全 文 ：书金属硫蛋白对热应激下体外培养奶牛淋巴细胞的影响
占今舜１，２，吴力专 １，李丽立３，张彬１
（１．湖南农业大学动物科学技术学院，湖南 长沙４１０１２８；２．扬州大学动物科学技术学院，江苏 扬州２２５００９；３．中国科学院亚热带
农业生态研究所动物生态营养与健康养殖联合实验室 农业生态工程重点实验室，湖南 长沙４１０１２５）
摘要：本研究的目的在于探讨外源性金属硫蛋白（ＭＴ）对热应激下体外培养奶牛淋巴细胞凋亡的影响。将屠宰获
取的奶牛脾脏淋巴细胞随机分为４组，每组细胞培养液中 ＭＴ的终浓度分别为０μｇ／ｍＬ（对照组）、７０μｇ／ｍＬ（第Ⅰ
组）、１４０μｇ／ｍＬ（第Ⅱ组）、２１０μｇ／ｍＬ（第Ⅲ组），同时置于细胞培养箱（３７℃、５％ＣＯ２）中培养２０ｈ，之后同时置于
４３℃水浴锅中进行热应激处理１ｈ，再回细胞培养箱中培养３ｈ，然后利用形态学观察、ＲＴ－ＰＣＲ等方法进行各项
指标的检测。结果如下，１）通过形态学观察和ＡＯ／ＥＢ染色观察，表明添加 ＭＴ可以有效缓解热应激对奶牛淋巴细
胞的损伤，但缓解效果随 ＭＴ浓度的增加而下降；２）第Ⅰ～Ⅲ组的ＣＡＴ活性、ＳＯＤ活性和ＧＳＨＰｘ活性均高于对
照组（犘＜０．０１），ＭＤＡ含量均低于对照组（犘＜０．０１），表明 ＭＴ能够有效改善淋巴细胞的抗氧化能力；３）试验Ⅰ～
Ⅲ组的犅犪狓基因相对表达量均显著低于对照组（犘＜０．０１），但试验Ⅰ～Ⅲ组犅犮犾２基因的表达量和狆５０基因的表
达量均显著低于对照组（犘＜０．０１），表明 ＭＴ可以调节与细胞凋亡相关基因的表达。综上所述，添加 ＭＴ可以降低
奶牛淋巴细胞死亡率，改善奶牛淋巴细胞抗氧化性能，抑制奶牛淋巴细胞凋亡，以添加终浓度为７０μｇ／ｍＬ的 ＭＴ
效果最好。
关键词：金属硫蛋白；热应激；淋巴细胞凋亡；细胞培养；奶牛
中图分类号：Ｓ８２３．９＋１　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１４）０３０２１５０９
犇犗犐：１０．１１６８６／ｃｙｘｂ２０１４０３２５　　
　　金属硫蛋白（ｍｅｔａｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ，ＭＴ）是在１９５７年研究金属镉的生物学作用时，从马肾中分离出的一类具有分
子量低、高巯基且具有与金属离子结合的独特性能的蛋白质。它含有大量的半胱氨酸残基（１８～２０个），少量或
不含芳香族氨基酸和组氨酸，能被金属元素诱导和结合多个金属原子［１４］。现有研究发现，ＭＴ能够通过提高奶
牛体内的过氧化氢酶（ＣＡＴ）、超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）和谷胱甘肽过氧化物（ＧＳＨＰｘ）基因的表达来提高奶牛的
抗热应激［５７］。细胞培养技术是在活体内取出与试验相关组织或细胞，在体外模拟体内生理环境，且建立无菌、适
温和一定的营养条件，使细胞生长和生存并维持其结构与功能的一种方法。该方法具有易于提供性状相似的试
验对象和耗资少，如对于大型经济动物来讲比较经济等特点，被广泛用于医药、农业等领域。利用细胞培养技术
来研究 ＭＴ对奶牛淋巴细胞的影响还尚未见报道。因此，本试验研究在热应激条件下，外源 ＭＴ对体外培养的
奶牛淋巴细胞的影响，目的是从细胞水平研究 ＭＴ对奶牛的影响，丰富相关理论的研究，为推广 ＭＴ在奶牛业上
的应用提供科学依据。
１　材料与方法
１．１　材料
１．１．１　ＭＴ的来源　采用本实验室２０１２年７月诱导合成、分离和纯化的奶牛肝脏锌金属硫蛋白（ＺｎＭＴ）［８］。
１．１．２　奶牛淋巴细胞的来源　从湖南省畜牧所购买出生１ｄ的荷斯坦公奶牛，然后进行屠宰。在无菌条件下取
出脾脏放入经过高温灭菌过的ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｓａｌｉｎｅ）溶液中。利用无菌的剪刀剪碎脾脏，去掉精膜和脂
肪，将其置入胰消化酶中，在恒温气浴锅中３７℃，振荡３０ｍｉｎ，将组织倒入细胞网筛，用无菌的注射器芯对其碾
第２３卷　第３期
Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．３
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
２１５－２２３
２０１４年６月
收稿日期：２０１３０６２１；改回日期：２０１３０９０５
基金项目：国家自然科学基金项目（３１０７２０５３；３０６７１５１６），湖南省自然科学基金重点项目（１１ＪＪ２０１４）和教育部高等学校博士学科点专项科研基
金（博导类）项目（２０１０４３２０１１０００１）资助。
作者简介：占今舜（１９８５），男，江西玉山人，硕士。Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎｊｓ１０２３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｚｈｂ８２３６＠１２６．ｃｏｍ
压、过滤，后将滤液轻轻加入装有牛淋巴分离液的离心管中，１５００ｒ／ｍｉｎ，２０ｍｉｎ离心，取离心后的第２层乳白色
的淋巴细胞层，然后加入４ｍＬ的ＲＰＭＩ１６４０进行１５００ｒ／ｍｉｎ，１５ｍｉｎ洗涤２次，最终得到淋巴细胞，然后用完
全培养液进行培养。
１．２　淋巴细胞凋亡的形态学观察
１．２．１　倒置显微镜观察凋亡形态　将提取出来的奶牛淋巴细胞，用完全培养液将细胞稀释成５×１０５ 个／ｍＬ，随
机分为４组，每组细胞培养液中 ＭＴ的终浓度分别为０μｇ／ｍＬ（对照组）、７０μｇ／ｍＬ（第Ⅰ组）、１４０μｇ／ｍＬ（第Ⅱ
组）、２１０μｇ／ｍＬ（第Ⅲ组），同时置于细胞培养箱（３７℃、５％ＣＯ２）中培养２０ｈ，之后同时置于４３℃水浴锅中进行热
应激处理１ｈ，再回细胞培养箱中培养３ｈ，收集每组的细胞在倒置显微镜下进行形态观察。
１．２．２　ＡＯ／ＥＢ染色观察　取处理过的细胞，调整为５×１０５ 个／ｍＬ，收集细胞，然后在９８μＬ的细胞悬液中加入
２μＬ的ＡＯ／ＥＢ荧光染色液，用漩涡混合器将其混匀。用移液枪吸取该液体，将其加在载玻片上，盖上盖玻片后
在荧光显微镜下进行观察。
１．３　淋巴细胞内抗氧化指标的检测
检测方法和步骤按照试剂盒上的说明书进行，试剂盒购于南京建成生物工程研究所。
１．４　细胞凋亡相关基因的检测
１．４．１　引物设计　根据ＧｅｎＢａｎｋ登录序列，以βａｃｔｉｎｍＲＮＡ作为内参，ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５．０设计引物，引物设
