全 文 ：书犃狋犖犎犡１基因对菊苣的转化和耐盐性研究
赵宇玮１，２，王英娟１，步怀宇１，郝建国１，贾敬芬１
（１．西北大学生命科学学院，陕西 西安７１００６９；２．中国科学院西安光学精密机械研究所
瞬态光学与光子技术国家重点实验室，陕西 西安７１００６９）
摘要：用农杆菌介导法将犃狋犖犎犡１基因导入菊苣中，共获得４２株卡那霉素（Ｋａｎ）抗性再生植株。经过ＰＣＲ检测、
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和ＲＴ－ＰＣＲ检测表明，犃狋犖犎犡１基因已成功整合到菊苣基因组中，并且能够正常转录。野生型和
转基因植株诱发的愈伤组织进行耐盐生长试验，结果显示，相同盐胁迫条件下，转基因愈伤组织的相对生长率显著
高于野生型愈伤组织。施加梯度ＮａＣｌ胁迫后，植株叶片Ｋ＋和Ｎａ＋含量测定结果显示，转基因植株叶片比野生型
积累更多的Ｎａ＋和Ｋ＋，维持较高的Ｋ＋／Ｎａ＋；叶片相对电导率测定结果表明，转基因株系叶片相对电导率显著低
于野生型。上述结果表明，犃狋犖犎犡１基因的导入和表达在提高菊苣耐盐性的同时减轻了盐胁迫对植物细胞膜的伤
害。
关键词：犃狋犖犎犡１；菊苣；农杆菌；遗传转化；耐盐性
中图分类号：Ｑ９４３．２；Ｑ９４９．７８３．５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２００９）０３０１０３０７
菊苣（犆犻犮犺狅狉犻狌犿犻狀狋狔犫狌狊）是菊科菊苣属多年生草本植物，广泛分布于亚洲、欧洲、美洲及大洋洲，在我国主
要分布于“三北”地区。菊苣喜暖湿润性气候，但耐寒性能良好，抗病性强，在整个生育期极少发生病虫害，同
时，菊苣还具有一定的耐盐碱性，可在ｐＨ 值为８．２，含盐量０．１７％的土壤中良好生长，是一种高产优质的牧
草［１］。菊苣还是一种重要的经济作物和药材，其根系含有丰富的菊糖和芳香族物质，可提制代用咖啡（犆狅犳犳犲犪
狊狋犲狀狅狆犺狔犾犾犪），根中提取的苦味物质可提高动物消化器官的活动能力［２］；菊苣地上部分、根和种子可入药，是印度
及我国维吾尔族和蒙古族的习用药材［３］。开展菊苣的研究，尤其是培育具有较高耐旱、耐盐碱能力的菊苣品系工
作对西部地区水土保持和农业／畜牧业的发展具有一定的现实意义。目前，菊苣的生物学研究主要集中在高产栽
培技术研究［４］、植株化学成分分析［５］和药理学研究［６］方面，而采用基因工程技术对菊苣进行遗传改良的研究报道
较少［７～１０］。２０世纪９０年代以来用单一的 Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因转化番茄（犛狅犾犪狀狌犿犾狔犮狅狆犲狉狊犻犮狌犿）等植
物［１１～１５］的研究表明，超量表达外源液泡膜Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因能够显著提高受体植物的耐盐性。这预
示着人们有可能通过向目标植物导入１个或少数几个基因就能得到新的耐盐植物种质资源。本研究以菊苣的叶
片为外植体，应用农杆菌介导法将拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）液泡膜Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因犃狋犖犎犡１
导入菊苣，并初步分析了犃狋犖犎犡１基因在转基因植物基因组中的整合情况及转基因植物的耐盐性表达特性，为
培育耐盐牧草新品种（系）和进一步利用基因工程技术对菊苣进行遗传改良打下基础。
１ 材料与方法
１．１ 犃狋犖犎犡１基因的获得及农杆菌植物表达系统构建
