全 文 ：书两种策略分别克隆紫花苜蓿光敏色素犃、犅基因
李平１，杨玲玲１，陈其新１，史莹华１，严学兵１，陈占宽２，王成章１
（１．河南农业大学牧医工程学院，河南 郑州４５０００２；２．河南省农作物新品种重点实验室，河南 郑州４５０００１）
摘要：短日照是苜蓿秋眠性的主要影响因子，故苜蓿秋眠被认为是一种光周期反应。光敏色素是光周期反应的主
要受体，因而探究光敏色素与苜蓿秋眠性之间的关系可能是揭示苜蓿秋眠性机理的有效途径之一。紫花苜蓿光敏
色素Ａ、Ｂ基因尚未被克隆，本研究采用２种不同的试验策略，分别以ｍＲＮＡ和基因组ＤＮＡ为起点，根据比较基因
组学原理和生物信息学方法，利用ＲＡＣＥ和染色体步移等手段，克隆得到了紫花苜蓿光敏色素Ａ 全长和光敏色素
Ｂ近全长基因序列，为进一步探讨两者在苜蓿生长发育，特别是苜蓿秋眠性的光周期调控机制中的作用奠定了基
础，并为克隆紫花苜蓿其他未知基因等研究提供思路和参考。
关键词：紫花苜蓿；蒺藜苜蓿；光敏色素；基因克隆；ＲＡＣＥ；染色体步移
中图分类号：Ｓ８１６；Ｓ５４１＋．１０３　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１１）０６００８５０８
 　 紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）是世界公认的一种多年生优质豆科牧草，被誉为“牧草之王”［１］，其在我国草产
业中的重要性日益凸现［２］，苜蓿产业也正逐步发展成为我国农业领域的新兴产业［３］。苜蓿的秋眠性（ｆａｌｄｏｒ
ｍａｎｃｙ，ＦＤ）是苜蓿在秋季日照长度变短和气温下降时的一种适应性生长特性［４，５］。研究表明，苜蓿的秋眠性与
抗寒性［６，７］、生产性能［８１２］等相关，因此，很多国家都将其作为苜蓿栽培选择品种时的首要指标［７］，也成为苜蓿研
究中的热点和重要参考性状［１３，１４］。尽管对苜蓿秋眠性的机理尚存争议，但目前被广泛接受的观点为苜蓿秋眠是
一种光周期反应（ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄｒｅｓｐｏｎｓｅ）［４，５，７］，不同秋眠型苜蓿品种对光周期反应的差异与它们原产地生长季节
的自然日照长度有很大关系，是植物对环境条件长期适应的结果。因此，从光周期角度研究光受体与苜蓿秋眠性
的关系可能是揭示苜蓿秋眠性机理的有效途径之一。
植物接收光周期信号主要是通过光受体（ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ）来实现的。通过光受体，光才能与植物内源的发育
程序相互作用，调节相关基因的表达［１５］。目前，已知至少存在４类感受不同波长的光受体：光敏色素（ｐｈｙｔｏｃｈｒｏ
ｍｅ，ＰＨＹ），主要感受红光（６２０～７００ｎｍ）和远红光（７００～８００ｎｍ）；隐花色素（ｃｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅ，ＣＲＹ）和向光素
（ｐｈｏｔｏｔｒｏｐｉｎ，ＰＨＯＴ，也称作ＮＰＨ１），感受蓝光（３８０～５００ｎｍ）和近紫外光 （ＵＶＡ，３２０～３８０ｎｍ）；一个或几个
尚未鉴定的紫外光Ｂ（ＵＶＢ）受体，感受紫外光Ｂ区域（２８０～３２０ｎｍ）的光［１６］。光敏色素是植物体内最重要也是
目前研究最为深入的一类光受体［１７］，它们的发现被认为是植物光形态建成研究的里程碑［１８］。光敏色素是一个较
为复杂的基因家族，拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）ＰＨＹ家族至少包括５个执行不同生理功能的成员（犘犎犢犃，
犘犎犢犅，犘犎犢犆，犘犎犢犇，犘犎犢犈），其中尤以犘犎犢犃、犘犎犢犅研究最为深入［１９］。
采用酶联免疫测定法（ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）研究了３个不同秋眠型苜蓿品种在８，
１２和１６ｈ光照条件下叶片和顶芽中的犘犎犢犅含量。结果表明，３个品种均是在８ｈ光照下犘犎犢犅合成量高，而
且秋眠型比非秋眠型苜蓿叶片中犘犎犢犅含量高。由此推测，犘犎犢犅作为绿色植物主要光受体，可能通过光周期
（短日照）参与苜蓿秋眠的调控［２０，２１］。另外，犘犎犢犃也是一种重要的光敏色素，已有研究证实犘犎犢犃与犘犎犢犅
共同参与了植物的多种生理反应［２２２４］，因此，推测犘犎犢犃也可能参与苜蓿秋眠的调控。
利用模式物种已知基因信息资源克隆近缘物种未知基因是一种常用而且高效的方法。紫花苜蓿虽是非常重