计结果见表１。引物的合成由上海生物工程股份有限公司完成。
１．４．２　ｃＤＮＡ的合成　根据所购买的ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＴＭＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｓｔｈｅｓｉｓＫｉｔ反转录试剂盒中的说明书
进行操作。
１．４．３　ＲＴ－ＰＣＲ反应液和反应条件　按表２配制ＰＣＲ反应液（操作请在冰上进行）。
表１　引物设计
犜犪犫犾犲１　犘狉犻犿犲狉犱犲狊犻犵狀
扩增基因
Ｇｅｎｅ
登录号
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ
引物序列（５′３′）
Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ
产物长度
Ｐｒｏｄｕｃｔｌｅｎｇｔｈ（ｂｐ）
βａｃｔｉｎ ＮＭ＿１７３９７９．３ Ｆ：ＧＣＧＴＴＡＣＡＣＣＣＴＴＴＴＴＣＴＴＧＡＣ；Ｒ：ＡＣＣＴＴＣＡＣＣＧＴＴＣＣＡＧＴＴＴＴＴＡ １５０
犅犪狓 ＮＭ＿１７３８９４．１ Ｆ：ＴＣＧＧＡＧＡＴＧＡＡＴＴＧＧＡＣＡＧＴＡＡＣ；Ｒ：ＣＡＡＡＧＴＡＧＡＡＡＡＧＧＧＣＧＡＣＡＡＣ １５３
犅犮犾２ ＮＭ＿００１１６６４８６．１ Ｆ：ＡＴＧＴＧＴＧＴＧＧＡＧＡＧＣＧＴＣＡＡＣ；Ｒ：ＡＧＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣ １８０
狆５０ ＮＭ＿１７４７２６．１ Ｆ：ＡＴＡＧＴＧＧＧＡＡＡＡＧＧＡＡＡＧＧＣＴＣＴ；Ｒ：ＣＧＧＴＧＴＣＡＡＡＡＡＣＴＧＧＧＴＡＴＧＴＡ ８９
表２　犚犜－犘犆犚反应液
犜犪犫犾犲２　犜犺犲狉犲犪犮狋犻狅狀犾犻狇狌犻犱狅犳狉犲犪犾狋犻犿犲犘犆犚
试剂Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ 使用量 Ｖｏｌｕｍｅ（μＬ） 终浓度Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（μｍｏｌ／Ｌ）
ｃＤＮＡ模板ｃＤＮＡｔｅｍｐｌａｔｅ ２
ＳＹＢＲ预混合试剂ＥｘＴａｑＴＭＳＹＢＲｐｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＴＭ（２×） １０ １×
ＰＣＲ反向引物ＰＣＲｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ（１０μｍｏｌ／Ｌ） ０．４ ０．２
ＰＣＲ正向引物ＰＣＲｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒ（１０μｍｏｌ／Ｌ） ０．４ ０．２
ＲＯＸ参比染料ＲＯＸｒｅｆｅｒｅｎｃｅｄｙｅ（５０×） ０．４ １×
灭菌蒸馏水ＳｔｅｒｉｌｅｄＨ２Ｏ ６．８
总体积Ｔｏｔａｌｖｏｌｕｍｅ ２０
　反应条件为：９５℃，３０ｓ预变性；９５℃，５ｓ，ＰＣＲ反应４０个循环；６０℃，３１ｓ。Ｒｅａｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：ｉｎｉｔｉａｌｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎｉｎ９５℃，３０ｓ；９５℃，５ｓ，ＰＣＲ
ｒｅａｃｔｉｏｎ４０ｃｙｃｌｅｓ；６０℃，３１ｓ．
６１２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．３
１．４．４　数据的处理　采用Ｅｘｃｅｌ软件进行初步处理，然后用ＳＰＳＳ１７．０统计软件进行数据分析，结果以平均
值±标准差表示，用ＬＳＤ方法进行多重比较。
２　结果与分析
２．１　淋巴细胞形态学观察结果
在倒置显微镜下观察（图１），正常的淋巴细胞悬浮生长并边缘整齐，细胞呈圆形或椭圆形。而本试验结果为
图１　淋巴细胞形态学观察结果
犉犻犵．１　犈犳犳犲犮狋狊狅犳犿狅狉狆犺狅犾狅犵犻犮犪犾狅犫狊犲狉狏犪狋犻狅狀狅狀犾狔犿狆犺狅犮狔狋犲
　１：对照组Ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ；２：试验Ⅰ组ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐⅠ；３：试验Ⅱ组ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐⅡ；４：试验Ⅲ组ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐⅢ．下同 Ｔｈｅ
ｓａｍｅｂｅｌｏｗ．　
图２　犃犗／犈犅染色观察结果
犉犻犵．２　犈犳犳犲犮狋狊狅犳狊狋犪犻狀犻狀犵狅狀犃犗／犈犅
７１２第２３卷第３期 草业学报２０１４年
奶牛淋巴细胞在４３℃热应激下，各组奶牛淋巴细胞出现细胞质的明亮度下降，细胞膜不完整，界限模糊并增强颗
粒感，以及细胞肿胀、碎片。说明热应激能够导致奶牛淋巴细胞凋亡和死亡。对照组中细胞肿胀数量和碎片均多
于试验Ⅰ～Ⅲ组，试验Ⅰ～Ⅲ组细胞肿胀数量和细胞碎片逐渐增多，且第Ⅰ组最少。说明在细胞培养液中添加低
浓度 ＭＴ可以有效缓解热应激对奶牛淋巴细胞的损伤。但随 ＭＴ浓度的增加，其缓解作用效果下降。
２．２　ＡＯ／ＥＢ染色观察结果
淋巴细胞经过ＡＯ／ＥＢ染色，在荧光显微镜下观察，正常的淋巴细胞会被ＡＯ染成绿色，而且荧光染料在细
胞内分布均匀；如果经过染色的细胞出现橙色且带有绿色，说明淋巴细胞处在凋亡初期；如果细胞出现橙红色且
有凋亡小体的生成，则说明细胞处在凋亡末期。如果细胞坏死，则会被ＥＢ染料染成红色。从图２中可以发现，
对照组的淋巴细胞大多处在细胞凋亡末期并且大量细胞坏死，而试验Ⅰ组中出现的绿色且带有橙色的细胞，说明
细胞处在凋亡初期；试验Ⅱ组中出现较多的橙色细胞，试验Ⅲ组出现部分橙红色和红色细胞，说明细胞从凋亡逐
渐转化成坏死。随着 ＭＴ添加浓度的增加，破裂淋巴细胞出现增加趋势，橙色的数量也在增加，而且出现橙红色
和红色。说明热应激下，添加低浓度 ＭＴ能够改善淋巴细胞的抗热应激作用，较高浓度 ＭＴ对奶牛淋巴细胞的
凋亡无抑制作用或抑制作用很小。
２．３　淋巴细胞内抗氧化指标的检测结果
