全 文 ：林业科学研究 ２０１６，２９（３）：４８７ ４９３
ＦｏｒｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ
文章编号：１００１１４９８（２０１６）０４０４８７０７
杨树 ＡＳＥ蛋白的生化功能研究
钱婷婷１，２，杨志灵３，曾庆银１，２
（１．中国科学院植物研究所，北京 １０００９３；２．中国科学院大学，北京 １０００４９；３．北京林业大学生物科学与技术学院，北京 １０００８３）
收稿日期：２０１５０８０４
基金项目：国家自然科学基金项目（Ｎｏ．３１４２５００６）
作者简介：钱婷婷，硕士，主要研究方向：林木遗传学，Ｅｍａｉｌ：１５６５２８２６６７１＠１６３．ｃｏｍ
责任作者：曾庆银，博士，研究员，Ｅｍａｉｌ：ｑｉｎｇｙｉｎ＠ｉｂｃａｓ．ａｃ．ｃｎ
摘要：［目的］谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶（ＡＳＥ）在植物嘌呤合成中发挥着关键作用，本研究的目的是详细
揭示杨树ＡＳＥ蛋白的生化功能特性。［方法］通过半定量ＲＴＰＣＲ、蛋白质亚细胞定位以及测定纯化蛋白的催化活
性等方法来研究其在体外的生化功能，进一步通过互补拟南芥缺失突变体（ａｔａｓｅ２）来研究杨树 ＡＳＥ基因的体内生
物学功能。［结果］从杨树基因组中鉴别出２个ＡＳＥ基因，序列分析发现它们之间有很高的蛋白质序列相似性。半
定量ＲＴＰＣＲ分析发现两个杨树ＡＳＥ基因在根、茎、叶和芽中均表达。蛋白质亚细胞定位分析发现杨树 ＡＳＥ蛋白
均定位在叶绿体中，而且两个杨树ＡＳＥ蛋白均能完全互补拟南芥ａｔａｓｅ２突变体的表型。酶学性质分析表明，杨树两
个ＡＳＥ蛋白均能催化５磷酸核糖α焦磷酸生成５磷酸核糖β胺。［结论］本研究预示着两个杨树 ＡＳＥ蛋白在嘌
呤合成中均发挥着重要作用。
关键词：ＡＳＥ基因，基因表达，酶学功能，突变体
中图分类号：Ｓ７９２１１ 文献标识码：Ａ
ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＰｏｐｕｌｕｓＡＳＥＰｒｏｔｅｉｎｓ
ＱＩＡＮＴｉｎｇｔｉｎｇ１，２，ＹＡＮＧＺｈｉｌｉｎｇ３，ＺＥＮＧＱｉｎｇｙｉｎ１，２
（１．ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙＢｏｔａｎｙ，ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｏｔａｎｙ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００９３，Ｃｈｉｎａ；
２．ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００４９，Ｃｈｉｎａ；３．ＣｏｌｅｇｅｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓａｎｄ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＢｅｉｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：［Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ］Ｔｈｅｐｕｒｐｏｓｅｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｉｓｔｏｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｔｈｅｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆｇｌｕｔａｍｉｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒｉ
ｂｏｓｙｌｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅａｍｉｄｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＡＳＥ）．［Ｍｅｔｈｏｄ］ＢｙｓｑＰＣＲ，ｐｒｏｔｅｉｎｓｕｂｃｅｌｕｌａｒｌｏｃａｔｉｏｎａｎｄｃａｔａｌｙｔｉｃａｃ
ｔｉｖｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｐｕｒｉｆｉｅｄｐｒｏｔｅｉｎ，ｔｈｅｉｎｖｉｔｒｏｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆＡＳＥｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄ，ａｎｄｆｕｒｔｈｅｒ
ｍｏｒｅ，ｔｈｅｄｅｌｅｔｉｏｎｍｕｔａｎｔｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｂｙｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ（ａｔａｓｅ２）ｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｉｎｖｉｖｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆｐｏｐｌａｒＡＳＥｇｅｎｅｓ．［Ｒｅｓｕｌｔ］ＴｗｏＡＳＥｇｅｎｅｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｆｒｏｍＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ．Ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｓｅ
ｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｅｄａｈｉｇｈｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｔｗｏＡＳＥｓ．ＴｈｅｓｅＡＳＥｇｅｎｅｓｗｅｒｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎ
ｒｏｏｔ，ｓｔｅｍ，ｌｅａｆａｎｄｂｕｄｔｉｓｓｕｅｓ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｕｂｃｅｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＰｏｐｕｌｕｓＡＳＥ
ｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅｌｏｃａｌｉｚｅｄｉｎｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ．ＴｈｅＰｏｐｕｌｕｓＡＳＥｇｅｎｅｓｃｏｕｌｄｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＡｒａｂｉ
ｄｏｐｓｉｓａｔａｓｅ２ｍｕｔａｎｔ．ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＰｏｐｕｌｕｓＡＳＥｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＥ．ｃｏｌｉａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙＮｉａｆｉｎｉｔｙ
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．ＰｏｐｕｌｕｓＡＳＥ ｐｒｏｔｅｉｎｓｓｈｏｗｅｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｔｏ５ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌαｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ．
［Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ］ＩｔｉｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｔｗｏＰｏｐｕｌｕｓＡＳＥｐｒｏｔｅｉｎｓｍｉｇｈｔｐｌａｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｓｉｎｄｅｎｏｖｏｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
ｏｆｐｕｒｉｎｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＡＳＥｇｅｎｅ，ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｅｎｚｙｍａｔｉｃｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｍｕｔａｎｔ
林 业 科 学 研 究 第２９卷
生物体内核苷酸的合成有两条途径：即从头合
成途径（ｄｅｎｏｖｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｐａｔｈｗａｙ）和补救合成途径
（ｓａｌｖａｇｅｐａｔｈｗａｙ）。从头合成途径是利用磷酸核糖、
氨基酸等简单物质为原料从头合成核苷酸，补救合
成途径是利用体内游离碱基或核苷，经简单反应过
程生成核苷酸的过程［１］。从头合成是植物体内合成
嘌呤核苷酸的主要途径，在植物的生长、发育和代谢
中发挥重要作用［２－３］。在嘌呤从头合成途径中，谷
氨酰胺磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶（ｇｌｕｔａｍｉｎｅｐｈｏｓｐｏｒ
ｉｂｏｓｙｌｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅａｍｉｄｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＡＳＥ；ＥＣ２．４．
２．１４）发挥着关键作用。ＡＳＥ负责催化嘌呤从头合
成途径的第一步反应，将５磷酸核糖α焦磷酸（５
ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌαｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＰＲＰＰ）转化为 ５磷
酸 核 糖β胺 （５ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂａｓｙｌ（β） １ａｍｉｎｅ，
ＰＲＡ）［４］。在植物基因组中，ＡＳＥ基因是以小基因家
族的形式存在，比如在拟南芥基因组中包含有３个
ＡＳＥ基因（ＡｔＡＳＥ１，ＡｔＡＳＥ２和 ＡｔＡＳＥ３）。ＡｔＡＳＥ２基
因主要在拟南芥根、叶和花中表达，ＡｔＡＳＥ２基因在
子叶和真叶中的表达量显著高于 ＡｔＡＳＥ１和
ＡｔＡＳＥ３［５－６］。利用ＴＤＮＡ插入敲除ＡｔＡＳＥ２基因后，
突变体植株表现出生长缓慢、植株矮小、子叶正常而
真叶白化等表型，这说明ＡｔＡＳＥ２基因的缺失影响到
植物的正常生长发育，特别是叶绿体的发育［６］。然
而当利用 ＴＤＮＡ插入敲除 ＡｔＡＳＥ１基因后，其突变
体和野生型植株在表型上没有明显差异［６］。目前的
研究结果说明了 ＡＳＥ基因家族内的成员间有显著
的功能分化。在本研究中，我们以杨树为研究对象。
杨树是我国重要的造林树种，也是林木研究的模式
树种，我们从杨树中鉴定了两个 ＡＳＥ基因，并对其
