全 文 ：书４２份高粱与苏丹草及其２个杂交种
犇犖犃指纹图谱的构建
詹秋文１，李杰勤１，汪保华２，李云飞１
（１．安徽科技学院，安徽 凤阳２３３１００；２．南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室，江苏 南京２１００９５）
摘要：选用１００个ＲＡＰＤ引物和９５对ＳＳＲ引物进行ＰＣＲ扩增，旨在构建４２份高粱和苏丹草品种资源及２份国审
品种高粱－苏丹草杂交种的ＤＮＡ指纹图谱。结果表明，从１００个ＲＡＰＤ引物中筛选到９个多态性高、重复性好的
引物，多态性条带比率为６４．０６％，利用４个核心ＲＡＰＤ引物可以为每份品种构建１张特定的数字指纹，并通过其
中１个引物Ｆ０１构建了１张能鉴别２个杂交种的ＲＡＰＤ指纹图谱，不过该图谱不能区别皖草３号与其父本Ｓａ。
从９５对ＳＳＲ引物中筛选出多态性丰富的引物７３对，多态性条带比率为８６．０６％，通过３对核心ＳＳＲ引物就可以
构建４２份高粱和苏丹草的ＳＳＲ数字指纹，同时利用其中１对ＳＳＲ引物狋狓狆１８，寻找到２个杂交种的互补带，从而
构建了２个高粱－苏丹草杂交种的ＳＳＲ指纹图谱，这张ＳＳＲ指纹图谱不仅能鉴别皖草２号和３号，还可以把杂交
种与其亲本区别开来。
关键词：高粱；苏丹草；杂交种；ＲＡＰＤ；ＳＳＲ；指纹图谱
中图分类号：Ｓ５１４．０３２；Ｓ５４４＋．１０３．２；Ｑ９４３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２００８）０６００８５０８
高粱（犛狅狉犵犺狌犿犫犻犮狅犾狅狉）是一种古老的禾谷类作物，苏丹草（犛狅狉犵犺狌犿狊狌犱犪狀犲狀狊犲）是栽培最普遍的一年生禾本
科牧草，二者的杂种优势强，其杂交种品质好，抗逆性强，在水产、畜禽养殖及资源利用与环境保护上有广阔的开
发利用前景［１］。由于种子生产、经营管理以及环境等方面因素，高粱－苏丹草杂交种（犛．犫犻犮狅犾狅狉×犛．狊狌犱犪狀犲狀狊犲）
容易导致假杂种或种子混杂，从而降低种子纯度，给农业生产造成损失。皖草２号和３号是当前推广的２个国审
品种，其中皖草２号长期作为国家草型高粱品种区域试验唯一对照品种。因此，高粱－苏丹草杂交种及其亲本种
质资源的遗传真实性是种子质量的重要保证，建立快速、标准的种子质量检测方法已成为规范种子市场经济秩序
迫切需要的技术之一。传统的种子纯度鉴定技术有田间性状鉴定和籽粒形态鉴定，但耗时长，且易受环境条件的
影响。作物指纹图谱多态性丰富，具有高度的个体特异性和环境稳定性，主要有两大类：一类是较早的蛋白质电
泳指纹图谱，但受同工酶位点及蛋白质种类限制；另一类是２０世纪９０年代之后发展起来的ＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕ
ｃｌｅｉｃａｃｉｄ，脱氧核糖核酸）分子标记指纹图谱，因其分辨率高、稳定可靠，可以准确鉴定生物个体和群体之间的差
异，已成为鉴别品种、品系和选择杂交亲本的有力工具。Ｔｉｎｋｅｒ等［２］利用７个ＲＡＰＤ（ｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙ
ｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ，随机扩增多态性ＤＮＡ）引物可区分２７个杂交大麦（犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲）品系，并认为ＲＡＰＤ方法
是区分高度相似性大麦品系的有效方法。Ｃｈａｒｔｅｒｓ等［３］运用ＳＳＲ（ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ，简单序列重复）引物
分析了２０个甘蓝油菜（犅狉犪狊狊犻犮犪狀犪狆狌狊）品种，指出ＳＳＲ是一种多态性很高、重复性很好的指纹库构建方法。之
后，许多研究者先后利用ＲＡＰＤ和（或）ＳＳＲ引物构建了黑麦草－羊茅复合体（犔狅犾犻狌犿－犉犲狊狋狌犮犪）［４］、马铃薯（犛狅
犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿）［５］、大豆（犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓）［６］、玉米（犣犲犪犿犪狔）［７］、苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）［８］、甘蓝（犅狉犪狊狊犻犮犪狅犾犲狉犪
犮犲犪）［９］、小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）［１０］、高羊茅（犉．犪狉狌狀犱犻狀犪犮犲犪）［１１］、结缕草（犣狅狔狊犻犪犼犪狆狅狀犻犮犪）［１２］、水稻（犗狉狔狕犪
犛犪狋犻狏犪）［１３］、棉花（犌狅狊狊狔狆犻狌犿犺犻狉狊狌狋狌犿）［１４］、大麦［１５］和油菜［１６］等作物ＤＮＡ指纹图谱。目前，高粱与苏丹草及其
杂交种ＤＮＡ指纹图谱的研究未见报道。本研究选取４２份高粱与苏丹草种质资源和２个杂交种，旨在筛选出
