全 文 ：书外源性金属硫蛋白对中国荷斯坦奶牛血淋巴细胞
凋亡／坏死及线粒体膜电位的影响
吴力专１，２，罗佳捷１，张彬１，李丽立３，罗锐１，占今舜１
（１．湖南农业大学动物科学技术学院，湖南 长沙４１０１２８；２．长江大学动物科学学院，湖北 荆州４３４０２５；３．中国科学院
亚热带农业生态研究所动物生态营养与健康养殖联合实验室 农业生态工程重点实验室，湖南 长沙４１０１２５）
摘要：选取２０头处于热应激环境的泌乳奶牛，随机分成 Ａ、Ｂ、Ｃ和Ｄ组４组，分别按剂量０．０（对照），４．０，８．０和
１６．０ｍｇ／头静脉注射金属硫蛋白（ＭＴ），以探讨外源性 ＭＴ对奶牛淋巴细胞凋亡、坏死和线粒体膜电位（ΔΨｍ）的
影响。结果表明，注射 ＭＴ后，在５１～６０ｄ时，校正标准产奶量Ｂ、Ｃ和Ｄ组均显著性高于Ａ组（犘＜０．０５）；３５ｄ时
Ｃ组（８ｍｇ／头）的血淋巴细胞凋亡率显著性低于Ｂ、Ｄ组（犘＜０．０５），但与 Ａ组无显著性差异（犘＞０．０５），Ｄ组（１６
ｍｇ／头）３５ｄ时凋亡率达到最大，随后（５０～６０ｄ）显著性下降（犘＜０．０５）；细胞的坏死率Ａ组５０ｄ时较１ｄ时显著
下降（犘＜０．０５），Ｃ组（８ｍｇ／头）３５，５０ｄ时显著下降（犘＜０．０５），但６０ｄ时开始呈上升趋势（犘＞０．０５），而Ｄ组（１６
ｍｇ／头）坏死率呈现下降趋势，且在５０，６０ｄ时均显著低于注射 ＭＴ之前的血淋巴细胞坏死率；３５ｄ时，Ａ组的线粒
体膜电位值（ΔΨｍ）最高，但上升速度最快的是Ｂ组（４ｍｇ／头），在３５ｄ时显著高于２０ｄ时的ΔΨｍ（犘＜０．０５）；５０
ｄ时Ａ组和Ｂ组的ΔΨｍ不但不上升，反而下降，其中Ａ组下降的速度更快，３５～５０ｄＣ组（８ｍｇ／头）保持基本恒
定，６０ｄ略有上升，Ｄ组（１６ｍｇ／头）１～３５ｄ时逐步上升，５０～６０ｄ时保持恒定。在６０ｄ时，ΔΨｍ与注射 ＭＴ浓度
呈正相关。说明外源性 ＭＴ不仅能提高热应激状态动物的体质，还可让泌乳母牛从热应激状态平稳的过渡到热应
激损伤修复状态，若注射８～１６ｍｇ／头，能抑制南方泌乳母牛夏季热应激引起的滞后效应。
关键词：金属硫蛋白；中国荷斯坦奶牛；细胞凋亡；细胞坏死；线粒体膜电位
中图分类号：Ｓ８２３．９＋１　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１３）０４０２０５０７
犇犗犐：１０．１１６８６／ｃｙｘｂ２０１３０４２５　　
　　动物热应激初期可通过自身调节来减弱热应激反应，而一旦超过自身调节的范围，淋巴细胞凋亡率则大大增
加。对奶牛乳腺上皮细胞高温处理后，６ｈ凋亡率达到高峰，而后逐渐降低，细胞凋亡率随热应激程度的不同而
不断变化，并表现出细胞凋亡滞后效应［１］。而我国南方大部分地区属亚热带季风气候，全年高温高湿气候时间
长，加上全球气候变暖的影响［２］，使得奶牛受热应激影响尤其之大，这也是我国奶牛平均年产奶量不高的主要因
素［３］，这样提高奶牛热耐受能力就显得尤为重要了。金属硫蛋白（ｍｅｔａｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ，ＭＴ）可显著提高奶牛血液中
谷胱甘肽过氧化酶（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＧＳＨＰＸ）和红细胞中超氧化物歧化酶（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ，
ＳＯＤ）活性，提高抗氧化酶ＳＯＤ基因表达水平［４６］。在细胞和组织中起保护ＤＮＡ、蛋白质和脂质免遭氧化应激损
伤的重要作用。ＭＴ具有调控细胞凋亡功能是通过其抗氧化作用，提高ＡＴＰ酶活性，保护线粒体功能和抑制促
凋亡蛋白表达［７］，或通过影响Ｂｃｌ２家族蛋白（又称细胞凋亡调节蛋白）表达而抑制应激引起细胞凋亡［８，９］，或通
过抑制线粒体ＣｙｔＣ释放及细胞凋亡蛋白酶Ｃａｓｐａｓｅ３活化，或抑制Ｐ５３基因表达［１０］，进而抑制细胞凋亡而实现
的［１１］。低水平活性氧（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）促进细胞增生，高水平ＲＯＳ则促进线粒体介导的细胞凋
亡［１２］，这是因为高水平ＲＯＳ使得位于线粒体内外膜交接处的一种复合结构———线粒体通透性转换孔（ＭＰＴＰ）