以１００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ处理２４ｈ的拟南芥幼苗为试验材料，通过ＲＴ－ＰＣＲ克隆得到编码液泡膜Ｎａ＋／Ｈ＋逆
向转运蛋白长度为１６１７ｂｐ的犃狋犖犎犡１基因完整ＯＲＦ，进而将该ＯＲＦ与２ＥＣａＭＶ３５Ｓ启动子，ＴＭＶＲＮＡ５′
ＵＴＲ中的Ω片段和ＮＯＳｐｏｌｙＡ终止子串连在一起构建完整的犃狋犖犎犡１基因表达盒，然后将该表达盒插入到
双元植物表达载体ｐＮＴ质粒ＴＤＮＡ区的多克隆位点中，构建重组双元植物表达载体质粒ｐＮＴ犃狋犖犎犡１（图
１）。用液氮冻融法将ｐＮＴ犃狋犖犎犡１质粒导入农杆菌ＬＢＡ４４０４感受态细胞中，获得可以用于植物遗传转化研究
的工程农杆菌ＬＢＡ４４０４（ｐＮＴ犃狋犖犎犡１）。
第１８卷 第３期
Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．３
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
１０３－１０９
２００９年６月
收稿日期：２００８０７２３；改回日期：２００８１０１３
基金项目：陕西省教育厅基金项目（Ｎｏ．ＪＨ０６２３８），陕西省重点实验室科学研究计划项目（Ｎｏ．０８ＪＺ７１）和陕西省自然基金（２００７Ｃ１０４）资助。
作者简介：赵宇玮（１９７７），男，北京人，讲师，博士。Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｏｙｗ＠ｎｗｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：Ｊｉａｊｆ３８＠ｎｗｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
１．２ 植物材料
图１ 植物双元表达载体狆犖犜犃狋犖犎犡１质粒结构示意图
犉犻犵．１ 犛犽犲狋犮犺犿犪狆狅犳狋犺犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狏犲犮狋狅狉
狆犾犪狊犿犻犱狅犳狆犖犜犃狋犖犎犡１
菊苣的种子经常规灭菌后接种到不添加外源
激素的 ＭＳ培养基上，在（２５±２）℃和１６ｈ／ｄ，３６
μｍｏｌ／（ｓ·ｍ
２）的光照条件下萌发产生无菌苗。
１．３ 菊苣离体再生体系的建立
将萌发７～１４ｄ的无菌苗叶片切成０．５ｃｍ×
０．５ｃｍ小块，接种到 ＭＳ１（附加６ＢＡ１．５ｍｇ／Ｌ＋
ＮＡＡ０．２ｍｇ／Ｌ＋抗坏血酸１００ｍｇ／Ｌ＋蔗糖３％＋
琼脂０．７％，ｐＨ值５．８～６．２的ＭＳ）固体培养基上，
在（２５±２）℃和１６ｈ／ｄ，３６μｍｏｌ／（ｓ·ｍ
２）的光照条
件下培养２８ｄ，诱导愈伤组织。愈伤组织在 ＭＳ１ 培
养基上再次继代培养１４～２８ｄ分化出大量丛生不
定芽。当不定芽２～５ｃｍ高时，将其从愈伤组织上取下，插入到生根培养基 ＭＳ２（附加ＩＢＡ０．２ｍｇ／Ｌ＋蔗糖３％
＋琼脂０．７％，ｐＨ值５．８～６．２的１／２ＭＳ固体培养基）上，壮苗并生根。再生苗形成发达根系后，炼苗７～１０ｄ，
直接移栽到花卉营养土∶沙∶黄土＝１∶１∶１的混合土中，温室培养。
１．４ 农杆菌ＬＢＡ４４０４（ｐＮＴ犃狋犖犎犡１）对菊苣的遗传转化
农杆菌ＬＢＡ４４０４（ｐＮＴ犃狋犖犎犡１）活化培养至对数生长期，于４℃８０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ，弃去培养液，用
无菌的 ＭＳ０ 液体培养基重悬菌体稀释至ＯＤ６００＝０．５。将菊苣叶片切块浸在添加１０μｍｏｌ／Ｌ的乙酰丁香酮（ＡＳ）
的上述农杆菌菌液中侵染１０ｍｉｎ。农杆菌侵染后的外植体在添加２５ｍｇ／ＬＫａｎ的 ＭＳ１ 培养基上，经历常规共