ＲＡＰＤ和ＳＳＲ核心引物，建立ＤＮＡ指纹图谱，从而鉴别不同苏丹草和高粱种质资源及其杂交种皖草２号和皖草
３号，为高粱－苏丹草杂交种的品种选育和知识产权保护提供理论依据。
８５－９２
１２／２００８
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第１７卷 第６期
Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．６
收稿日期：２００７１２１２；改回日期：２００８０１３０
基金项目：科技部农业科技成果转化资金项目（Ｎｏ：２００８ＧＢ２Ｃ３００１２５），安徽省“十一五”科技攻关计划重点项目（Ｎｏ：０６０１３１０４Ｂ）和安徽省高
校学科拔尖人才基金 （Ｎｏ：教秘人［２００５］７９号）资助。
作者简介：詹秋文（１９６３），男，安徽宿松人，教授，博士。Ｅｍａｉｌ：ｑｗｚｈａｎ＠１６３．ｃｏｍ
１ 材料与方法
１．１ 植物材料
高粱和苏丹草品种资源４２份（表１），另外选取通过全国牧草品种审定委员会审定的高粱－苏丹草杂交种２
份，即皖草２号（Ｔｘ６２３Ａ×Ｓ７２２）和皖草３号（Ｔｘ６２３Ａ×Ｓａ）。全部试验材料于２００５年４月种植于安徽科技学院
种植科技园。
１．２ ＤＮＡ的提取
在幼苗期取２ｇ叶片置于研钵中，加入８００μＬ经６５℃预热的ＤＮＡ提取液［１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ．Ｃｌ，ｐＨ 值
８．０，５０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡＮａ２（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄＮａ２，乙二胺四乙酸二钠），５００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，
１．２５％ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ，十二烷基硫酸钠）］和少量石英砂，研磨好后转入１．５ｍＬＥＰ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，微
量离心）管中，在６５℃水浴锅中保温３０ｍｉｎ，然后加入２００μＬ预冷的５ｍｏｌ／ＬＫＡｃ（ｋａｌｉｕｍａｃｅｔｉｃｕｍ，醋酸钾）溶
液，混匀后冰浴２０ｍｉｎ；每管中加入２４∶１的氯仿／异戊醇溶液至１．５ｍＬ，充分混匀后１００００ｒ／ｍｉｎ离心１０
ｍｉｎ，将上清液转入另一ＥＰ管中，分别用７０％乙醇和无水乙醇各洗涤１次，弃掉洗液挥干，加２００μＬＴＥ（Ｔｒｉｓ
ＥＤＴＡ，三羟甲基氨基甲烷－乙二胺四乙酸）溶解，并用０．８％琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测ＤＮＡ 的浓
度和纯度，后保存备用。
１．３ ＲＡＰＤ的ＰＣＲ扩增和检测
选取来自美国ＯｐｅｒｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司设计合成的１００个ＲＡＰＤ引物，这１００个引物曾被李杰勤等［１７］用
于高粱属物种之间遗传差异的研究，并取得了较好的试验结果。
ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，多聚酶链式反应）扩增采用２０μＬ的反应体系，包括２μＬ１０×Ｂｕｆｆｅｒ，２μＬ
ｄＮＴＰｓ（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，脱氧核苷三磷酸）（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ），１μＬ随机引物（２μｍｏｌ／Ｌ），２μｍｏｌ／Ｌ
模板ＤＮＡ（５０ｎｇ／μＬ）；Ｔａｑ酶为１．２Ｕ；Ｍｇ
２＋浓度为２．０ｍｍｏｌ／Ｌ；最后用ｄｄＨ２Ｏ补足２０μＬ。反应程序为９４℃
预变性５ｍｉｎ，９４℃变性１ｍｉｎ，３６℃复性１ｍｉｎ，７２℃延伸２ｍｉｎ，循环４５次，最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。反应产物在
１．２％琼脂糖胶上检测，电压１００Ｖ，电泳后在Ａｌｐｈａ紫外凝胶成像系统上观察拍照。
１．４ ＳＳＲ的ＰＣＲ扩增和检测
根据ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｒａｍｅｎｅ．ｏｒｇ／ｄｂ／ｍａｒｋｅｒｓ／网站提供的高粱引物序列，筛选并合成了８８对ＳＳＲ引物。其
中，在编号为狋狓狆０１～狋狓狆４３中选取３１对，在犮狌狆０１～犮狌狆７４中选取５７对，这８８对引物覆盖了高粱的１０条连锁
群，并先后被Ｋｏｎｇ等［１８］和Ｓｃｈｌｏｓｓ等［１９］用于高粱遗传图谱和分子标记研究。另外，本试验利用Ｐｒｉｍｅｒ３程序
（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ３／）设计并合成了７对ＳＳＲ引物，这些引物已被Ｚｈａｎ等［２０］用于高粱