表达模式、蛋白质功能进行了详细研究，发现两个杨
树ＡＳＥ蛋白可能在嘌呤合成中均发挥着重要作用。
１ 材料与方法
１．１ ＡＳＥ基因的序列搜索与鉴定
以拟南芥 ＡｔＡＳＥ２蛋白序列为模板，在 Ｐｈｙｔｏ
ｚｏｍｅｖ９．１（ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ．ｎｅｔ）上利用
ＴＢＬＡＳＴＮ搜索毛果杨（ＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａＴｏｒ．＆
Ｇｒａｙ）基因组数据库，将获得序列在 ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒ
ｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｄａｔａｂａｓｅ（ＮＣＢＩ）上进行
保守结构域分析。
１．２ 系统发生关系分析
将杨树和其他植物 ＡＳＥ序列通过 ＣｌｕｓｔａｌＸ１．
８３进行氨基酸序列比对，然后经 ＢｉｏＥｄｉｔ手动校对。
利用 ＰＨＹＭＬ的 ＪＴＴ模型构建进化树，Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ值
为１００。
１．３ 杨树ＡＳＥ基因克隆
本研究所用毛果杨（ＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａＴｏｒ．＆
Ｇｒａｙ）采自瑞典 Ｕｍｅａ大学校园。将采集得到的枝
条带回国内在营养土中进行扦插培养三个月。用天
根ＤＰ４４１多糖多酚植物总 ＲＮＡ提取试剂盒提取毛
果杨根、茎、叶和芽的总ＲＮＡ。用１％琼脂糖凝胶电
泳检测提取的总ＲＮＡ质量，用ＴａＫａＲａＲＮＡＰＣＲＫｉｔ
（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．３．０反转录试剂盒，将上述总 ＲＮＡ反转
录为ｃＤＮＡ。
根据从杨树基因组鉴定的 ＡＳＥ基因序列，用
ｐｒｉｍｅｒ５．０设计克隆引物（表１）。用ＴａＫａＲａ公司的
ＥｘＴａｑ聚合酶扩增杨树 ＡＳＥ基因。用１％琼脂糖凝
胶电泳检测ＰＣＲ扩增产物，在紫外灯下切割目的条
带，使用鼎国ＤＮＡ快速回收纯化试剂盒回收目的条
带。将纯化后的 ＤＮＡ片段分别连接至克隆载体
ｐＥＡＳＹＴ３上并转化大肠杆菌感受态细胞Ｔｒａｎｓ１Ｔ１，
并在含有５０μｇ·ｍＬ－１氨苄霉素的固体 ＬＢ培养基
上培养。每个基因挑取８个白色菌斑，分别用博迈
德公司的２×ＴａｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ进行菌落 ＰＣＲ检
测，将检测阳性的克隆进行双向测序。
１．４ 杨树ＡＳＥ基因的表达模式分析
为检测杨树ＡＳＥ基因的表达模式，本研究用半
定量 ＲＴＰＣＲ的方法对正常生长条件下的杨树的
根、茎、叶、芽等组织进行分析，ＰＣＲ反应分别设置
２４、２６、２８和３０四个循环数对目的基因表达情况进
行检测，用杨树Ａｃｔｉｎ基因作为内参。检测基因表达
模式引物见表１。
１．５ 杨树ＡＳＥ蛋白的亚细胞定位分析
将杨树 ＡＳＥ基因连接到改造载体 ｐＣＡＭ
ＢＩＡ１３０２中，使ＡＳＥ蛋白的Ｃ末端加上 ｅＧＦＰ标签，
用于检测其亚细胞定位情况。构建 ＡＳＥ蛋白亚细
胞定位的引物见表 １。将构建的重组质粒转化到
Ｔｒａｎｓ１Ｔ１感受态中，测序正确后提取质粒，参照Ｙｏｏ
等人拟南芥原生质体转化的方法［７］转化拟南芥原生
质体，用激光共聚焦显微镜（ＯｌｙｍｐｕｓＦＶ１０００ＭＰＥ）
观察亚细胞定位情况。
１．６ 杨树 ＡＳＥ蛋白质的表达、纯化和生化功能
分析
将杨树ＡＳＥ基因克隆到 ｐＥＴ３０ａ表达载体中，
构建表达载体的引物见表１。将测序正确的表达菌
分别在１００ｍＬ含３０μｇ·ｍＬ－１卡那霉素的ＬＢ培养
８８４
第４期 钱婷婷，等：杨树ＡＳＥ蛋白的生化功能研究
表１ 本研究所用的引物序列
基因名称 引物名称 引物序列 （５′－３′） 用途