培养和筛选培养，约９０ｄ后获得卡那霉素（Ｋａｎ）抗性愈伤组织。Ｋａｎ抗性愈伤组织分化出的绿色小苗生长到６
～８ｃｍ时，切下再生苗转接至添加２５ｍｇ／ＬＫａｎ的 ＭＳ２ 培养基，１６ｈ／ｄ，３６μｍｏｌ／ｓ·ｍ
２ 的光照条件下诱导生
根，转基因幼苗长出发达根系后移栽至土壤中。
１．５ Ｔ０ 代转基因植物的初步鉴定
１．５．１ 转基因植物的ＰＣＲ检测 采用十六烷基三乙基溴化铵（ＣＴＡＢ）微量法［１６］分别提取假定转基因植株和野
生型菊苣基因组ＤＮＡ。ＰＣＲ检测狀狆狋Ⅱ和犃狋犖犎犡１基因在转基因植物基因组中的整合状况。犃狋犖犎犡１基因
的 ＰＣＲ 引 物 序 列 如 下，上 游 引 物：５′ＣｇｇｇＡＴＣＣＡＣＣＡＴｇｇＴｇｇＡＴＴＣＴＣＴＡｇＴｇＴＣｇ３′，下 游 引 物：５′
ＡＣｇＣｇＴＣｇＡＣＴＣＡＡｇＣＣＴＴＡＣＴＡＡｇＡＴＣＡｇｇ３′。ＰＣＲ扩增体系２０μＬ，扩增程序为：９４℃ ４ｍｉｎ；９４℃ １
ｍｉｎ，６０℃１ｍｉｎ，７２℃１．５ｍｉｎ，３５个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ。狀狆狋Ⅱ基因保守序列ＰＣＲ引物序列如下，上游引
物：５′ＴＣＣｇｇＣＣｇＣＴＴｇｇｇＴｇｇＡｇＡｇ３′；下游引物：５′ＣＴｇｇＣｇＣｇＡｇＣＣＣＣＴｇＡＴｇＣＴ３′。ＰＣＲ扩增体系２０μＬ，
扩增程序为：９４℃３ｍｉｎ；９４℃１ｍｉｎ，６３．６℃３０ｓ，７２℃４５ｓ，３３个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ。ＰＣＲ产物经１．０％琼
脂糖凝胶电泳，由ＢｉｏｃａｐｔＭＷ凝胶成像系统记录结果。
１．５．２ 转基因植物的Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交检测 分别提取３０～４０μｇ假定转基因植株和野生型菊苣基因组
ＤＮＡ，以犃狋犖犎犡１基因中间５１０ｂｐ特异性序列为探针，按Ｒｏｃｈｅ公司的ＤＩＧＨｉｇｈＰｒｉｍｅｒＤＮＡＬａｂｅｌｉｎｇａｎｄ
ＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｔａｒｔｅｒＫｉｔＩＩ试剂盒使用说明进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ，质粒和基因组ＤＮＡ均使用购自 Ｔａｋａｒａ公司的
ＥｃｏＲＩ酶切。
１．５．３ 转基因植物的ＲＴ－ＰＣＲ检测 分别提取菊苣转基因植株和野生型植株总ＲＮＡ，用ＭＭＬＶ第一链ｃＤ
ＮＡ合成试剂盒进行逆转录。以ｃＤＮＡ的第一链为模板，ＰＣＲ扩增目的基因犃狋犖犎犡１，所用引物、反应体系、
ＰＣＲ程序同１．５．１。
１．５．４ 转基因植物愈伤组织对ＮａＣｌ胁迫的抗性试验 从不同转基因株系诱导的愈伤组织（愈伤组织编号与其
外植体转基因株系编号相同）和野生型愈伤组织经过２次传代培养后，分别接种到含不同浓度（０，５０，１００，１５０，
２００和２５０ｍｍｏｌ／Ｌ）ＮａＣｌ的 ＭＳ１ 培养基。每组处理２５块，设３组重复。在１６ｈ／ｄ，３６μｍｏｌ／（ｓ·ｍ
２）光照，（２５
±２）℃条件下培养２８ｄ，统计愈伤组织相对生长量。
４０１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．３
１．５．５ 转基因植物在ＮａＣｌ胁迫下的叶片Ｎａ＋、Ｋ＋含量测定 取生长４周，高７～８ｃｍ，具有４～６片真叶的转
基因及野生型菊苣组培苗于培养皿中，用含不同浓度（０，５０，１００，１５０和２００ｍｍｏｌ／Ｌ）ＮａＣｌ的ＭＳ０ 液体培养基对