要的豆科牧草，但其已经测定的基因资源却非常有限。幸运的是，与紫花苜蓿同属的蒺藜苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狋狉狌狀
犮犪狋狌犾犪）是一种即将完成全基因组序列测定的豆科模式植物，具有大量的基因信息资源（ｗｗｗ．ｍｅｄｉｃａｇｏ．ｏｒｇ），两
第２０卷　第６期
Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．６
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
８５－９２
２０１１年１２月
 收稿日期：２０１００８２４；改回日期：２０１０１２０５
基金项目：国家牧草产业技术体系（ＣＡＲＳ３５）和国家十二五科技支撑计划项目（２０１１ＢＡＤ１７８０４）资助。
作者简介：李平（１９８０），男，河南民权人，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ａｌａｌｉｐｉｎｇ＠ｑｑ．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｃｈｅｎｇｚｈａｎｇ＠２６３．ｎｅｔ
者具有非常近的亲缘关系［比其他豆科模式物种如豌豆（犘犻狊狌犿狊犪狋犻狏狌犿）、百脉根（犔狅狋狌狊犮狅狉狀犻犮狌犾犪狋狌狊）、大豆
（犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓）亲缘关系更近］，两者二倍体的染色体数相同且基因具有高度的共线性，基因组具有非常高的同源
性［２５２８］，例如几丁质酶基因在氨基酸水平同源性达到９８％［２９］。因此，对于欲研究的未知紫花苜蓿基因，可以通过
预测或查找蒺藜苜蓿相关基因，然后将其近似假定为未知的紫花苜蓿基因和最重要参考序列，再以之作为模板设
计引物进行ＰＣＲ反应，从而直接克隆得到紫花苜蓿基因序列。这种策略将“未知基因”变成“已知基因（近似基
因）”，引物为特异引物而非简并引物，仅需普通ＰＣＲ反应即可得到基因部分或全长序列，因而将是克隆紫花苜蓿
未知基因的一条捷径。
目前，紫花苜蓿的犘犎犢犃和犘犎犢犅 基因都尚未被克隆。本研究采用２种不同的策略对紫花苜蓿犘犎犢犃和
犘犎犢犅基因进行了克隆。其中，犘犎犢犃采用较为常用的方法，以ｍＲＮＡ为起点，运用反转录－聚合酶链式反应
（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＲＴ－ＰＣＲ）和ｃＤＮＡ末端快速扩增（ｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤ
ＮＡｅｎｄｓ，ＲＡＣＥ）获得犘犎犢犃ｃＤＮＡ主体序列，辅以染色体步移法获得犘犎犢犃５′端序列；犘犎犢犅则根据比较基
因组学和生物信息学的有关原理，首先预测蒺藜苜蓿犘犎犢犅基因，然后以预测的蒺藜苜蓿犘犎犢犅基因序列设计
引物直接扩增得到紫花苜蓿犘犎犢犅 基因主体序列，再使用染色体步移法得到该基因的５′端序列。本研究最终获
得犘犎犢犃的ｃＤＮＡ基因全长和犘犎犢犅基因的近全长序列，为进一步利用分子生物学手段探究这２种光敏色素
基因在苜蓿秋眠性调控机制中的作用奠定了基础。
１　材料与方法
１．１　材料
１．１．１　试验材料　２００７年７月，将紫花苜蓿品种 ＷＬ５２５ＨＱ盆栽于实验室，根据试验需要随时摘取其茎端叶
片提取总ＲＮＡ和基因组ＤＮＡ。
１．１．２　主要试剂　快捷型植物基因组 ＤＮＡ 提取系统（目录号：ＤＰ３２１）、ＤＮＡ 凝胶回收试剂盒（目录号：
ＤＰ２０９）、质粒抽提纯化试剂盒等购自天根生化科技（北京）有限公司；总ＲＮＡ提取试剂（ＲＮＡｉｓｏＰｌｕｓ，目录号：
Ｄ９１０８Ａ）、反转录试剂盒（目录号：ＤＲＲ０２３）、３′ＦｕｌＲＡＣＥＣｏｒｅＳｅｔＶｅｒ．２．０试剂盒、５′ＦｕｌＲＡＣＥＫｉｔ试剂
盒、染色体步移试剂盒（ｇｅｎｏｍｅｗａｌｋｉｎｇｋｉｔ，目录号：Ｄ３１６）、ＬＡＴａｑ（目录号：ＤＲＲ０２）、ｐＭＤ１９Ｔ载体（目录号：
Ｄ１０２）、感受态细胞ＪＭ１０９（目录号：Ｄ９０５２）、ＤＮＡＭａｒｋｅｒ等购自宝生物工程（大连）有限公司；ＰＣＲ引物合成和
测序主要由北京三博远志技术服务有限责任公司和宝生物工程（大连）有限公司完成。
１．１．３　引物设计　参考ＧｅｎＢａｎｋ中发表的有关基因序列，使用Ｏｌｉｇｏ（Ｖｅｒｓｉｏｎ６．５４）软件设计引物。
１．２　ＲＮＡ和ＤＮＡ的提取