从表３中可以看出，试验Ⅰ组和Ⅱ组的奶牛淋巴细胞内的ＣＡＴ活性显著高于对照组和第Ⅲ组（犘＜０．０１），
但试验Ⅰ、Ⅱ组之间差异不显著。细胞内的ＳＯＤ和 ＧＳＨＰｘ的活性，均为试验Ⅰ组显著高于其他３组（犘＜
０．０１），对照组的活性最低，且试验Ⅰ～Ⅲ组活性呈逐渐下降的趋势。奶牛淋巴细胞内的丙二醛（ＭＤＡ）含量，对
照组显著高于其他３组（犘＜０．０１），试验Ⅰ～Ⅲ组之间差异不显著（犘＞０．０５），但有随着 ＭＴ含量的提高 ＭＤＡ
含量依次增高的趋势。综合上述结果，可以发现，ＭＴ能够通过提高ＣＡＴ活性、ＳＯＤ的活性、ＧＳＨＰｘ的活性和
降低 ＭＤＡ含量来改善奶牛淋巴细胞的抗氧化性能，进而提高奶牛淋巴细胞的抗热应激能力，且 ＭＴ提高奶牛淋
巴细胞抗氧化能力与其浓度存在密切的联系，添加低浓度的效果优于高浓度。
表３　淋巴细胞内抗氧化指标的检测
犜犪犫犾犲３　犚犲狊狌犾狋狊狅犳狋犺犲犪狀狋犻狅狓犻犱犪狀狋犻狀犱犲狓狊狅犳犱犪犻狉狔犮狅狑犾狔犿狆犺狅犮狔狋犲
组别
Ｇｒｏｕｐｓ
ＣＡＴ活性
ＣＡＴａｃｔｉｖｉｔｙ（Ｕ／ｍＬ）
ＳＯＤ活性
ＳＯＤａｃｔｉｖｉｔｙ（Ｕ／ｍＬ）
ＧＳＨＰＸ活性
ＧＳＨＰＸａｃｔｉｖｉｔｙ（Ｕ／ｍＬ）
ＭＤＡ含量
ＭＤＡｃｏｎｔｅｎｔ（ｎｍｏｌ／ｍＬ）
对照组Ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ １．５０±０．９８Ａ １９．３６±０．８０Ａ ２６０．６６±６．３４Ａ ４．９４±１．０１Ａ
试验Ⅰ组ＴｒｉａｌｇｒｏｕｐⅠ ５．３４±０．８３Ｂ ２５．３２±０．４８Ｃｂ ３９０．１１±６．８８Ｂ ２．３８±０．９１Ｂａ
试验Ⅱ组ＴｒｉａｌｇｒｏｕｐⅡ ５．２８±０．４７Ｂ ２４．２０±０．８３Ｃａ ３５２．０４±９．６５Ｃ ２．９６±０．９３Ｂａ
试验Ⅲ组ＴｒｉａｌｇｒｏｕｐⅢ １．６１±０．２７Ａ ２２．５３±１．０９Ｂ ３２０．３６±６．３９Ｄ ３．５５±１．７１Ａａ
　注：同列不同大写字母表示差异极显著（犘＜０．０１），不同小写字母表示差异显著（犘＜０．０５）。下同。
　Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃａｐｉｔａｌｌｅｔｔｅｒｍｅａｎｓｈｉｇｈｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（犘＜０．０１）ａｎｄｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｏｗｅｒｃａｓｅｌｅｔｔｅｒｍｅａｎｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（犘＜
０．０５）．Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．
２．４　基因犅犪狓、犅犮犾２、狆５０的ＲＴ－ＰＣＲ检测
从表４可以看到，试验Ⅰ～Ⅲ组的犅犪狓基因相对表达量分别是对照组的０．１６，０．３４和０．２４倍，且均显著低
于对照组（犘＜０．０１），其中试验Ⅱ组最高，而试验Ⅰ组最低。说明 ＭＴ降低了犅犪狓基因相对表达量。对于犅犮犾２
基因，试验Ⅰ～Ⅲ组表达量显著高于对照组（犘＜０．０１），分别为对照组的２．５７，１．７８和２．１３倍，试验Ⅰ组显著高
于试验Ⅱ、Ⅲ组（犘＜０．０１），试验Ⅲ组显著高于试验Ⅱ组（犘＜０．０１）。说明 ＭＴ能提高犅犮犾２基因的表达量，且低
浓度的 ＭＴ效果最好，添加 ＭＴ浓度的增加，其表达量呈下降趋势。狆５０基因的表达量为试验Ⅰ～Ⅲ组分别是
对照组的０．７４，０．６５和０．４７倍，且各组均显著低于对照组（犘＜０．０１），其中，试验Ⅰ和Ⅱ组显著高于试验Ⅲ组
（犘＜０．０１），试验Ⅰ和Ⅱ组之间无显著差异（犘＞０．０１），说明添加 ＭＴ组的淋巴细胞的狆５０基因表达量下降。
８１２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．３
表４　奶牛淋巴细胞犅犪狓、犅犮犾２、狆５０的犚犜－犘犆犚检测
犜犪犫犾犲４　犚犜－犘犆犚狅狀犅犪狓，犅犮犾２，狆５０犻狀犱犪犻狉狔犮狅狑犾狔犿狆犺狅犮狔狋犲
组别Ｇｒｏｕｐｓ 犅犪狓 犅犮犾２ 狆５０
对照组Ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ １．００Ｃ １．００Ａ １．００Ｃ
试验Ⅰ组ＴｒｉａｌｇｒｏｕｐⅠ ０．１６±０．０３Ａ ２．５７±０．０８Ｄ ０．７４±０．０９Ｂ
试验Ⅱ组ＴｒｉａｌｇｒｏｕｐⅡ ０．３４±０．０７Ｂｃ １．７８±０．１２Ｂ ０．６５±０．０７Ｂ
试验Ⅲ组ＴｒｉａｌｇｒｏｕｐⅢ ０．２４±０．０２Ｂｂ ２．１３±０．１８Ｃ ０．４７±０．０７Ａ
３　讨论与结论
３．１　ＭＴ对热应激下淋巴细胞形态的影响
热应激是机体在高温环境下对热环境所做出的非特异性生理反应的总和。热应激能够引起乳鼠的心肌细
胞、奶牛的外周淋巴细胞和乳腺上皮细胞的凋亡［９１１］。当细胞发生凋亡时，在电镜下观察，可以发现细胞质的密
度增加，核质浓缩、核膜核仁破碎，核膜形成小泡，但是细胞膜的结构保持完整。细胞坏死是细胞受到外界因子的
刺激引起细胞无序变化的死亡，表现为细胞肿大、胞膜破裂和细胞内容物外溢等。刘庆华等［１２］研究热胁迫下淋
巴细胞的凋亡情况，发现胞质浓缩，细胞体积缩小，染色体凝集成团，而细胞膜未改变。在本试验中，热应激导致
淋巴细胞体积变小，细胞质的明亮度下降，界限模糊并增强颗粒感，出现很多细胞的碎片；淋巴细胞还出现细胞膜
不完整、细胞肿胀并溶解的现象，与其研究相一致。王艳凤［１３］研究氟对体外培养牛脾脏淋巴细胞凋亡的影响，结
果发现，正常的细胞被ＡＯ染成绿色，细胞凋亡初期呈橙色，凋亡末期呈橙红色，而坏死细胞则被ＥＢ染成红色。
从本试验结果来看，说明热应激能够导致体外培养奶牛淋巴细胞的凋亡和坏死。ＭＴ是一种分子量低、含有高巯
基的蛋白质，具有抗应激的功能。刘颖等［１４］研究结果表明，附子多糖能够保护心肌细胞免受损伤的主要原因是
其促进 ＭＴ的合成对抗氧化应激，进而抑制心肌细胞凋亡。在本试验结果中也可以看出，外源 ＭＴ能够延缓热
应激下奶牛淋巴细胞的凋亡，但低浓度的 ＭＴ效果优于高浓度。研究表明，体外细胞受到应激时，自身能够产生
ＭＴ来提高体外细胞的存活率［１５］。那么，淋巴细胞在热应激情况下，细胞自身应该也会产生一定量的 ＭＴ来保
护淋巴细胞。体外再增加低剂量的 ＭＴ会协同细胞自身的 ＭＴ来保护细胞免受热应激的损伤。试验中所用的