其进行浇灌。为了消除外源盐胁迫诱导菊苣自身抗逆基因的短时应激性表达对试验结果的影响（外源导入的
犃狋犖犎犡１基因为组成型表达），盐液浇灌２４ｈ后，剪取试验材料的叶片４５℃烘至恒重，参照王宝山和赵可夫［１７］
的方法，使用岛津ＡＡ６３００原子吸收分光光度计测定供试材料中的Ｎａ＋、Ｋ＋含量。
１．５．６ 转基因植物在ＮａＣｌ胁迫下的叶片电导率测定 分别取同１．５．５处理转基因菊苣及野生型组培苗新鲜
叶片０．５ｇ，加３０ｍＬ超纯水。１份于２５℃、１５０ｒ／ｍｉｎ振荡４ｈ，另一份煮沸５ｍｉｎ，然后分别用电导率仪ＤＤＢ
３０３Ａ测定２份溶液的电导率［１１］。前者定义为犚犮，后者定义为犚犮′，相对电导率＝犚犮／犚犮′×１００％。
２ 结果与分析
２．１ 转犃狋犖犎犡１基因菊苣再生植株的获得
农杆菌侵染的外植体于 ＭＳ０ 固体培养基上共培养３～７ｄ后，置于含Ｋａｎ２５ｍｇ／Ｌ＋Ｃｅｆ２５０ｍｇ／Ｌ的 ＭＳ１
选择培养基上诱导Ｋａｎ抗性愈伤组织。培养７～１０ｄ，外植体边缘开始形成大量愈伤组织（图２Ａ），但这些愈伤
组织中的绝大多数在含Ｋａｎ２５ｍｇ／Ｌ的 ＭＳ１ 培养基上继代培养过程中逐渐黄化或褐化，只有少数愈伤组织可以
分化出再生苗（图２Ｂ）。待再生绿苗生长到６～８ｃｍ高时，将其从母体愈伤组织上切下，随即插入附加２５ｍｇ／Ｌ
Ｋａｎ生根培养基ＭＳ２ 上诱导生根（图２Ｃ）。３周左右可形成生长健壮的Ｋａｎ抗性再生植株（图２Ｄ），经过炼苗，即
可移栽到土壤中（图２Ｅ）。
图２ 农杆菌介导转犃狋犖犎犡１基因菊苣的获得
犉犻犵．２ 犜狉犪狀狊犵犲狀犻犮犆犻犮犺狅狉犻狌犿犻狀狋狔犫狌狊狅犫狋犪犻狀犲犱狏犻犪犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿犿犲犱犻犪狋犲犱狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀
Ａ：外植体转化得到的Ｋａｎ抗性愈伤组织Ｋａｎｒｅｓｉｓｔａｎｔｃａｌｉｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｅｘｐｌａｎｔｓ；Ｂ：Ｋａｎ抗性细胞系分化得到的再生芽Ｔｈｅｒｅｇｅｎ
ｅｒａｔｅｄｐｌａｎｔｌｅｔｓｆｒｏｍＫａｎｒｅｓｉｓｔａｎｔｃａｌｉ；Ｃ：Ｋａｎ抗性植株生根ＲｏｏｔｉｎｇｏｆｔｈｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄＫａｎｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｌａｎｔｌｅｔｓ；Ｄ：Ｋａｎ抗性再生植株Ｔｈｅｒｅｇｅｎｅｒ
ａｔｅｄＫａｎｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｌａｎｔｌｅｔｓ；Ｅ：移栽的Ｋａｎ抗性再生苗．Ｋａｎｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｌａｎｔｌｅｔｓｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄｔｏｓｏｉｌ
２．２ 转基因植株的分子生物学鉴定
图３ 部分犜０ 代转基因植株的犘犆犚检测
犉犻犵．３ 犘犆犚犱犲狋犲犮狋犻狀犵狅犳狊狅犿犲犜０犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋狊
Ａ：犃狋犖犎犡１基因扩增结果Ａｍｐｌｉｆｙｏｆ犃狋犖犎犡１；Ｂ：狀狆狋Ⅱ基因扩增结果
Ａｍｐｌｉｆｙｏｆ狀狆狋Ⅱ；Ｍ：１ｋｂｐｌｕｓＤＮＡＭａｒｋｅｒ；１：野生型植株
Ｗｉｌｄｔｙｐｅｐｌａｎｔｓ；２～１５：１～１４号Ｔ０代转基因植株