１．２．１　植物总ＲＮＡ的提取　将约２５ｍｇ新鲜的紫花苜蓿茎顶端叶片迅速转移至用液氮预冷的研钵中研磨至
粉状，按照ＲＮＡ提取试剂盒（Ｔａｋａｒａ，ＲＮＡｉｓｏＰｌｕｓ）的操作说明提取总ＲＮＡ。
１．２．２　植物基因组ＤＮＡ的提取　取紫花苜蓿茎顶端新鲜叶片约１００ｍｇ在液氮中研磨至粉状，之后按试剂盒
（天根快捷型植物基因组ＤＮＡ提取系统）说明书进行操作。
１．３　紫花苜蓿犘犎犢犃基因的克隆
１．３．１　紫花苜蓿犘犎犢犃ｍＲＮＡ基因片段的克隆　因为目前尚无有关紫花苜蓿犘犎犢犃基因序列的报道，因而，
本研究根据ＧｅｎＢａｎｋ已发表的与苜蓿亲缘关系较近的其他豆科植物（主要参考大豆和豌豆）的犘犎犢犃基因序列
的保守区域设计１对ＰＣＲ引物，序列为，Ｆ１：ＴＴＧＧＧＧＴＴＴＧＧＴＡＧＴＴＴＧＣＣＡＴ；Ｒ１：ＡＧＣＣＴＴＧＡＡＴＧＡＴ
ＧＡＴＣＴＴＧＧＡＴＧＣ。反转录用Ｒａｎｄｏｍ９ｍｅｒｓ作引物，反应条件：６５℃１ｍｉｎ，３０℃５ｍｉｎ，２５ｍｉｎ匀速升温至
６５℃，然后６５℃２０ｍｉｎ，９８℃５ｍｉｎ，５℃５ｍｉｎ。ＰＣＲ扩增按照９４℃５ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，６０℃３０ｓ，７２℃４５ｓ，３０
个循环；７２℃５ｍｉｎ进行。对扩增产物先进行琼脂糖凝胶电泳检测，然后用凝胶纯化回收试剂盒回收预期的目的
ＤＮＡ片段，委托北京三博远志技术服务有限责任公司进行测序。
１．３．２　紫花苜蓿犘犎犢犃３′ＲＡＣＥ　采用３′ＦｕｌＲＡＣＥＣｏｒｅＳｅｔＶｅｒ．２．０试剂盒。根据获得的犘犎犢犃基因片
段序列，设计３′ＲＡＣＥ套式ＰＣＲ特异性引物，Ｏｕｔｅｒ和Ｉｎｎｅｒ引物序列分别为：３ＯＴＧＴＧＣＧＡＴＡＴＧＣＴＧＡＴ
ＧＣＧＡＧＡＴ，３ＩＡＧＡＴＡＡＧＡＧＡＧＡＴＡＧＣＴＴＴＡＴＧＧＡＴＧＴＣＣＧＡＧ。具体操作基本按照试剂盒说明书进行，
６８ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．６
其中，反转录体系为１０μＬ，反应条件为４２℃６０ｍｉｎ，７０℃１５ｍｉｎ；套式ＰＣＲＯｕｔｅｒ反应条件为：９４℃３ｍｉｎ；
９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，３０个循环；７２℃１０ｍｉｎ。之后取ＯｕｔｅｒＰＣＲ产物１μＬ作为模板进行Ｉｎｎｅｒ反
应，条件为：９４℃３ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，３０个循环；７２℃１０ｍｉｎ。扩增产物经１％琼脂糖凝胶电
泳分离后，割胶回收目的片段，再进行连接、转化、克隆和测序。
１．３．３　紫花苜蓿犘犎犢犃５′ＲＡＣＥ　采用５′ＦｕｌＲＡＣＥＫｉｔ试剂盒。根据获得的犘犎犢犃 基因片段序列，设计５′
ＲＡＣＥ套式ＰＣＲ特异性引物，Ｏｕｔｅｒ和Ｉｎｎｅｒ引物序列分别为：５ＯＡＣＡＧＣＴＧＣＣＡＴＴＣＣＡＣＡＴＡＣＡＧＴ，５Ｉ
ＣＧＴＣＧＡＴＣＣＴＡＡＴＡＴＣＣＡＴＡＡＣＴＴＧ。按照试剂盒说明书进行操作。主要步骤包括去磷酸化处理、“去帽
子”反应、５′ＲＡＣＥＡｄａｐｔｏｒ的连接、反转录反应、ＯｕｔｅｒＰＣＲ反应和ＩｎｎｅｒＰＣＲ反应。其中ＯｕｔｅｒＰＣＲ反应条件
为：９４℃３ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃１５０ｓ，２０个循环；７２℃１０ｍｉｎ。ＩｎｎｅｒＰＣＲ反应条件为：９４℃３ｍｉｎ；
９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃１５０ｓ，２５个循环；７２℃１０ｍｉｎ。扩增产物进行电泳分离、回收、连接、转化、克隆和测
序。
１．３．４　紫花苜蓿犘犎犢犃５′端染色体步移　将以上克隆得到的３个犘犎犢犃序列片段，通过拼接和分析比对后发
现５′ＲＡＣＥ并未得到５′端ｃＤＮＡ全长，而是缺失了约３６７ｂｐ的编码（ｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＣＤＳ）序列，重复１次试验
后仍未得到理想结果，于是改用染色体步移法获得５′端缺失的ＣＤＳ序列。引物设计模板为上述克隆拼接得到的
ｃＤＮＡ序列，第１，２，３轮特异引物分别为Ａ５３ＣＡＣＴＡＴＣＴＣＣＡＴＣＴＴＣＡＴＣＧＣＴＧＴＣ、Ａ５２ＧＧＧＡＡＴＡＴＣＴ
ＧＴＧＧＣＣＧＧＡＴＡＧＴＧ和Ａ５１ＣＧＧＴＡＡＣＡＣＧＧＴＧＡＡＴＡＡＴＣＧＣＡＴ。具体操作按照染色体步移试剂盒（ｇｅ