与苏丹草亲缘关系的研究，获得了理想的结果。
ＰＣＲ扩增采用１０μＬＰＣＲ反应体系，包括１０×Ｂｕｆｆｅｒ１μＬ，２０ｎｇ的总ＤＮＡ，１μＬＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ／Ｌ），０．２
μＬｄＮＴＰ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ），１．０ＵＴａｑＤＮＡ 聚合酶，各０．８μＬ双向引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）。ＰＣＲ 扩增程序：９５℃２
ｍｉｎ，接着是９４℃４５ｓ，５７℃４５ｓ，７２℃６０ｓ，３０个循环，最后７２℃延伸７ｍｉｎ。ＰＣＲ扩增产物用６％非变性聚丙
烯酰胺（ＰＡＧＥ，ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）胶在北京六一电泳仪上完成电泳。电泳完成后，用０．５％冰
醋酸溶液固定，然后用０．２％硝酸银溶液染色，１．５％氢氧化钠溶液显色，后漂洗，经Ａｌｐｈａ公司成像系统观察、拍
照。
１．５ 数据处理
以１和０分别代表某个等位基因位点扩增ＤＮＡ条带的有无，并将ＲＡＰＤ或ＳＳＲ图谱转换为由０和１组成
的字符串，构成ＤＮＡ数字指纹。
２ 结果与分析
２．１ ４２份高粱与苏丹草品种资源的ＲＡＰＤ数字指纹
在１００个ＲＡＰＤ随机引物中，有１２个引物可以扩增出条带清晰、重复性好的ＤＮＡ条带，条带数最少３条，
最多为８条，总扩增带数为６４条，其中９个引物在４２份高粱和苏丹草中扩增出多态性，多态性条带４１条，多态
性条带比率为６４．０６％，多态性水平较高。平均每个ＲＡＰＤ引物可获得３．４２个多态条带，分子量从７００ｂｐ至
１１００ｂｐ以上（图１）。
６８ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．６） １２／２００８
表１ ４２份高粱和苏丹草的编号、名称、类型和来源
犜犪犫犾犲１ 犘犾犪狀狋犿犪狋犲狉犻犪犾狌狊犲犱犻狀狋犺犲狊狋狌犱狔
编号Ｎｏ． 名称Ｎａｍｅ 类型Ｔｙｐｅ 来源Ｓｏｕｒｃｅ
１ Ｓａ 苏丹草品系犛．狊狌犱犪狀犲狀狊犲，ｓｔｒａｉｎ 安徽Ａｎｈｕｉ，Ｃｈｉｎａ
２ 新苏２号ＸｉｎｓｕＮｏ．２ 苏丹草品种犛．狊狌犱犪狀犲狀狊犲，ｃｕｌｔｉｖａｒ 新疆Ｘｉｎｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ
３ Ｍ５ 苏丹草种质犛．狊狌犱犪狀犲狀狊犲，ｇｅｒｍｐｌａｓｍ 安徽Ａｎｈｕｉ，Ｃｈｉｎａ
４ Ｓ７２２ｌｉｎｅ 苏丹草种质犛．狊狌犱犪狀犲狀狊犲，ｇｅｒｍｐｌａｓｍ 安徽Ａｎｈｕｉ，Ｃｈｉｎａ
５ ３０４２Ｂ 高粱保持系犛．犫犻犮狅犾狅狉，ｍａｉｎｔａｉｎｅｒｌｉｎｅ 美国ＵＳＡ
６ 皖恢ＡＲ 高粱恢复系犛．犫犻犮狅犾狅狉，ｒｅｓｔｏｒｅｒｌｉｎｅ 安徽Ａｎｈｕｉ，Ｃｈｉｎａ
７ Ｓｈｏｒｔ４ 高粱矮秆种质犛．犫犻犮狅犾狅狉，ｓｈｏｒｔｓｔｅｍ 安徽Ａｎｈｕｉ，Ｃｈｉｎａ
８ Ｗｈｉｔｅ５ 高粱白粒种质犛．犫犻犮狅犾狅狉，ｗｈｉｔｅｇｒａｉｎ 安徽Ａｎｈｕｉ，Ｃｈｉｎａ
９ 晋五选系Ｊｉｎ５ｌｉｎｅ 高粱品系犛．犫犻犮狅犾狅狉，ｓｔｒａｉｎ 山西Ｓｈａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ
１０ Ｔｘ６２３Ｂ 高粱保持系犛．犫犻犮狅犾狅狉，ｍａｉｎｔａｉｎｅｒｌｉｎｅ 美国ＵＳＡ
１１ １６Ｂ 高粱保持系犛．犫犻犮狅犾狅狉，ｍａｉｎｔａｉｎｅｒｌｉｎｅ 山西Ｓｈａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ
１２ 三尺三ＢＳａｎｃｈｉｓａｎＢ 高粱保持系犛．犫犻犮狅犾狅狉，ｍａｉｎｔａｉｎｅｒｌｉｎｅ 山西Ｓｈａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ
１３ Ｔｘ２７９１Ｂ 高粱保持系犛．犫犻犮狅犾狅狉，ｍａｉｎｔａｉｎｅｒｌｉｎｅ 美国ＵＳＡ
１４ Ｔｘ６２３Ａ 高粱不育系犛．犫犻犮狅犾狅狉，ｓｔｅｒｉｌｅｌｉｎｅ 美国ＵＳＡ
１５ ３０４２Ａ 高粱不育系犛．犫犻犮狅犾狅狉，ｓｔｅｒｉｌｅｌｉｎｅ 美国ＵＳＡ
１６ １６Ａ 高粱不育系犛．犫犻犮狅犾狅狉，ｓｔｅｒｉｌｅｌｉｎｅ 山西Ｓｈａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ
１７ 三尺三ＡＳａｎｃｈｉｓａｎＡ 高粱不育系犛．犫犻犮狅犾狅狉，ｓｔｅｒｉｌｅｌｉｎｅ 山西Ｓｈａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ
１８ Ｔｘ２７９１Ａ 高粱不育系犛．犫犻犮狅犾狅狉，ｓｔｅｒｉｌｅｌｉｎｅ 美国ＵＳＡ
１９ Ｖ４／Ｆ４Ｂ 高粱保持系犛．犫犻犮狅犾狅狉，ｍａｉｎｔａｉｎｅｒｌｉｎｅ 山西Ｓｈａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ
２０ 三尺三Ｓａｎｃｈｉｓａｎ 高粱品种犛．犫犻犮狅犾狅狉，ｃｕｌｔｉｖａｒ 山西Ｓｈａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ
２１ 忻粱七Ｙｉｌｉａｎｇ７ 高粱品种犛．犫犻犮狅犾狅狉，ｃｕｌｔｉｖａｒ 山西Ｓｈａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ
２２ 晋粱五Ｊｉｎｌｉａｎｇ５ 高粱品种犛．犫犻犮狅犾狅狉，ｃｕｌｔｉｖａｒ 山西Ｓｈａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ
２３ 康６０ＣｏｍｂｉｎｅＫａｆｉｒ６０ 高粱种质犛．犫犻犮狅犾狅狉，ｇｅｒｍｐｌａｓｍ 山西Ｓｈａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ
２４ Ｊｉｎｓｕ１ 苏丹草种质犛．狊狌犱犪狀犲狀狊犲，ｇｅｒｍｐｌａｓｍ 山西Ｓｈａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ
２５ Ｊｉｎｓｕ３ 苏丹草种质犛．狊狌犱犪狀犲狀狊犲，ｇｅｒｍｐｌａｓｍ 山西Ｓｈａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ
２６ Ｇｗ３１０５ 苏丹草引进种质犛．狊狌犱犪狀犲狀狊犲，ｇｅｒｍｐｌａｓｍ 美国ＵＳＡ
２７ Ｇｗ００１７５ 苏丹草引进种质犛．狊狌犱犪狀犲狀狊犲，ｇｅｒｍｐｌａｓｍ 美国ＵＳＡ
２８ Ｇｗ０１６８４ 苏丹草引进种质犛．狊狌犱犪狀犲狀狊犲，ｇｅｒｍｐｌａｓｍ 美国ＵＳＡ
２９ 中国高粱Ｇａｏｌｉａｎｇ 高粱种质犛．犫犻犮狅犾狅狉，ｇｅｒｍｐｌａｓｍ 辽宁Ｌｉａｏｎｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ
３０ 沙鲁Ｓｈａｌｕ 高粱种质犛．犫犻犮狅犾狅狉，ｇｅｒｍｐｌａｓｍ 辽宁Ｌｉａｏｎｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ
３１ 卡佛尔Ｋａｆｉｒ 高粱种质犛．犫犻犮狅犾狅狉，ｇｅｒｍｐｌａｓｍ 辽宁Ｌｉａｏｎｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ
３２ 都拉Ｄｕｒｒａ 高粱种质犛．犫犻犮狅犾狅狉，ｇｅｒｍｐｌａｓｍ 辽宁Ｌｉａｏｎｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ
３３ 迈罗 Ｍｉｌｏ 高粱种质犛．犫犻犮狅犾狅狉，ｇｅｒｍｐｌａｓｍ 辽宁Ｌｉａｏｎｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ
３４ 菲特瑞塔Ｆｅｔｅｒｉｔｅ 高粱种质犛．犫犻犮狅犾狅狉，ｇｅｒｍｐｌａｓｍ 辽宁Ｌｉａｏｎｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ
３５ 亨加利 Ｈｅｇａｒｉ 高粱种质犛．犫犻犮狅犾狅狉，ｇｅｒｍｐｌａｓｍ 辽宁Ｌｉａｏｎｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ
３６ 帚高粱Ｂｒｏｏｍｃｏｒｎ 高粱帚用种质犛．犫犻犮狅犾狅狉，ｇｅｒｍｐｌａｓｍ 辽宁Ｌｉａｏｎｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ
３７ 青壳洋Ｑｉｎｇｋｅｙａｎｇ 高粱酒用品种犛．犫犻犮狅犾狅狉，ｃｕｌｔｉｖａｒ 四川Ｓｉｃｈｕａｎ，Ｃｈｉｎａ
３８ ７５０１Ａ 高粱不育系犛．犫犻犮狅犾狅狉，ｓｔｅｒｉｌｅｌｉｎｅ 吉林Ｊｉｌｉｎ，Ｃｈｉｎａ
３９ Ａ２Ｖ４Ａ 高粱不育系犛．犫犻犮狅犾狅狉，ｓｔｅｒｉｌｅｌｉｎｅ 山西Ｓｈａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ
４０ 甚迪亚Ｓｕｎｄｈｉａ 高粱种质犛．犫犻犮狅犾狅狉，ｇｅｒｍｐｌａｓｍ 印度Ｉｎｄｉａ
４１ ７５０１Ｂ 高粱保持系犛．犫犻犮狅犾狅狉，ｍａｉｎｔａｉｎｅｒｌｉｎｅ 吉林Ｊｉｌｉｎ，Ｃｈｉｎａ
４２ ＡｆｒｉｃａＳｕ 苏丹草种质犛．狊狌犱犪狀犲狀狊犲，ｇｅｒｍｐｌａｓｍ 非洲Ａｆｒｉｃａ
７８第１７卷第６期 草业学报２００８年
图１ 犚犃犘犇引物犉０１在４２份高粱和苏丹草中扩增的结果
犉犻犵．１ 犜犺犲犪犿狆犾犻犳犻犲犱狉犲狊狌犾狋狌狊犻狀犵狆狉犻犿犲狉犉０１
材料编号同表１，下同 Ｔｈｅｍａｔｅｒｉａｌｎｕｍｂｅｒｓｗｅｒｅｔｈｅｓａｍｅｎｕｍｂｅｒｓａｓｔａｂｌｅ１，ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ
分析９个ＲＡＰＤ引物在４２份高粱和苏丹草上扩增的多态性指纹图谱，未能发现能鉴别全部４２份品种资源
的单个ＲＡＰＤ引物，而且就某一引物来说，某些品种的谱带相同。以ＲＡＰＤ引物Ｆ０１（序列为ＡＣＧＧＡＴＣＣＴＧ）