ＰｔＡＳＥ１ ＰｔＡＳＥ１ＣＬ１ ＣＧＣＡＣＧＣＡＣＣＡＴＴＣＴＴＴＴＴ 克隆ＡＳＥ基因
ＰｔＡＳＥ１ＣＬ２ ＴＡＣＣＡＣＣＴＧＡＣＣＡＣＡＴＣＡＣＡＴＡＡＴ
ＰｔＡＳＥ２ ＰｔＡＳＥ２ＣＬ１ ＣＡＣＣＣＡＣＣＡＴＴＣＴＴＴＴＴＣＴＣＣ
ＰｔＡＳＥ２ＣＬ２ ＴＧＡＧＣＣＡＡＡＡＴＣＣＡＴＣＡＧＴＴＣ
ＰｔＡＳＥ１ ＰｔＡＳＥ１ＥＰ１ ＴＡＴＧＣＣＧＣＧＡＡＡＧＣＴＧＧＴ 检测ＡＳＥ基因的表达
ＰｔＡＳＥ１ＥＰ２ ＧＣＴＣＧＧＡＧＡＣＴＣＡＴＣＡＣＣＴＡＡＣ
ＰｔＡＳＥ２ ＰｔＡＳＥ２ＥＰ１ ＴＴＧＣＧＡＴＧＴＡＧＴＧＡＴＴＧＣＧＧ
ＰｔＡＳＥ２ＥＰ２ ＴＣＧＧＡＧＡＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＡＡＣ
ＰｔＡｃｔｉｎ ＰｔＡｃｔｉｎ１ ＧＴＧＡＧＣＡＡＣＴＧＧＧＡＴＧＡＣＡＴＧ
ＰｔＡｃｔｉｎ２ ＴＣＡＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＴＡＴＧＴＧＧＴＣＴ
ＰｔＡＳＥ１ ＰｔＡＳＥ１ＳＣＬ１ ＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＣＡＧＡＣＡＣＣＡＣＴＡＧＴＴＴＣＴＣ 构建ＡＳＥ蛋白的亚细胞定位载体
ＰｔＡＳＥ１ＳＣＬ２ ＣＴＧＣＡＧＡＴＴＣＴＧＣＡＡＡＧＡＡＧＡＣＡＡＣＴＴＣＣ
ＰｔＡＳＥ２ ＰｔＡＳＥ２ＳＣＬ１ ＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＣＡＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧ
ＰｔＡＳＥ２ＳＣＬ２ ＣＴＧＣＡＧＴＧＴＣＡＡＡＧＡＡＧＡＣＡＡＣＴＴＣＣＣＧＧ
ＰｔＡＳＥ１ ＰｔＡＳＥ１Ｅｘ１ ＧＧＡＡＴＴＣＧＡＣＧＡＴＧＡＴＧＡＣＧＡＴＡＡＧＣＣＴＣ 构建ＡＳＥ蛋白的原核表达载体
ＰｔＡＳＥ１Ｅｘ２ ＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＴＣＴＧＣＡＡＡＧＡＡＧＡＣＡＡＣＴＴＣＣＣ
ＰｔＡＳＥ２ ＰｔＡＳＥ２Ｅｘ１ ＧＧＡＡＴＴＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＡＡＧＣＣＴ
ＰｔＡＳＥ２Ｅｘ２ ＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＴＣＡＡＡＧＡＡＧＡＣＡＡＣＴＴＣＣＣＧ
ＰｔＡＳＥ１ ＰｔＡＳＥ１ＯＥ１ ＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＣＡＧＡＣＡＣＣＡＣＴＡＧＴＴＴＣＴＣ 构建互补ａｔａｓｅ２突变体的载体
ＰｔＡＳＥ１ＯＥ２ ＣＴＧＣＡＧＴＣＡＡＴＴＣＴＧＣＡＡＡＧＡＡＧＡＣＡＡＣＴ
ＰｔＡＳＥ２ ＰｔＡＳＥ２ＯＥ１ ＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＣＡＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧ
ＰｔＡＳＥ２ＯＥ２ ＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＧＴＣＡＡＡＧＡＡＧＡＣＡＡＣＴＴＣＣＣＧ
基培养至ＯＤ６００值为０．５左右，加入 ＩＰＴＧ至终浓度
０．１ｍｍｏｌ·Ｌ－１诱导 ＡＳＥ蛋白表达。在 ２０℃、２００
ｒｐｍ的条件下培养３６ｈ，取１ｍＬ留样检测，收集菌
体（１００００ｒｐｍ，３ｍｉｎ，４℃），用 ｂｉｎｄｉｎｇｂｕｆｅｒ（２０
ｍｍｏｌ·Ｌ－１Ｎａ３ＰＯ４、０．５ｍｏｌ·Ｌ
－１ＮａＣｌ和２０ｍｍｏｌ
·Ｌ－１咪唑，ｐＨ７．４）重悬菌体，并在冰上用超声波细
胞破碎仪破碎菌体，离心（１００００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃），