ｎｏｍｅｗａｌｋｉｎｇｋｉｔ）说明书进行，其中，以 ＷＬ５２５ＨＱ基因组ＤＮＡ为模板，以试剂盒提供的ＡＰ引物１，２，３，４作
为上游引物分别与３轮特异引物进行ＰＣＲ反应，延伸时间为２ｍｉｎ。３轮反应后，扩增产物经１％琼脂糖凝胶电
泳分析，将效果最好（条带亮、单一）的ＡＰ引物１与Ａ５１引物组合的第３轮ＰＣＲ产物分离、克隆和测序。
１．４　紫花苜蓿犘犎犢犅基因的克隆
通过预测与紫花苜蓿同属的蒺藜苜蓿的犘犎犢犅基因，然后以其为参考序列，设计引物进行ＰＣＲ反应，从而
直接克隆得到紫花苜蓿犘犎犢犅基因序列。
１．４．１　蒺藜苜蓿犘犎犢犅基因预测　在通过与几种近缘物种已测序犘犎犢犅基因的反复比对及在ＧｅｎＢａｎｋ非冗
余核苷酸数据库中使用Ｂｌａｓｔｎ搜索后，发现在登录号为ＡＣ１５２１８５的蒺藜苜蓿细菌人工染色体（ｂａｃｔｅｒｉａｌａｒｔｉｆｉ
ｃｉａｌｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ＢＡＣ）克隆测序结果中，在第２５５５１～３２００７位碱基，有１段长度为６４５７ｂｐ的序列，注释为
“ＧＡＦ；ｈｅａｖｙｍｅｔａｌｓｅｎｓｏｒｋｉｎａｓｅ”基因（尚无中文翻译，可暂译为“重金属感受器激酶”），编码蛋白登录号为：
ＡＢＮ０７９５６．１，全长１１５２个氨基酸。经查，光敏色素基因中包含ＧＡＦ区（ＧＡＦｄｏｍａｉｎ）。这段序列与豌豆、大豆
和百脉根的犘犎犢犅基因高度相似且长度、结构都非常吻合，将此段序列通过Ｂｌａｓｔｘ比对后，推测该段序列极可
能为蒺藜苜蓿的犘犎犢犅基因，而并非注释的 “ＧＡＦ；ｈｅａｖｙｍｅｔａｌｓｅｎｓｏｒｋｉｎａｓｅ”基因（尽管光敏色素中包含ＧＡＦ
区，但并不能用ＧＡＦ代表整个基因），经与其他物种犘犎犢犅基因序列比对分析后可知该序列方向与ｍＲＮＡ序列
相反，应为ｍＲＮＡ序列的反向互补序列。为进一步验证其可靠性，将该序列用ＦＡＳＴＡＰｒｏｔｅｉｎ程序（ｈｔｔｐ：／／
ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｆａｓｔａ３３／）进行比对，得到与Ｂｌａｓｔｐ非常近似的结果，即：该段序列所编码的氨基酸序列
与以下几种植物的犘犎犢犅相似性很高，由高到低依次为：豌豆（９３％）、百脉根（８８％）、大豆（８７％）和葡萄（犞犻狋犻狊
狏犻狀犻犳犲狉犪）（８０％）（后略），由注释信息可知，该基因由４个外显子和３个内含子组成。为进一步验证该基因注释
的外显子与内含子边界的正确性，采取了３种验证方式：１）通过 ＧＥＮＳＣＡＮ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｓ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ＧＥＮ
ＳＣＡＮ．ｈｔｍｌ）在线服务分析，Ｏｒｇａｎｉｓｍ选择“拟南芥”（玉米预测效果较差），对比发现前３个外显子与“ＧＡＦ；
ｈｅａｖｙｍｅｔａｌｓｅｎｓｏｒｋｉｎａｓｅ”注释相一致，而最后１个外显子不符。２）对后段ＧＥＮＳＣＡＮ预测不准区域通过氨基
酸序列ｔＢｌａｓｔｎ查找最后１个外显子在核苷酸序列中相应的位置。３）应用ＧＴＡＧ规则对整个基因的外显子－
内含子边界进行验证。通过验证，认为在ＧｅｎＢａｎｋ中登录号为 ＡＣ１５２１８５、名为“ＧＡＦ；ｈｅａｖｙｍｅｔａｌｓｅｎｓｏｒｋｉ
ｎａｓｅ”的基因，实际上应为犘犎犢犅基因，而其关于基因长度及内含子、外显子边界等相关注释是可信的，于是得到
预测的蒺藜苜蓿犘犎犢犅基因的ＣＤＳ（３４５９ｂｐ）和包含了内含子的基因组序列（６４５７ｂｐ）。
７８第２０卷第６期 草业学报２０１１年
１．４．２　紫花苜蓿犘犎犢犅基因主体序列的克隆　直接以预测的蒺藜苜蓿犘犎犢犅基因ＣＤＳ序列为模板，设计了２
对能部分重叠的ＰＣＲ引物（因基因较长，采用分段克隆再拼接的策略），分别为：ＬＵ１ＣＣＴＧＡＡＣＡＡＣＡＧＡＴ
ＣＡＣＴＧＣＴＴＡＣ、１７ＵＣＡＡＧＣＡＣＣＴＣＴＴＣＴＣＣＣＡＣＣ和 ＨＵ１ＴＴＣＡＧＴＴＡＧＣＣＧＣＡＣＡＧＴＣＧＴＴ 与 ＨＬ２
ＣＴＴＣＴＣＣＧＣＧＴＣＡＣＡＧＧＴＡＧＴＴＣ。基因组ＤＮＡ提取见１．２．２（下同）。ＬＵ１与１７Ｕ组合的ＰＣＲ反应条件
为：９４℃３ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃９０ｓ，３５个循环；７２℃５ｍｉｎ。ＨＵ１与 ＨＬ２组合的ＰＣＲ反应条件为：
９４℃１ｍｉｎ；９８℃１０ｓ，６８℃６ｍｉｎ，３０个循环；７２℃１０ｍｉｎ。目的产物分别进行克隆和测序。