Ｔ０ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓＮｏ．１－Ｎｏ．１４
２．２．１ 转基因植株的ＰＣＲ检测 分别以卡那霉素
抗性筛选标记基因狀狆狋Ⅱ保守区（４９１ｂｐ）和目的基
因犃狋犖犎犡１（１６１７ｂｐ）作为检测的靶 ＤＮＡ 进行
ＰＣＲ反应。在４２个假定Ｔ０ 代转基因植株中，１１个
植株的基因组ＤＮＡ能够扩增出预期的２种产物；
另７个植株基因组ＤＮＡ中只能检测到狀狆狋Ⅱ基因
的整合，而检测不到犃狋犖犎犡１基因（部分试验结果
见图３）；其余植株为假转化子。
２．２．２ 转基因植株的Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测 分别制
备野生型及２个经ＰＣＲ检验初步确定为转基因株
系的菊苣植株基因组ＤＮＡ用ＥｃｏＲＩ完全酶解后，
进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ试验（图４）。结果表明，野生型
５０１第１８卷第３期 草业学报２００９年
植物基因组ＤＮＡ没有阳性信号；２个Ｋａｎ抗性株系的基因组ＤＮＡ中，均出现阳性杂交信号。这初步表明所检
验的２个假定转基因株系均是真实的转基因植株，各有１个拷贝的犃狋犖犎犡１基因整合到菊苣的基因组中。
２．２．３ 转基因植株的ＲＴ－ＰＣＲ检测 ＲＴ－ＰＣＲ检测转基因植株中犃狋犖犎犡１基因的表达状况，扩增产物经
１％的琼脂糖凝胶电泳检测结果（图５）显示，野生型植株总ＲＮＡ的反转录产物没有特异性的扩增信号，２个转基
因株系总ＲＮＡ的反转录产物都能够扩增出预期的１．６ｋｂ目标产物。这一结果说明目的基因犃狋犖犎犡１可以在
所检测的转基因植株中正常地转录。
图４ 部分犜０ 代转基因植株的犛狅狌狋犺犲狉狀犫犾狅狋分析
犉犻犵．４ 犛狅狌狋犺犲狉狀犫犾狅狋犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狊狅犿犲犜０
犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋狊
１：ｐＮＴ犃狋犖犎犡１质粒ＤＮＡＤＮＡｏｆｐｌａｓｍｉｄｐＮＴ犃狋犖犎犡１；
２：野生型植株 Ｗｉｌｄｔｙｐｅｐｌａｎｔｓ；３～４：１～２号Ｔ０代转基因
植株Ｔ０ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓＮｏ．１－Ｎｏ．２
图５ 部分犜０ 代转基因植株的犚犜－犘犆犚检测
犉犻犵．５ 犚犜－犘犆犚犱犲狋犲犮狋犻狀犵狅犳狊狅犿犲犜０
犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋狊
Ｍ：１ｋｂｐｌｕｓＤＮＡＭａｒｋｅｒ；１：野生型植株 Ｗｉｌｄｔｙｐｅｐｌａｎｔｓ；
２～３：１～２号转基因株系Ｔ０ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓＮｏ．１－Ｎｏ．２
２．３ 转基因植株耐盐性的初步生理鉴定
图６ 转基因愈伤组织在犖犪犆犾胁迫下的相对生长率测定
犉犻犵．６ 犚犲犾犪狋犻狏犲犵狉狅狑狋犺狉犪狋犲狅犳狋犺犲狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮
犮犪犾犻狌狀犱犲狉狋犺犲狊狋狉犲狊狊狅犳犖犪犆犾
２．３．１ 转基因植株愈伤组织对 ＮａＣｌ胁迫的耐受
性分析 １和２号转基因株系诱发的愈伤组织（分
别编号为１和２号转基因愈伤组织）和野生型菊苣
愈伤组织在含不同浓度ＮａＣｌ（０，５０，１００，１５０和２００
ｍｍｏｌ／Ｌ）的 ＭＳ１ 培养基上的耐盐试验结果如图６