开放，线粒体跨膜电位消失，耗氧量及ＡＴＰ合成降低，释放Ｃａ２＋、细胞色素Ｃ、凋亡诱导因子（ＡＩＦ）富含半胱氨酸
的蛋白酶以及膜间隙中的其他凋亡因子，启动凋亡［１３］。因此线粒体膜电位值（ΔΨｍ）下降为凋亡早期阶段，并为
第２２卷　第４期
Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．４
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
２０５－２１１
２０１３年８月
收稿日期：２０１２０９０４；改回日期：２０１２１１０５
基金项目：国家自然科学基金项目（３１０７２０５３；３０６７１５１６），湖南省自然科学基金重点项目（１１ＪＪ２０１４），教育部高等学校博士学科点专项科研基金
（博导类）项目（２０１０４３２０１１０００１）和湖南省博士生科技创新基金项目（ＣＸ２０１０Ｂ２８４）资助。
作者简介：吴力专（１９７３），女，湖南醴陵人，讲师，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｌｉｚｈｕａｎｗ１１１１＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｚｈｂ８２３６＠１２６．ｃｏｍ，ｌｉｌｉ＠ｉｓａ．ａｃ．ｃｎ
凋亡特异性变化。本次通过 ＭＴ对细胞凋亡、坏死及线粒体膜电位作用的研究，有助于深入了解 ＭＴ对热氧化
应激引起的细胞凋亡的机制，旨在揭示 ＭＴ对中国南方泌乳母牛抗热氧化应激的机理及夏季高热病防治的理论
研究及其在奶业安全生产中的应用提供科学依据，且 ＭＴ对动物血淋巴细胞的凋亡、坏死以及线粒体膜电位的
调节作用也鲜见报道。
１　材料与方法
１．１　金属硫蛋白（Ｚｎ－ＭＴ）
系参照李丽立［１４］建立硫酸锌诱导法，从中国荷斯坦奶牛公犊肝脏诱导、提取、纯化的ＺｎＭＴ。
１．２　试验动物的选择、饲养与试验设计
饲养试验地点在湖南亚华集团畜牧公司奶牛养殖示范基地———长沙市望城区白箬铺镇胜和奶牛养殖场；动
物饲养时间为２０１１年７－１０月。选取健康、体重５００～６００ｋｇ、年龄４～６岁、产犊期相近且以往产奶性能相似的
中国荷斯坦泌乳母牛２０头，供试牛在同一幢双列式牛舍，１头／牛床，拴养。每日挤奶２次，喂料２次，刷拭体表１
次，清扫牛舍２次，自由饮水。预饲期为７月２３日－８月６日，正式试验期为８月７日－１０月６日，时间为６０ｄ，
此期间舍内温湿指数［ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｈｕｍｉｄｉｔｙｉｎｄｅｘ，ＴＨＩ，又称不适指数，是气温和气湿相结合用于估计炎热程
度的一个综合指标，计算公式为 ＴＨＩ＝０．８１Ｔｄ＋（０．９９Ｔｄ－１４．３）ＲＨ＋４６．３，其中，Ｔｄ（ｄｒｙｂｕｌｂｔｅｍｐｅｒａ
ｔｕｒｅ）———舍内干球温度，ＲＨ（ｒｅｌａｔｉｖｅｈｕｍｉｌｉｔｙ）———舍内空气相对湿度［１５］。］变化见图１。当ＴＨＩ高于７２时，奶
牛进入热应激状态。在注射 ＭＴ时奶牛正处于热应激
图１　舍内温湿指数变化情况
犉犻犵．１　犞犪狉犻犪狋犻狅狀狅犳狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲犺狌犿犻犱犻狋狔犻狀犱犲狓犻狀狊犺犲犱
状态，４０ｄ进入热应激损伤恢复期。日粮组成［１６］见表１。
采用随机区组设计，根据不同产奶量和生理时期
均分为４组，每组５头，Ａ为对照组，Ｂ、Ｃ、Ｄ为试验
组，依次静脉注射２０ｍＬ生理盐水溶解的Ｚｎ－ＭＴ
０．０，４．０，８．０和１６．０ｍｇ／头。预试期７ｄ，正试期６０ｄ。
１．３　采样与测定项目
１．３．１　采样　试验期第１（注射 ＭＴ前），２０，３５，５０
和６０天（时间递减）分别从供试牛颈静脉采全血１０
ｍＬ／头·次，采用牛淋巴细胞分离液提取淋巴细胞，用
ＰＢＳ洗涤细胞２次，以备１２ｈ内染色或装载探针后上
流式细胞仪进行检测，流式细胞仪为美国ＢＥＣＫＭＡＮ
公司生产，型号为ＥＸＰ０３２ＡＤＣＸＬ。
表１　奶牛采食日粮组成及成分
犜犪犫犾犲１　犐狀犵狉犲犱犻犲狀狋狊犪狀犱犮狅犿狆狅狊犲狅犳犳犲犲犱犳狅狉犮狅狑狊
平均采食
Ａｖｅｒａｇｅｆｅｅｄｉｎｇ
鲜重
Ｆｒｅｓｈｗｅｉｇｈｔ
日粮成分
Ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｄｉｅｔ
采食量Ｆｏｏｄｉｎｔａｋｅ
（ｇ／ｄ·头Ｃａｐｉｔａ）
精料Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ｋｇ／ｄ·头Ｃａｐｉｔａ） ４．３２２ 粗蛋白Ｃｒｕｄｅｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＰ） ２０１６
豆渣Ｂｅａｎｄｒｅｇｓ（ｋｇ／ｄ·头Ｃａｐｉｔａ） ３．６３６ 粗灰分Ｃｒｕｄｅａｓｈ（ＣＡ） ８６５
酒糟Ｖｉｎａｓｓｅ（ｋｇ／ｄ·头Ｃａｐｉｔａ） ３．８４２ 粗脂肪Ｃｒｕｄｅｆａｔ（ＣＦ） ８０４
牛鞭草犎犲犿犪狉狋犺狉犻犪犼犪狆狅狀犻犮犪（ｋｇ／ｄ·头Ｃａｐｉｔａ） ２５．０６７ 钙Ｃａｌｃｉｕｍ（Ｃａ） ２１７
总能Ｔｏｔａｌｅｎｅｒｇｙ（ＮＮＤ／ｄ·头Ｃａｐｉｔａ） ７５．８７９ 磷Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ（Ｐ） １６
中性洗涤纤维Ｎｅｕｔｒａｌｄｅｔｅｒｇｅｎｔｆｉｂｅｒ（ＮＤＦ） １０６２８
酸性洗涤纤维Ａｃｉｄｄｅｔｅｒｇｅｎｔｆｉｂｅｒ（ＡＤＦ） ４６１５
酸性不溶木质素Ａｃｉｄｄｅｔｅｒｇｅｎｔｌｉｇｎｉｎ（ＡＤＬ） １１７０
６０２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．４
１．３．２　产奶性能　计量校正标准产奶量［１７］／日·头，乳脂率测定采用红外线乳品分析仪，红外线乳品分析仪由
瑞典 ＭＩＲＩＳ公司生产，型号为ＤＭＡＳＹＲＩＮＧＥ。
１．３．３　细胞凋亡率和坏死率　采用ＡｎｎｅｘｉｎＶＦＩＴＣＡｐｏｐｔｏｓｉｓＫｉｔ（北京索莱宝公司生产）检测，上机前预先设
置模式：将１管细胞均分成ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ五管，每管约１×１０６ 个细胞；ａ管不加任何试剂，作阴性对照管；ｂ管加１％
多聚甲醛中固定３０ｍｉｎ，用ＡｎｎｅｘｉｎＶ和ＰＩ双染，作阳性对照；ｃ管加１０μＬＰＩ液，室温避光孵育１５ｍｉｎ；ｄ管加
５μＬＡｎｎｅｘｉｎＶ液，室温避光孵育１５ｍｉｎ；ｅ管加１０μＬＰＩ液和５μＬＡｎｎｅｘｉｎＶ液，室温避光孵育１５ｍｉｎ；每管
各加４００μＬ的ＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ（１×）重悬，上机：检测阴性对照管（ａ），建立ＡｎｎｅｘｉｎＶｖｓＰＩ双参数点图，建立十
字门，确定阴性范围。调节电压将阴性细胞置于该区域；上ｄ管，通过调节补偿将ＦＩＴＣ漏入ＦＬ３的荧光去掉；上
ｃ管，通过补偿将ＰＩ漏入ＦＬ１的荧光去掉；上阳性对照（ｂ）将十字门位置上调，大致包含双阳性细胞的９０％；上
检测管（ｅ），并读数，将该模式保存，各待测样品按ｅ管进行检测。
１．３．４　淋巴细胞膜电位（ΔΨｍ）　以ＪＣ１（江苏省碧云天生物技术研究所生产）为荧光探针。对于大多数细胞，
通常１０μｍｏｌ／ＬＣＣＣＰ处理２０ｍｉｎ后，线粒体的膜电位会完全丧失，取刚出生牛犊血淋巴细胞做阴性对照，按
ＣＣＣＰ终浓度为１０μｍｏｌ／Ｌ加到细胞培养液中培养２０ｍｉｎ后，用ＰＢＳ洗涤２次后，将待测细胞样品与阴性对照
同时悬浮于０．５ｍＬ含有１０％新生牛血清的ＲＭＰＩ１６４０中，然后再加０．５ｍＬ的ＪＣ１工作液，混匀，３７℃孵育２０
ｍｉｎ，洗涤细胞２次后重悬，上机，用阴性对照设置成界线上为０．１％，表示此细胞的线粒体膜电压为０，然后上待
测细胞，界线上下细胞百分率之比值即为线粒体膜电压值。
１．４　数据处理与统计分析
采用ＳＡＳ８．１统计软件，Ａｎｏｖａ程序分析，Ｄｕｎｃａｎ多重比较。
２　结果与分析
２．１　外源性 ＭＴ对奶牛产奶性能的影响
注射 ＭＴ之前，各组动物的产奶量无差异（表２），在注射 ＭＴ后，对照组动物产奶量有一定程度的下降，但各
时间段无显著性差异 （犘＞０．０５），而试验各组各阶段产奶量保持基本恒等水平；５１～６０ｄ时Ｃ和Ｄ组略微有上
升的趋势（犘＞０．０５），各试验组动物产奶量均显著性的高于Ａ组（犘＜０．０５），说明 ＭＴ虽然不能快速提高处于热