１．４．３　紫花苜蓿犘犎犢犅５′端染色体步移　通过对上述１．４．２中获得的序列进行拼接，得到了紫花苜蓿犘犎犢犅
的主体序列，３′端与预测的蒺藜苜蓿犘犎犢犅相差仅１９ｂｐ，而５′端相差约３００ｂｐ，为给下游试验提供尽量长的序
列信息和获得可能的犘犎犢犅启动子序列，使用染色体步移法对犘犎犢犅５′端序列进行克隆。引物设计模板为上
述１．４．２中克隆拼接得到的ＣＤＳ序列，第１，２，３轮特异引物分别为Ｂ５２ＴＧＡＣＡＡＣＣＡＴＧＡＧＧＡＧＣＡＣＧＡＡＧＣＧ、
Ｂ５３ＡＡＣＣＴＣＧＡＣＧＣＣＴＧＣＧＧＴＡＴＡＴＣＡＧＴ 和 Ｂ５４ＣＣＣＡＴＡＴＡＣＧＧＣＴＣＣＡＡＡＴＣＡＡＴＣ。其余操作同
１．３．４，将效果最好的ＡＰ４引物第３轮ＰＣＲ产物克隆和测序。
２　结果与分析
２．１　获得紫花苜蓿犘犎犢犃 基因ｃＤＮＡ全长序列
使用引物Ｆ１和Ｒ１进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增得到与预期扩增长度相符的约５７０ｂｐ的ｃＤＮＡ 片段（图１）。测序
后获得了长度为５４９ｂｐ的ｃＤＮＡ片段，Ｂｌａｓｔ比对结果证实这个ｃＤＮＡ片段与其他已克隆的犘犎犢犃基因具有
很高的相似性，说明是犘犎犢犃基因片段的序列。根据此片段设计特异引物３Ｏ和３Ｉ、５Ｏ和５Ｉ，用ＲＡＣＥ技术扩
增到此基因的５′和３′末端序列（图２和３）。将这３个片段的序列进行拼接，得到长度为３１３０ｂｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登录
号为ＧＱ３７９９０５）的犘犎犢犃基因序列。而后，使用染色体步移法克隆得到了１２６０ｂｐ的５′端序列（图４）（Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ登录号为ＧＱ３７９９０４），补齐了此前缺失的５′端序列。再经过分析比对和拼接剪切，得到了紫花苜蓿犘犎犢犃
ＣＤＳ全长，共３３７５ｂｐ，编码１１２５个氨基酸。经分析，紫花苜蓿犘犎犢犃 基因与已知的 ＧｅｎＢａｎｋ中的植物
犘犎犢犃基因的相似性都比较高（大多在７５％以上），与豌豆、百脉根、山黧豆（犔犪狋犺狔狉狌狊狊犪狋犻狏狌狊）等豆科植物都达
到９２％以上。
图１　犘犎犢犃犚犜－犘犆犚扩增产物
犉犻犵．１　犘犎犢犃犚犜－犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀
Ｍ：分子量标记 ＤＮＡＭａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）；１：犘犎犢犃ＲＴ－ＰＣＲ
产物犘犎犢犃ＲＴ－ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ．
图２　犘犎犢犃３′犚犃犆犈－犘犆犚扩增产物
犉犻犵．２　犘犎犢犃３′犚犃犆犈－犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀
Ｍ：分子量标记 ＤＮＡＭａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）；１：犘犎犢犃３′ＲＡＣＥ－ＰＣＲ
产物犘犎犢犃３′ＲＡＣＥ－ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ．
２．２　获得紫花苜蓿犘犎犢犅 基因组ＤＮＡ近全长序列
使用２对引物ＬＵ１、１７Ｕ和ＨＵ１、ＨＬ２进行ＰＣＲ扩增，分别得到与预期扩增片段相符的２个片段（图５和
６）。测序结果表明，两片段长度分别为１０９７和４９９７ｂｐ。染色体步移获得了１７５２ｂｐ的５′端序列（图７）。将３
８８ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．６
　图３　犘犎犢犃５′犚犃犆犈－犘犆犚扩增产物
犉犻犵．３　犘犎犢犃５′犚犃犆犈－犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀
Ｍ：分子量标记 ＤＮＡＭａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）；１：犘犎犢犃５′
ＲＡＣＥ－ＰＣＲ产物犘犎犢犃５′ＲＡＣＥ－ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ．
图４　犘犎犢犃犵犲狀狅犿犲狑犪犾犽犻狀犵扩增产物
