全 文 ：第 34 卷第 12 期
2010 年 12 月
水 产 学 报
JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA
Vol． 34，No． 12
Dec．，2010
文章编号:1000 － 0615(2010)12 － 1844 － 09 DOI:10． 3724 /SP． J． 1231． 2010． 07027
收稿日期:2010 07 11 修回日期:2010 09 24
资助项目:国家“十一五”科技支撑计划重大项目(2006BAD09A01) ;江苏省海洋生物技术重点实验室开放课题(2008HS004)
通讯作者:阎斌伦，E-mail:yanbinlun@ yahoo． com． cn
条斑紫菜 HSP90 基因的克隆与表达分析
周向红1，2， 李信书1，2， 王 萍2， 阎斌伦1* ， 滕亚娟2， 易乐飞1，2
(1．淮海工学院江苏省海洋生物技术重点实验室，江苏 连云港 222005;
2．淮海工学院海洋学院，江苏 连云港 222005)
摘要:为了研究 HSP90 在条斑紫菜胁迫耐受中的作用，克隆了条斑紫菜 HSP90 基因(命名为
PyHSP90)，采用定量 RT-PCR研究了其表达规律。PyHSP90 基因包含一个长 2 274 nt 的完整
开放阅读框，编码 757 个氨基酸。PyHSP90 蛋白定位于细胞质中，具有 HSP90 蛋白家族的特
征序列和保守结构域，与多种生物的 HSP90 具有较高的序列一致性。在进化树上条斑紫菜等
红藻的 HSP90 与隐藻的亲缘关系最近，与绿藻和陆生植物亲缘关系较远。低温和高温胁迫都
能显著性地诱导条斑紫菜叶状体 PyHSP90 基因的表达，而且表达量与胁迫程度成正相关;低
盐胁迫下 PyHSP90 基因表达上调;而失水胁迫下 PyHSP90 基因表达下调。
关键词:条斑紫菜;热应激蛋白 90;克隆;表达;定量 PCR
中图分类号:S 917;Q 781;Q 786 文献标识码:A
热应激蛋白(heat shock protein，HSP)是一类
广泛分布于各类生物细胞内且高度保守的蛋
白［1］，按其分子量大小可分为 5 大类:HSP110，
HSP90，HSP70，HSP60 及小分子 HSP［2］。HSP 在
细胞正常代谢过程中负责蛋白的折叠、组装、转运
和降解，在胁迫状态下稳定蛋白和膜结构，并协助
蛋白再折叠，最终维持细胞稳态［2 － 3］。大量研究
表明，HSP参与了机体对温度、盐度、重金属、干旱
和病害等多种胁迫的耐受，起到了修复受损蛋白
和提高机体抗逆性等保护作用［4 － 6］。
HSP90 是 一 类 高 度 保 守 的 分 子 伴 侣
(molecular chaperone) ，在细胞内含量较丰富，占
蛋白总量的 1% ～ 2%［7］。在植物中，已知 HSP90
分布于细胞质、内质网和叶绿体中，也可能分布于
线粒体中［8 － 9］。HSP90 作用的大部分蛋白底物参
与了细胞周期和信号传导，因此 HSP90 对真核细
胞的生存至关重要［2，10 － 11］。HSP90 还能作为形态
进化和形态表型变异的缓冲器，确保了表型稳定
性［12 － 13］。目前已从鱼类［14］、贝类［15］和虾蟹类［16］
等多种海洋生物中克隆了 HSP90 基因并研究了
其在不同发育时期、不同组织或不同胁迫下的表
达差异与功能。但大型海藻 HSP90 基因的研究
报道较少，目前尚无条斑紫菜(Porphyra yezoensis
Udea)HSP90 基因(命名为 PyHSP90)克隆与表达
的相关报道。
条斑紫菜是红藻门(Rhodophyta) ，原红藻纲
(Protoflorideophyceae) ，红毛菜目(Bangiales) ，红
毛菜科(Bangiaceae) ，紫菜属(Porphyra)的大型海
藻，其营养丰富，味道鲜美，已成为我国重要的海
洋养殖种类及出口创汇商品。随着极端天气和环
境恶化愈演愈烈，由此产生的高温、低温、盐渍、干
旱和重金属等逆境因子严重制约了植物生长，影
响了农产品品质和产量［5，17］。条斑紫菜生长于潮
间带，随着潮汐变化，会周期性地经历干出与覆水
过程，其生长、品质和产量更容易受到上述胁迫影
响。因此非常有必要研究条斑紫菜的胁迫耐受机
制，以及 PyHSP90 在这个机制中的作用。
本文报道了 PyHSP90 基因的克隆、序列特征
及其在不同温度、盐度和失水胁迫下的 mRNA 表
达变化。有助于进一步解释条斑紫菜的抗逆分子
机理，对遗传改良和抗逆品系培育等具有一定
意义。
12 期 周向红，等:条斑紫菜 HSP90 基因的克隆与表达分析
1 材料与方法