所示。随ＮａＣｌ胁迫浓度升高，转基因和野生型菊
苣愈伤组织的相对生长率均下降，但转基因愈伤组
织表现出显著高于野生型的相对生长。当培养基中
ＮａＣｌ浓度达到１５０ｍｍｏｌ／Ｌ时转基因愈伤组织的
相对生长率为野生型愈伤组织的４．０～４．５倍；而当
ＮａＣｌ胁迫浓度提高到２５０ｍｍｏｌ／Ｌ时，野生型愈伤
组织停止生长，而转基因愈伤组织仍然表现出５．２％
～７．２％的相对生长率。
２．３．２ 转基因植株在ＮａＣｌ胁迫下的叶片Ｎａ＋／Ｋ＋含量 随着培养基中ＮａＣｌ浓度的提高，野生型和转基因植
株的Ｎａ＋含量都上升（图７）；而两者叶片中的Ｋ＋含量则随培养基中ＮａＣｌ浓度的提高，表现出先上升，后下降的
趋势，拐点出现在ＮａＣｌ浓度达到２５０ｍｍｏｌ／Ｌ时（图８）。同时，在相同的ＮａＣｌ胁迫条件下，转基因植株叶片中
Ｎａ＋和Ｋ＋含量均明显高于野生型植株。对植株叶片 Ｋ＋／Ｎａ＋的统计结果（表１）进一步显示，在相同浓度的
ＮａＣｌ胁迫下，转基因植株叶片不仅比野生型植株积累更多的Ｎａ＋和Ｋ＋，同时维持较高的Ｋ＋／Ｎａ＋。
６０１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．３
图７ 菊苣叶片犖犪＋含量测定
犉犻犵．７ 犇犲狋犲犮狋犻狀犵狅犳狋犺犲犖犪＋犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀
犻狀犾犲犪狏犲狊狅犳犆．犻狀狋狔犫狌狊
图８ 菊苣叶片犓＋含量测定
犉犻犵．８ 犇犲狋犲犮狋犻狀犵狅犳狋犺犲犓＋犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀
犻狀犾犲犪狏犲狊狅犳犆．犻狀狋狔犫狌狊
表１ 犖犪犆犾胁迫对菊苣叶片犓＋／犖犪＋的影响
犜犪犫犾犲１ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犖犪犆犾狊狋狉犲狊狊狅狀狋犺犲犓＋／犖犪＋犻狀狋犺犲犾犲犪狏犲狊狅犳犆．犻狀狋狔犫狌狊
ＮａＣｌ浓度
ＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＮａＣｌ（ｍｍｏｌ／Ｌ）
菊苣叶片Ｋ＋／Ｎａ＋ Ｋ＋／Ｎａ＋ｉｎｔｈｅｌｅａｖｅｓｏｆ犆．犻狀狋狔犫狌狊
Ｗｔ Ｔ１ Ｔ２
０ ６．５４ ６．４０ ６．４９
５０ ３．８９ ４．７３ ５．００
１００ ３．２６ ４．００ ４．２１
１５０ ２．４１ ３．２１ ３．２６
２００ ２．１１ ３．２２ ２．９０
２５０ １．１６ １．７５ １．６５
Ｗｔ：野生型菊苣 Ｗｉｌｄｔｙｐｅ犆．犻狀狋狔犫狌狊；Ｔ１：１号转基因株系ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓＮｏ．１；Ｔ２：２号转基因株系ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓＮｏ．２．
２．３．３ 转基因植株在ＮａＣｌ胁迫下的叶片电导率
图９ 菊苣叶片相对电导率测定
犉犻犵．９ 犇犲狋犲犮狋犻狀犵狅犳狉犲犾犪狋犻狏犲犮狅狀犱狌犮狋犻狏犻狋狔犻狀狋犺犲犾犲犪狏犲狊狅犳犆．犻狀狋狔犫狌狊
野生型植株与转基因植株的叶片相对电导率均随
ＮａＣｌ胁迫浓度的提高而增加（图９），但在相同ＮａＣｌ
胁迫浓度下，转基因株系的叶片相对电导率低于野
生型株系，随着盐胁迫程度的增加，野生型植株的
叶片相对电导率的增长幅度大于转基因植株。在
２５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ胁迫下，野生型菊苣植株的相对