是ＺｎＭＴ，据报道，氧化型物质多，会使 ＭＴ的分子结构发生变化，导致Ｚｎ２＋容易从 ＭＴ中脱离［１６］。ＺｎＭＴ浓
度越高，从其脱离的Ｚｎ２＋越多，而金属Ｚｎ２＋对细胞有一定的毒性。因此，高浓度的ＺｎＭＴ会使淋巴细胞凋亡和
坏死增加。
３．２　ＭＴ对热应激下淋巴细胞内抗氧化功能的影响
机体在新陈代谢过程中会产生自由基，自由基具有强氧化性，对机体的组织和细胞具有损伤作用。正常情况
下，机体内自由基的产生和清除保持平衡，对机体不会造成伤害，且一定量的自由基对机体有好处。但是，过多的
自由基大量积累会因强烈的氧化作用使细胞中的不饱和脂肪酸产生 ＭＤＡ，而 ＭＤＡ能够导致细胞解体，最终促
使细胞死亡［１７］。机体在受到热应激情况下，会导致活性氧自由基的产生增多，活性氧自由基易与细胞内的大分
子进行结合并发生反应，促进细胞或组织的脂质过氧化作用［１８］。ＭＴ中含有３０％的半胱氨酸，且所有的半胱氨
酸残基均以还原态出现，容易发生亲和反应。与ＧＳＨＰｘ等相比，自由基更容易攻击 ＭＴ。因此，ＭＴ是一种高
效抗氧化剂。ＭＴ可提高动物机体的抗氧化物酶活性，从而提高机体的抗氧化能力。李丽立等［１９］给仔猪补充外
源性ＺｎＭＴ，仔猪肝脏ＳＯＤ、ＧＳＨＰｘ活性得到显著提高。张彬等［７］和李丽立等［８］研究注射外源ＺｎＭＴ对奶牛
血清的抗氧化性能的影响，结果 ＭＴ提高了奶牛的ＳＯＤ、ＧＳＨＰｘ、ＣＡＴ和ＴＡＯＣ的活性，且较高剂量的 ＭＴ
改善抗氧化能力的效果优于低剂量，效果表现出一定的时间效应和剂量效应。本试验研究结果发现，在热应激情
况下，外源 ＭＴ能够提高奶牛淋巴细胞的ＳＯＤ、ＧＳＨＰｘ、ＣＡＴ活性，降低细胞内的 ＭＤＡ含量，从而改善奶牛淋
巴细胞的抗氧化性能，提高奶牛淋巴细胞的抗热应激能力，且 ＭＴ提高奶牛淋巴细胞抗氧化能力与其浓度存在
密切的联系，添加低浓度的效果优于高浓度。Ｚｎ是构成ＣｕＺｎＳＯＤ的组成成分，而ＣｕＺｎＳＯＤ具有清除氧自由
９１２第２３卷第３期 草业学报２０１４年
基的作用。另外，Ｚｎ是ＧＳＨＰｘ的激活剂，当Ｚｎ缺乏时，细胞内的ＧＳＨＰｘ数量会减少，ＧＳＨＰｘ发挥抗氧化作
用减弱。在热应激情况下，细胞内产生的自由基会使ＺｎＭＴ置换出Ｚｎ，从而提高ＳＯＤ、ＧＳＨＰｘ的活性，增强
自由基的清除能力，减少 ＭＤＡ的产生。然而，有报道称，当内环境处于高Ｚｎ状态时，能够抑制ＳＯＤ活性，从而
使机体清除氧自由基的功能降低，过氧化脂质堆积。另外，细胞内Ｚｎ含量超过生理水平时，就会诱导细胞产生
自由基并呈现毒副作用［２０］。因此，随着添加ＺｎＭＴ的浓度增加，Ｚｎ２＋的含量增加，使奶牛淋巴细胞内处于高Ｚｎ
状态，导致抗氧化酶类的活性有所下降，进而促使ＺｎＭＴ抗氧化功能下降。
３．３　ＭＴ对热应激下淋巴细胞内犅犪狓、犅犮犾２基因表达的影响
动物机体在热应激下，机体发生紊乱，其自由基增加以及脂质过氧化，增加活性氧的积累，而活性氧对犅犪狓
基因的表达具有促进作用。犅犪狓是促凋亡蛋白，犅犮犾２是抑制凋亡蛋白，它们之间通过形成异二聚体来维持细胞
凋亡的动态平衡。另外，犅犮犾２还通过阻止细胞膜脂质过氧化，抑制线粒体细胞色素 Ｃ的释放，抑制下游的
Ｃａｓｐａｓｅ活化，进而阻止细胞凋亡［２１］。如果自由基清除不及时，导致犅犮犾２表达和犅犪狓表达不平衡，会使细胞产
生凋亡。谢远杰等［２２］发现，热应激后第３天大鼠生精细胞的犅犮犾２ｍＲＮＡ表达明显下降，而第７天犅犪狓ｍＲＮＡ
表达明显增加，表明热应激早期导致生精细胞凋亡主要是因为犅犮犾２表达减少造成的，后期则由于犅犪狓表达的不
断增强，进一步促进生精细胞的凋亡。汪君民和赵阶祥［２３］利用免疫组化方法检测热应激组的大鼠外周血淋巴细
胞的犅犮犾２和犅犪狓基因表达情况，结果与其一致。贾丹等［２４］试验结果为热应激下，猪小肠细胞的犅犪狓基因表达
升高，犅犮犾２基因表达下降，导致小肠绒毛上皮细胞的凋亡增加。蔡亚非等［１０］研究热应激对奶牛外周血淋巴细胞
犅犪狓ａ基因的表达，结果热应激下犅犪狓ａ基因的表达量最高，且与淋巴细胞凋亡率呈平行关系。另外，宋学立
等［２５］通过研究犅犮犾２基因转染对热应激心肌细胞保护的作用所得结果认为，在热应激下，犅犮犾２基因通过保护心
肌细胞线粒体 Ｈ＋ＡＴＰａｓｅ合成活力，阻抑Ｃａｓｐａｓｅ３活化来抑制心肌细胞的凋亡。ＭＴ含有大量的巯基基团，
还原状态的巯基具有亲核性，自由基容易与其结合，降低体内的氧自由基，进而降低犅犪狓基因的表达。孙忠东
等［２６］研究发现，用ＺｎＳＯ４ 诱导产生的 ＭＴ能够促使大鼠心肌犅犮犾２蛋白的表达增加，犅犪狓蛋白表达下降。罗佳
捷等［２７］研究ＺｎＭＴ对热应激下奶牛淋巴细胞的凋亡基因的影响，结果发现，犅犪狓基因表达量较对照组降低，
犅犮犾２基因表达增强。另外，Ａｌｅｓｓａｎｄｒｒａ等［２８］通过试验结果发现 ＭＴ对犅犮犾２蛋白表达有促进作用，认为 ＭＴ
在调控多形性腺瘤细胞凋亡中发挥重要作用。从本试验看，试验组的犅犪狓基因表达显著低于对照组（犘＜０．０１），
犅犮犾２基因表达量显著高于对照组（犘＜０．０１），犅犪狓／犅犮犾２下降，抑制了淋巴细胞的凋亡。说明在一定程度上添
加适量外源ＭＴ抑制了淋巴细胞的凋亡。Ｃａｓｐａｓｅ蛋白的级联活动是细胞凋亡的中心环节，由犅犮犾２蛋白家族和
凋亡抑制蛋白家族（ＩＡＰｓ）联合调控。Ｚｎ２＋能够与ＩＡＰｓ形成锌指结构，激发其活性，进而抑制细胞凋亡。另外，
核酸内切酶中含有相同的Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋竞争位点，当Ｚｎ２＋浓度达到一定程度Ｚｎ２＋能够和Ｃａ２＋竞争与核酸内切酶
结合，抑制核酸酶的活性，进而抑制细胞的凋亡。但是，当Ｚｎ２＋浓度过高时，会导致细胞的ＤＮＡ降解，促使细胞
凋亡进而死亡［２９３０］。因此，在本试验中，添加低浓度的ＺｎＭＴ，游离出的Ｚｎ２＋也发挥了抑制细胞凋亡的作用，但
是随着添加剂量的增加，Ｚｎ２＋对淋巴细胞产生了一定的毒性，进而导致抑制细胞凋亡的作用呈下降趋势。在热
应激下，机体很容易合成各种热休克蛋白。研究表明，热休克蛋白家族的 犎狊狆７０和 犎狊狆４０在协同作用下抑制
犅犪狓的活化，阻断其促进细胞凋亡；犎狊狆６０能与犅犪狓形成复合物以及增强犅犮犾２的作用，进而抑制细胞的凋亡；
犅犮犾２／犎狊狆９０β复合物能够抑制细胞色素Ｃ和犆犪狊狆犪狊犲３的释放
［３１３３］。罗佳捷等［２７］发现 ＭＴ对热应激下，奶牛
血液淋巴细胞的犎狊狆７０基因的表达具有提高作用。因此，认为在热应激下，ＭＴ能通过调控热休克蛋白和细胞