扩增的结果为例（图１），苏丹草２号与３，４号扩增的谱带相同，苏丹草２５号与２６，２７，２８号谱带相同，甚至与高粱
１１，１７，２３，３０，３１，３２，３３，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２号也相同。因此，要鉴别全部４２份品种资源，必须结合其他
ＲＡＰＤ引物。引物筛选结果表明，只要另外增加３个ＲＡＰＤ核心引物（Ｅ１７，系列为ＣＴＡＣＴＧＣＣＧＴ；Ｃ０７，系列
为ＧＴＣＣＣＧＡＣＧＡ；Ｃ０３，系列为ＧＧＧＧＧＴＣＴＴＴ），将ＲＡＰＤ图谱转换为由１和０组成的字符串后，就可以构
成能够区别４２份品种资源的ＲＡＰＤ数字指纹（表２）。
表２ 利用４个犚犃犘犇核心引物构建４２份品种资源的数字指纹
犜犪犫犾犲２ 犇犖犃犳犻狀犵犲狉狆狉犻狀狋狅犳４２犪犮犮犲狊狊犻狅狀狊犲狊狋犪犫犾犻狊犺犲犱犫狔４犚犃犘犇犮狅狉犲狆狉犻犿犲狉狊
引物Ｐｒｉｍｅｒ１２３４５６７８９１０１１１２１３１４１５１６１７１８１９２０２１２２２３２４２５２６２７２８２９３０３１３２３３３４３５３６３７３８３９４０４１４２
Ｆ０１
１１１１１１１１１１ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １
０１１１１０００００ １ １ ０ ０ ０ ０ １ ０ ０ ０ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ ０ １ １ １ １ １ １ １ １
１１１１１１１１１１ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １
００００００１０００ １ ０ ０ ０ ０ ０ １ １ ０ ０ ０ ０ １ ０ １ １ １ １ ０ １ １ １ １ ０ １ １ １ １ １ １ １ １
１１１１１１１１１１ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １
１１１１１１１１１１ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １
Ｅ１７
００００１００１０１ ０ ０ １ １ １ １ ０ １ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ １ ０ ０ １ ０
１１１１１１１００１ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ ０ ０ １ １ １ １ １ １
１０１１１１１０００ ０ １ ０ ０ １ ０ １ １ １ ０ ０ ０ １ １ １ ０ １ １ １ １ ０ ０ ０ １ １ ０ １ ０ ０ １ ０ ０
１１１１１１１１１１ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １
１１００１０００００ １ １ ０ ０ １ １ １ ０ １ １ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ １ ０ １ ０ ０ １ ０ １ １ ０ １ ０ ０ １ ０
Ｃ０７
０１００１００１１０ ０ １ ０ ０ １ １ ０ ０ ０ １ ０ １ ０ １ ０ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ ０ １ １ １ １
０００１０１００１０ ０ １ １ １ １ ０ １ １ ０ １ １ ０ １ １ ０ ０ ０ ０ １ １ １ ０ １ １ １ １ １ １ ０ １ １ １
１１１１１１１１１１ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ ０ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １
１１１１１１１０１１ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ ０ ０ １ １
１１１１０１１１１１ １ １ ０ １ ０ １ １ ０ ０ １ １ １ ０ １ １ １ １ １ １ ０ １ １ ０ ０ ０ ０ ０ ０ １ ０ ０ １
０００００１１１１１ １ ０ １ １ ０ １ ０ １ １ ０ １ １ １ ０ ０ ０ １ １ ０ １ ０ １ １ １ ０ ０ ０ １ ０ １ １ ０
Ｃ０３
００１０１０００００ ０ ０ ０ ０ １ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ １ １ ０ ０ ０ ０ ０ １ ０ １ ０ １ １ ０ ０ ０ ０ ０ ０
１１１１１１１１１１ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ ０ １ １ １ １ １ １ １ １
１１１１００００００ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ １ ０ １ １ １ １ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ １ ０ ０ ０ １ ０ ０