取５０μＬ上清样品，用８ｍｏｌ·Ｌ－１的尿素溶解沉淀
取样５０μＬ，用 ＳＤＳＰＡＧＥ凝胶电泳检测其表达情
况。将剩余的上清用ｂｉｎｄｉｎｇｂｕｆｅｒ预平衡的镍离子
亲和层析柱（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）进行纯化。
用Ｅｌｕｔｉｏｎｂｕｆｅｒ（２０ｍｍｏｌ·Ｌ－１Ｎａ３ＰＯ４、０．５ｍｏｌ·
Ｌ－１ＮａＣｌ和５００ｍｍｏｌ·Ｌ－１咪唑，ｐＨ７．４）洗脱目的
蛋白。
１．７ 杨树ＡＳＥ蛋白质的酶活性测定
参考 Ｗａｌｓｈ等人的 ＡＳＥ蛋白的酶活性测定方
法［８］，取５个灭过菌的１．５ｍＬ的ＥＰ管，其中两个为
对照，剩余的三个为重复反应。向所有ＥＰ管中分别
加入１５０μＬ蛋白质，反应组加入１５０μＬ底物Ａ（４０
ｍｍｏｌ·Ｌ－１Ｇｌｎ，５ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＰＲＰＰ），对照组加入
１５０μＬ底物Ｂ（４０ｍｍｏｌ·Ｌ－１Ｇｌｎ），之后向反应组
和对照组均加入底物 Ｃ（５ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＭｇＣｌ２，１０
ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＤＴＴ），室温反应３０ｍｉｎ，在１００℃条件下
２．５ｍｉｎ终止反应，１２０００ｒｐｍ离心１ｍｉｎ，分别取上
清２００μＬ到新的ＥＰ管中，向其中加入６００μＬ反应
液Ａ（１２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１Ｎａ３ＰＯ４，ｐＨ８．０，其中 Ｎａ３ＰＯ４
用１．３６ｍｍｏｌ·Ｌ－１的３ａｄｅｔｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ和
３３Ｕ·ｍＬ－１的 Ｇｌｕｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ溶解）。加入反应
液Ａ后用紫外分光光度计在 Ａ３６３波长下读取１０
９０ｍｉｎ的读数，时间间隔为１０ｍｉｎ。
１．８ 杨树ＡＳＥ蛋白互补拟南芥ａｔａｓｅ２突变体研究
在ＴＡＩＲ网站上购买 ａｔａｓｅ２突变体种子（种子
号：ＳＡＬＫ＿０２８０３４），在正常生长条件下种植，培养一
个月左右后提取植株总ＤＮＡ进行插入缺失的鉴定。
将杨树 ＡＳＥ基因连接到 ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２表达载体，
并转化 Ｔｒａｎｓ１Ｔ１感受态，检测得到阳性克隆并测
序。用电转化的方法将含有目的基因的质粒转化到
农杆菌 ＥＨＡ１０５感受态中，菌落 ＰＣＲ检测并测序，
用测序正确的农杆菌用蘸花法［９］转化拟南芥 ａｔａｓｅ２
杂合突变体，正常条件下培养。
将收获的转基因拟南芥种子消毒后种到终浓度
为２５μｇ·ｍＬ－１的潮霉素和３００μｇ·ｍＬ－１的头孢霉
素的１／２ＭＳ培养基上，４℃春化处理四天，然后在
２５℃的条件下避光生长三天，看到有明显茎增长的
９８４
林 业 科 学 研 究 第２９卷
植株后转至正常长日照（１６ｈ白昼／８ｈ黑夜）条件
下培养两天，子叶变绿后移苗至营养土中正常生长。
两周后提取植株 ＤＮＡ，用 ａｔａｓｅ２突变体鉴定引物检
测转基因植株的杂合性，用转基因检测引物检测转基
因情况。移苗后１周及２周分别照相记录生长情况。
２ 结果与分析
２．１ 杨树 ＡＳＥ基因的克隆、序列特性及系统发育
分析
在杨树基因组中鉴定出２个 ＡＳＥ基因，分别命
名为ＰｔＡＳＥ１和ＰｔＡＳＥ２。保守结构域分析发现这两
个基因所编码的蛋白均具有完整的谷氨酰胺转酰胺
酶结构域和磷酸核糖转移酶结构域，确定该序列编
码的蛋白具有 ＡＳＥ结构域特征。然后我们从杨树
中克隆获得２个ＡＳＥ基因（ＰｔＡＳＥ１和ＰｔＡＳＥ２）。杨