凋亡相关基因的表达来抑制细胞凋亡。但是，ＭＴ是否是同时调控热休克蛋白和细胞凋亡相关基因的表达还是
调控热休克蛋白和细胞凋亡相关基因的表达之间存在先后顺序，需要进一步深入的研究。
３．４　ＭＴ对热应激下淋巴细胞内狆５０基因表达的影响
在哺乳动物中，ＮＦκＢ主要由５个相关的转录因子（狆６５、狆５０、狆５２、犚犲犾犅和犮犚犲犾）之间形成同源或异源二聚
体组成的，研究最多的是狆５０／狆６５二聚体。据报道，活化的犖犉κ犅 对多种与细胞凋亡相关的基因具有转录调节
作用，对细胞凋亡具有抑制和促进的作用［３４］。犖犉κ犅 抑制细胞凋亡是一种多个信号通路转导的过程，通过转导
激活犐犈犡犐犔、犅犮犾２家族等提高机体的抗细胞凋亡的作用［３５］。夏钰弘等［３６］研究结果表明，犖犉κ犅 可能通过抑制
０２２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．３
犆犪狊狆犪狊犲３的活性进而抑制肝癌细胞凋亡。然而，也有报道称，犖犉κ犅 对细胞的凋亡有促进的作用。研究发现，
黑色素瘤细胞在紫外线诱导下会因犖犉κ犅 的活化而导致细胞凋亡；在Ｈ２Ｏ２ 的诱导下，活化的犖犉κ犅 能使Ｔ细
胞发生细胞凋亡［３７３８］。另外还发现，活化的犖犉κ犅 能够通过抑制抗凋亡基因的表达进而促进细胞凋亡［３９］。之
前研究结果表明，添加ＺｎＭＴ能够提高淋巴细胞犅犮犾２基因的表达量，降低犅犪狓基因的表达量，抑制细胞的凋
亡。而研究ＺｎＭＴ对淋巴细胞狆５０基因表达的影响，发现在热应激下，与对照组相比，添加ＺｎＭＴ组的奶牛淋
巴细胞内的狆５０基因表达量下降。出现这种现象可能原因如下：在正常情况下，犖犉κ犅 由于与其抑制蛋白（ＩκＢ）
相结合而无活性。当淋巴细胞受到热应激时，促使ＩκＢ磷酸化，导致犖犉κ犅 激活。研究已发现，犖犉κ犅 对细胞
凋亡有双向作用，激活的犖犉κ犅 具有促进细胞凋亡的作用，因此，本试验的结果说明，ＭＴ可能通过抑制狆５０基
因的表达，抑制ＩκＢ磷酸化，降低犖犉κ犅 的活性，从而降低犖犉κ犅 抑制抗凋亡基因的表达，抑制淋巴细胞的凋
亡。
在热应激下，添加外源 ＭＴ能够提高奶牛淋巴细胞的存活率，降低淋巴细胞的凋亡率；提高淋巴细胞内的
ＣＡＴ活性、ＳＯＤ活性和ＧＳＨＰｘ活性，降低 ＭＤＡ含量，促进淋巴细胞的抗氧化性能；提高淋巴细胞内的犅犮犾２
基因的表达量，降低犅犪狓基因和狆５０基因的表达量，从而抑制淋巴细胞的凋亡。从本试验的结果上看，添加终浓
度为７０μｇ／ｍＬ的 ＭＴ抑制热应激下体外培养奶牛淋巴细胞凋亡的效果最好。
参考文献：
［１］　ＨｅｎｋｅｌＧ，ＫｒｅｂｓＢ．Ｍｅｔａｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎｓ：ｚｉｎｃ，ｃａｄｍｉｕｍ，ｍｅｒｃｕｒｙ，ａｎｄｃｏｐｐｅｒｔｈｉｏｌａｔｅｓａｎｄｓｅｌｅｎｏｌａｔｅｓｍｉｍｉｃｋｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎａｃｔｉｖｅ
ｓｉｔｅｆｅａｔｕｒｅｓｓｔｒｕｃｔｕｒａｌａｓｐｅｃｔｓａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＣｈｅｍｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ，２００４，１０４（２）：８０１８２４．
［２］　ＩｖａｎＳ，ＤａｖｏｒｋａＢ，ＭａｒｉｏＳ，犲狋犪犾．Ｒｏｌｅｏｆｍｅｔａｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎｉｎｃａｄｍｉｕｍｔｒａｆｆｉｃａｎｄｔｏｘｉｃｉｔｙｉｎｋｉｄｎｅｙｓａｎｄｏｔｈｅｒｍａｍｍａｌｉａｎｏｒ
ｇａｎｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｍｅｔａｌｓ，２０１０，２３：８９７９２６．
［３］　ＴｈｉｒｕｍｏｏｒｔｈｙＮ，ＫｕｍａｒＫ Ｍ，ＳｕｎｄａｒＡＳ，犲狋犪犾．Ｍｅｔａｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ：Ａｎｏｖｅｒｖｉｅｗ［Ｊ］．ＷｏｒｌｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，
２００７，１３（７）：９９３９９６．
［４］　ＶａｓａｋＭ．Ａｄｖａｎｃｅｓｉｎｍｅｔａｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｒａｃｅＥｌｅｍｅｎｔｓｉｎＭｅｄｉｃｉｎｅ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，
１９（１）：１３１７．
［５］　张彬，谭琼，肖兵南，等．外源性金属硫蛋白对奶牛泌乳性能和抗氧化状况的影响［Ｊ］．草业学报，２００９，１８（６）：１３７１４３．
［６］　张彬，薛立群，李丽立，等．外源金属硫蛋白对奶牛抗热应激调控及ＳＯＤ基因表达的影响［Ｊ］．应用生态学报，２００７，１８（１）：
１９３１９８．
［７］　张彬，谭琼，李丽立，等．金属硫蛋白对奶牛血液抗氧化酶ＧＳＨＰｘ和ＣＡＴ基因表达的影响［Ｊ］．草业学报，２０１０，１９（３）：
１３２１３８．
［８］　李丽立，张彬，印遇龙，等．猪肝金属硫蛋白的诱导［Ｊ］．广西农业生物科学，２００４，２３（４）：２７０２７３．
［９］　周振峰，崔瑞莲，王加启，等．热应激对体外培养奶牛乳腺上皮细胞生长、凋亡及其热休克蛋白ｍＲＮＡ转录的影响［Ｊ］．畜牧
兽医学报，２０１０，４１（５）：６００６０７．
［１０］　蔡亚非，李莲，刘庆华，等．热应激奶牛外周血淋巴细胞凋亡和犅犪狓犪基因表达［Ｊ］．南京农业大学学报，２００５，２８（１）：６６
７０．
［１１］　宋学立，钱令嘉，李凤芝．热应激对乳鼠心肌细胞损伤作用的研究［Ｊ］．中国应用生理学杂志，２０００，１６（３）：２２７２３０．
［１２］　刘庆华，甘乾福，梁学武．热胁迫下奶牛肝脾ＨＳＰ７０的表达特征及脾淋巴细胞凋亡［Ｊ］．中国兽医科学，２０１２，４２（２）：１８６
１９１．
［１３］　王艳凤．氟致体外培养牛脾脏淋巴细胞凋亡机理的研究［Ｄ］．哈尔滨：东北农业大学，２００８．
［１４］　刘颖，纪超，吴伟康．金属硫蛋白介导附子多糖对缺氧复氧心肌细胞的保护［Ｊ］．中国实验方剂学杂志，２０１２，１８（４）：１７２
１７５．