００００００００００ １ ０ １ ０ ０ １ ０ １ １ ０ ０ ０ ０ ０ １ ０ ０ ０ ０ ０ １ ０ １ ０ １ ０ １ １ ０ ０ １ ０
１１１１１１１０００ １ １ １ ０ １ １ １ １ １ １ １ ０ １ １ １ １ １ ０ １ １ １ ０ １ １ １ １ １ １ １ １ １ ０
８８ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．６） １２／２００８
２．２ ４２份高粱与苏丹草品种资源的ＳＳＲ数字指纹
对９５对ＳＳＲ引物进行ＰＣＲ扩增，发现有９１对ＳＳＲ引物可以扩增出ＤＮＡ。９１对ＳＳＲ引物扩增结果的多
态性水平有较大差异，条带数最少１条，最多达到１２条，总扩增条带数为５０２条，其中７３对引物在４２份高粱和
苏丹草中扩增出多态性，多态性条带４３２条，多态性条带比率为８６．０６％，多态性丰富。平均每对引物可获得
５．９２个多态条带，分子量１５０～５００ｂｐ（图２）。
在７３对ＳＳＲ引物中，未能找到仅通过１对引物就能鉴别全部４２份资源的ＤＮＡ指纹图谱。而且，在某些引
物上，有些品种如苏丹草２号与３号扩增的图谱相同，高粱不育系与其对应保持系（如高粱３８号７５０１Ａ与４１号
７５０１Ｂ；高粱１７号三尺三 Ａ与１２号三尺三Ｂ等）的谱带也完全一致。即使多态性非常丰富的ＳＳＲ引物，如
犮狌狆５７，其扩增的结果也发现，某些品种扩增的谱带相同（图２）。这说明某些品种不仅形态学性状（包括植株和籽
粒等）相似，而且ＤＮＡ的遗传变异也较小，亲缘关系较近。这从另外一个侧面表明，无论从遗传育种还是种子生
产利用上讲，建立一套能鉴别不同品种资源的指纹图谱的必要性。
图２ 引物犮狌狆５７在４２份高粱和苏丹草中扩增的结果
犉犻犵．２ 犛犛犚犳犻狀犵犲狉狆狉犻狀狋犪犿狆犾犻犳犻犲犱犫狔狆狉犻犿犲狉犮狌狆５７
根据引物组合方法，筛选出３对具有清晰条带，且重复性好的ＳＳＲ核心引物用于４２份高粱和苏丹草指纹图
谱的构建。这３对ＳＳＲ引物分别是：狋狓狆１８（系列Ｆ：ＡＣＴＧＴＣＴＡＧＡＡＣＡＡＧＣＴＧＣＧ；Ｒ：ＴＴＧＣＴＣＴＡＧＣＴＡＧ
ＧＣＡＴＴＴＣ）、犮狌狆５３（系列Ｆ：ＧＣＡＧＧＡＧＴＡＴＡＧＧＣＡＧＡＧＧＣ；Ｒ：ＣＧＡＣＡＴＧＡＣＡＡＧＣＴＣＡＡＡＣＧ）、犮狌狆５７
（系列Ｆ：ＣＴＧＣＡＧＡＧＡＧＣＴＡＡＴＴＧＴＧＣ；Ｒ：ＴＣＴＴＧＧＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＣＣＴＧ）。这样，虽然某２个品种在１
或２对引物上的数字指纹完全相同，但只要利用筛选出的３对ＳＳＲ核心引物就可以构建１个ＳＳＲ数字指纹系
列，使得全部供试材料之间的多态性可以通过０或１字符串的排列顺序得到清楚的表达，获得４２份品种资源各
自独立的ＳＳＲ数字指纹（表３）。
２．３ ２个高粱－苏丹草杂交种的ＤＮＡ指纹图谱
利用以上构建数字指纹所筛选出的ＲＡＰＤ随机引物，对皖草２号和３号２个杂交种进行扩增，结果表明，随
机引物Ｆ０１的条带在两杂交种间差异明显（图３左）。试验时，考虑到皖草２号和３号有相同的母本Ｔｘ６２３Ａ，
ＲＡＰＤ指纹图谱构建时未加入Ｔｘ６２３Ａ，只是选择了２个杂交种各自父本，即Ｓ７２２和Ｓａ。皖草２号及其父本
Ｓ７２２在分子量超过１１００ｂｐ最下处，有１条特征带，而皖草３号及其父本Ｓａ没有这条特征带，据此可以鉴别皖
草２号和３号；Ｓ７２２在分子量约９００ｂｐ处有１特征带，可以与皖草２号、皖草３号、Ｓａ区别开，但皖草３号与其
父本Ｓａ没有特征带，二者间无法区分。针对这一问题，本研究利用筛选出的ＳＳＲ引物，对２个杂交种及其亲本
进行ＰＣＲ扩增，结果筛选到１对ＳＳＲ核心引物狋狓狆１８在２个杂交种间有明显的互补带，并且可以把２个杂交种
与其亲本区别开来，从而构建了１张皖草２号和３号及其亲本的ＳＳＲ指纹图谱（图３右）。
３ 讨论
以往研究结果表明［１７，２０］，随着苏丹草与高粱参试品种数量的增加，无论ＲＡＰＤ或ＳＳＲ标记技术都无法完全
区分开苏丹草和高粱两类群。因此，本研究目的并非开展苏丹草与高粱的分类和系谱研究，也不是要鉴别苏丹草
和高粱２个种群，而是通过ＤＮＡ指纹图谱的构建，鉴定不同苏丹草与高粱品种资源，尤其２个国审杂交种。
９８第１７卷第６期 草业学报２００８年
表３ 利用３对犛犛犚核心引物构建的４２份品种资源的数字指纹
犜犪犫犾犲３ 犇犖犃犳犻狀犵犲狉狆狉犻狀狋狅犳４２犪犮犮犲狊狊犻狅狀狊犲狊狋犪犫犾犻狊犺犲犱犫狔３狆犪犻狉狊犮狅狉犲狆狉犻犿犲狉狊
引物Ｐｒｉｍｅｒ１２３４５６７８９１０１１１２１３１４１５１６１７１８１９２０２１２２２３２４２５２６２７２８２９３０３１３２３３３４３５３６３７３８３９４０４１４２
狋狓狆１８
１０００００００１０ １ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ １ １ ０ ０ ０ ０ １ １ １ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ １ １ １ １ １
１１１１００００００ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ １ １ １ １ ０ ０ １ ０ ０ １ ０ ０ １ １ ０ １ ０ １ １ １ １ １
１１１１１１００００ ０ １ １ １ １ ０ １ １ １ １ ０ ０ １ １ １ １ ０ ０ １ １ ０ ０ １ ０ ０ ０ ０ １ １ １ １ １
０１１１１１０００１ ０ １ １ １ １ １ ０ １ １ １ １ ０ ０ １ ０ ０ １ ０ ０ ０ １ １ １ ０ ０ ０ ０ １ １ １ １ １
犮狌狆５３
０１００１００１０１ １ ０ １ １ １ １ ０ １ １ ０ ０ ０ ０ １ １ ０ ０ ０ ０ １ １ ０ ０ １ １ ０ ０ ０ ０ ０ ０ １
１１１１０１１０１０ ０ １ ０ ０ ０ ０ １ ０ ０ １ １ １ １ ０ ０ １ １ ０ １ ０ ０ １ ０ ０ ０ ０ ０ １ １ ０ １ ０
０１１１００００００ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ １ ０ ０ １ １ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０
犮狌狆５７
１０００００００００ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ １ ０ １ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０
１１１１１１１１１１ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ ０ ０ １ ０ １ １ １ １
１１１１１１１１１１ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ １ ０ １ １
０００００００１１０ ０ １ ０ ０ ０ ０ １ ０ ０ １ １ １ ０ １ １ １ １ ０ １ １ １ １ １ １ １ ０ １ ０ ０ ０ ０ １
０００００００１１０ １ １ １ ０ １ １ １ ０ １ １ １ １ ０ １ １ １ ０ ０ １ １ ０ ０ ０ １ ０ ０ １ ０ ０ ０ ０ ０
０００１１１１０００ １ ０ １ ０ １ １ ０ ０ １ １ ０ ０ ０ １ １ １ ０ ０ １ １ １ １ １ ０ １ １ １ １ １ ０ １ ０
００００００００００ ０ ０ ０ ０ １ １ １ ０ １ １ ０ ０ ０ １ １ １ ０ ０ ０ ０ ０ １ １ ０ １ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０
００００００００００ ０ ０ ０ ０ ０ １ ０ ０ １ ０ ０ ０ ０ ０ １ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ １ ０ １ １ ０ １ ０ ０ ０ ０
１１１１０００１１０ ０ １ ０ ０ ０ ０ １ ０ ０ １ １ １ １ １ １ １ １ ０ １ １ ０ １ ０ １ ０ １ １ ０ １ １ ０ ０
１０００１１１００１ １ ０ １ １ １ １ ０ １ １ ０ ０ ０ ０ ０ １ ０ １ １ ０ ０ １ ０ １ ０ １ １ ０ １ ０ ０ １ １
１１１１００１０１０ １ １ １ １ １ １ １ ０ １ １ ０ １ １ ０ １ １ １ ０ １ １ ０ １ １ ０ １ １ １ １ １ ０ ０ ０
１０００００００００ １ ０ １ １ ０ １ ０ ０ １ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ ０ １ ０ ０ １ ０ ０ ０ ０ １ ０ ０ ０ ０
图３ 犚犃犘犇引物犉０１（左）和犛犛犚引物狋狓狆１８（右）构建的２个杂交种指纹图谱
犉犻犵．３ 犉犻狀犵犲狉狆狉犻狀狋犻狀犵狅犳狋狑狅狊狅狉犵犺狌犿狊狌犱犪狀犵狉犪狊狊犺狔犫狉犻犱狊犫狔犚犃犘犇狆狉犻犿犲狉犉０１（犔）犪狀犱犛犛犚狆狉犻犿犲狉狋狓狆１８（犚）
箭头表示特征带Ｔｈｅａｒｒｏｗｓｏｎｔｈｅｆｉｇｕｒｅｄｅｎｏｔｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｂａｎｄｓ；１：Ｓａ；２：Ｓ７２２；
３：皖草２号 ＷａｎｃａｏＮｏ．２；４：皖草３号 ＷａｎｃａｏＮｏ．３；５：Ｔｘ６２３Ａ
必须承认，在研究作物品种资源的遗传亲缘关系时，应选用尽量多的、能够覆盖整个基因组的引物进行ＰＣＲ
扩增［１７，２０］；但在建立作物ＤＮＡ指纹图谱时，若采用超过２０个（或对）以上引物，则不利于节约资源、降低成本和
提高工作效率，也给生产上应用该指纹图谱鉴定作物品种资源或杂交种时带来很大困难。所以，本研究认为虽然
有９个ＲＡＰＤ和７３对ＳＳＲ引物在４２份品种资源间表现出很好的多态性，但并不主张选取全部表现多态的引物
所构成的数字指纹组合作为指纹图谱，而是通过筛选出尽量少的核心引物，达到事半功倍的效果。
０９ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．６） １２／２００８