1． 1 条斑紫菜样品采集及胁迫处理
条斑紫菜叶状体的小藻体(6 ～ 10 cm)于
2010 年 1 － 2 月从连云港海区的紫菜养殖场采
集，选取健康叶片暂养于改良的 ES 培养基［18］中;
模拟采集地区的海水环境，控制海水盐度为 25、
温度为 5 ℃、光照为 40 μmol photons /(m2·s)、光
周期为 12L∶ 12D，每天更换海水和营养盐。
将 5 ℃培养的叶状体分别转移到 0，5，10，
15，20，25 和 30 ℃的培养基中进行温度胁迫，处
理 2 h后取样。将 25 盐度培养的叶状体分别转
移到 5，15，25，35 和 45 盐度(对天然海水稀释获
得低盐度，蒸发获得高盐度)的培养基中进行盐
度胁迫，处理 2 h 后取样。失水胁迫处理前先计
算叶状体的含水率，然后将叶状体从海水中取出，
暴露于空气中，不定时称重，最后获得失水率为
20%，40%，60%和 80%的样品。
1． 2 总 RNA分离纯化
总 RNA 抽提参照 TRIzol 试剂(Invitrogen)说
明书进行。为了避免残留的微量基因组 DNA 影
响定量 PCR 结果的准确性，抽提后的总 RNA 按
DNase Ⅰ(Fermentas)说明书进行处理。核酸蛋
白定量仪(Bio-Rad)检测总 RNA 的纯度及浓度，
电泳检测总 RNA的完整性。
1． 3 条斑紫菜 HSP90 基因克隆与测序
按 RevertAidTM H Minus First Strand cDNA
Synthesis kit(Fermentas)说明书操作，合成第一链
cDNA。参照文献［19］中的方法对 PyHSP90 进行
了计算机辅助克隆，并据此设计和合成一对克隆用
引物，正 向 引 物 HSP90F:5 TCCCGCTGTGC-
TTCCTGT 3，反向引物 HSP90R:5 ACGACGCCC-
AAGCCTAAT 3。PCR反应在 25 μL 体系中进行，
体系中含有 1 × Dream Buffer(with 2 mmol /L
MgCl2) ，0． 2 mmol /L dNTP，0． 5 μmol /L 引物，2 U
Dream Taq 酶(Fermentas) ，1 μL 第一链 cDNA。
PCR循环为 96 ℃预变性 3 min;接着 30个循环，每
个循环中96 ℃变性30 s，52． 5 ℃退火30 s，72 ℃延
伸 2 min 35 s;最后 72 ℃充分延伸 5 min。PCR产
物直接进行正反双向测序。
1． 4 条斑紫菜 HSP90 基因及其编码产物的序列
分析
用 ORF Finder(http:∥www． ncbi． nlm． nih．
gov /gorf /gorf． html)分析 PyHSP90 基因的开放阅
读框，并获得编码蛋白(PyHSP90)的氨基酸序列。
PyHSP90 的基本理化特性分析、多序列比对和系
统进化树构建分别使用 ProtParam［20］、Clustal
W［21］和 MEGA4［22］。PyHSP90 的功能结构域使用
ScanProsite［23］和 CDD［24］进行分析，亚细胞定位使
用 PSORT［25］和 TargetP［26］进行分析。
1． 5 条斑紫菜 HSP90 基因表达的定量 RT-PCR
检测
根据 PyHSP90基因的测序结果设计并筛选出
1对优化的定量 PCR引物，正向引物 HSP90QF:5-
GAGGAGTCGGAGGAGGAGAAG-3，反 向 引 物
HSP90QR:5-CCAGGCGGTCAGACACAAC-3。本
文选用 18S rRNA作内参进行上样误差校正和标准
化。根据 GenBank 上条斑紫菜 18S rRNA 序列
(DQ666486)设计并筛选出 1对优化的定量 PCR引
物，正向引物:5-TGCCAGCACTGCGTTCTT-ACC-
3，反向引物:5-AGCCTTCCGACCCAGG-ACTATC-
3。所有引物由上海生工合成。
按 PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa)说明
书操作，以 Oligo(dT)和 Random 6 mers 为引物进
行反转录反应。实时荧光定量 PCR 反应在 IQ5
PCR仪(Bio-Rad)上进行。25 μL 的反应体系中
包含 12． 5 μL 2 × SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ
(TaKaRa)、0． 2 μmol /L引物和 2 μL反转录产物。
采用两步 PCR法进行扩增，即首先 95 ℃预变性 1