应激状态的泌乳母牛产奶量，但是能加快奶牛热应激损伤的修复速度，从而改善生产性能，其中以Ｃ、Ｄ组效果较好。
表２　各组奶牛的校正平均标准乳产量
犜犪犫犾犲２　犕犻犾犽狆狉狅犱狌犮犻狀犵犪犫犻犾犻狋狔狅犳狋犺犲犮狅狑狊犻狀犱犻犳犳犲狉犲狀狋犵狉狅狌狆狊 ｋｇ／（ｄ·头Ｃａｐｉｔａ）
时间Ｔｉｍｅ（ｄ） Ａ组ＧｒｏｕｐＡ Ｂ组ＧｒｏｕｐＢ Ｃ组ＧｒｏｕｐＣ Ｄ组ＧｒｏｕｐＤ
－１５～０ ２７．６１０７±８．４０２７Ａａ ２１．３１６８±１３．２３８８Ａａ ２３．２１５３±１９．４８６５Ａａ ２２．６３９１±１６．０２７１Ａａ
１～２０ ２７．７８７３±７．０３４９Ａａ １９．６４０７±１０．７５５２Ａａ ２８．４５０４±２７．９４３９Ａａ ２２．９２２７±１７．２５６５Ａａ
２１～３５ ２０．４８０３±３．４９０５ＡＢａ １６．５１２１±１０．４１５５Ａａ ２８．０６６０±２９．２８９１Ａａ １８．７８９３±１４．８３７９Ａａ
３６～５０ １９．７８８６±３．７５９５ＡＢａ ２０．１１５７±１２．６０９９Ａａ ２４．４９９７±２６．１３７７Ａａ １８．４６６６±１４．９８９２Ａａ
５１～６０ １６．９４０９±４．０１４４Ｂａ １８．２６５０±１４．２０２５Ａａ ３３．２６２９±３３．０５５５Ａａ ２４．５０７９±８．６５０２Ａａ
　注：同列相同小写字母表示差异不显著（犘＞０．０５），不同小写字母表示差异显著（犘＜０．０５）；同行相同大写字母表示差异不显著（犘＞０．０５），不同大
写字母表示差异显著（犘＜０．０５）。下同。
　Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅｒｅａｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓａｍｏｎｇｆｉｇｕｒｅｓｉｎｔｈｅｓａｍｅｃｏｌｕｍｎｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｓｕｃｈａｓａ，ｂｏｒｂ，ｃ（犘＜０．０５）ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｒｅ
ａｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓａｍｏｎｇｆｉｇｕｒｅｓｉｎｔｈｅｓａｍｅｒｏｗｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｓｕｃｈａｓＡ，ＢｏｒＢ，Ｃ（犘＜０．０５）ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．
２．２　外源性 ＭＴ对奶牛血淋巴细胞凋亡率的影响
外源性 ＭＴ对奶牛血淋巴细胞凋亡有调节作用（表３），Ａ组凋亡率均值变化较大，但由于个体差异较大而没
有显著性下降（犘＞０．０５）；Ｂ组动物的凋亡率均值基本保持在１１％～２１％的恒定水平范围内（犘＞０．０５）；Ｃ组在
３５ｄ时显著性低于Ｂ、Ｄ组（犘＜０．０５），但与对照组无显著性差异（犘＞０．０５）；Ｄ组对泌乳母牛的影响较大，３５ｄ
７０２第２２卷第４期 草业学报２０１３年
时凋亡率均值达到最大，５０，６０ｄ时淋巴细胞凋亡率则呈显著性下降（犘＜０．０５）。说明 ＭＴ对奶牛热应激的直接
抑制作用以８ｍｇ／头为佳，但是热应激损伤后修复还是以注射１６ｍｇ／头的剂量更适宜。
２．３　外源性 ＭＴ对奶牛血淋巴细胞坏死率的影响
外源性 ＭＴ对奶牛血淋巴细胞坏死率作用规律与凋亡率的作用规律不同（表４）：对照组动物在５０ｄ时较１
ｄ时的坏死率显著下降（犘＜０．０５），６０ｄ时又略有上升（犘＞０．０５）；Ｂ组的淋巴细胞坏死率的变动幅度不大（犘＞
０．０５）；Ｃ组在３５，５０ｄ时细胞坏死率显著下降（犘＜０．０５），但６０ｄ时同样开始呈上升趋势（犘＞０．０５）；而Ｄ组淋
巴细胞坏死率呈现下降趋势，并且在５０，６０ｄ时均显著低于注射 ＭＴ之前的血淋巴细胞坏死率；且３５ｄ时，Ｃ组
的血淋巴细胞坏死率显著性低于Ｄ组动物血淋巴细胞的坏死率（犘＜０．０５）。由此可推测当注射 ＭＴ量为８
ｍｇ／头时，可改善动物体质，减缓抗热应激作用所发生体质减弱的现象，作用期为３５～５０ｄ，若注射量增加到１６
ｍｇ／头时，对热应激过程中所发生体质减弱的现象作用不明显，但可抑制热应激滞后效应所带来的动物体质减弱
