全 文 ：书唐古特白刺蛋白激酶基因犖狋犆犐犘犓２超表达
载体构建及紫花苜蓿转化研究
郑琳琳１，王佳１，贺龙梅１，王学峰２，王迎春１
（１．内蒙古大学生命科学学院 内蒙古自治区牧草与特色作物生物技术重点实验室，内蒙古 呼和浩特０１００２１；
２．内蒙古和信园蒙草抗旱绿化股份有限公司，内蒙古 呼和浩特０１００２１）
摘要：环境因素如高盐、干旱或冷冻等严重制约着豆科重要牧草紫花苜蓿的生长发育和产量。根据已发表的盐生
植物唐古特白刺蛋白激酶基因犖狋犆犐犘犓２的序列信息（序列号ＫＣ８２３０４４），利用ＰＣＲ方法扩增其编码区ｃＤＮＡ，连
接ｐＭＤ１９Ｔｓｉｍｐｌｅ载体并测序，测序结果表明所克隆的ＤＮＡ片段长度为１３６２ｂｐ，与ＧｅｎＢａｎｋ上公布的序列完
全一致。在此基础上构建植物超表达载体ｐＰＺＰ２２１ＮｔＣＩＰＫ２，采用 ＣａＣｌ２ 冻融法将该表达载体转入农杆菌
ＧＶ３１０１中，然后通过农杆菌介导的方法转化紫花苜蓿的下胚轴，形成愈伤组织后经庆大霉素筛选培养，最终获得
７株抗性幼苗。对抗性幼苗进行庆大霉素基因的ＰＣＲ检测，结果表明，犖狋犆犐犘犓２基因成功整合到紫花苜蓿基因组
中，进一步对其进行外源基因的ＲＴ－ＰＣＲ检测，发现只有３株幼苗中的外源基因实现了过量表达，这可能是由于
基因插入位点的差异引发的基因沉默所致。本研究的开展为进一步分析转化植株在各种逆境胁迫条件的表现及
其遗传稳定性，培育具有多重抗逆能力的苜蓿品种，促进苜蓿产业发展奠定基础。
关键词：紫花苜蓿；犖狋犆犐犘犓２基因；超表达载体；遗传转化
中图分类号：Ｓ８１６；Ｑ９４３．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１３）０６０２２３０７
犇犗犐：１０．１１６８６／ｃｙｘｂ２０１３０６２８
“牧草之王”紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）是全世界栽培历史最悠久、种植面积最广、利用价值最高的一种豆
科多年生优质牧草，广泛种植于以畜牧业为支柱产业的中国西北地区［１２］。然而这些地区多具有干旱、高盐、低温
等生境特点，严重制约着苜蓿生长发育和产量。因此，通过转基因手段培育具有多重抗逆能力的优良品种，对于
苜蓿产业的可持续发展具有举足轻重的作用。
在植物应对非生物胁迫的防御机制中，Ｃａ２＋作为第二信使发挥着重要的作用［３］。ＣＩＰＫ（ＣＢＬｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ
ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ）是近年来鉴定的一类丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，可与上游植物特有的Ｃａ２＋传感器钙调磷酸酶Ｂ类
似蛋白（ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎＢｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＣＢＬｓ）结合，识别并传递胞质钙信号，引发细胞内一系列应激反应［４５］。通过
生物信息学分析，在模式植物拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）和水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）基因组中分别发现２６和３０
个犆犐犘犓 基因［６］，后在银杨（犘狅狆狌犾狌狊狋狉犻犮犺狅犮犪狉狆犪）［７］、葡萄（犞犻狋犻狊狏犻狀犻犳犲狉犪）［８］、高粱（犛狅狉犵犺狌犿犫犻狅犮狅犾狅狉）［９］和玉米
（犣犲犪犿犪狔狊）［１０１１］中相继获得多个ＣＩＰＫ家族成员。多项研究表明，ＣＩＰＫ广泛参与植物对高盐、低钾和干旱等外
界刺激的应答反应［１２１４］，在拟南芥、水稻、烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿）等植物中过量表达不同犆犐犘犓 基因均可提高
转基因植株的抗逆能力［１５１８］。
本实验以唐古特白刺（犖犻狋狉犪狉犻犪狋犪狀犵狌狋狅狉狌犿）ｃＤＮＡ为模板，利用ＰＣＲ技术克隆获得犖狋犆犐犘犓２完整编码序
列（ｃｏｍｐｌｅｔｅｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＣＤＳ），在此基础上构建含有该序列的植物表达载体ｐＰＺＰ２２１ＮｔＣＩＰＫ２，采用农杆
菌介导法对紫花苜蓿进行遗传转化，经ＰＣＲ及ＲＴ－ＰＣＲ验证，获得了超表达犖狋犆犐犘犓２基因的转化植株，为利
用转基因手段选育抗逆苜蓿新品种奠定基础。
第２２卷 第６期
Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．６
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
２２３－２２９
２０１３年１２月
收稿日期：２０１３０５０８；改回日期：２０１３０６０３
基金项目：国家自然科学基金地区项目（３１３６００６３），内蒙古自然科学基金重大项目（２０１２ＺＤ０５）和内蒙古自治区教育厅项目（３１００１５）资助。
作者简介：郑琳琳（１９８３），女，内蒙古呼伦贝尔人，讲师，在读博士。Ｅｍａｉｌ：１３８５６２６５＠ｑｑ．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｙｃｗａｎｇ＠ｉｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
１ 材料与方法
１．１ 材料
本实验于２０１２年９月开始进行。紫花苜蓿“中苜一号”种子由中国农业科学院草原研究所孙启忠研究员惠
赠。大肠杆菌ＤＨ５α、农杆菌ＧＶ３１０１、植物表达载体ｐＰＺＰ２２１由内蒙古大学牧草与特色作物生物技术省部共建
教育部重点实验室提供。
氨苄青霉素（ａｍｐｉｃｉｌｉｎ，Ａｍｐ）、壮观霉素（ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ，Ｓｐｅ）、庆大霉素（ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ，Ｇｅｎ）、头孢霉素
（ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ，Ｃｅｆ）等抗生素购自Ｓｉｇｍａ公司；２，４二氯苯氧乙酸（２，４ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃａｃｉｄ，２，４Ｄ）、激动
素（ｋｉｎｅｔｉｎ，ＫＴ）、６苄氨基腺嘌呤（６ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ，６ＢＡ）、萘乙酸（１ｎａｐｈｔｈｙｌａｃｅｔｉｃａｃｉｄ，ＮＡＡ）等植物激
素购自Ｓａｎｇｏｎ公司；ＤＮＡ限制性内切酶、Ｔ４ＤＮＡ连接酶购自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司，Ｔａｑ酶、Ｍａｒｋｅｒ购自ＴｒａｎｓＧｅｎ
公司；总ＲＮＡ分离采用ＲＮＡｉｓｏ试剂（Ｔａｋａｒａ），ｃＤＮＡ合成采用 ＭＭＬＶＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅＫｉｔｓ反转录试
剂盒（Ｐｒｏｍｅｇａ），基因组ＤＮＡ提取采用ＰｌａｎｔＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡＫｉｔ试剂盒（Ｔｉａｎｇｅｎ）；寡核苷酸引物合成和产物测
序由Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司承担；其他化学试剂均为国产分析纯。
苜蓿遗传转化所需培养基如下：无菌苗生长，１／２ＭＳ（ＭｕｒａｓｈｉｇｅａｎｄＳｋｏｏｇ）培养基；预培养及共培养培养
基，ＭＳ＋２ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ＋０．５ｍｇ／ＬＫＴ；愈伤组织诱导培养基，ＭＳ＋２ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ＋０．５ｍｇ／ＬＫＴ＋５００ｍｇ／Ｌ
Ｃｅｆ；分化培养基，ＭＳ＋０．５ｍｇ／Ｌ６ＢＡ＋０．０５ｍｇ／ＬＮＡＡ＋２００ｍｇ／ＬＣｅｆ＋３０ｍｇ／ＬＧｅｎ；生根培养基，１／２
ＭＳ＋０．３％活性炭。
１．２ 研究方法
１．２．１ 犖狋犆犐犘犓２ＣＤＳ的克隆 按照ＲＮＡｉｓｏ总ＲＮＡ抽提试剂盒的操作说明提取唐古特白刺叶片总ＲＮＡ，用
