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几种禾草内生固氮菌的分离及固氮活性测定



全 文 :书几种禾草内生固氮菌的分离及固氮活性测定
李倍金1,罗明1,周俊2,孔德江3,张铁明1
(1.新疆农业大学农学院,新疆 乌鲁木齐830052;2.新疆农业科学院分析测试中心,新疆 乌鲁木齐830000;
3.新疆畜牧科学院草原研究所,新疆 乌鲁木齐830000)
摘要:从13种禾草组织中分离内生细菌,研究比较不同禾草品种,不同组织中内生细菌的菌群密度和分布特点;筛
选内生固氮菌菌株,经乙炔还原法测定其固氮酶活性。结果表明,不同禾草品种的内生细菌菌群密度有较大差异,
菌群密度为8.70×104~8.06×106CFU/g鲜重。根组织中菌群密度高于叶。采用CCM 培养基结合无氮选择性
培养基筛选获得21株内生固氮菌菌株,其固氮酶活性在8~2865nmol/h·mL。研究结果证明从禾草中可分离到
具有高固氮酶活性的菌株,具有开发应用的潜力。
关键词:禾草;内生固氮菌;分离;固氮酶活性
中图分类号:Q945.13;S543.01  文献标识码:A  文章编号:10045759(2008)05003706
  新疆属典型的内陆干旱气候,生态系统脆弱,环境条件严酷。加强草地等绿地建设,保护和改善生态环境,防
治土地荒漠化是保障新疆社会、经济可持续发展的重要问题[1]。禾草类植物具有根系强大,保蓄水土效果好,抗
逆性强等优良特性,是牧草和草坪草的主要种类,在饲料作物、城市绿化和生态环境保护中具有重要的作用。氮
素是植物生长最重要的营养元素,直接影响禾草的生长及草坪质量[2~3]。大面积施用化肥解决草地缺氮的问题
不仅成本高,还会引发环境污染。生物固氮每年可提供全球可利用还原态氮的60%,在解决氮素来源问题上具
有巨大的潜力,是发展草地生产力的长久之计[4]。1987年以来,相继在甘蔗(犛犪犮犮犺犪狉狌)、卡拉草(犔犲狆狋狅犮犺犾狅犪
犳狌狊犮犪)[5~7]等禾本科植物中发现了内生固氮菌与宿主之间形成的高效固氮系统,为禾本科植物实现生物固氮开
辟了一条新的途径。研究表明,内生固氮菌生活在植物体内,避免了化合态氮的抑制及土著微生物的竞争,表现
出更高的固氮效率,同时还具有分泌生长素、溶磷,增强植株抗病性、抗逆境等多方面的促进植物生长的作用,在
解决禾草氮素来源,增强对环境的适应性上有巨大的潜力,显示出了良好的应用前景[8~10]。
本研究从几种禾草中分离内生固氮菌,测定其固氮酶活性,从中筛选出固氮效能高、性能稳定的内生固氮菌
株,以期为研制与应用禾草微生物接种剂,建立禾草高效固氮体系,促进禾草生长,增强抗逆性,加强新疆特殊气
候及环境条件下草地的良性生态循环提供菌种资源和技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料
13种禾草采自新疆农业大学温室栽培,校园草坪和乌鲁木齐市园林草坪。品种有苏丹草(犛狅狉犵犺狌犿狊狌犱犪狀犲
狀狊犲),高冰草(犃犵狉狅狆狔狉狅狀犲犾狅狀犵犪狋狌犿),新麦草(犘狊犪狋犺狔狉狅狊狋犪犮犺狔狊犼狌狀犮犲犪),高羊茅(犉犲狊狋狌犮犪犪狉狌狀犱犻狀犪犮犲犪)(红宝石,
猎狗5号,可奇斯,红象),紫羊茅(犉犲狊狋狌犮犪狉狌犫狉犪)(宝瑞)、黑麦草(犔狅犾犻狌犿狆犲狉犲狀狀犲)(美丽达),早熟禾(犘狅犪犪狀