犉犻犵．４　犘犎犢犃犵犲狀狅犿犲狑犪犾犽犻狀犵犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀
Ｍ：分子量标记 ＤＮＡＭａｒｋｅｒ（２５０ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒＭａｒｋｅｒ）；１：犘犎犢犃
ｇｅｎｏｍｅｗａｌｋｉｎｇＰＣＲ产物犘犎犢犃ｇｅｎｏｍｅｗａｌｋｉｎｇＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ．
图５　犘犎犢犅犘犆犚扩增产物
犉犻犵．５　犘犎犢犅犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀
引物Ｐｒｉｍｅｒ：ＬＵ１和１７Ｕ；Ｍ：分子量标记 ＤＮＡＭａｒｋｅｒ（２５０ｂｐ
ＤＮＡＬａｄｄｅｒＭａｒｋｅｒ）；１：ＰＣＲ产物ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ．
图６　犘犎犢犅犘犆犚扩增产物
犉犻犵．６　犘犎犢犅犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀
引物Ｐｒｉｍｅｒ：ＨＵ１和 ＨＬ２；Ｍ：分子量标记 ＤＮＡＭａｒｋｅｒ（２５０ｂｐ
ＤＮＡＬａｄｄｅｒＭａｒｋｅｒ）；１：ＰＣＲ产物ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ．
图７　犘犎犢犅犵犲狀狅犿犲狑犪犾犽犻狀犵扩增产物
犉犻犵．７　犘犎犢犅犵犲狀狅犿犲狑犪犾犽犻狀犵犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀
Ｍ：分子量标记 ＤＮＡＭａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）；１～３：犘犎犢犅ｇｅｎｏｍｅｗａｌｋｉｎｇ
ＰＣＲ产物犘犎犢犅ｇｅｎｏｍｅｗａｌｋｉｎｇＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ．
段序列拼接后得到长度为７１５０ｂｐ的基因序列（登
录号 ＧＱ３７９９０２），其 中 包 含 了 ５′端 非 翻 译 区
（ＵＴＲ）、３个内含子和长度为３４２５ｂｐ的ＣＤＳ序列
（编码１１４１个氨基酸），达到预测的蒺藜苜蓿
犘犎犢犅 基 因 编 码 序 列 的９９．０％。将 紫 花 苜 蓿
犘犎犢犅ＣＤＳ 序列与编码氨基酸序列分别进行
Ｂｌａｓｔｎ和Ｂｌａｓｔｐ，得到的相似性由高到低分别为：蒺
藜苜蓿预测犘犎犢犅（９７％）、豌豆犘犎犢犅（９１％）、大
豆犘犎犢犅（８６％）和百脉根犘犎犢犅（８５％）；蒺藜苜蓿
预测 犘犎犢犅（９７％）、豌豆 犘犎犢犅（９３％）、百脉根
犘犎犢犅（８９％）和大豆犘犎犢犅（８８％）。
分析发现，紫花苜蓿犘犎犢犅与预测的蒺藜苜蓿
犘犎犢犅，不仅基因结构及其保守区序列十分相似，并
９８第２０卷第６期 草业学报２０１１年
且在非编码区的基因序列相似性也很高。紫花苜蓿犘犎犢犅５′端上游长度为８８６ｂｐ的序列与预测的蒺藜苜蓿
犘犎犢犅５′端上游序列相似性达到７８％，一致性（Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）＝６３０／８０４，两者内含子序列相似性也接近９０％。非编
码区具有这样高的序列相似性，说明可以尝试在蒺藜苜蓿已知或预测基因的ＣＤＳ外端设计引物，这样会使引物
设计的范围拓宽，就可能直接克隆出未知紫花苜蓿基因的全长，从而省去ＲＡＣＥ和染色体步移等操作，大大提高
试验效率，节约试验成本。
３　讨论
本研究采用了２种基因克隆策略分别克隆紫花苜蓿犘犎犢犃 和犘犎犢犅 基因，现对两者进行比较：１）犘犎犢犃
和犘犎犢犅 分别以ｍＲＮＡ和基因组ＤＮＡ为试验起点，前者由于 ｍＲＮＡ容易降解，因此对操作和试验条件要求
较高，而且进行ＰＣＲ前需要反转录；后者可获得内含子等更多基因信息，但内含子较大时也会增大克隆难度和测
序成本。２）对于犘犎犢犃，先根据近缘物种已知犘犎犢犃基因序列在保守区设计引物ＲＴ－ＰＣＲ扩增出一段序列，
然后用３′ＲＡＣＥ和５′ＲＡＣＥ向两端延伸；对于犘犎犢犅，先预测蒺藜苜蓿犘犎犢犅，然后直接以之设计ＰＣＲ引物克
隆得到紫花苜蓿犘犎犢犅的大部分序列，最后再用染色体步移法补齐５′端序列。两者所采用的ＲＡＣＥ和染色体
步移法，尽管原理不同［３０，３１］，试验起点不同，但都是根据已知序列片段向两侧延伸从而克隆未知区域序列的常用