［１５］　ＺｂｉｎｄｅｎＳ，ＷａｎｇＪＳ，ＡｄｎｉｋａＲ，犲狋犪犾．Ｍｅｔａｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎｅｎｈａｎｃｅｓａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄａｒｔｅｒｉｏｇｅｎｅｓｉｓｂｙｍｏｄｕｌａｔｉｎｇｓｍｏｏｔｈｍｕｓ
ｃｌｅｃｅｌａｎｄｍａｃｒｏｐｈａｇｅｆｕｎｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＡｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓａｎｄＶａｓｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２０１０，３０：４７７４８２．
［１６］　ＫａｎｇＪＹ．Ｍｅｔａｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎｒｅｄｏｘｃｙｃｌｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｅｄｉｃｉｎｅ，２００６，２３１：１４５９１４６７．
［１７］　ＣｈｅｎｇＪＺ，ＳｈａｒｍａＲ，ＹａｎｇＹＳ，犲狋犪犾．Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍａｎｄｅｘｃｌｕｓｉｏｎｏｆ４Ｈｙｄｒｏｘｙｎｏｎｅｎａｌｔｈｒｏｕｇｈｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆ
１２２第２３卷第３期 草业学报２０１４年
ＲＬＩＰ７６ａｎｄＨｇｓｔ５．８ｉｓａｎｅａｒｌｙａｄａｐｔｉｖｅｒｅｓｐｏｎｓｅｏｆｃｅｌｓｔｏｈｅａｔａｎｄｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ，２００１，２７６（４４）：４１２１３４１２２３．
［１８］　ＳｉｍｏｎＨＵ，ＹｅｈｉａＡＨ，ＳｃｈａｆｆｅｒＦＬ．Ｒｏｌｅｏｆｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ（ＲＯＳ）ｉｎａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，２０００，
５（５）：４１５４１８．
［１９］　李丽立，刘云华，侯德兴，等．金属硫蛋白对仔猪抗氧化功能及ＳＯＤ基因表达的影响［Ｊ］．第四军医大学学报，２００６，
２７（１９）：１７３３１７３６．
［２０］　曹功明，卢建雄．锌对动物抗氧化作用的研究进展［Ｊ］．黑龙江畜牧兽医，２０１０，１：１９２０．
［２１］　ＷｅｉＹ，ＭｉｃｈｅｌＳ，ＢｅｒｎａｒｄＪ，犲狋犪犾．Ｂｃｌｗｆｏｒｍｓｃｏｍｐｌｅｘｅｓｗｉｔｈ犅犪狓ａｎｄ犅犪犽，ａｎｄｅｌｅｖａｔｅｄｒａｔｉｏｓｏｆＢａｘ／ＢｃｌｗａｎｄＢａｋ／Ｂｃｌ
ｗｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｔｏｓｐｅｒｍａｔｏｇｏｎｉａｌａｎｄｓｐｅｒｍａｔｏｃｙｔｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｔｈｅｔｅｓｔｉｓ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２０００，１４（５）：６８２
６９８．
［２２］　谢远杰，石金凤，赵国军，等．热应激对大鼠睾丸犅犮犾２和犅犪狓表达的影响［Ｊ］．南华大学学报（医学版），２０１０，３８（２）：１６６
１６９．
［２３］　汪君民，赵阶祥．运动热应激对大鼠淋巴细胞凋亡氧化应激机制的影响［Ｊ］．辽宁医学院学报，２０１１，３２（２）：１０５１０９，１１３．
［２４］　贾丹，昝君兰，赵宏，等．热应激对猪小肠组织形态和细胞凋亡的影响［Ｊ］．北京农学院学报，２０１２，２７（１）：３６３８．
［２５］　宋学立，钱令嘉，李凤芝，等．犅犮犾２基因转染对热应激心肌细胞保护作用的机制探讨［Ｊ］．中国应用生理学杂志，２００２，
１８（４）：３４７３４９．
［２６］　孙忠东，高尚志，毛志福，等．金属硫蛋白对供心细胞犅犮犾２、犅犪狓和犉犪狊蛋白表达的影响［Ｊ］．中华实验外科杂志，２００５，２２
（３）：３７５．
［２７］　罗佳捷，吴宗明，张彬，等．金属硫蛋白对热应激奶牛血淋巴细胞凋亡基因和Ｈｓｐ７０基因表达的影响［Ｊ］．草业学报，２０１２，
２１（４）：２４４２５１．
［２８］　ＡｌｅｓｓａｎｄｒｒａＣＭＶ，ＤａｎｉｅａｌＣＲ，ＴａｙｎａｒａＮＧＦ，犲狋犪犾．Ｉｍｍｕｎｏｈｉａｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｅｘｐｒｅｓｓｏｆｍｅｔａｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎｉｎｐｌｅｏｍｏｒｐｈｉｃａｄ
ｅｎｏｍａｏｆｍｉｎｏｒｓａｌｉｖａｒｙｇｌａｎｄｓ：Ａｒｏｌｅｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓ？［Ｊ］．ＡｃｔａＨｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃ，２０１３，１１５（６）：５６４５６８．
［２９］　罗琦，王建华，王远亮，等．金属离子在细胞凋亡中的调控作用［Ｊ］．重庆大学学报，２００３，２６（８）：９７１０１．
［３０］　ＷｏｌｆｇａｎｇＭ．Ｍｅｔａｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎｒｅｄｏｘｂｉｏｌｏｇｙｉｎｔｈｅｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅａｎｄｃｙｔｏｔｏｘｉｃｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆｚｉｎｃ［Ｊ］．ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＧｅｒｏｎｔｏｌｏ
ｇｙ，２００８，４３：３６３３６９．