min，然后进入 40 个循环，每个循环中95 ℃变性
10 s，61． 5 ℃延伸 30 s，循环结束后，从 55 ℃缓慢
升温到 95 ℃，绘制熔解曲线。
以 10 ×系列稀释的 cDNA 为模板进行定量
PCR，制作 PyHSP90 和内参的标准曲线。每次反
应都设置阴性对照和无模板对照，每个反应设 3
个复孔。应用 Pfaffl［27］建立的数学模型进行相对
定量分析，结果采用均数 ±标准差表示。统计分
析采用 SPSS进行，各组数据都通过了正态性和方
差齐性检验，因此组间差异采用单因素方差分析，
组间多重比较采用 SNK(Student-Newman-Keuls)
检验，P ＜ 0． 05 表示差异显著。
2 结果与分析
2． 1 条斑紫菜 HSP90 基因克隆
来自 GenBank的 105 条条斑紫菜表达序列标
签(expressed sequence tag，EST)参与了 PyHSP90
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基因序列的组装，所有 EST 序列的长度范围介于
150 ～ 500 nt 之间，EST 拼接后得到了长 2 664 nt
的 contig。据此设计了一对克隆引物，预期扩增
产物大小为 2 527 bp。PCR 产物经电泳检测，仅
在稍大于 2 500 bp 的位置上有一特异性扩
增条带(图1) ，与预期大小相符。将PCR产物
图 1 条斑紫菜 HSP90 基因的 PCR扩增结果
M:200 bp DNA Marker;1:PyHSP90 的扩增产物。
Fig． 1 PCR amplification of HSP90 gene
from Porphyra yezoensis
M:200 bp DNA Marker; 1:PCR amplification product of
PyHSP90．
送上海生工进行正反双向测序，得到了 PyHSP90
基因的 cDNA序列(GU301885)。
2． 2 条斑紫菜HSP90基因与编码产物的序列分析
将 cDNA 序列与 contig 序列进行比对，结果
显示两者序列一致性(identity)高达 99． 8%，说明
计算机辅助克隆技术适合同源基因的快速克隆与
分析。PyHSP90 基因的 cDNA 序列包含一个长
2 274 nt 的开放阅读框。PyHSP90 分子量为 86
ku，长 757 个氨基酸，其碱性、酸性、疏水性和极性
氨基酸数量分别为 106、153、244 和 168 个，含量
最丰富的氨基酸是 Glu 和 Leu，含量最少的是
Trp、Cys和 His，理论等电点(pI)为 4． 81。
PSORT 和 TargetP 的 分 析 结 果 都 表 明
PyHSP90 不存在跨膜结构和信号肽，在细胞质内
合成后不进行蛋白转运，定位于细胞质中。结构
域分析显示 PyHSP90 在 47 ～ 56 位氨基酸处具有
HSP90 蛋白家族的特征序列 YSNKEIFLRE，49 ～
202 位氨基酸为 ATP 结合区，具有类 ATPase 活
性，205 ～ 757 位氨基酸为 HSP90 家族序列。
PyHSP90 的羧基最末端为MEDVD(图2) ，与细
图 2 HSP90 的多序列比对
来自条斑紫菜(PyHSP90)、莱茵衣藻(CrHSP90A1，XP _001695264)、拟南芥(AtHSP90A2，NP _200414)、水稻(OsHSP90A3，
BAD33406)、果蝇(DmHSP90A1，NP_523899)和人(HsHSP90AA1，NP_005339)的细胞质 HSP90 用 Clustal W构建了多序列比对。
Fig． 2 Multiple sequence alignment of HSP90
The alignment of HSP90 was performed with the Clustal W method． The source organisms for cytoplasmic HSP90 sequences one as follows:
Porphyra yezoensis(PyHSP90) ，Chlamydomonas reinhardtii(CrHSP90A1，XP_001695264) ，Arabidopsis thaliana(AtHSP90A2，NP_200414) ，
Oryza sativa (OsHSP90A3，BAD33406) ，Drosophila melanogaster(DmHSP90A1，NP _523899)and Homo sapiens (HsHSP90AA1，NP _