方法［３２３４］。其中犘犎犢犃５′ＲＡＣＥ未得到理想的结果（获得５′ｃＤＮＡ全长），原因可能是多方面的，包括操作步骤
较多、试验条件要求高、试剂较为昂贵等［３５］；而染色体步移法操作较为简单，试验条件要求较低，试验成功率高，
试剂成本较低，所以可优先作为克隆基因未知区域序列的方法。３）２种策略的本质差别在于前者只是按照克隆
未知基因的一般思路和模式，后者则是充分利用蒺藜苜蓿与紫花苜蓿基因组的高度相似性，将“未知”变成“已
知”，将未知基因的克隆变成了“已知（或准已知）”基因的克隆，这样，无论采用 ｍＲＮＡ还是基因组ＤＮＡ为试验
起点，都可以通过查找或预测蒺藜苜蓿对应基因，然后直接应用或作为最重要的参考序列来克隆紫花苜蓿目的基
因，这样往往会使克隆难度大大降低，从而快速高效的完成试验；但后者对试验人员的理论基础、生物信息学操作
和分析能力要求较高，前期需要进行细致的分析和基因预测等工作。所以，针对特定的试验条件、目的和研究背
景，２种策略各有优劣。综上所述，当前紫花苜蓿基因信息资源短缺，却拥有大量可以利用的蒺藜苜蓿基因信息
资源，在这种情况下，应充分利用蒺藜苜蓿资源研究紫花苜蓿，这非常适用于紫花苜蓿未知基因的克隆，同理，也
适用于紫花苜蓿研究的其他很多方面［３６］，例如用于蒺藜苜蓿的基因芯片同样可适用于紫花苜蓿［３７］等，因此，在进
行某些紫花苜蓿相关研究时，可以先对蒺藜苜蓿进行研究，而后再应用于紫花苜蓿，可能绕道蒺藜苜蓿后，反而加
快了研究进程。
植物接受环境中光信号并调节自身生理反应的机制是非常复杂的，常常有多种光受体共同参与和调
控［２４，３８，３９］，例如隐花色素和光敏色素一起调节植物的去黄化反应、光周期反应和光形态建成反应［１５，１８，２２］。因此，
欲探究光与苜蓿秋眠性的关系，除了光敏色素中的犘犎犢犃、犘犎犢犅外，还应将其他可能存在的光敏色素以及隐花
色素、向光素甚至紫外光受体等其他光受体列入研究范围。
本试验使用２种策略克隆了紫花苜蓿犘犎犢犃和犘犎犢犅 基因，所得序列均可以满足下游实时定量ＰＣＲ（Ｒｅ
ａｌｔｉｍｅＰＣＲ）和ＲＮＡ干扰（ＲＮＡｉ）试验要求，为进一步研究两基因的功能及其与苜蓿秋眠的关系奠定了基础；同
时证明利用豆科模式植物蒺藜苜蓿已知基因组信息资源克隆紫花苜蓿未知基因的方法是可行和高效的，从而为
克隆紫花苜蓿其他未知基因及其他方面研究提供思路和参考。
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ａｎｅｓｓｅｎｔｉａｌｔｏｏｌｆｏｒｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｌｅｇｕｍｅｇｅｎｏｍｉｃｓａｎｄｔｈｅｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆａｇｒｏｎｏｍｉｃａｌｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｇｅｎｅｓ［Ｊ］．ＢＭＣＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙ，
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犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔ，２０１０，３（１）：２４６２５９．
犜狑狅狊狋狉犪狋犲犵犻犲狊狅犳犮犾狅狀犻狀犵犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪狆犺狔狋狅犮犺狉狅犿犲犃犪狀犱犅犵犲狀犲狊
ＬＩＰｉｎｇ１，ＹＡＮＧＬｉｎｇｌｉｎｇ１，ＣＨＥＮＱｉｘｉｎ１，ＳＨＩＹｉｎｇｈｕａ１，ＹＡＮＸｕｅｂｉｎｇ１，
ＣＨＥＮＺｈａｎｋｕａｎ２，ＷＡＮＧＣｈｅｎｇｚｈａｎｇ１
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＨｅｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ
４５０００２，Ｃｈｉｎａ；２．ＨｅｎａｎＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＣｒｏｐＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，
Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ４５０００１，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｓｈｏｒｔｄａｙｓａｒｅｔｈｅｍａｉｎｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｆａｃｔｏｒｌｅａｄｉｎｇｔｏｆａｌｄｏｒｍａｎｃｙ（ＦＤ）ｉｎａｌｆａｌｆａ（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻
狏犪）ｗｈｉｃｈｉｓｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄｔｏｂｅａｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄｉｃｒｅｓｐｏｎｓｅｗｉｔｈｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓａｓｔｈｅｍａｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｔｈｉｓｓｔｕｄｙ
ｅｘｐｌｏｒｅｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｃｌｏｎｉｎｇｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓｏｆ犕．狊犪狋犻狏犪，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅＡ（犘犎犢犃）ａｎｄｐｈｙ
ｔｏｃｈｒｏｍｅＢ（犘犎犢犅），ｗｈｉｃｈａｒｅｔｈｅｍａｉｎｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓａｎｄｈａｖｅｎｏｔｂｅｅｎｃｌｏｎｅｄｉｎｔｈｉｓｓｐｅｃｉｅｓ．Ｂａｓｅｄｏｎ
ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｇｅｎｏｍｉｃｓａｎｄａｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｐｐｒｏａｃｈ，犘犎犢犃ａｎｄ犘犎犢犅ｇｅｎｅｓｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄｂｙｔｗｏ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ：ｕｓｉｎｇｍＲＮＡａｔｔｈｅｂｅｇｉｎｎｉｎｇａｎｄｔｈｅｎｔｈｅＲＡＣＥｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｏｒｂｙｇｅｎｏｍｉｃ
ＤＮＡｔｈｅｎｇｅｎｏｍｅｗａｌｋｉｎｇ．ＴｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｉｌｂｅｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｔｏｓｔｕｄｉｅｓｏｆｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎＦＤｉｎａｌ
ｆａｌｆａａｎｄｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ．Ｗｅａｌｓｏｆｏｕｎｄｔｈａｔ犕．狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪ｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄａｓａｍｏｄｅｌｐｌａｎｔｉｎｃｌｏｎｉｎｇｕｎｋｎｏｗｎ
ｇｅｎｅｓｏｆ犕．狊犪狋犻狏犪．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪；犕．狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪；ｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅ；ｇｅｎｅｃｌｏｎｉｎｇ；ＲＡＣＥ；ｇｅｎｏｍｅｗａｌｋｉｎｇ
２９ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．６