、有机质（ＯＭ）、土壤含水量（ＳＭ）、ｐＨ（正相关）和硝态氮
（ＮＯ３－Ｎ）、铵态氮（ＮＨ４＋Ｎ）（负相关）组成。第２排序轴由速效磷（ＡＰ）、全磷（ＴＰ）、全氮（ＴＮ）、有机质（ＯＭ）
（正相关）和土壤含水量（ＳＭ）、ｐＨ、硝态氮（ＮＯ３－Ｎ）、铵态氮（ＮＨ４＋Ｎ）（负相关）组成。
各处理的土质状况以有机质（ＯＭ）、全氮（ＴＮ）、硝态氮（ＮＯ３－Ｎ）、铵态氮（ＮＨ４＋Ｎ）、全磷（ＴＰ）、速效磷
（ＡＰ）、土壤含水量（ＳＭ）和ｐＨ共８项理化指标来表征。经蒙特卡洛检验（ＭｏｎｔｅＣａｒｌｏｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎｔｅｓｔ）发现
ＡＰ（犘：０．００２０）、ｐＨ（犘：０．００２０）、ＴＮ（犘：０．００２０）、ＴＰ（犘：０．００６）和ＳＭ（犘：０．００６）可以解释反硝化细菌的种
群变化，置信度达到９５％以上。如图４所示，ＡＰ（狉＝０．７８０３）、ＴＰ（狉＝０．５７９３）、ＴＮ（狉＝０．４５３９）、ＳＭ（狉＝
０．３７３３）、ｐＨ（狉＝０．７３９８）和 ＯＭ（狉＝０．４５１９）与第１排序轴正相关，ＮＨ４＋Ｎ（狉＝－０．０８２７）和 ＮＯ３－Ｎ（狉＝
－０．０３５４）与第１排序轴负相关。ＴＮ（狉＝０．０７４６）、ＴＰ（狉＝０．０３４０）、ＡＰ（狉＝０．０８３８）和ＯＭ（狉＝０．０８９４）与第２
排序轴正相关，ＮＨ４＋Ｎ（狉＝－０．２２３７）、ＮＯ３－Ｎ（狉＝－０．１２４１）、ＳＭ（狉＝－０．０６７６）和ｐＨ（狉＝－０．１８８５）与第２
排序轴负相关。第１排序轴将 ＵＨ 与 ＡＣＨＥ和 ＵＡ、ＵＣ与 ＡＣ分开，第２排序轴将 ＵＨ、ＵＡ和 ＵＣ与 ＡＣ、
ＡＣＨＥ分开。同时对具有显著影响的各理化因子之间进行相关分析发现，ＡＰ、ｐＨ、ＴＮ、ＴＰ和ＳＭ之间均极显著
相关（犘＜０．０１），说明土壤反硝化细菌的狀犻狉犓 基因组成变化是多种理化因子之间共同影响的结果。
９１１第１期 李刚 等：不同植被恢复模式下呼伦贝尔沙地土壤反硝化细菌狀犻狉犓基因组成结构和多样性研究
图３ 土壤反硝化细菌狀犻狉犓基因系统发育树（邻接法）
犉犻犵．３ 犖犲犻犵犺犫狅狌狉犼狅犻狀犻狀犵狋狉犲犲犱犲狆犻犮狋犻狀犵狋犺犲狆犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狉犲犾犪狋犻狅狀狊犺犻狆狊犪犿狅狀犵狋犺犲狀犻狉犓狊犲狇狌犲狀犮犲狊
Ⅰ：根瘤菌属犚犺犻狕狅犫犻狌犿ｓｐ．；Ⅱ：苍白杆菌属犗犮犺狉狅犫犪犮狋狉狌犿ｓｐ．；Ⅲ：不可培养细菌Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ；Ⅳ：不可培养细菌Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ．
表４ 犆犆犃分析结果
犜犪犫犾犲４ 犚犲狊狌犾狋狊狅犳犮犪狀狅狀犻犮犪犾犮狅狉狉犲狊狆狅狀犱犲狀犮犲犪狀犪犾狔狊犻狊（犆犆犃）
项目
Ｉｔｅｍｓ
第１轴
Ａｘｅｓ１
第２轴
Ａｘｅｓ２
第３轴
Ａｘｅｓ３
第４轴
Ａｘｅｓ４
特征值Ｅｉｇｅｎｖａｌｕｅｓ ０．７０９ ０．５９８ ０．５５４ ０．３３２
种－环境相关系数Ｓｐｅｃｉｅｓｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ０．９６７ ０．９０１ ０．９６１ ０．８９０