005339)．
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12 期 周向红，等:条斑紫菜 HSP90 基因的克隆与表达分析
胞质 HSP90 的 羧 基 最 末 端 的 保 守 基 序
(MEEVD)［28］不同，存在着 E － D 的保守替换。
MEEVD是细胞质 HSP90 区别于其他 HSP90 的特
征序列，容易被认为是亚细胞定位信号，但其主要
功能是通过与辅陪伴分子(cochaperone)的三十
四肽重复序列(tetratricopeptide repeat，TPR)基序
结合，参与 HSP90 的多聚化过程［11］。多聚化还涉
及到 HSP90 的其他序列，有些辅陪伴分子不需要
MEEVD 也能单独与 HSP90 结合［29］。在线虫
(Saccharomyces cerevisiae)中已经发现这个基序并
不是必需的［10］。因此 PyHSP90 的羧基最末端的
保守替换不会影响其亚细胞定位和功能，反而反
映出它在进化上的独特性。
按文献［8］的方法，可将 PyHSP90 分成 7 个
区域，分别是 3 个保守区和 4 个可变区(图 2，分
别标记为 conserved region Ⅰ ～ Ⅲ 和 variable
region A ～ D)。保守区Ⅰ和可变区 A构成了 N端
结构域，在 HSP90 中保守性强，参与了 ATP 的结
合和水解;保守区Ⅱ构成了中间结构域，参与了结
合 ATP、底物和辅陪伴分子;保守区Ⅲ和可变区 D
构成了 C 端结构域，参与了多聚化过程［11］。
PyHSP90 氨基酸序列明显比其他细胞质HSP90
图 3 不同生物 HSP90 的系统进化树
用最小进化法构建进化树，节点前数字表示自举支持率，HSP90 的命名系统参考 Chen等［8］的方法，GenBank索引号显示在括号中。
HSP90A(包括 HSP90AA和 HSP90AB)、HSP90B、HSP90C、TRAP和 HTPG分别表示细胞质、内质网、叶绿体、线粒体和细菌 HSP90。
Fig． 3 Phylogenetic tree of HSP90 family members
The phylogenetic tree was constructed with minimum evolution method． Numbers at each branch indicate the percentage of times a node was
supported in 1000 bootstrap pseudoreplications． Designated naming system of HSP90s referred to criteria of Chen et al［8］． Accession numbers
are shown in parentheses． HSP90A(including HSP90AA and HSP90AB) ，HSP90B，HSP90C，TRAP and HTPG stand for cytoplasmic，
endoplasmic reticulum，chloroplastic，mitochondrial and bacterial HSP90 respectively．
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要长，但这些长度差异主要位于可变区内，特别是
可变区 B。可变区 B除了连接 N端结构域和中间
结构域外，目前还未发现有何特殊功能［11］，因此
在进化过程中容易发生变化。
多序列比对(图 2，仅显示与模式动植物的比
对结果)显示 PyHSP90 与各种原核生物、植物和动
物的 HSP90具有较高的序列一致性，表明来自于
不同物种的 HSP90 具有高度的保守性。PyHSP90
与大肠杆菌(Escherichia coli)和无类囊体蓝藻
(Gloeobacter violaceus)等原核生物 HSP90 (即
HTPG)的序列一致性为 26． 0% ～39． 4%，与莱茵衣
藻(Chlamydomonas reinhardtii)等真核藻类的细胞
质 HSP90的序列一致性为 66． 5% ～ 71． 8%，与拟
南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oryza sativa)的
细胞质 HSP90 的序列一致性为 69． 0% ～ 69． 6%，
与果 蝇 (Drosophila melanogaster)和 人 (Homo