树的两个基因 ＰｔＡＳＥ１和 ＰｔＡＳＥ２长度分别为
１７６１ｂｐ和１７５８ｂｐ，分别编码 ５８６和 ５８５个氨基
酸，预测分子量分别为 ６３．９８ｋＤａ和 ６３．８０ｋＤａ。
ＰｔＡＳＥ１和ＰｔＡＳＥ２蛋白序列的相似性很高（图１），达
到了９０．６％。
我们从代表不同进化历史的苔藓植物小立碗藓
（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌａｐａｔｅｎｓ（Ｈｅｄｗ．）Ｂｒｕｃｈ＆Ｓｃｈｉｍｐ），江
南卷柏（ＳｅｌａｇｉｎｅｌａｍｏｅｌｅｎｄｏｒｆｉＨｉｅｒｏｎ．）和单子叶
植物水稻（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ．ｓｓｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ）中鉴定出
ＡＳＥ基因，然后与杨树进行序列分析，发现植物ＡＳＥ
蛋白序列的相似性在４７．０％和９０．６％之间（表２）。
系统进化分析发现两个杨树ＡＳＥ基因聚成一支（图
２，Ａ１），两个拟南芥ＡＳＥ基因（ＡｔＡＳＥ１和ＡｔＡＳＥ２）聚
成另一支（图２，Ａ２）。这说明杨树和拟南芥分化后，
各自产生了一次基因重复事件，导致杨树和拟南芥
都增加了一个基因。但根据进化树，有可能在杨树
中丢失了一个ＡｔＡＳＥ３的直系同源基因。
图１ 杨树ＡＳＥ蛋白的氨基酸序列比对
２．２ 杨树ＡＳＥ基因表达模式分析
为了检测杨树ＡＳＥ基因的表达模式，本研究用
半定量ＰＣＲ的方法研究了杨树根、茎、叶和芽等组
织部位的表达情况（图 ３）。杨树中 ＰｔＡＳＥ１和
ＰｔＡＳＥ２基因在根、茎、叶和芽等部位均表达，但是
ＰｔＡＳＥ１在根、茎和芽部位的表达量高于ＰｔＡＳＥ２。
０９４
第４期 钱婷婷，等：杨树ＡＳＥ蛋白的生化功能研究
图２ 植物ＡＳＥ家族的系统进化树
２．３ 杨树ＡＳＥ蛋白的亚细胞定位分析
为研究杨树ＡＳＥ蛋白的亚细胞定位情况，本研
究在ＡＳＥ蛋白的 Ｃ末端加上 ｅＧＦＰ标签，利用共聚
焦显微镜观察融合蛋白在拟南芥原生质体中的表达
情况。杨树的ＡＳＥｅＧＦＰＳ融合蛋白在４８８ｎｍ激发
光下的绿色荧光与叶绿体在５４３ｎｍ下的红色自发
荧光重合呈黄色（图４），说明杨树 ＡＳＥ蛋白都定位
于叶绿体。
２．４ 杨树ＡＳＥ蛋白质生化功能分析
ＡＳＥ蛋白具有催化 ＰＲＰＰ转化为 ＰＲＡ的活性。
为研究杨树 ＡＳＥ基因所编码的蛋白是否有催化
ＰＲＰＰ的功能，本研究将去除信号肽的杨树 ＡＳＥ基
表２ 植物ＡＳＥ家族蛋白质序列相似性比量
ＰｔＡＳＥ１ ＰｔＡＳＥ２ ＡｔＡＳＥ１ ＡｔＡＳＥ２ ＡｔＡＳＥ３ ＯｓＡＳＥ１ ＯｓＡＳＥ２ ＳｍＡＳＥ１ ＰｐＡＳＥ１ ＰｐＡＳＥ２
ＰｔＡＳＥ１ １．０００
ＰｔＡＳＥ２ ０．９０６ １．０００
ＡｔＡＳＥ１ ０．７５９ ０．７６４ １．０００
ＡｔＡＳＥ２ ０．７５４ ０．７５８ ０．８４９ １．０００
ＡｔＡＳＥ３ ０．６１１ ０．６２３ ０．６２８ ０．６２８ １．０００
ＯｓＡＳＥ１ ０．５３２ ０．５２５ ０．５３９ ０．５３３ ０．５１７ １．０００
ＯｓＡＳＥ２ ０．５３９ ０．５３１ ０．５４８ ０．５４０ ０．５１３ ０．８０５ １．０００
ＳｍＡＳＥ１ ０．６２０ ０．６２１ ０．６２１ ０．６２８ ０．５５１ ０．５３６ ０．５３９ １．０００
ＰｐＡＳＥ１ ０．５５４ ０．５５８ ０．５６７ ０．５６２ ０．５２７ ０．４９０ ０．４９０ ０．６０４ １．０００
ＰｐＡＳＥ２ ０．５７４ ０．５８０ ０．５６８ ０．５６２ ０．５００ ０．４７０ ０．４７２ ０．５８４ ０．７７８ １．０００
注：图中ＲＯ、ＳＴ、ＬＥ、ＢＵ分别代表根、茎、叶和芽组织
图３ 杨树ＡＳＥ基因的表达模式
因连接到蛋白表达载体ｐＥＴ３０ａ上，将构建好的重组
质粒转化至蛋白表达菌株 ＢＬ２１（ＤＥ３）中，用 ＩＰＴＧ
诱导蛋白表达。发现两个基因都能在大肠杆菌中可
溶性表达。