狀狌犪)(康尼,蓝宝石,优美),偃麦草(犈犾狔狋狉犻犵狉犻犪狉犲狆犲狀)。
1.2 培养基及缓冲液
营养琼脂培养基(NA,g/L)[11]:牛肉膏5,蛋白胨10,蔗糖10,酵母浸膏1,pH值7.2。
多碳源低氮培养基(CCM)[12]:溶液Ⅰ:KH2PO40.2g,NaCl0.1g,K2HPO40.8g,Na2FeEDTA28mg,钼
酸钠25mg,酵母浸膏100mg,甘露醇5g,蔗糖5g,乳酸钠0.5mL,蒸馏水900mL。
溶液Ⅱ:MgSO4·7H2O0.2g,CaCl2·2H2O0.06g,蒸馏水100mL。
第17卷 第5期
Vol.17,No.5
草 业 学 报
ACTAPRATACULTURAESINICA   
37-42
10/2008
 收稿日期:20071106;改回日期:20071205
基金项目:国家自然科学基金项目(30460005)和新疆教育厅优秀青年学者科学研究奖励计划项目(XJEDU2004E06)资助。
作者简介:李倍金(1982),男,甘肃民勤人,在读硕士。
通讯作者。Email:luomingxjau@yahoo.com.cn
溶液Ⅰ、Ⅱ分别灭菌,冷却至50℃左右混合后再加入生物素(5μg/L)和维生素(10μg/L)各0.5mL。
阿须贝无氮培养基(Ashby,g/L)[13]:甘露醇10,KH2PO40.2,MgSO4·7H2O0.2,NaCl0.2,CaSO4·
2H2O0.1,CaCO35.0。
无氮培养基(Nfb,g/L)[7]:苹果酸5,KOH4.5,K2HPO40.5,MgSO4·7H2O0.2,CaCl2·2H2O0.02,NaCl
0.1g/L,溴百里酚蓝2mL,EDTA4mL,维生素1mL(VB6200mg/L,生物素100mg/L),微量元素2mL(Cu
SO40.4g,ZnSO40.12g,H2BO31.4g,钼酸钠1g,MnSO41.5g)。
磷酸缓冲液(PBS):A液:0.2mol/LNa2HPO430.5mL。B液:0.2mol/LNaH2PO418.5mL。取 A液
30.5mL,B液18.5mL混合,pH值7.0。
1.3 禾草内生细菌的分离和菌群密度测定
分离组织的表面灭菌:将所采集新鲜禾草的根、叶用流水冲洗1h,70%酒精浸泡30~60s,1%~2% NaClO
分别处理1~10min进行表面灭菌,无菌水冲洗4次,最后1次冲洗液涂抹NA平板,26~28℃培养2~3d,检测
待分离材料表面灭菌是否彻底[14],测定适宜的表面灭菌时间。
取经检验表面灭菌彻底的禾草根、叶材料1g于无菌研钵中,加灭菌的PBS缓冲液研磨,取上清液倍比稀释,
取0.2mL涂布CCM培养基平板。26~28℃培养3~5d后,计数。挑取不同形态的菌落平板划线纯化,镜检,
斜面保存。
1.4 禾草内生固氮菌的筛选
将CCM固体培养基上分离得到的内生细菌菌株回接于 Ashby和 Nfb培养基上4~5次,确定能同时在
Ashby和Nfb培养基上正常生长的菌株为备选的固氮菌菌株,待测其固氮酶活性。
1.5 内生固氮菌的固氮酶活性测定
采用乙炔还原法[15~18]。主要参考张国霞等[9]的方法,对一些重要参数进行测定修正。
1.5.1 培养时间对固氮酶活性测定的影响 将待测菌株接种于含10mLNfb半固体培养基的25mL小瓶中,