sapiens)等动物的细胞质 HSP90 序列一致性为 61．
4% ～65． 0%。
根据已有文献［8 － 9，30］的分析结果，选取多种
细菌、植物和动物的已知亚细胞定位的各种
HSP90，采用 MEGA4 程序构建了 HSP90 的系统
进化树(图 3)。在进化树上 HSP90 首先按不同
的亚细胞定位进行聚类，不论动物还是植物，所有
的细胞质 HSP90 聚为一簇，所有的内质网、叶绿
体和线粒体 HSP90 也都各自聚为一簇，另外细菌
的 HSP90 单独聚为一簇。PyHSP90 与细胞质
HSP90 聚类在一起，表明其属于细胞质 HSP90，这
与亚细胞定位的预测结果一致。在进化树上，条
斑紫菜与同属红藻门的 Cyanidioschyzon merolae
亲缘关系最近，首先聚类在一起，与隐藻的亲缘关
系次之，接着与绿藻、陆生植物和动物聚成一簇。
2． 3 条斑紫菜 HSP90 基因在胁迫下的表达变化
PyHSP90 和内参的扩增曲线基线平整、指数
区明显、斜率大且固定，熔解曲线上显示扩增产物
均为单一的特异峰，扩增效率为(100 ± 1)%，阴
性对照和无模板对照均无扩增，3 个复孔的重复
性好。表明扩增体系和反应条件良好，无引物二
聚体等非特异性扩增，定量准确。
定量 RT-PCR 结果显示温度、盐度和失水胁
迫对 PyHSP90 基因的相对表达量具有显著影响
(图 4)。温度胁迫下，PyHSP90 的表达量在 15 ℃
时最低，25 ℃时最高，且 25 ℃时的表达量是 15
℃下的 17． 81 倍;从 15 ℃向低温方向，PyHSP90
的表达量增加，且与 15 ℃下的表达量差异显著，0
℃时达到最大;从 15 ℃向高温方向，PyHSP90 的
表达量迅速增加，且也差异显著，25 ℃时表达量
迅速上升并达到最大，但 30 ℃时表达量急剧下
降，与 15 ℃下的表达量无明显差异(图 4-A)。高
盐(35 和 45)胁迫下，PyHSP90 表达量与 25 盐度
的没有显著性差异;但 5 和 15 低盐胁迫下，
PyHSP90 表达量上升，分别是 25 盐度表达量的
1． 60 倍和 1． 77 倍，且差异显著(图 4-B)。失水
(20% ～80%失水率)胁迫下，PyHSP90 的表达量
不同程度的降低，是不失水时表达量的 0． 39 ～
0． 52倍，且与之差异显著，但不同失水率间的表达
量无显著性差异(图 4-C)。
3 讨论
PyHSP90 在进化树上处于植物和动物之间，
与动植物的氨基酸序列一致性为 61． 4% ～
69． 6%，这种序列一致性明显低于植物间或动物
间的序列一致性(76． 6% ～ 90%) ，表明其与植物
和动物的亲缘关系都较远，这种现象在条斑紫菜
的泛素结合酶基因中也有发现［19］。Gupta［28］在比
对了植物、动物和真菌的各种 HSP90 后，提出在
HSP90 家族中存在 5 条特征性序列(图 2，标记为
signature sequence Ⅰ ～Ⅳ) ，大多数生物在这 5 条
序列上几乎完全相同［15 － 16］，仅有少数生物存在个
别氨基酸差异［31］，但是条斑紫菜在这 5 条特征序
列上与动植物存在明显差异，没有一条特征序列
是完全匹配的。PyHSP90 的羧基最末端基序与绝
大多数生物(包括绿藻)的不同，存在着 E － D 的
保守替换，类似现象在条斑紫菜 RNA聚合酶Ⅱ大
亚单位(largest subunit of RNA polymerase Ⅱ，
RPB1)上也有发现，其羧基端不具备动植物普遍
具有 的 羧 基 末 端 结 构 域 (carboxyl-terminal
domain)［32］。上述各种差异可能归咎于条斑紫菜
在进化上的特殊起源，即红藻的演化早于植物、动
物和真菌的共同祖先［32 － 33］，而且条斑紫菜是红藻
门中较原始的一类。
每种生物都有各自适宜的生活环境，当环境
条件超出适宜范围时，生物体就受到了来自环境
的胁迫，为了生存于这种胁迫环境，生物体必然会
产生相应的耐受机制。条斑紫菜生活在潮间带，
每天周期性地经历干出与覆水过程，在干出时面
临温度、盐度、失水、强光照和紫外线等多种非生
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12 期 周向红，等:条斑紫菜 HSP90 基因的克隆与表达分析
物胁迫。这些胁迫已经成为条斑紫菜生长过程中
的一种常态，表明其具备多种胁迫耐受机制。因
此本研究应用定量 RT-PCR技术分析了 PyHSP90
基因在温度、盐度和失水胁迫耐受过程中的作用。
图 4 条斑紫菜 HSP90 基因在胁迫下的相对表达量