的问题，作用期可超过６０ｄ，见效时间反而比８ｍｇ／头慢。
表３　各组奶牛血淋巴细胞凋亡率的变化
犜犪犫犾犲３　犞犪狉犻犪狋犻狅狀狉犪狋犲狅犳犾狔犿狆犺狅犮狔狋犲狊犪狆狅狆狋狅狊犻狊犻狀犱犻犳犳犲狉犲狀狋犵狉狅狌狆狊 ％
时间Ｔｉｍｅ（ｄ） Ａ组ＧｒｏｕｐＡ Ｂ组ＧｒｏｕｐＢ Ｃ组ＧｒｏｕｐＣ Ｄ组ＧｒｏｕｐＤ
１ ９．４２±５．５３６０Ａａ １１．３０±１４．０１２９Ａａ １２．０８±２．３９７３Ａａ １９．７０±８．１８０２Ａａｂ
２０ １８．０８±２６．３０６６Ａａ １４．５３±１０．０４５５Ａａ ８．７８±７．９２６０Ａａ １５．１２±１５．２８１３Ａａｂ
３５ １８．９０±１２．２６８５ＡＢａ ２０．７４±９．６１５５Ａａ ５．９０±８．８３５４Ｂａ ２５．１２±９．２０３６Ａａ
５０ ５．３０±５．９９０８Ａａ １３．３２±１２．４１１４Ａａ ５．６４±５．９０８７Ａａ ８．０４±７．９８９２Ａｂ
６０ ０．４２±０．４１４７Ａａ １４．１８±１９．３８３７Ａａ ２．２０±２．３７０７Ａａ ８．１５±６．０３５５Ａｂ
表４　各组奶牛血淋巴细胞坏死率的变化
犜犪犫犾犲４　犞犪狉犻犪狋犻狅狀狉犪狋犲狅犳犾狔犿狆犺狅犮狔狋犲狊狀犲犮狉狅狊犻狊犻狀犱犻犳犳犲狉犲狀狋犵狉狅狌狆狊 ％
时间Ｔｉｍｅ（ｄ） Ａ组ＧｒｏｕｐＡ Ｂ组ＧｒｏｕｐＢ Ｃ组ＧｒｏｕｐＣ Ｄ组ＧｒｏｕｐＤ
１ １１．４８±９．６０１１Ａａ １５．７８±１０．２１４３Ａａ １３．９２±１３．３４７０Ａａ １４．７６±８．９３６６Ａａ
２０ ７．９８±５．１３７３Ａａｂ １１．７８±８．９００４Ａａｂ ９．７２±６．８３０２Ａａ １１．６２±７．１６１５Ａａｂ
３５ ９．３６±２．９６１１ＡＢａｂ ９．９６±６．０４８０ＡＢａｂ ３．７４±３．１６９１Ｂｂ １２．７６±８．５０９０Ａａｂ
５０ ３．２４±１．１４５９Ａｂ ７．８６±８．９５９５Ａａ ３．５８±１．３４２４Ａｂ ４．９４±４．９８３８Ａｂ
６０ ５．３６±２．９７０４Ａａｂ ７．８４±７．３１８７Ａａｂ ６．００±５．４９４５Ａａ ４．７５±１．３２７６Ａｂ
２．４　外源性 ＭＴ对奶牛血淋巴细胞线粒体膜电位（ΔΨｍ）的影响
由于热应激损伤的影响，各组动物血淋巴细胞的ΔΨｍ在１，２０ｄ时均低（图２），说明热应激确实对细胞线粒
体损伤的作用很强；３５ｄ时动物的环境温湿指数仍高于７２，动物处于热应激状态，ΔΨｍ均升高，尤其是对照组，
ΔΨｍ最高，Ｂ组显著高于２０ｄ的ΔΨｍ（犘＜０．０５），试验各组随着 ＭＴ注射量增加，ΔΨｍ反而依次降低。但热
应激损伤恢复期到来后，５０ｄ时Ａ组和Ｂ组的ΔΨｍ不但不上升，反而下降，但对照Ａ组下降的速度更快，Ｃ组
保持基本恒定，Ｄ组不降反升；６０ｄ时，各试验组的ΔΨｍ上升，并且随着 ＭＴ注射量的升高，ΔΨｍ依次升高，与
注射 ＭＴ浓度呈正相关。可见，ＭＴ可以通过调节线粒体的膜电压来智能双向调节细胞内的能量供应，使得泌乳
母牛从热应激状态平稳的过渡到热应激损伤修复状态，以注射８～１６ｍｇ／头为佳。
３　讨论
热应激不仅仅发生在夏季的炎热季节，同时也可发生在天气已经转凉的秋季（１０－１１月份），这就是典型的
夏季热应激影响的滞后效应［１５］，即动物体内生理状态对热应激损伤恢复期间体内机能变化的不适应性，从本次
研究结果来看，固然 ＭＴ对抗热应激的效果有限，但对提高奶牛热应激期间的体质以及对热应激影响的滞后效
８０２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．４
应有着较强的抑制作用是毋庸置疑的，能使泌乳母牛平稳的从热应激状态过渡到热应激损伤恢复期。如表２中
所示各奶牛的产奶量，在３５ｄ后，对照组的产奶量呈现下降趋势，而试验各组奶牛产奶量在略有升高的情况下显
著高于Ａ组的产奶量。说明 ＭＴ对处于热应激状态的泌乳母牛体质具有较好的保护作用，同时可以减轻外界热
环境的快速变化对动物不良影响。
图２　犕犜对奶牛血淋巴细胞线粒体膜电位的影响
犉犻犵．２　犈犳犳犲犮狋狅犳犕犜狅狀犫犾狅狅犱犾狔犿狆犺狅犮狔狋犲狊犿犻狋狅犮犺狅狀犱狉犻犪犾狋狉犪狀狊犿犲犿犫狉犪狀犲狆狅狋犲狀狋犻犪狅犳犮狅狑狊
　不同时间同组之间用相同小写字母表示差异不显著（犘＞０．０５），相邻小写字母表示差异显著（犘＜０．０５）；不同组同一时间之间用相同大写字母表