用Ｎｉ离子亲和层析纯化获得纯化的目的蛋白，
并通过 ＰＤ１０柱脱盐，用紫外分光光度计在３６３ｎｍ
的波长下检测ＡＳＥ催化ＰＲＰＰ产生谷氨酰胺的生成
量。杨树两个ＡＳＥ蛋白都具有酶学活性（图５）。在
９０分钟终止反应时，ＰｔＡＳＥ１蛋白的催化活性是
ＰｔＡＳＥ２的６６．１７％。
２．５ 杨树ＡＳＥ蛋白互补拟南芥ａｔａｓｅ２突变体分析
先前的研究发现拟南芥ＡｔＡＳＥ２基因被敲除后，
突变体植株表现出生长缓慢、植株矮小、子叶正常而
真叶白化等表型［６］。在本研究中，我们首先筛选得
到ａｔａｓｅ２突变体植株的纯合体，野生型（ＷＴ）表现为
正常生长的状态，ａｔａｓｅ２突变体表现为子叶正常而
真叶白化的表型（图６），而且纯合突变体植株比野
生型植株生长速度慢。此结果与２００４年Ｈｕｎｇ等人
报道的ａｔａｓｅ２突变体表型一致［６］。因ａｔａｓｅ２纯合突
变体生长很弱，难以进行转基因，因此我们用农杆菌
蘸花法将ＰｔＡＳＥ１和ＰｔＡＳＥ２转入ａｔａｓｅ２杂合突变体
植株中。然后筛选纯合背景且转基因成功的 ａｔａｓｅ２
突变体植株，观察其表型。我们分别获得了１０和３
株ＰｔＡＳＥ１和ＰｔＡＳＥ２基因的转基因阳性植株。在１０
１９４
林 业 科 学 研 究 第２９卷
白色标尺长度为１０μｍ
图４ 杨树ＡＳＥ蛋白的亚细胞定位
图５ 杨树ＡＳＥ蛋白的酶学活性
株ＰｔＡＳＥ１的转基因植株中，有七株表现为子叶生长
正常且真叶也生长正常，３株 ＰｔＡＳＥ２的转基因植株
均表现为子叶生长正常且真叶也生长正常，说明
ＰｔＡＳＥ１和 ＰｔＡＳＥ２蛋白都能互补 ａｔａｓｅ２突变体
（图７）。
３ 讨论
基因家族成员间经常存在功能分化，功能分化
的原因可能来自于调控区，也有可能来自于蛋白编
码区。对具体的基因家族，则需要通过对基因表达
模式和蛋白功能的分析研究其基因家族成员间功能
分化的原因。拟南芥 ＡＳＥ家族有３个成员，以前的
研究发现拟南芥３个 ＡＳＥ基因的表达模式有显著
分化，ＡｔＡＳＥ２基因主要在拟南芥根、叶和花中表达，
ＡｔＡＳＥ２基因在子叶和真叶中的表达量显著高于
ＡｔＡＳＥ１和 ＡｔＡＳＥ３［５－６］。而且分别敲除拟南芥
白色标尺长度为５０ｍｍ。
图６ 拟南芥ａｔａｓｅ２纯合突变体的表型
白色标尺长度为５０ｍｍ。
图７杨树ＡＳＥ蛋白能够回补拟南芥ａｔａｓｅ２突变体的表型
２９４
第４期 钱婷婷，等：杨树ＡＳＥ蛋白的生化功能研究
ＡｔＡＳＥ１和 ＡｔＡＳＥ２基因后，仅敲除 ＡｔＡＳＥ２基因的突
变体植株表现出生长缓慢、植株矮小、子叶正常而真
叶白化等表型，这说明ＡｔＡＳＥ２基因对在嘌呤合成中
起主要作用，而 ＡｔＡＳＥ１基因并不起主要作用，这种
功能的分化主要是由基因表达的差异引起的。对杨
树ＤＯＦ基因、ＬＥＡ和ＧＳＴ基因的研究也显示表达模
式的分化对重复基因的功能分化有重要的
作用［１０－１２］。
在本研究中，我们发现 ２个杨树 ＡＳＥ基因
（ＰｔＡＳＥ１和 ＰｔＡＳＥ２）所编码的蛋白都定位到叶绿
体，且都具有催化５－磷酸核糖α焦磷酸转化为５
磷酸核糖β胺的催化活性，同时 ＰｔＡＳＥ１和 ＰｔＡＳＥ２
两个蛋白都能互补拟南芥 ａｔａｓｅ２突变体的表型，这
说明ＰｔＡＳＥ１和ＰｔＡＳＥ２的编码区是有功能的。表达
模式分析发现ＰｔＡＳＥ１和ＰｔＡＳＥ２基因在相同的组织
部位表达，ＰｔＡＳＥ１在根、茎和芽部位的表达量高于
ＰｔＡＳＥ２，由于ＰｔＡＳＥ１和 ＰｔＡＳＥ２两个基因的表达模
式分化较小，可能目前这两个基因存在功能的部分
冗余。
４ 结论
本研究详细地揭示了杨树 ＡＳＥ蛋白的生化功
能特性，研究结果预示着两个杨树 ＡＳＥ蛋白在嘌呤
合成中均发挥着重要作用，研究结果也表明对于同
一个基因家族，在不同物种中基因功能的分化模式
可能存在差异。
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（责任编辑：张 研）
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