30℃培养2d后,将棉塞换成胶塞密封,抽出10%气体后加入1.5mLC2H2,分别培养2,4,6和8d。从瓶中抽取
混合气体0.2mL注入用津GC28A气相色谱仪中测定C2H2、C2H4 的产生情况。色谱参数为:不锈钢层析柱2
mm×1000mm,柱温150℃,氢离子火焰检测器,温度20℃,载气为氮气,气体体积流量30mL/min。
用下列公式计算固氮酶活性大小[19]:
犈犃1=(58.0×犛犲×犜×犘犲)/(犛犫×犜犲×犘×狋×犞)(μmol/h·mL)
式中,犛犲:乙烯峰面积;犜:开氏绝对温度(犜=273.13K);犘犲:实验条件下的大气压强(Pa);犛犫:乙炔峰面积;犜犲:实
验条件下的温度(K);犘:绝对大气压强(P=101324.72Pa);狋:培养时间;犞:体积。
1.5.2 乙炔加入量对固氮酶活性测定的影响 方法同1.5.1,加入乙炔气体量分别为细菌培养瓶体积的1/10、
1/100和1/1000,测定乙炔加入量对菌株固氮酶活大小的影响。
2 结果与分析
2.1 禾草内生细菌分离、菌群密度和分布
试验确定,禾草叶片采用1%的 NaClO处理4min,根采用2%的 NaClO处理8min,表面除菌率可达到
100%。
对禾草不同品种,不同组织中内生细菌菌群密度的测定结果表明(图1),测定的13个禾草品种的根、叶组织
中均有内生细菌分布。不同禾草品种的内生细菌菌群密度有较大差异,菌群密度为8.70×104~8.06×106
CFU/g鲜重,其中早熟禾(康尼)最高,高羊茅(红象)最低。不同组织中,以根中菌群密度最大,含量为6.0×104
~6.6×106CFU/g鲜重;其次为叶,含量为2.4×104~3.2×106CFU/g鲜重。
2.2 禾草内生固氮菌的筛选
采用CCM培养基从13个品种的禾草组织中分离出60株内生细菌菌株。将这些菌株再反复回接于无氮选
择性培养基Ashby和Nfb上,确定能同时在Ashby和Nfb培养基上正常生长的有24株,作为备选的内生固氮
菌菌株,待测其固氮酶活性。
83 ACTAPRATACULTURAESINICA(Vol.17,No.5) 10/2008
2.3 确定固氮酶活性测定的基本参数
2.3.1 培养时间对固氮酶活性测定的影响 对ENB25(本试验分离的内生固氮菌菌株编号,下同)、ENB26两
个菌株分别培养2,4,6和8d后,测定其固氮酶活性大小,结果表明(图2),菌体培养2~6d内,乙烯产生量随培
养时间的增加而增加,培养至6d乙烯产生量达到最大;培养超过6d,乙烯产生量不再增加,保持稳定。
图1 不同禾草品种组织中内生细菌菌群密度
犉犻犵.1 犘狅狆狌犾犪狋犻狅狀狅犳犲狀犱狅狆犺狔狋犻犮犫犪犮狋犲狉犻犪犻狀犱犻犳犳犲狉犲狀狋狊狆犲犮犻犲狊犪狀犱狋犻狊狊狌犲狊狅犳犵狉犪犿犻狀犪犮犲狅狌狊犵狉犪狊狊犲狊
 A:苏丹草犛.狊狌犱犪狀犲狀狊犲,B:高羊茅犉.犪狉狌狀犱犻狀犪犮犲犪(猎狗5号),C:高羊茅犉.犪狉狌狀犱犻狀犪犮犲犪(可奇斯),D:高羊茅犉.犪狉狌狀犱犻狀犪犮犲犪(红宝石),E:高羊茅
犉.犪狉狌狀犱犻狀犪犮犲犪(红象),F:高冰草犃.犲犾狅狀犵犪狋狌犿,G:早熟禾犘.犪狀狀狌犪(康尼),H:早熟禾犘.犪狀狀狌犪(优美),I:早熟禾犘.犪狀狀狌犪(蓝宝石),J:黑麦草犔.