示差异不显著（犘＞０．０５），相邻大写字母表示差异显著（犘＜０．０５）。Ｔｈｅｒｅａｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓａｍｏｎｇｆｉｇｕｒｅｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔａｇｅｓｉｎｔｈｅｇｒｏｕｐ
ｓｕｃｈａｓａ，ｂｏｒｂ，ｃ（犘＜０．０５）ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｒｅａｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓａｍｏｎｇｆｉｇｕｒｅｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｒｏｕｐｓｏｎｔｈｅｓａｍｅｓｔａｇｅｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓ
ｓｕｃｈａｓＡ，ＢｏｒＢ，Ｃ（犘＜０．０５）ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
　
　　细胞凋亡是一把“双刃剑”，一方面是机体发育的正常过程，另一方面如果细胞凋亡过速，则会导致慢性退行
性病变［１３］。因此淋巴细胞的凋亡保持在一个较低且恒定的水平时，既不影响免疫性能的发挥，又能及时增殖更
新细胞。从表３来看，ＭＴ对泌乳母牛的血淋巴细胞的凋亡具有较好的调节作用，如注射８ｍｇ／头（２０ｄ后）、１６
ｍｇ／头（３５ｄ后）的动物血淋巴细胞凋亡率开始降低，而后基本维持在较低且恒定的水平；而Ａ组，在热应激状态
时（１～３５ｄ），细胞凋亡率迅速上升，最高可达４０％，使得奶牛的免疫性能受到抑制，后进入热应激损伤恢复期
（５０～６０ｄ）则细胞凋亡率又迅速下降，低达０．４％，抑制血淋巴细胞的增殖更新。细胞坏死是细胞受到强烈理化
或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程，和细胞凋亡不同，它是由于离子平衡调节失调，被动进行的病理
死亡方式，其后果会引起炎症反应。若动物体内淋巴细胞的坏死率较大时，说明动物机体状态处于病理状态，反
之，动物则较健康。ＭＴ提高动物体质是一个渐变的过程（表４），Ａ组动物表现为在热应激期（０～３５ｄ），细胞坏
死率水平持续保持较高水平，在热应激损伤恢复初期（５０ｄ时）迅速下降，但在６０ｄ又有增加的趋势；试验各组随
ＭＴ浓度增加，对动物细胞坏死抑制的作用时间越来越长，如Ｃ组（８ｍｇ／头）作用时间为５０ｄ，Ｄ组（１６ｍｇ／头）
作用时间则超过６０ｄ。而我国南方各地区的奶牛每年处于热应激状态时间大部分超过４０ｄ。
在脊椎动物细胞凋亡过程中，线粒体被认为是处于凋亡调控的中心位置，ΔΨｍ是线粒体内膜两侧电子的不
对称分布所造成的，线粒体内膜的低通透性和电化学质子梯度是维持膜电位的基础。研究证实细胞凋亡的早期
阶段，在细胞核病理改变出现前ΔΨｍ已经下降。Ｈ２Ｏ２ 诱导心肌细胞凋亡时，ΔΨｍ下降，并且胞浆内的Ｂａｄ转
移到线粒体，随后Ｂａｄ与Ｂｃｌ２均降解［１８］。从本研究结果来看（图２），ＭＴ抑制泌乳母牛热应激引起的细胞凋亡
信号转导通路之一是线粒体通路，并通过智能双向调节ΔΨｍ来调节动物体内血淋巴细胞凋亡，在动物热应激
期，如Ａ组３５ｄ时ΔΨｍ最高（图２），与５０，６０ｄ时细胞凋亡率Ａ组最低相对应（表３），则意味着此时动物体内
细胞的耗氧量增加，体内的ＡＴＰ合成量增加，由于热应激的作用，此时动物体质最差，体内相应的代谢反应速度
较慢，此时过量的ＡＴＰ大部分可能会以热量的形式散失，从而增加动物体温调节的负担，因此出现后期（５０，６０
９０２第２２卷第４期 草业学报２０１３年
ｄ）ΔΨｍ迅速下降的现象（图２），此时动物就表现为热应激导致细胞凋亡和夏季热应激影响的滞后效应；而注射
ＭＴ组，在热应激期，ΔΨｍ并没有大幅度升高，使得动物耗氧量和ＡＴＰ生成量均不会增加太大，缓解了动物体
温调节的压力，而后在热应激损伤修复期逐步增加ΔΨｍ并保持恒定，使得动物逐步恢复ＡＴＰ的生成量，保证动
物热应激损伤恢复期各生理代谢反应逐步增强所需的氧和能量，规避了热应激引起的滞后效应。另外，ＭＴ的线