种累积百分比变化率Ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｖａｒｉａｎｃｅｏｆｓｐｅｃｉｅｓ（％） ２５．６ ４７．２ ６７．２ ７９．２
种－环境累积百分比变化率Ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｖａｒｉａｎｃｅｏｆｓｐｅｃｉｅｓｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｒｅｌａｔｉｏｎ（％） ２９．２ ５３．８ ７６．６ ９０．３
３ 讨论
由微生物推动的反硝化使地球生物圈中被固定的氮素重新回到大气中去，从而实现整个自然界的氮素循
环［２３］。由亚硝酸盐转化为一氧化氮的反应由亚硝酸还原酶催化实现，是反硝化这一生物过程中重要的限速步
０２１ 草 业 学 报 第２４卷
骤，因此亚硝酸还原酶基因（狀犻狉犓和狀犻狉犛）成为反硝化
图４ 土壤理化因子与反硝化细菌群落结构组成的犆犆犃分析
犉犻犵．４ 犆犪狀狅狀犻犮犪犾犮狅狉狉犲狊狆狅狀犱犲狀犮犲犪狀犪犾狔狊犻狊（犆犆犃）狅犳狋犺犲狊狅犻犾
狆犺狔狊犻犮狅犮犺犲犿犻犮犪犾犳犪犮狋狅狉狊犪狀犱犱犲狀犻狋狉犻犳狔犻狀犵犫犪犮狋犲狉犻犪犾
犮狅犿犿狌狀犻狋狔狊狋狉狌犮狋狌狉犲犪狀犱犮狅犿狆狅狊犻狋犻狅狀
ＯＭ：有机质 Ｏｒｇａｎｉｃｍａｔｔｅｒ；ＴＮ：全氮 Ｔｏｔａｌｎｉｔｒｏｇｅｎ；ＮＯ３－Ｎ：
硝态氮Ｎｉｔｒａｔｅｎｉｔｒｏｇｅｎ；ＮＨ４＋Ｎ：铵态氮 Ａｍｍｏｎｉｕｍｎｉｔｒｏｇｅｎ；ＴＰ：
全磷Ｔｏｔａｌｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ；ＡＰ：速效磷Ａｖａｉｌａｂｌｅｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ；ＳＭ：土壤含
水量Ｓｏｉｌｍｏｉｓｔｕｒｅ．
细菌功能基因中研究最多的基因，并作为反硝化的分
子标记用于研究其种群及多样性［２４］。由于狀犻狉犓 基因
对环境的响应比狀犻狉犛基因更加敏感［２５２６］。因此，本文
以狀犻狉犓 基因作为研究对象，通过ＰＣＲ－ＤＧＧＥ和克
隆测序分析探讨了呼伦贝尔沙地土壤中反硝化细菌
狀犻狉犓 基因多样性变化对不同植被恢复模式的响应。
研究结果表明土壤反硝化细菌狀犻狉犓 基因结构组
成存在明显差异，仅 ＵＡ和 ＵＣ间土壤反硝化细菌群
落结构组成相似度较高。通过对Ｓｈａｎｎｏｎ指数（犎）
和均匀度指数（犈犎）的分析发现，５种植被恢复模式土
壤反硝化细菌多样性均显著高于对照沙地，说明在植
被恢复过程中，土壤中的反硝化细菌种类明显增加，其
中混播模式下（ＡＣ和ＡＣＨＥ）最低。本实验室对土壤
固氮细菌多样性研究发现，混播模式下 （ＡＣ 和
ＡＣＨＥ）土壤固氮细菌的Ｓｈａｎｎｏｎ指数和均匀度最
高，而单播模式低于混播模式，且均高于对照沙地［１９］。
对土壤氨氧化细菌多样性研究发现，５种植被恢复模
式均高于对照沙地，其中ＡＣ模式下Ｓｈａｎｎｏｎ指数和
均匀度最高，而另一种混播模式下Ｓｈａｎｎｏｎ指数和均
匀度仅排在第４位［２０］。这些结果说明，土壤中不同的功能微生物对不同植被恢复模式产生了不同的响应。土壤
反硝化细菌多样性的变化与固氮细菌和氨氧化细菌呈现出一定的相反趋势，这一变化是否能够说明植被恢复后