狆犲狉犲狀狀犲(美丽达),K:紫羊茅犉.狉狌犫狉犪(宝瑞),L:偃麦草犈.狉犲狆犲狀狊,M:新麦草犘.犼狌狀犮犲犪。
图2 培养时间对固氮酶活性测定的影响
犉犻犵.2 犈犳犳犲犮狋狅犳犲狀犱狅狆犺狔狋犻犮犫犪犮狋犲狉犻犪犾犮狌犾狋狌狉犲狆犲狉犻狅犱狅狀狋犲狊狋犻狀犵狀犻狋狉狅犵犲狀犪狊犲犪犮狋犻狏犻狋狔
2.3.2 乙炔加入量对固氮酶活性测定的影响 乙炔
加入量对乙烯产量的影响测定结果显示(表1),乙炔
气体加入量对乙烯产量没有显著影响,与固氮酶活性
测定没有相关关系。
2.4 禾草内生固氮菌固氮酶活性测定结果
对从CCM 培养基上分离的60株禾草内生细菌
固氮酶活性进行测定。其中39株无固氮酶活性,21
株具有固氮酶活性(表2)。21株具有固氮酶活性的菌
表1 乙炔加入量对乙烯产量的影响
犜犪犫犾犲1 犈犳犳犲犮狋狅犳犳犻犾犻狀犵犪犮犲狋狔犾犲狀犲狇狌犪狀狋犻狋狔狅狀犲狋犺狔犾犲狀犲狅狌狋狆狌狋
乙炔加入量
Filingacetylenequantity
乙烯产生量Ethyleneoutput(nmol/h·mL)
ENB25 ENB26
10% 1.19324 2.64448
1% 1.11178 2.67547
1‰ 1.19314 2.65448
株均出自经反复回接于无氮选择性培养基Ashby和Nfb上正常生长的24株菌株之中。其中分离自高羊茅的内
生固氮菌有9株,早熟禾的有3株,高冰草,黑麦草,苏丹草,偃麦草各2株,紫羊茅1株。分离自根和叶不同组织
的内生固氮菌比例相差不大。
93第17卷第5期 草业学报2008年
表2 禾草内生固氮菌株固氮酶活性
犜犪犫犾犲2 犖犻狋狉狅犵犲狀犪狊犲犪犮狋犻狏犻狋狔狅犳犲狀犱狅狆犺狔狋犻犮犫犪犮狋犲狉犻犪狊狋狉犪犻狀狊犻狊狅犾犪狋犲犱犳狉狅犿犵狉犪犿犻狀犲犪犲犵狉犪狊狊犲狊
菌株
Strain
品种
Species
分离部位
Section
固氮酶活性
Nitrogenaseactivity
(nmol/h·mL)
菌株
Strain
品种
Species
分离部位
Section
固氮酶活性
Nitrogenaseactivity
(nmol/h·mL)
ENB1 高冰草 根Root 80 ENB37 高羊茅(红象) 叶Leaf 37
ENB2 早熟禾(蓝宝石) 根Root 1710 ENB41 高羊茅(猎狗5号) 根Root 97
ENB5 早熟禾(优美) 根Root 221 ENB42 高羊茅(猎狗5号) 根Root 274
ENB10 紫羊茅(宝瑞) 根Root 4 ENB44 高羊茅(红象) 根Root 237
ENB17 高冰草 叶Leaf 1624 ENB45 高羊茅(红象) 叶Leaf 41
ENB19 苏丹草 根Root 40 ENB46 苏丹草 叶Leaf 89
ENB23 高羊茅(红宝石) 叶Leaf 8 ENB47 高羊茅(猎狗5号) 根Root 2865
ENB24 高羊茅(红象) 根Root 320 ENB48 黑麦草(美丽达) 根Root 451
ENB25 高羊茅(红象) 叶Leaf 620 ENB54 黑麦草(美丽达) 叶Leaf 495
ENB29 偃麦草 叶Leaf 390 ENB57 偃麦草 叶Leaf 2280
ENB36 早熟禾 叶Leaf 2653
 高冰草犃.犲犾狅狀犵犪狋狌犿,早熟禾犘.犪狀狀狌犪,紫羊茅犉.狉狌犫狉犪,苏丹草犛.狊狌犱犪狀犲狀狊犲,偃麦草犈.狉犲狆犲狀狊,高羊茅犉.犪狉狌狀犱犻狀犪犮犲犪,蓝宝石Lanbaoshi,优美
Youmei,宝瑞Baorui,红宝石 Hongbaoshi,红象 Hongxiang,猎狗5号Liegou5th,美丽达 Meilida.