采用实时定量 RT-PCR技术分析了 PyHSP90 基因在温度(A)、盐度(B)和失水(C)胁迫下的相对表达量。PyHSP90 基因的表达量
先用 18S rRNA内参进行归一，再与对照样品(即图中表达量设定为 1 的样品)比较，最后得到相对表达量。图中数据表示为平均值
±标准差(n = 3) ，柱形图上的不同字母表示差异的显著性(P ＜ 0． 05)。
Fig． 4 The relative mRNA expression levels of HSP90 gene in Porphyra yezoensis under different stresses
The relative expression levels of PyHSP90 gene in response to temperature(A) ，salinity(B)and desiccation(C)stress were analyzed using
real-time RT-PCR． The relative mRNA levels of the PyHSP90 gene were normalized with the amount of 18S rRNA and given as relative fold
abundance compared to sample whose relative expression level was set to 1． Error bars indicate the mean and standard deviation(n = 3)．
Different letters above each bar indicate statistical difference(P ＜ 0． 05)．
HSP的发现与命名已经反映出其主要功能之
一是参与温度胁迫的耐受，即在热激环境下 HSP
表达上调，参与稳定蛋白和膜结构，并最终维持细
胞稳态［2 － 3］。本文的定量结果也表明 PyHSP90
基因表达受到温度胁迫的显著影响。PyHSP90 基
因在 15 ℃时表达量最低，表明条斑紫菜叶状体的
小藻体要求的生长温度相对较高。这一结果与前
人研究结果一致，即不同大小的条斑紫菜叶状体
具有不同的适宜生长温度，藻体越小要求的温度
越高，反之越低［34］。高温胁迫时，PyHSP90 基因
的表达急剧上升，而且表达量与胁迫程度成正相
关，即 PyHSP90 基因在 25 和 20 ℃的表达量分别
是 15 ℃的 17． 81 和 2． 06 倍，且差异显著。但当
环境温度到达 30 ℃时，PyHSP90 基因的表达量却
急剧下降，可能是 30 ℃热激超出了机体的保护能
力，导致 PyHSP90 基因无法继续转录。低温胁迫
时，PyHSP90 基因表达也上调，而且温度越低表达
量越高，0 ℃时表达量最高，是15 ℃的 2． 33 倍。
相对于温度胁迫下的剧烈变化，在其它胁迫
下 PyHSP90 基因表达变化相对温和。在 5 和 15
低盐度胁迫下，PyHSP90 基因表达上调，分别是
25 盐度下的 1． 60 和 1． 77 倍;在 45 高盐度胁迫
下，PyHSP90 基因表达几乎没有变化，是 25 盐度
下的 1． 04 倍。在失水(失水 20% ～ 80%)胁迫
下，PyHSP90 基因表达下调，是失水前的 0． 39 ～
0． 52 倍。上述结果表明条斑紫菜可能存在其它
的胁迫耐受机制，因而对 PyHSP90 的依赖性减
弱。已有研究结果表明，潮间带海藻在短期盐度
胁迫时，通过一个迅速且低能耗的过程，对盐离子
进行选择性吸收和排出或在液泡中积累起来，以
缓解离子胁迫;在长期盐度胁迫时，通过一个缓慢
且耗能的过程，在细胞内合成、积累或降解有机渗
透物质，以缓解渗透胁迫［35］。失水胁迫下，条斑
紫菜细胞膜上富含的红藻糖苷和多不饱和脂肪酸
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可以维持细胞膜的液态，细胞质内形成氢键框架
(hydrogen bonding framework)以降低分子运动来
抵御失水胁迫［36］。
既然温度、盐度和失水都会对条斑紫菜产生
胁迫，那么是什么原因使 PyHSP90 基因在温度胁
迫下剧烈表达，而在盐度和失水胁迫下仅表现出
少量上调或者无变化、甚至下调呢?乳糖操纵子
(Lac operon)模型也许能给我们启示，当葡萄糖和
乳糖同时出现在培养基时，大肠杆菌优先利用葡
萄糖，因为代谢葡萄糖是最经济、最有效的，而代
谢乳糖需要重新合成乳糖代谢的相关酶类，需要
消耗额外能量［37］。也就是说任何生物体都是一
个经济的个体，不会有能量浪费。因此我们推测，