［３１］　ＳｈａｎＹＸ，ＬｉｕＴＪ，ＳｕＨＦ，犲狋犪犾．Ｈｓｐ１０ａｎｄＨｓｐ６０ｍｏｄｕｌａｔｅ犅犮犾２ｆａｍｉｌｙａｎｄｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａａｐｏｐｔｏｓｉｓｓｉｇｎａｌｉｎｇｉｎｄｕｃｅｄｂｙ
ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎｉｎｃａｒｄｉａｃｍｕｓｃｌｅｃｅｌｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｕｌａｒＣａｒｄｉｏｌｏｇｙ，２００３，３５：１１３５１１４３．
［３２］　ＲｕｃｈａｌｓｋｉＫ，ＭａｏＨ，ＬｉＺ，犲狋犪犾．ＤｉｓｔｉｎｃｔＨｓｐ７０ｄｏｍａｉｎｓｍｅｄｉａｔｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｕｃｉｎｇｆａｃｔｏｒｒｅｌｅａｓｅａｎｄｎｕｃｌｅａｒａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．
ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６，２８１：７８７３７８８０．
［３３］　ＣｏｈｅｎＳａｉｄｏｎＣ，ＣａｒｍｉＩ，ＫｅｒｅｎＡ，犲狋犪犾．Ａｎｔｉａｐｏｐｔｏｔｉｃｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆ犅犮犾２ｉｎｍａｓｔｃｅｌｓｉｓｄｅｐｅｎｄｅｎｔｏｎｉｔｓａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｗｉｔｈ
ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ９０ｂｅｔａ［Ｊ］．Ｂｌｏｏｄ，２００６，１０７：１４１３１４２０．
［３４］　ＤｕｔｔａＪ，ＦａｎＹ，ＧｕｐｔａＮ，犲狋犪犾．ＣｕｒｒｅｎｔｉｎｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｃｅｌｄｅａｔｈｂｙＮＦｋａｐｐａＢ［Ｊ］．Ｏｎｃｏ
ｇｅｎｅ，２００６，２５：６８００６８１６．
［３５］　ＶｅｒｍｅｕｌｅｎＬ，ＶａｎｄｅｎｂＷ，ＨａｅｇｅｍａｎＧ．ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＮＦｋａｐｐａＢｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＴｒｅａｔｍｅｎｔａｎｄＲｅ
ｓｅａｒｃｈ，２００６，１３０：８９１０２．
［３６］　夏钰弘，周婧，常艳华，等．肝细胞肝癌组织中ＮＦκＢ和Ｃａｓｐａｓｅ３的表达及其意义［Ｊ］．中国现代医学杂志，２０１２，２２（３）：
２６２９．
［３７］　ＤｕｍｏｎｔＡ，ＨｅｈｎｅｒＳＰ，ＨｏｆｍａｎｎＴＧ，犲狋犪犾．ＨｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｓＣＤ９５ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｒｅｑｕｉｒｅｓｔｈｅｒｅｌｅａｓｅ
ｏｆｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｄｅｒｉｖｅｄｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓａｎｄｔｈｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＮＦｋａｐｐａＢ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９９，１８（３）：７４７７５７．
［３８］　ＩｖａｎｏｖＶ，ＲｏｎａｉＺ．Ｐ３８ｐｒｏｔｅｃｔｓｈｕｍａｎｍｅｌａｎｏｍａｃｅｌｓｆｒｏｍＵＶｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｔｈｒｏｕｇｈｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＮＦｋａｐｐａＢ
ａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄＦａｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２０００，１９：３００３３０１２．
［３９］　ＣａｍｐｂｅｌＫＪ，ＲｏｃｈａＳ，ＰｅｒｋｉｎｓＮＤ．ＡｃｔｉｖｅｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｎｔｉａｐｏｐｔｏｔｉｃｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙＲｅｌＡ（６５）ＮＦｋａｐｐａＢ［Ｊ］．Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＣｅｌ，２００４，１３（６）：８５３８６５．
２２２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．３
犈犳犳犲犮狋狅犳犿犲狋犪犾狅狋犺犻狅狀犲犻狀狅狀犾狔犿狆犺狅犮狔狋犲犪狆狅狆狋狅狊犻狊狅犳狋犺犲犱犪犻狉狔犮狅狑犮狌犾狋狌狉犲犱犻狀狏犻狋狉狅狌狀犱犲狉犺犲犪狋狊狋狉犲狊狊
ＺＨＡＮＪｉｎｓｈｕｎ１，２，ＷＵＬｉｚｈｕａｎ１，ＬＩｌｉｌｉ３，ＺＨＡＮＧＢｉｎ１
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＨｕｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１０１２８，Ｃｈｉｎａ；
２．ＣｏｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＹａｎｇｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｙａｎｇｚｈｏｕ２２５００９，Ｃｈｉｎａ；３．Ｋｅｙ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｇｒｏｅｃｏｌｏｇｙ，ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎａｎｄＨｕｍａｎＨｅａｌｔｈ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆ
ＳｕｂｔｒｏｐｉｃａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ｔｈｅＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１０１２５，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｅｘｏｇｅｎｏｕｓＭＴｏｎｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｔｈｅｄａｉｒｙｃｏｗｗａｓｓｔｕｄｉｅｄ犻狀狏犻狋狉狅ｕｎｄｅｒｈｅａｔ
ｓｔｒｅｓｓ．Ｔｈｅｓｐｌｅｎｉｃｄａｉｒｙｃｏｗｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏ４ｇｒｏｕｐｓｗｈｉｃｈｈａｄｆｉｎａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＭＴ０
（ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ），７０（ｇｒｏｕｐⅠ），１４０（ｇｒｏｕｐⅡ）ａｎｄ２１０μｇ／ｍＬ（ｇｒｏｕｐⅢ）．Ｔｈｅｃｅｌｓｏｆｅａｃｈｇｒｏｕｐｗｅｒｅｃｕｌ
ｔｕｒｅｄｉｎａｃｅｌｉｎｃｕｂａｔｏｒ（３７℃，５％ＣＯ２）．Ａｆｔｅｒ２０ｈ，ｔｈｅｃｅｌｓｏｆｅａｃｈｇｒｏｕｐｗｅｒｅｐｕｔｉｎｔｏｗａｔｅｒｂａｔｈｐｏｔ
（４３℃）ｆｏｒ１ｈ，ａｎｄｔｈｅｎｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎａｃｅｌｉｎｃｕｂａｔｏｒ（３７℃，５％ＣＯ２）ｆｏｒ３ｈ．Ｆｉｎａｌｙ，ｖａｒｉｏｕｓｉｎｄｅｘｅｓｗｅｒｅ
ｔｅｓｔｅｄｂｙｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙａｎｄＲＴ－ＰＣＲ．１）ＭＴａｄｄｅｄｉｎｃｅｌｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｒｅｄｕｃｅｄｔｈｅｄａｍａｇｅ
ｏｆｄａｉｒｙｃｏｗｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｕｎｄｅｒｈｅａｔｓｔｒｅｓｓ，ｂｕｔｔｈｅｅｆｆｅｃｔｄｅｃｒｅａｓｅｄｗｉｔｈａｎｉｎｃｒｅａｓｅｉｎＭＴｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．２）
ＴｈｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆＣＡＴ，ＳＯＤ，ＧＳＨＰｘｉｎｇｒｏｕｐｓⅠｔｏⅢ ｗｅｒｅｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐａｎｄｔｈｅ
ｃｏｎｔｅｎｔｏｆＭＤＡｗｅｒｅｌｏｗｅｒ．ＩｔｉｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔＭＴｃｏｕｌｄｉｍｐｒｏｖｅａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎｏｆｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．３）Ｔｈｅｒｅｌａ
ｔｉｖｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｌｅｖｅｌｓｏｆ犅犪狓ａｎｄ狆５０ｉｎｇｒｏｕｐⅠｔｏⅢ ｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（犘＜０．０１）ｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎｔｈｅ
ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｌｅｖｅｌｏｆ犅犮犾２ｉｎｇｒｏｕｐｓⅠｔｏⅢ ｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（犘＜０．０１）ｈｉｇｈｅｒ
ｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ．ＴｈｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＭＴｃｏｕｌｄｒｅｇｕｌａｔｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｇｅｎｅｓｒｅｌａｔｅｄｔｏｌｙｍ
ｐｈｏｃｙｔｅａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｉｎｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ，ｅｘｏｇｅｎｏｕｓＭＴｄｅｃｒｅａｓｅｄｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｍｏｒｔａｌｉｔｙｒａｔｅ，ｉｍｐｒｏｖｅｄｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ
ｉｎｏｘｉｄｉｚａｂｉｌｉｔｙａｎｄｒｅｓｔｒａｉｎｅｄｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅａｐｏｐｔｏｓｉｓ．ＴｈｅｂｅｓｔｆｉｎａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＭＴｗａｓ７０μｇ／ｍＬ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｍｅｔａｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ（ＭＴ）；ｈｅａｔｓｔｒｅｓｓ；ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅａｐｏｐｔｏｓｉｓ；ｃｅｌｃｕｌｔｕｒｅ；ｄａｉｒｙｃｏｗ
３２２第２３卷第３期 草业学报２０１４年