粒体信号转导途径调节细胞凋亡也是一个渐变的过程（图２），即随着 ＭＴ浓度增加，对热应激损伤恢复期前期的
ΔΨｍ抑制作用越强，而在后期，开始促进ΔΨｍ的升高，随着浓度的增加，使ΔΨｍ保持恒定的高水平的能力越
强，如Ｄ组（１６ｍｇ／头）在５０，６０ｄ时ΔΨｍ达到恒定，而此时的Ｂ（４ｍｇ／头）和Ｃ组（８ｍｇ／头）ΔΨｍ均比Ｄ组的
低。
由此可见，静脉注射 ＭＴ可用来提高南方泌乳母牛抗热应激力，且能有效预防高热病和热应激滞后效应，若
年热应激时间不超过４０ｄ，可采用注射剂量为８ｍｇ／头，年热应激时间超过４０ｄ，则宜注射 ＭＴ１６ｍｇ／头。
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犈犳犳犲犮狋狊狅犳犲狓狅犵犲狀狅狌狊犿犲狋犪犾狅狋犺犻狅狀犲犻狀狅狀犫犾狅狅犱犾狔犿狆犺狅犮狔狋犲狊犪狆狅狆狋狅狊犻狊犪狀犱犿犻狋狅犮犺狅狀犱狉犻犪犾
狋狉犪狀狊犿犲犿犫狉犪狀犲狆狅狋犲狀狋犻犪犾狅犳犆犺犻狀犪犎狅犾狊狋犲犻狀犮狅狑狊
ＷＵＬｉｚｈｕａｎ１，２，ＬＵＯＪｉａｊｉｅ１，ＺＨＡＮＧＢｉｎ１，ＬＩＬｉｌｉ３，ＬＵＯＲｕｉ１，ＺＨＡＮＪｉｎｓｈｕｎ１
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ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１０１２５，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｅｘｏｇｅｎｏｕｓｍｅｔａｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ（ＭＴ）ｏｎｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｎｅｃｒｏｓｉｓａｎｄｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ
ｍｅｍｂｒａｎｅｖｏｌｔａｇｅ（ΔΨｍ）ｏｆＣｈｉｎａＨｏｌｓｔｅｉｎｃｏｗｓｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｕｓｉｎｇ２０ｌａｃｔａｔｉｎｇｃｏｗｓｉｎｈｅａｔｓｔｒｅｓｓ．Ｔｈｅｙ
ｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙａｌｏｃａｔｅｄｔｏｇｒｏｕｐｓＡ，Ｂ，ＣａｎｄＤ．ＭＴｗａｓｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄａｔ０．０，４．０，８．０ａｎｄ１６．０ｍｇ／ｃａｐｉ
ｔａ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｂｙｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．ＣｏｒｒｅｃｔｅｄｍｉｌｋｙｉｅｌｄｓｉｎｇｒｏｕｐｓＢ，Ｃ，ａｎｄＤｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｈｉｇｈｅｒ
ｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎｇｒｏｕｐＡａｆｔｅｒｂｅｉｎｇｉｎｊｅｃｔｅｄＭＴｄｕｒｉｎｇｄａｙｓ５１－６０（犘＜０．０５）；ａｔ３５ｄ，ｔｈｅｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓａｐｏｐ
ｔｏｓｉｓｒａｔｅｏｆｇｒｏｕｐＣ（８ｍｇ／ｃａｐｉｔａ）ｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｏｆｇｒｏｕｐｓＢａｎｄＤ（犘＜０．０５），ｂｕｔｗａｓ
ｎｏｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆｒｏｍｇｒｏｕｐＡ（犘＞０．０５）．ＴｈｅｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓａｐｏｐｔｏｓｉｓｒａｔｅｏｆｇｒｏｕｐＤ（１６ｍｇ／ｃａｐｉ