条斑紫菜首先调用最经济、最具针对性的耐受机
制来对抗胁迫，当胁迫强度超出这些机制的耐受
范围时，藻体再调用 PyHSP90 等其它分子来稳定
胁迫下的蛋白和膜结构，因为 PyHSP90 的转录和
翻译是一个极耗能的过程。那么可以预测当条斑
紫菜遭受更高盐度胁迫时，PyHSP90 基因的表达
可能会出现上调。
PyHSP90 基因的克隆采用了计算机辅助克隆
技术，与传统基因克隆方法相比，该技术更为快
速、简便、精确且目的性强［19］。基因的表达分析
采用了实时荧光定量 PCR 技术，与 Northern 印
迹、原位杂交、RNase 保护分析和半定量 RT-PCR
等定量技术相比，该技术将特异且灵敏的 PCR 技
术与 PCR产物荧光检测技术相结合，避免了凝胶
电泳、转膜、放射性探针杂交和胶片显影等操作的
局限性，是核酸检测和定量最准确和灵敏的
方法［38］。
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水 产 学 报 34 卷
Molecular cloning and expression analysis of HSP90 gene from
Porphyra yezoensis Ueda(Bangiales，Rhodophyta)
ZHOU Xiang-hong1，2，LI Xin-shu1，2，WANG Ping2，YAN Bin-lun1* ，TENG Ya-juan2，YI Le-fei1，2
(1． Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology，Huaihai Institute of Technology，Lianyungang 222005，China;
2． School of Marine Science ＆ Technology，Huaihai Institute of Technology，Lianyungang 222005，China)
Abstract:The 90-ku heat shock proteins(HSP90s)are a group of evolutionarily highly conservative molecular
chaperones and essential for viability in eukaryotes． The basic functions of HSP90s are of assisting protein
folding，protein degradation and protein trafficking，and they also play an important role in signal transduction
networks，cell cycle control and morphological evolution． Although HSP90s are constitutively expressed in most
organisms，their expression is up-regulated in response to stresses such as cold，heat，salt stress，heavy metals，
phytohormones，light and dark transitions． Porphyra yezoensis Ueda，one of intertidal macroalgae，periodically
experiences immersion and emersion due to the tidal cycles． When P． yezoensis thalli are exposed to air，they
experience a variety of abiotic stresses such as nutrient limitation，high light，ultraviolet ray，high and low
temperature，desiccation and osmotic stress． In order to investigate the contribution of HSP90 to abiotic stresses
tolerance in P． yezoensis thalli，molecular cloning and expression analysis of HSP90 gene(designated as