不同分离菌株的固氮酶活性显著差异,在8~2865nmol/h·mL,固氮酶活性最高的为ENB47菌株,最低的
为ENB10菌株。
3 讨论
3.1 近年来对禾草内生菌的研究主要集中于内生真菌[20]。现已发现至少有80个属、几百种禾本科植物被确认
含内生真菌[21],大量的研究都集中在2个有重要经济意义的禾草即高羊茅和黑麦草[22]。对禾草内生细菌的研究
尚鲜见报道。本研究表明所测定的高冰草,黑麦草,高羊茅和偃麦草等13个禾草品种的根、叶组织内同样普遍存
在着大量的内生细菌,菌群密度为8.7×104~8.06×106CFU/g鲜重。内生细菌与内生真菌均在长期的进化过
程中与禾草建立起共生关系,对增强宿主的生态适应性具有重要的意义[23]。这些禾草中的内生细菌是来自于种
子的垂直传播还是植株生长过程中的水平传播?是否终身带菌?尚有待于进一步研究证实。
3.2 CCM培养基是一种含复合碳源的固氮菌分离培养基,其中添加有蔗糖、甘露醇和乳酸钠碳源,尽可能满足
不同菌株对碳源的选择利用。Rennie[24]利用该培养基从土壤中分离固氮菌时取得了较好的效果。相对于其他
单一碳源的固氮菌培养基如Dbereiner,NFDM,kalininskaya等[25]在CCM培养基上生长的菌落数量多,种类丰
富多样,75%以上的分离菌株具有固氮酶活性。本试验为了从禾草中分离到更多的内生固氮菌菌株,也采用了
CCM培养基,共获得了60个菌株,但测定后仅有35%的菌株具有固氮酶活性。Amandeep[12]的研究也证实
CCM培养基分离植物内生固氮菌的效果不如土壤固氮菌理想。这可能是由于土壤中有效氮含量低,CCM 培养
基加入的少量酵母浸膏起到了“起爆氮”效应,促进了土壤固氮菌的生长。而植株体内环境与土壤迥然不同,培养
基中的氮源降低了它对固氮菌的选择性。本试验将在CCM培养基上初筛获得的菌株反复回接于无氮选择性培
养基Ashby和Nfb培养基复筛后,固氮菌的出菌率达到87.5%。此分离策略一方面可以最大限度的保证分离
内生细菌的多样性,同时又能提高固氮菌的分离频率,不失为一种分离内生固氮菌的有效方法。
3.3 试验分离出的禾草内生固氮菌各菌株之间的固氮酶活性差异较大,酶活性范围在8~2865nmol/h·mL。
有研究显示,从水稻(犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪)中分离的内生固氮菌株的最高酶活性为806.58nmol/h·mL;从玉米(犣犲犪
犕犪狔)中分离的内生固氮菌株的最高酶活性为215.2nmol/h·mL,从欧洲海滨草(犃犿犿狅狆犺犻犾犪犪狉犲狀犪狉犻犪)中分离
的内生固氮菌株的最高酶活性为20.6nmol/h·mL[23~25]。本研究获得的ENB47菌株酶活性达到了2865
nmol/h·mL,高于一些已报道的研究结果,表明在禾草中可以分离到高固氮酶活的菌株。
04 ACTAPRATACULTURAESINICA(Vol.17,No.5) 10/2008
3.4 内生固氮菌定殖在宿主植物体内,能避免化合态氮的抑制及土著微生物的竞争,分泌固氮产物直接供给植
物吸收,不易受到外界环境条件的干扰,更有利于充分发挥固氮效能,比联合固氮表现出更高的固氮效率[7]。因
此内生固氮细菌在植物体内存活生长、传导,并以一定数量稳定定殖于植物体内,与寄主植物之间建立起“和谐联
合关系”是发挥其独具优势的关键[26]。本试验获得的固氮菌株是否能在植株体内良好地定殖和传导,在植株体
内能否保持高固氮效能,是否还同时具有分泌生长素、溶磷等特性均有待于进一步深入研究。
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14第17卷第5期 草业学报2008年
犐狊狅犾犪狋犻狅狀狅犳犲狀犱狅狆犺狔狋犻犮犱犻犪狕狅狋狉狅狆犺犻犮犫犪犮狋犲狉犻犪犳狉狅犿狊犲狏犲狉犪犾犵狉犪犿犻狀犲犪犲犵狉犪狊狊犲狊