ＲＡＰＤ和ＳＳＲ标记构建指纹图谱的原理是不同的。ＲＡＰＤ标记一般表现为显性遗传，所构建的指纹图谱中
１、０表示特异扩增的ＤＮＡ片段有无。因影响ＰＣＲ扩增反应的各种因素（如ＤＮＡ、Ｍｇ２＋、ＤＮＴＰ、Ｔａｑ、退火温度
等）同样影响ＲＡＰＤ的扩增效果，其重复性一直受到研究者的关注［７，８］。本研究表明，在反应仪器固定、试剂来源
和型号一致、保证ＤＮＡ模板质量的前提下，对试剂用量和扩增条件加以严格控制，重复结果是可以得到的，并且
利用４个ＲＡＰＤ核心引物扩增的数字指纹组合，可以鉴定全部４２份高粱与苏丹草品种资源。作物杂交种的
ＤＮＡ图谱有双亲型、偏母型、偏父型、杂种型、互补型和缺失型等，而互补型是鉴定杂交种纯度最可靠最直观的谱
带。本研究筛选的ＲＡＰＤ核心引物Ｆ０１虽然能鉴别皖草２号和３号２个杂交种，但未能在２个杂交种中寻找到
互补型特征谱带，也难以通过该图谱鉴定皖草３号杂交种和其父本Ｓａ，表明利用ＲＡＰＤ技术建立高粱－苏丹草
杂交种ＤＮＡ指纹图谱存在不足。ＳＳＲ标记呈共显性，数量丰富、信息含量高、重复性好、稳定可靠；所构建的指
纹图谱中０，１表示位点（ｌｏｃｉ）上等位基因（ａｌｅｌｅ）的变异。本研究仅利用３对ＳＳＲ核心引物组合构建的ＤＮＡ数
字指纹，可以鉴定４２份高粱和苏丹草品种资源，这对７种栽培高粱类型（中国高粱、菲特瑞塔、都拉、迈罗、卡佛
尔、沙鲁和亨加利）和常用高粱不育系和保持系（如Ｔｘ６２３Ａ和Ｔｘ６２３Ｂ，Ｔｘ２７９１Ａ和Ｔｘ２７９１Ｂ，３０４２Ａ和３０４２Ｂ，
三尺三Ａ和三尺三Ｂ等）的鉴别和利用具有重要的理论和实际应用价值。更为重要的是，与某些研究者需要利
用大量引物组合进行作物品种鉴定不同，本研究只要利用１对ＳＳＲ核心引物就可以建立１张能够区别皖草２号
和３号及其亲本的ＤＮＡ指纹图谱，显示了ＳＳＲ标记在高粱与苏丹草ＤＮＡ指纹图谱构建中的优势，也说明本研
究所筛选的核心ＳＳＲ引物对杂交种品种鉴定的应用价值。
致谢：农业部国家高粱改良中心、辽宁省农业科学院高粱所邹剑秋研究员、卢庆善研究员，山西省农业科学院高粱
所张福耀研究员提供部分试验材料，谨致谢忱。
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１９第１７卷第６期 草业学报２００８年
ｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｔｉｃｒｅｓｏｕｒｃｅｓｕｓｉｎｇｗｉｌｄ，ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄａｎｄｅｌｉｔｅｂａｒｌｅｙｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，
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［１９］ ＳｃｈｌｏｓｓＳＪ，ＭｉｔｃｈｅｌＳＥ，ＷｈｉｔｅＧＭ，犲狋犪犾．ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＲＦＬＰｐｒｏｂｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｆｏｒｇｅｎｅｄｉｓｃｏｖｅｒｙａｎｄＳＳＲｄｅｖｅｌｏｐ
ｍｅｎｔｉｎ犛狅狉犵犺狌犿犫犻犮狅犾狅狉（Ｌ．）Ｍｏｅｎｃｈ［Ｊ］．ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓ，２００２，１０５：９１２９２０．
［２０］ ＺｈａｎＱＷ，ＺｈａｎｇＴＺ，ＷａｎｇＢＨ，犲狋犪犾．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙｃｏｍｐａｒｉｓｏｎａｎｄｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｏｆ犛．犫犻犮狅犾狅狉ａｎｄ犛．狊狌犱犪狀犲狀狊犲
ａｓｒｅｖｅａｌｅｄｂｙＳＳＲｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，２００８，１７４（１）：９１６．
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（１．ＡｎｈｕｉＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｆｅｎｇｙａｎｇ２３３１００，Ｃｈｉｎａ；２．ＮａｔｉｏｎａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｒｏｐ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ＆ＧｅｒｍｐｌａｓｍＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ，ＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００９５，Ｃｈｉｎａ）
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