PyHSP90)from P． yezoensis were performed． PyHSP90 gene was obtained with computer assisted cloning，and
characterized using multiple bioinformatic programs． The relative mRNA expression levels of PyHSP90 gene
under stresses were investigated in P． yezoensis thalli using real-time RT-PCR． The PyHSP90 cDNA contained a
2 274 nt of continuous complete open reading frame encoding a polypeptide of 757 amino acids with a
calculated molecular mass of 86 ku． Analytic results of PSORT，TargetP and phylogenetic tree showed that
PyHSP90 localized to cytoplasm． PyHSP90 contained conserved signature motifs and domains of HSP90 family．
PyHSP90 shared high amino acid sequence identity with HSP90s from other organisms． Sequence comparison of
PyHSP90 revealed 26． 0% － 39． 4% and 61． 4% － 71． 8% identity with prokaryotic and eukaryotic HSP90s
respectively． In the phylogenetic tree red algae HSP90s，including PyHSP90，clustered with Cryptophyta
HSP90s firstly，and then clustered with HSP90s of green algae and land plants，and at last all cytoplasmic
HSP90s of algae，plants and animals were clustered together． Low and high temperature stresses significantly
induced the expression of PyHSP90 gene in P． yezoensis thalli，and there was a clear dose-dependent expression
pattern of PyHSP90 gene after different temperature exposure． The expression of PyHSP90 gene was up-
regulated under low salinity stress，and down-regulated under desiccation stress． The results indicated that
PyHSP90 is essential to hold configuration of proteins under temperature and salinity stresses，and dispensable
under desiccation stress． Investigation of PyHSP90 gene can contribute to its molecular mechanism of tolerance
to abiotic stresses，and lay a foundation for further enhancing resilience of P． yezoensis through genetic
improvement．
Key words:Porphyra yezoensis Ueda;heat shock protein 90(HSP90) ;cloning;expression;real-time PCR
Corresponding author:YAN Bin-lun． E-mail:yanbinlun@ yahoo． com． cn
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