犪狀犱犱犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狋犺犲犻狉狀犻狋狉狅犵犲狀犪狊犲犪犮狋犻狏犻狋狔
LIBeijin1,LUOMing1,ZHOUJun2,KONGDejiang3,ZHANGTieming1
(1.AgronomyColege,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China;2.AnalysisandTesting
Center,XinjiangAcademyofAgriculturalScience,Urumqi830000,China;3.Instituteof
GrasslandScience,XinjiangAcademyofAnimalScienceUrumqi830000,China)
犃犫狊狋狉犪犮狋:Thisstudyevaluatedcommunitystructuresindifferentcultivarsandtissuesofendophyticbacteriai
solatedfrom13gramineaegrassspeciesinXinjiang,andtheirnitrogenaseactivitywasdetectedusinganacety
lenereductionassay.Thepopulationdensitiesoftheendophyticbacteriavarieddependingongramineaegrass
species.Thequantitiesofendophytesindifferentcultivarsvariedfrom8.70×104to8.06×106CFU/gfresh
weight,andweremuchhigherinrootsthaninfoliage.Twentyoneendophyticdiazotrophicbacterialstrains
wereisolatedusingCCM mediumcombinedwithselectednitrogenfreemedium,andthedetectednitrogenase
activityrangedfrom8to2865nmol/h·mL.Theresearchrevealedthatendophyticbacterialstrainswithhigh
nitrogenaseactivitycanbeisolatedfromgramineaegrass,andhaveconsiderableapplicationpotentialstobe
usedasbiofertilizers.
犓犲狔狑狅狉犱狊:gramineaegrass;endophyticdiazotrophicbacteria;isolation;nitrogenaseactivit
檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵

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由任继周院士主编的《草业大辞典》是全国近百位
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邮局汇款地址:兰州市嘉峪关西路768号 《草业学报》编辑部,邮政编码:730020。注:草业大辞典。
注:购书单位或个人汇款后,请将收件人详细地址、姓名、邮编及开发票单位和联系电话,Email或电话告知
联系人。
联系人:《草业大辞典》秘书处林慧龙,未丽 咨询电话:09318910281 犈犿犪犻犾:linhuilong2007@126.com
24 ACTAPRATACULTURAESINICA(Vol.17,No.5) 10/2008