沙地土壤向天然草原演变，仍需进一步研究。
土壤反硝化细菌的活性受到土壤理化性质的影响，典范对应分析表明，ＡＰ、ＴＰ、ＴＮ、ＳＭ 和ｐＨ对反硝化细
菌区系的影响均达到显著水平，并且这５种理化因子之间均极显著相关，说明反硝化细菌的区系组成受到土壤各
理化因子之间相互关联共同影响。Ｍａｒｓｃｈｎｅｒ等［２７］认为多个相互联系的环境因子共同控制草原生态系统的微
生物群落结构。Ｐｅｎｇｔｈａｍｋｅｅｒａｔｉ等［２８］认为土壤微生物的分布、活动以及多样性与土壤微生境的改变密切相关，
而这均是土壤物理性质改变的结果。Ｗｏｌｓｉｎｇ和Ｐｒｉｅｍｅ［２９］应用ＴＲＦＬＰ技术对土壤中狀犻狉犓 基因片段的细菌群
落组成分析认为，土壤中狀犻狉犓 基因群落组成的差异不能归因于单一影响因素，反硝化细菌种群对氮含量增加的
影响可能是氮含量增加（直接效应）和其他环境因素（间接效应）共同作用的结果。尽管ＮＯ３－被认为是反硝化速
率的重要控制因素，而本研究并未发现狀犻狉犓 基因群落多样性与ＮＯ３－含量具有显著相关性，这与 Ｍｅｒｇｅｌ等［３０］
研究发现酸性森林土的土壤剖面中ＮＯ３－含量与反硝化细菌群落有很小的相关性具有一致性，表明反硝化细菌
的数量和多样性由多种因素共同调控。
土壤理化性质与地表植物的种类密切相关，同时对土壤微生物群落结构造成影响［３１３２］。本实验室研究发现，
植被恢复后植物物种数量均有所增加（结果未列出）。植被组成、生长状况、地表覆盖程度、根系分泌物的化学组
成及根系周转速率均存在差异［３３］，造成土壤养分含量的变化，从而导致土壤反硝化细菌多样性的不同。Ｂａｎｅｒａｓ
等［３４］发现植被类型的改变对狀犻狉犓 反硝化群落具有显著影响。Ｂｒｅｍｅｒ等［３５］也发现植物根系分泌物能够直接影
响土壤微生物的种群组成，反硝化细菌群落结构的形成是根系生物量、植被类型以及土壤理化性质等多种因素共
同作用的结果。
从系统发育树可以看出，部分条带与已知种类细菌相似，具有一定的亲缘关系，但同源性均小于８５％；大多
数的条带与未知的反硝化细菌具有近的亲缘关系，这表明它们可能代表新的反硝化细菌基因序列。从系统发育
分析结果可知，不同植被恢复模式下土壤反硝化细菌群落结构主要由α变形菌纲（Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）的苍白
１２１第１期 李刚 等：不同植被恢复模式下呼伦贝尔沙地土壤反硝化细菌狀犻狉犓基因组成结构和多样性研究
杆菌属和根瘤菌属以及不可培养的细菌组成，其中与不可培养细菌相关的片段占到总数的５０％以上。在已有的
关于研究不同生物地理条件下反硝化细菌多样性的报道中，多数检测到的片段均为不可培养的细菌。Ｙｏｓｈｉｄａ
等［２５］研究水稻土反硝化微生物群落组成时发现，大部分狀犻狉犛和狀犻狉犓 片段均与不可培养的细菌相关。Ｆａｌｋ
等［３６］研究海洋水体和沉积物中狀犻狉犛基因的群落多样性时，发现多数狀犻狉犛片段为不可培养细菌狀犻狉犛片段。从反
硝化细菌的结构组成上可以看到，对照沙地中土壤反硝化细菌主要属于苍白杆菌属；ＵＡ和ＵＣ模式中反硝化细
菌主要属于苍白杆菌属、根瘤菌属和不可培养细菌；ＡＣ模式中反硝化细菌主要属于根瘤菌属；而 ＵＨ和ＡＣＨＥ
模式中反硝化细菌全部为不可培养细菌。这再次说明不同植被恢复模式下，土壤中的反硝化细菌群落组成差异