ｔａ）ｗａｓｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔａｔ３５ｄ（犘＜０．０５）ｂｕｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（犘＜０．０５）ｄｅｃｒｅａｓｅｄｄｕｒｉｎｇｄａｙｓ５０－６０；Ｃｏｍｐａｒｅｄｔｏ
１ｄ，ｔｈｅｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｎｅｃｒｏｓｉｓｒａｔｅｏｆｇｒｏｕｐＡｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（犘＜０．０５）ｄｅｃｒｅａｓｅｄａｔ５０ｄ，ｇｒｏｕｐＣ（８ｍｇ／ｃａｐｉ
ｔａ）ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（犘＜０．０５）ｄｅｃｒｅａｓｅｄａｔ３５ｄａｎｄ５０ｄ，ａｎｄｂｅｇａｎｔｏｓｈｏｗａｒｉｓｉｎｇｔｒｅｎｄａｔ６０ｄ（犘＞０．０５），
ｗｈｉｌｅｇｒｏｕｐＤ（１６ｍｇ／ｃａｐｉｔａ）ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄａｔ５０ｄａｎｄ６０ｄ．Ｔｈｅｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｍｅｍｂｒａｎｅｖｏｌｔａｇｅ
（ΔΨｍ）ｏｆｇｒｏｕｐＡｗａｓｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔａｔ３５ｄ，ｂｕｔｔｈｅΔΨｍｏｆｇｒｏｕｐＢｒｏｓｅｆａｓｔｅｓｔａｔ３５ｄ（犘＜０．０５），ａｎｄｗａｓ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎａｔ２０ｄ（犘＜０．０５）．ＴｈｅΔΨｍｏｆｇｒｏｕｐｓＡａｎｄＢｄｅｃｒｅａｓｅｄａｔ５０ｄｗｉｔｈｔｈａｔｏｆｇｒｏｕｐ
Ａｆａｌｉｎｇｆａｓｔｅｓｔ．ＴｈｅΔΨｍｏｆｇｒｏｕｐＣｗａｓｃｏｎｓｔａｎｔｄｕｒｉｎｇｄａｙｓ３５－５０ｂｕｔｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｌｉｇｈｔｌｙａｔ６０ｄ．Ｔｈｅ
ΔΨｍｏｆｇｒｏｕｐＤ（１６ｍｇ／ｃａｐｉｔａ）ｉｎｃｒｅａｓｅｄｇｒａｄｕａｌｙｄｕｒｉｎｇｄａｙｓ１－３５ａｎｄｒｅｍａｉｎｅｄｃｏｎｓｔａｎｔｄｕｒｉｎｇｄａｙｓ５１－
６０．ＴｈｅｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓΔΨｍａｎｄｉｎｊｅｃｔｅｄＭＴａｍｏｕｎｔｗｅｒｅｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙｃｏｒｒｅｌａｔｅｄａｔ６０ｄ．Ｉｎｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ，ｔｈｅ
ｈｅａｔｈｏｆｃｏｗｓｕｎｄｅｒｈｅａｔｓｔｒｅｓｓｃａｎｂｅｉｍｐｒｏｖｅｄ，ｂｙｅｘｏｇｅｎｏｕｓＭＴｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎｏｆ８－１６ｍｇ／ｃａｐｉ
ｔａ，ｃａｎｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｌａｇｇｅｄｅｆｆｅｃｔｓｏｆｓｏｕｔｈｅｒｎｓｕｍｍｅｒｈｅａｔｓｔｒｅｓｓｉｎｌａｃｔａｔｉｎｇｃｏｗ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｍｅｔａｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ；ＣｈｉｎａＨｏｌｓｔｅｉｎｃｏｗｓ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；ｎｅｃｒｏｓｉｓ；ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｍｅｍｂｒａｎｅｖｏｌｔａｇｅ
１１２第２２卷第４期 草业学报２０１３年