１％的琼脂糖凝胶鉴定其质量和完整性；利用 ＭＭＬＶＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅＫｉｔｓ反转录试剂盒将１μｇＲＮＡ反
转录为ｃＤＮＡ，并最终将其稀释为２０ｎｇ／μＬ。
根据本实验室提交的犖狋犆犐犘犓２序列（ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＫＣ８２３０４４），设计１对用于扩增其编码区ｃＤＮＡ的
引物［ＮＣＦ：５′ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＴＧＧＡＡＣＡＣＡＡ３′和ＮＣＲ：５′ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＣＴＡＡＴＧＧＴＡＡＴＧＣＴ３′］。
酶切位点用下划线表示，分别为犅犪犿犎Ⅰ和犓狆狀Ⅰ。以合成的ｃＤＮＡ作为模板，利用高保真酶扩增犖狋犆犐犘犓２
ＣＤＳ。ＰＣＲ反应体系为２５μＬ，内含２ｍｍｏｌ／ＬＭｇ
２＋、２００μｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ、引物各１．０μｍｏｌ／Ｌ，ＴａｑＤＮＡ 聚合
酶１．０Ｕ，２０ｎｇ模板。ＰＣＲ扩增程序为９４℃预变性５ｍｉｎ；然后９４℃变性３０ｓ，５５℃退火３０ｓ，７２℃延伸１
ｍｉｎ，共３５个循环，最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。将ＰＣＲ产物插入ｐＭＤ１９Ｔｓｉｍｐｌｅ载体（Ｔａｋａｒａ）中，命名为ｐＭＤ
ＮｔＣＩＰＫ２，转化大肠杆菌ＤＨ５α，经菌体ＰＣＲ检测的阳性克隆进行双向测序。
１．２．２ 植物表达载体的构建 选取测序正确的阳性克隆提取质粒，利用限制性内切酶犅犪犿犎Ⅰ和犓狆狀Ⅰ双酶
切ｐＭＤＮｔＣＩＰＫ２和ｐＰＺＰ２２１质粒，琼脂糖凝胶检测后回收目的片段，Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接过夜，转化大肠杆菌
ＤＨ５α，在含有Ｓｐｅ抗性的ＬＢ（ＬｕｒｉａＢｅｒｔａｎｉ）平板中筛选阳性菌落，经ＰＣＲ检测和双酶切鉴定，获得植物表达载
体ｐＰＺＰ２２１ＮｔＣＩＰＫ２。
１．２．３ 农杆菌介导的紫花苜蓿遗传转化 采用ＣａＣｌ２ 冻融法将植物表达载体ｐＰＺＰ２２１ＮｔＣＩＰＫ２转入农杆菌
ＧＶ３１０１中，在筛选培养基（ＬＢ＋５０ｍｇ／ＬＲｉｆ＋１００ｍｇ／ＬＳｐｅ＋５０ｍｇ／ＬＧｅｎ）上获得转化菌落，经ＰＣＲ鉴定后
保存备用。
选取颗粒饱满的苜蓿种子，利用７５％的酒精和０．１％的ＨｇＣｌ２ 溶液分别消毒１和１０ｍｉｎ，无菌水清洗３～５
次，用灭菌滤纸吸干种子上的多余水分，置于１／２ＭＳ培养基中萌发。切取７ｄ龄无菌苗的下胚轴作为受体材料，
预培养３ｄ后，将其浸泡于活化的农杆菌菌液中侵染１５ｍｉｎ，在共培养培养基中避光生长３～５ｄ。形成愈伤组织
后，经分化筛选培养和生根培养得到紫花苜蓿抗性转化植株。待再生苜蓿根与地上部分均长至１０ｃｍ左右时，移
入营养土中继续培养。
１．２．４ 转化植株的检测 设计１对引物［ａａｃＣ１Ｆ：５′ＧＧＡＴＣＧＴＣＡＣＣＧＴＡＡＴＣＴＧＣＴ３′和ａａｃＣ１Ｒ：５′
ＧＣＴＣＣＧＴＡＧＴＡＡＧＡＣＡＴＴＣＡＴＣＧ３′］，用于扩增载体中的庆大霉素抗性基因犪犪犮犆１，扩增长度为２４６ｂｐ。以
转基因抗性苜蓿的基因组ＤＮＡ作为模板，质粒ｐＰＺＰ２２１和野生型紫花苜蓿基因组ＤＮＡ为阳性和阴性对照，进
４２２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．６
行ＰＣＲ扩增和电泳分析。ＰＣＲ反应体系为２５μＬ，内含２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍｇ
２＋、２００μｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ、引物各１．０
μｍｏｌ／Ｌ，ＴａｑＤＮＡ聚合酶１．０Ｕ，２０ｎｇ模板。ＰＣＲ反应程序为９４℃预变性５ｍｉｎ；然后９４℃变性２０ｓ，５５℃退
火２０ｓ，７２°Ｃ延伸２０ｓ，共３５个循环。
提取转化植株总ＲＮＡ，反转录合成ｃＤＮＡ，利用ＮＣＦ和ＮＣＲ引物扩增目的基因。质粒ｐＰＺＰ２２１ＮｔＣＩＰＫ２
和野生型紫花苜蓿ｃＤＮＡ用作阳性对照和阴性对照。ＰＣＲ体系和反应条件与犖狋犆犐犘犓２基因克隆相同，通过