电导率增加到未受胁迫时的４．４倍；而此条件下转
基因植株的平均相对电导率只增加３．２倍。
３ 讨论
３．１ 转犃狋犖犎犡１植株细胞水平耐盐性分析
有较多的研究报告表明，通过基因工程手段将
液泡膜 Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因在植物中的表
达上调，可以显著提高植物的耐盐性，而且这种提高与液泡膜Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因的来源无关［１８～２０］。与
之类似，对转犃狋犖犎犡１基因的菊苣细胞系进行了盐胁迫耐受能力检测，结果表明在不同浓度的盐胁迫下，转基
因愈伤组织的相对生长率均明显高于野生型愈伤组织，可见，犃狋犖犎犡１基因的导入能够显著提高转基因菊苣细
胞水平上的耐盐性。
７０１第１８卷第３期 草业学报２００９年
３．２ 转犃狋犖犎犡１基因植株叶片Ｋ＋，Ｎａ＋含量及相对电导率分析
菊苣叶片Ｋ＋，Ｎａ＋含量测定结果显示，同等盐胁迫条件下，转基因植株积累了较多的Ｎａ＋，这可能是由于与
野生型细胞相比，外源犃狋犖犎犡１基因组成型表达的产物增强了转基因植株细胞的Ｎａ＋区域化能力，能够把更多
渗透到胞质中的Ｎａ＋转运进液泡内储存起来。转基因植物细胞这种增强了的Ｎａ＋区域化能力，能够使细胞积累
较多的Ｎａ＋，但由于这些Ｎａ＋主要被区域化到液泡中，与野生型细胞相比其细胞基质中的Ｎａ＋反而较少。通常
认为细胞通过质膜对Ｎａ＋和Ｋ＋的吸收是相互抑制的，胞质Ｎａ＋浓度的相对降低导致了更多的Ｋ＋内流。细胞内
Ｋ＋含量经历峰值后明显下降的可能原因是，随环境中盐胁迫的进一步加剧，细胞膜破坏程度加大，细胞膜两侧电
化学梯度难以保持，导致Ｋ＋内流减少而外泄增加。有报道认为ＮａＣｌ胁迫下，细胞内Ｋ＋／Ｎａ＋的高低与植物细
胞水平的耐盐性呈正相关［２１］。本试验所测试的各个浓度ＮａＣｌ胁迫下，转基因株系细胞内Ｋ＋／Ｎａ＋始终高于野
生型，这表明Ｔ０ 代转基因菊苣的耐盐能力比野生型植株有了显著提高。在盐胁迫下，植株的相对电导率（Ｒｃ／
Ｒｃ′）反映的是细胞膜在渗透胁迫下受到伤害的程度，常被作为细胞膜在逆境胁迫下是否具有生理活性的重要指
标之一。植物在遭受到盐胁迫时，相对电导率越低，表明细胞质电解液外渗的越少，细胞膜受到破坏的程度越低，
细胞受到的伤害也越小，该植物抗盐胁迫能力越强［２２，２３］。本研究发现相同浓度ＮａＣｌ胁迫下转基因株系的叶片
相对电导率显著低于野生型株系，表明外源犃狋犖犎犡１基因的导入提高了植株的耐盐性，使盐胁迫条件下转基因
株系细胞膜受伤害程度减轻。
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犵犲狀犲犪狀犱狊犪犾犻狀犻狋狔狋狅犾犲狉犪狀犮犲狅犳狋犺犲狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狀狋狊
ＺＨＡＯＹｕｗｅｉ１，２，ＷＡＮＧＹｉｎｇｊｕａｎ１，ＢＵＨｕａｉｙｕ１，ＨＡＯＪｉａｎｇｕｏ１，ＪＩＡＪｉｎｇｆｅｎ１
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ｏｆＴｒａｎｓｉｅｎｔＯｐｔｉｃｓａｎｄＰｈｏｔｏｎｉｃｓ，Ｘｉ’ａｎ７１００６９，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｈｅ犃狋犖犎犡１ｇｅｎｅｗａｓｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄｉｎｔｏ犆犻犮犺狅狉犻狌犿犻狀狋狔犫狌狊ｕｓｉｎｇ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿ａｎｄ４２ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ
ｐｌａｎｔｓｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｏＫａｎａｍｙｃｉｎ（Ｋａｎ）ｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅ犃狋犖犎犡１ｇｅｎｅｉｎｔｈｅ
ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓｗｅｒｅｃｏｎｆｉｒｍｅｄｂｙＰＣＲ，Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ，ａｎｄＲＴ－ＰＣＲ．Ｕｎｄｅｒｔｈｅｓａｍｅｓａｌｔｓｔｒｅｓｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，
ｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｃａｌｉｗｉｔｈＮａＣｌｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ｔｈａｔｗｅｒｅｉｎｄｕｃｅｄｆｒｏｍｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ，ｈａｄｃｏｎｓｉｄｅｒａｂｌｙｈｉｇｈｅｒ
ｒｅｌａｔｉｖｅｇｒｏｗｔｈｒａｔｅｓｔｈａｎｔｈｅｗｉｌｄｔｙｐｅｃａｌｉ．ＵｎｄｅｒｔｈｅｓｔｒｅｓｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＮａＣｌ，ｔｈｅＫ＋／
Ｎａ＋ｒａｔｉｏｉｎｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｃｅｌｓｗａｓａｌｗａｙｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｔｈｅｗｉｌｄｔｙｐｅ，ｗｈｅｒｅａｓｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｃｏｎ
ｄｕｃｔｉｖｉｔｙｗａｓｔｈｅｏｐｐｏｓｉｔｅ．Ｔｈｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｔｈｅ犃狋犖犎犡１ｇｅｎｅｎｏｔｏｎｌｙｅｎｈａｎｃｅｄｔｈｅｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｏｆ
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ犆．犻狀狋狔犫狌狊，ｂｕｔａｌｓｏｒｅｄｕｃｅｄｃｅｌｍｅｍｂｒａｎｅｄａｍａｇｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙｓａｌｉｎｉｔｙ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犃狋犖犎犡１；犆犻犮犺狅狉犻狌犿犻狀狋狔犫狌狊；犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊；ｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｓａｌｔｓｔｒｅｓｓｒｅ
ｓｉｓｔａｎｃｅ
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