明显，而产生这种结果的原因还有待进一步研究。近年来，好氧反硝化作用逐渐被认识，而本研究所发现的苍白
杆菌属和根瘤菌属均属于好氧反硝化细菌，且形成由苍白杆菌属（对照沙地、ＵＡ和ＵＣ）向根瘤菌属（ＵＡ、ＵＣ和
ＡＣ）一种潜在的过度趋势，这是否说明好氧反硝化细菌在植被恢复过程中发挥了重要作用，仍需要通过采用更为
先进的分子生物学技术进行长期跟踪研究。
本研究首次分析了呼伦贝尔沙地不同植被恢复模式土壤反硝化细菌狀犻狉犓 基因多样性及群落组成，为沙地
植被恢复模式的建立提供了一定的理论依据。由于反硝化细菌在陆地生态系统具有重要的生态位，因此开展此
研究对沙地的恢复和重建具有重要意义。土壤反硝化过程由４种反硝化酶逐步催化完成，而携带不同反硝化基
因的微生物种群对环境因子变化的响应并不一致［３７］。因此，为进一步揭示呼伦贝尔沙地植被恢复过程中反硝化
细菌群落组成变化，有必要对不同类型的反硝化微生物开展研究。同时还要结合多种分子生物学技术，如实时定
量ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ及高通量测序等［３８］，分别在ＤＮＡ和ＲＮＡ水平上对植被恢复过程中土壤反硝化细菌群落结
构、动态变化以及数量变化等进行分析，深入剖析土壤反硝化细菌种群动态变化对植被恢复的响应机制。
犚犲犳犲狉犲狀犮犲：
［１］ ＺｈａｎｇＹＧ，ＬｉＤＱ，ＷａｎｇＨＭ，犲狋犪犾．ＰｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｓｔｕｄｙｏｆａｌｐｉｎｅｍｅａｄｏｗｓｏｉｌｄｅｎｉｔｒｉｆｙｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎｔｈｅＴｈｒｅｅＲｉｖｅｒｓａｒｅａｏｆＴｉｂｅｔ
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２２１ 草 业 学 报 第２４卷
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ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒａｎｄｃａｔｔｌｅｍａｎｕｒｅｂｙｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇＴＲＦＬＰｏｆ狀犻狉ｇｅｎｅｆｒａｇｍｅｎｔｓ．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＥｃｏｌｏｇｙ，２００４，４８（２）：２６１２７１．
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ａｌｐｉｎｅｍｅａｄｏｗｉｎｔｈｅｈｅａｄｗａｔｅｒａｒｅａｏｆｔｈｅＹａｎｇｔｚｅａｎｄＹｅｌｏｗＲｉｖｅｒ，ＱｉｎｇｈａｉＴｉｂｅｔａｎｐｌａｔｅａｕ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２００７，１６（１）：３４４０．
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３２１第１期 李刚 等：不同植被恢复模式下呼伦贝尔沙地土壤反硝化细菌狀犻狉犓基因组成结构和多样性研究