１％琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。
检测实验重复３次，以确定犖狋犆犐犘犓２基因在苜蓿中的整合及表达。
２ 结果与分析
２．１ 犖狋犆犐犘犓２基因犆犇犛的获得
图１ 犖狋犆犐犘犓２基因犆犇犛的犘犆犚扩增
犉犻犵．１ 犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犖狋犆犐犘犓２犆犇犛
Ｌ１：ＰＣＲ扩增产物ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔ；Ｍ：ＤＮＡ分子量ＤＮＡｍａｒｋｅｒ．
图２ 植物表达载体狆犘犣犘２２１犖狋犆犐犘犓２质粒图谱
犉犻犵．２ 犕犪狆狅犳狆犾犪狀狋狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀狏犲犮狋狅狉狆犘犣犘２２１犖狋犆犐犘犓２
ＬＢ：左边界Ｌｅｆｔｂｏｒｄｅｒ；Ｐ３５Ｓ：３５Ｓ启动子３５Ｓｐｒｏｍｏｔｅｒ；ａａｃＣ１：庆
大霉素氨基乙酰转移酶 Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ３′Ｎａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＴＮＯＳ：
ＮＯＳ终止子ＮＯＳｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ；ＲＢ：右边界Ｒｉｇｈｔｂｏｒｄｅｒ．
以唐古特白刺ｃＤＮＡ作为模板进行ＰＣＲ扩增，
获得１条１３６２ｂｐ的ＤＮＡ片段，与预期结果相符（图
１）。将ＰＣＲ 产物切胶回收，连接到载体ｐＭＤ１９Ｔ
上，转化大肠杆菌，阳性克隆进一步测序验证。测序结
果表明该片段与ＧｅｎＢａｎｋ中公布的序列完全一致，成
功的克隆获得犖狋犆犐犘犓２的ＣＤＳ。
２．２ 植物表达载体ｐＰＺＰ２２１ＮｔＣＩＰＫ２的鉴定
以ｐＰＺＰ２２１为基本骨架，通过双酶切切出的末端
之间的连接将外源基因犖狋犆犐犘犓２插入其中，获得植
物表达载体ｐＰＺＰ２２１ＮｔＣＩＰＫ２（图２）。提取重组质
粒，应用ＮＣＦ和ＮＣＲ引物进行ＰＣＲ扩增，结果显示
均扩增出１３５０ｂｐ左右的预期片段（图３）；同时对重组
质粒进行双酶切鉴定，电泳分析表明重组质粒可以切
出两个片段，大片段为载体序列，约为９．８ｋｂ，小片段
为犖狋犆犐犘犓２基因，约为１．４ｋｂ（图４）。
２．３ 农杆菌转化
随机挑取５个转化菌落进行ＰＣＲ鉴定，均可扩增
出目的条带（图５），表明载体ｐＰＺＰ２２１ＮｔＣＩＰＫ２已成
功转入农杆菌，可用于后续苜蓿的转化。
２．４ 紫花苜蓿抗性转化植株的获得
将预培养的紫花苜蓿下胚轴，加入活化的农杆菌
中侵染１５ｍｉｎ，共培养３ｄ后，在愈伤组织诱导培养基
上生长１５ｄ左右，形成愈伤组织（图６Ａ），将浅黄色的
愈伤组织分别接入分化培养基中继续培养，直至绿色
再生芽产生（图６Ｂ），最后切下再生芽转入生根培养基
中生成再生植株（图６Ｃ），经炼苗移栽至营养土中继续
培养（图６Ｄ）。
２．５ 再生植株的检测
对获得的７株抗性幼苗进行庆大霉素抗性基因
犪犪犮犆１的鉴定，ＰＣＲ产物电泳分析表明所有幼苗均克
隆得到长约２５０ｂｐ的条带，与预期结果相符（图７），证
明外源基因确已整合到紫花苜蓿基因组中。
５２２第２２卷第６期 草业学报２０１３年
图３ 狆犘犣犘２２１犖狋犆犐犘犓２的犘犆犚鉴定
犉犻犵．３ 犘犆犚犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狆犘犣犘２２１犖狋犆犐犘犓２
Ｌ１～Ｌ３：ＰＣＲ鉴定结果ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔ；Ｍ：ＤＮＡ分子量ＤＮＡｍａｒｋｅｒ．
图４ 狆犘犣犘２２１犖狋犆犐犘犓２的双酶切鉴定
犉犻犵．４ 犇狅狌犫犾犲犱犻犵犲狊狋犻狅狀狅犳狆犘犣犘２２１犖狋犆犐犘犓２
Ｌ１，Ｌ２：ＰＣＲ鉴定结果ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔ；Ｍ：ＤＮＡ分子量ＤＮＡｍａｒｋｅｒ．
图５ 狆犘犣犘２２１犖狋犆犐犘犓２导入农杆菌的犘犆犚检测
犉犻犵．５ 犘犆犚犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狆犘犣犘２２１犖狋犆犐犘犓２狋狉犪狀狊犳狅狉犿犲犱
犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊
Ｌ１～Ｌ５：重组农杆菌ＲｅｃｏｍｂｉｎｅｄＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ；
Ｍ：ＤＮＡ分子量ＤＮＡｍａｒｋｅｒ．
同时对抗性苗进行犖狋犆犐犘犓２基因的ＲＴ－ＰＣＲ
检测，结果显示其中的３株扩增获得大小一致的目的
条带，其他４株幼苗无扩增条带（图８），这可能是由于
基因插入位点的差异引发的基因沉默所致。结果说明
犖狋犆犐犘犓２基因在３株转基因幼苗中可以正常表达。
３ 讨论
自１９８６年Ｄｅａｋ等［１９］首次报道利用转基因技术
获得抗逆苜蓿植株以来，利用基因工程手段提高苜蓿
抗逆性状已成为苜蓿育种的重要途径［２０２４］。将拟南芥
冷诱导转录因子犃狋犆犅犉１［２５］和犃狋犆犅犉２［２６］导入和田
苜蓿或“Ｈｕｎｔｅｒｒｉｖｅｒ”苜蓿中，经ＰＣＲ检测得到了阳
性转化植株，为紫花苜蓿抗寒新品种的选育奠定了基
础；燕丽萍等［２７２９］采用分子生物学检测手段和不同浓
度ＮａＣｌ对转甜菜碱醛脱氢酶犅犃犇犎 基因苜蓿进行
研究，证实犅犃犇犎 基因可以稳定遗传，且转基因苜蓿
耐盐性明显高于对照，最终获得综合性状优良的耐盐
苜蓿新品种“山苜２号”；李燕等［３０］构建了紫花苜蓿
犕狊犣犐犘基因超表达载体并对转基因苜蓿进行检测，结
果表明该基因的超表达可以提高苜蓿的耐盐性和耐旱性；Ｌｉｕ等［３１］将角果碱蓬（犛狌犪犲犱犪犮狅狉狀犻犮狌犾犪狋犪）液泡膜
Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白犛犮犖犎犡１和液泡质子ＡＴＰ酶犛犮犞犘基因共转化紫花苜蓿，发现转化植株在盐胁迫和盐
碱复合胁迫条件下存活，而野生植株则萎黄死亡；在紫花苜蓿过量表达苏打猪毛菜（犛犪犾狊狅犾犪狊狅犱犪）犛狊犖犎犡１基
因，成功获得迄今所有报道中耐盐能力最强的转化植株，可以在４００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ中正常生长超过５０ｄ［３２］。
近期的研究证实犆犐犘犓２基因在植物传递钙信号，应答外界刺激的过程中发挥着重要的作用。Ｃｈｅｎ等［１０］发
现玉米犣犿犆犐犘犓２受盐、干旱、低温和高温诱导上调表达，表达量在根和叶中存在差异；高盐、干旱和ＡＢＡ处理
均可增加盐生植物短芒大麦草（犎狅狉犱犲狌犿犫狉犲狏犻狊狌犫狌犾犪狋狌犿）犎犫犆犐犘犓２的表达量，且超表达犎犫犆犐犘犓２的转基因
６２２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．６
拟南芥抵抗盐和渗透胁迫的能力显著上升［３３］；本实验室从盐生植物唐古特白刺中克隆获得犖狋犆犐犘犓２基因，并
将其转入大肠杆菌，发现转化菌株对高盐、干旱、低温及高温的抗性明显提高（未发表数据）。上述研究表明
犆犐犘犓２的表达可能是植物具有多种抗性的基础，因此可以作为遗传转化的候选基因。
图６ 转化再生植株
犉犻犵．６ 犗犫狋犪犻狀犻狀犵狋犺犲狋狉犪狀狊犳狅狉犿犲犱狆犾犪狀狋狊
Ａ：愈伤组织诱导Ｃａｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；Ｂ：愈伤组织分化Ｃａｌｕｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；Ｃ：组培再生植株Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｐｌａｎｔｌｅｔｉｎｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅ；Ｄ：移栽抗性
苗Ｔｈｅｓｅｅｄｌｉｎｇｉｎｓｏｉｌ．
图７ 再生植株庆大霉素抗性基因检测
犉犻犵．７ 犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犪犪犮犆１犵犲狀犲犻狀狉犲犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀狆犾犪狀狋狊
Ｌ１：阳性对照Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；Ｌ２～Ｌ８：再生植株 Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ｐｌａｎｔｓ；Ｌ９：阴性对照Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；Ｍ：ＤＮＡ分子量ＤＮＡｍａｒｋｅｒ．
图８ 再生植株目的基因检测
犉犻犵．８ 犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犖狋犆犐犘犓２犵犲狀犲犻狀狉犲犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀狆犾犪狀狋狊
Ｌ１：阳性对照 Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；Ｌ２～Ｌ８：再生植株 Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ｐｌａｎｔｓ；Ｌ９：阴性对照Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；Ｍ：ＤＮＡ分子量ＤＮＡｍａｒｋｅｒ．
本研究获得抗性紫花苜蓿转化植株，经ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ检测发现外源基因已整合到苜蓿基因组中并过量
表达，为进一步研究转化植株在各种逆境胁迫条件的表现及其遗传稳定性，培育具有多重抗逆能力的苜蓿品种，
促进苜蓿产业发展提供参考。
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ＺＨＥＮＧＬｉｎｌｉｎ１，ＷＡＮＧＪｉａ１，ＨＥＬｏｎｇｍｅｉ１，ＷＡＮＧＸｕｅｆｅｎｇ２，ＷＡＮＧＹｉｎｇｃｈｕｎ１
（１．ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＨｅｒｂａｇｅ＆ＥｎｄｅｍｉｃＣｒｏｐ
ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａ，Ｈｏｈｈｏｔ０１００２１，Ｃｈｉｎａ；２．ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＨｏｔｉｓｉｏｎａｎｄ
ＭｏｎｓｏｄＤｒｏｕｇｈｔＲｅｓｉｓｔａｎｃｅＧｒｅｅｎｉｎｇＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｌｉｍｉｔｅｄ，Ｈｏｈｈｏｔ０１００２１，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ａｄｖｅｒｓｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｆａｃｔｏｒｓｓｕｃｈａｓｓａｌｉｎｉｔｙ，ｄｒｏｕｇｈｔａｎｄｃｏｌｄｌｉｍｉｔｔｈｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｏｆ
犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪，ｔｈｅｍｏｓｔｅｃｏｎｏｍｉｃａｌｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｆｏｒａｇｅｌｅｇｕｍｅｗｏｒｌｄｗｉｄｅ．Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｔｈｅｃｏｍｐｌｅｔｅｃｏｄ
ｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆ犖狋犆犐犘犓２ｗａｓｃｌｏｎｅｄｆｒｏｍａｈａｌｏｐｈｙｔｅ犖犻狋狉犪狉犻犪狋犪狀犵狌狋狅狉狌犿，ｌｉｇａｔｅｄｉｎｔｏａｐＭＤ１９Ｔｓｉｍｐｌｅ
ｖｅｃｔｏｒａｎｄｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｙｓｅｑｕｅｎｃｅｄ．ＴｈｅＣＤＳｏｆ犖狋犆犐犘犓２ｗａｓ１３６２ｂｐａｎｄｗａｓｉｄｅｎｔｉｃａｌｗｉｔｈａ犖狋犆犐犘犓２
ｇｅｎｅｉｎＧｅｎＢａｎｋ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＫＣ８２３０４４）．Ｔｈｉｓｆｒａｇｍｅｎｔｗａｓｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｐｌａｎｔｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｖｅｃ
ｔｏｒｐＰＺＰ２２１ｕｎｄｅｒｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｏｆｔｈｅｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ（ＣａＭＶ）３５Ｓｐｒｏｍｏｔｅｒ，ａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉ
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ＣＩＰＫ２ｂｙｃｏｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｓｅｖｅｎｓｅｅｄｌｉｎｇｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄａｆｔｅｒｃａｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｇｅｎｔａｍｙｃｉｎｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｎ
ｔｈｅｓｅｅｄｌｉｎｇｓｗｅｒｅｓａｍｐｌｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｇｅｎｔａｍｙｃｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｎｅ犪犪犮犆１ｂｙＰＣＲａｎｄｔａｒｇｅｔｇｅｎｅ犖狋犆犐犘犓２ｂｙ
ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓ．ＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔ犖狋犆犐犘犓２ｗａｓｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅ犕犲犱犻犮犪犵狅
ｇｅｎｏｍｅｉｎａｌｓｅｅｄｌｉｎｇｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ＲＴ－ＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔ犖狋犆犐犘犓２ｗａｓｏｖｅｒｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｔｔｈｅ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｅｖｅｌｉｎｔｈｒｅｅｓｅｅｄｌｉｎｇｓ，ａｎｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｍｉｇｈｔｂｅｏｃｃｕｒｒｉｎｇｉｎｓｏｍｅｓｅｅｄｌｉｎｇｓｄｕｅｔｏｔｈｅ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓｉｔｅｓｏｆｔｈｅｅｘｏｇｅｎｏｕｓｇｅｎｅ．Ａｓｏｌｉｄｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅａｎｄ
ｇｅｎｅｔｉｃｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｐｌａｎｔｓａｎｄａｄｖａｎｃｅｄｂｒｅｅｄｉｎｇｏｆ犕犲犱犻犮犪犵狅ｖａｒｉｅｔｉｅｓｗｉｔｈｓｔｒｏｎｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏ
ａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｅｓｉｓｏｆｆｅｒｅｄ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪；犖狋犆犐犘犓２；ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ；ｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
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